KR102502736B1 - 항암 및 면역증강용 신규 타겟 - Google Patents

항암 및 면역증강용 신규 타겟 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 면역증강용 약학적 조성물, 항암제 스크리닝 방법, 및 암 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 억제제를 사용하여 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있으며, 개체의 면역력을 증강시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 활성 또는 발현 측정을 통해 새로운 항암제 후보물질을 효과적으로 선별할 수 있으며, 암 예후 진단 및 예측에 필요한 정보를 제공할 수 있어 매우 유용하다.

Description

항암 및 면역증강용 신규 타겟{NOVEL TARGET FOR ANTI-CANCER AND IMMUNE-ENHANCING}
본 발명은 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제를 포함하는 면역증강용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상을 이용한 항암제 스크리닝 방법, 및 암 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
지난 수년간 암에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고 여전히 암은 전세계적으로 주요한 사망 원인이다. 다수의 암 치료법이 개발되었으나 모든 암종에 대해 그리고 모든 환자에 대해 효과적이지 않다. 암을 치료하기 위해 현재 대부분 사용되고 있는 방법은 상대적으로 비선택적이다. 수술에 의해 질병을 갖는 조직을 제거하거나, 방사선 치료에 의해 고형 종양의 크기를 감소시키거나, 화학치료에 의해 암세포를 빠르게 사멸시킨다. 특히, 화학치료는 약물에 대한 내성을 발달시킬 수 있으며, 일부 경우에는 투여가능한 용량을 제한하여 결국 잠재적으로 유효한 약물의 사용을 배제시킬 정도로 심각한 부작용을 야기시킨다. 따라서, 타겟 특이적이고 보다 효과적인 암 치료의 개발이 시급하다.
인체 적응 면역 체계는 암세포를 특이적으로 제거할 수 있는 매우 정교한 시스템이다. 특히 T 세포의 경우, 세포성 적응 면역을 결정하는 역할을 하며, 세포가 비자아 또는 비정상적인 항원에 노출되는 경우 항원을 인지하여 제거한다. T 세포의 경우, 세포당 약 20,000-40,000 TCR 분자를 발현하고 APC의 100,000 pMHC 분자 중 몇 개의 항원 (펩타이드 서열에 의해 결정)을 특이적으로 인지하여 신호 전달을 시작하게 된다. 이와 같은 TCR 분자는 매우 정교하고, 미묘한 항원 변화를 인지하여 신호를 전달해야 하는 고감도 센서로서의 역할을 하여야 한다. 이러한 세포성 적응 면역은 매우 정교하게 작동되어 암세포를 효과적으로 제거할 수 있어야 한다. 만약 항원 특이적 적응 면역 체계가 정상적으로 작동하지 않게 되면, 암세포 제거 기능에 심각한 문제를 초래한다. 예를 들어, 암세포의 표면에 있는 단백질 PD-L1 또는 PD-L2가 T 세포의 표면에 있는 단백질 PD-1과 결합하면, T 세포는 암세포를 공격하지 못한다. 따라서, 효과적인 암 치료를 위해, T 세포가 암세포를 제거하는 데 방해가 되는 요소를 제거하는 것이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 인체 면역 체계를 이용한 암 치료 방법을 발굴하기 위하여 연구를 진행한 결과, KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 활성 저해가 암의 발달, 성장, 침윤 및 전이를 현저하게 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 일 목적은 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역증강용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 양태는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
용어 "KIRREL3(Kin of IRRE-like protein 3)"는 KIRREL3 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 네프린 유사 단백질(nephrin-like protein)의 구성원에 속하며, 'NEPH2'라고도 명명된다. 이 단백질은 태아 및 성인의 뇌, 신장 사구체의 족세포(podocytes)에서 발현되며, 신장의 혈액 여과 기능, 시냅스 형성 등과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.
용어 "CNTN4(Contactin-4)"는 CNTN4 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 면역글로불린 상과(immunoglobulin superfamily)에 속하며, 세포접착분자로서 기능하는 GPI(glycosylphosphatidylinositol)-anchored 신경세포 막단백질로서 신경계의 발달과정에서 axon 커넥션을 형성하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
용어 "CD351(Cluster of Differentiation 351)"은 IgA 및 IgM에 높은 친화성으로 결합하는 Fc 수용체이며, 'Fcα/μR'라고도 명명된다. 마우스에서 대식세포(macrophages), 여포성수상돌기세포(follicular dendritic cells), 변연부 및 여포성 B 세포(marginal zone and follicular B cells), 및 신장 관상피 세포(kidney tubular epithelial cells)에서 발현되고 인간에서는 장의 점막고유층 세포(intestinal lamina propria cells), 파네드 세포(Paneth cells), 편도선 내 여포성수상돌기세포(follicular dendritic cells in tonsils), 활성화된 대식세포(activated macrophages) 및 일부 유형의 전-배중심 IgD+/CD38+ B 세포(pre-germinal centre IgD+/CD38+ B cells)에서 발현되는 것으로 알려져 있다.
상기 KIRREL3, CNTN4 및 CD351은 인간 유래 KIRREL3, CNTN4 및 CD351일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 KIRREL3의 아미노산 서열은 NCBI에 개시된 NCBI Reference Sequence: NP_115920.1의 서열이거나 이를 포함할 수 있으며, 상기 CNTN4의 아미노산 서열은 NCBI에 개시된 NP_783200.1의 서열이거나 이를 포함할 수 있으며, 상기 CD351의 아미노산 서열은 NCBI에 개시된 AAL51154.1의 서열이거나 이를 포함할 수 있다. 또한, 상기 KIRREL3, CNTN4 및 CD351의 아미노산 서열은 각각 NCBI Reference Sequence: NP_115920.1, NP_783200.1, AAL51154.1의 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 서열이거나 이를 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, KIRREL3, CNTN4 및 CD351의 특성 또는 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면 모두 포함된다.
상기 KIRREL3의 유전자는 인간 유래 KIRREL3의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이거나 이를 포함하거나, 또는 NCBI에 개시된 NCBI Reference Sequence: NM_032531.4의 핵산 서열이거나 이를 포함할 수 있다. 상기 CNTN4의 유전자는 인간 유래 CNTN4의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이거나 이를 포함하거나, 또는 NCBI에 개시된 NCBI Reference Sequence: NM_175607.3의 핵산 서열이거나 이를 포함할 수 있다. 상기 CD351의 유전자는 인간 유래 CD351의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이거나 이를 포함하거나, 또는 NCBI에 개시된 NCBI Reference Sequence: AY063125.1의 핵산 서열이거나 이를 포함할 수 있다. 또한, 상기 KIRREL3, CNTN4 및 CD351의 핵산 서열은 각각 NCBI에 개시된 NCBI Reference Sequence: NM_032531.4, NM_175607.3, AY063125.1의 핵산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 서열이거나 이를 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, KIRREL3, CNTN4 및 CD351의 특성 또는 기능을 나타내는 아미노산을 생산할 수 있는 핵산 서열이라면 모두 포함된다.
용어 "KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제"는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 발현을 저해하는 물질을 의미한다. "KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제"와 "KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제"는 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 상기 억제제는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351의 활성 또는 발현을 저해하는 물질일 수 있다. 또다른 예로서, 상기 억제제는 KIRREL3 및 CNTN4의 활성 또는 발현을 저해하는 물질이거나, 또는 KIRREL3 및 CD351의 활성 또는 발현을 저해하는 물질이거나, 또는 CNTN4 및 CD351의 활성 또는 발현을 저해하는 물질일 수 있다. 또다른 예로서, 상기 억제제는 KIRREL3의 활성 또는 발현을 저해하는 물질이거나, 또는 CNTN4의 활성 또는 발현을 저해하는 물질이거나, 또는 CD351의 활성 또는 발현을 저해하는 물질일 수 있다. 또다른 예로서, 상기 억제제는 KIRREL3 억제제, CNTN4 억제제 및 CD351 억제제의 조합일 수 있다. 또다른 예로서, 상기 억제제는 KIRREL3 억제제 및 CNTN4 억제제의 조합이거나, 또는 KIRREL3 억제제 및 CD351 억제제의 조합이거나, 또는 CNTN4 억제제 및 CD351 억제제의 조합일 수 있다.
상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제는 바람직하게는 T 세포의 암세포 회피기능을 저해할 수 있다. KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제가 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 활성을 차단함으로써, KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351에 의해 T 세포가 암세포를 공격하지 못하게 되는 작용기전을 억제하고, 또한 T 세포의 암세포에 대한 면역 활성을 유지시킬 수 있다. 또는, KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제는 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 단백질에 특이적으로 결합하여 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351과 T 세포의 결합을 방해하거나, 또는 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 특정 대사 경로를 저해하여 단백질 발현을 감소시키거나 활성을 갖지 못하도록 변성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제는 암 치료 또는 예방에 매우 효과적이다.
상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제는 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 활성 또는 발현을 저해하는 물질이라면, 화합물, 단백질, 융합 단백질, 항체, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산, 추출물, 분획물 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 KIRREL3 억제제, CNTN4 억제제 및 CD351 억제제는 서로 독립적으로 상이하거나 동일한 형태의 물질일 수 있다. 예를 들어, 모든 억제제들이 항체일 수 있다. 또다른 예로서, 2개의 억제제는 항체이고, 나머지 1개의 억제제는 화합물일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 억제제로 처리되지 않은 암세포에 대비하여 암세포 내 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 발현 감소는 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 유전자로부터 생성되는 mRNA 및/또는 단백질의 수준이 감소되거나 제거된 것을 의미할 수 있다. 상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제는 예를 들면, KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 KIRREL3 억제제, CNTN4 억제제 및 CD351 억제제는 서로 독립적으로 상이하거나 동일한 형태의 물질일 수 있다. 예를 들어, 모든 억제제들이 siRNA일 수 있다. 또다른 예로서, 2개의 억제제는 siRNA이고, 나머지 1개의 억제제는 안티센스 핵산일 수 있다.
용어 "안티센스 핵산"은 특정 mRNA의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA, 또는 이들의 단편 또는 유도체를 의미하며, mRNA의 서열에 상보적으로 결합 또는 혼성화하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다.
용어 "siRNA(small interfering RNA)"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통해 RNAi(RNA interference)를 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 갖는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 갖는 안티센스 RNA 가닥을 포함한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있으므로, 유전자 넉다운 방법 또는 유전자치료 방법 등에 사용된다.
용어 "shRNA(short hairpin RNA)"는 단일가닥 RNA로서 수소결합에 의해 이중가닥 부분을 형성하는 줄기(stem) 부분과 고리 형태를 띄는 루프(loop) 부분으로 구분되며, Dicer 등의 단백질에 의해 프로세싱되어 siRNA로 변환되고 siRNA와 동일한 기능을 수행할 수 있다.
용어 "miRNA(micro RNA)"는 표적 RNA의 분해를 촉진시키거나 또는 이들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다.
용어 "리보자임(ribozyme)"은 특정 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.
상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 등은 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 임의의 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 억제제로 처리되지 않은 암세포와 비교하여 암세포 내 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 기능을 불활성화시키거나 활성을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 억제제는 예를 들면 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체, 앱타머 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 KIRREL3 억제제, CNTN4 억제제 및 CD351 억제제는 서로 독립적으로 상이하거나 동일한 형태의 물질일 수 있다.
용어 "특이적"은 세포 내에서 다른 단백질에 영향을 미치지 않고 목적 단백질에만 결합하는 능력을 의미한다.
용어 "항체"는 단일클론 항체, 다클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 포함하며, 신규 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지되거나 시판되는 항체들도 포함된다. 상기 항체는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 전체 길이의 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 여기에는 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 포함될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)"는 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 활성을 유도하는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드이다.
용어 "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 활성 또는 발현을 저해하는 물질은 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351이 T 세포의 기능을 억제하는 것을 저해할 수 있으며, 이에 따라 T 세포가 암세포를 공격할 수 있는 기능을 유지시키거나 촉진시키는 작용을 할 수 있다. 여기서, KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 활성 또는 발현을 저해하는 물질로 처리한 군에서 T 세포의 암세포 공격 능력은 비처리군에 비해 5% 내지 200% 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물이 치료 또는 예방할 수 있는 암에는 예를 들면, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 백혈병, 림프종, 섬유선종 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 유효성분을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 안정화제, 보존제 등을 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 포함할 수 있다. 상기 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 상기 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스, 글리콜 등을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 안정화제는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제 등이 있다. 약학적으로 허용되는 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤, 클로로부탄올 등이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995에 기재되어 있는 것을 참고할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간 등 동물에게 임의의 방법으로, 예를 들어 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 상기 비경구적 투여방법으로는 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하, 직장내 투여 등일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 제제 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
상기 경구 투여용 제제는 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등의 형태로 당업계에 공지된 방법에 의해 본 발명의 조성물을 제형화한 것일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유효성분을 부형제와 배합하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써, 경구 투여를 위한 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 상기 부형제의 예에는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 선택적으로, 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산, 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 비경구 투여용 제제는 주사제, 겔제, 에어로졸, 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 의해 본 발명의 조성물을 제형화한 것일 수 있다.
이들 제형은 문헌 Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour의 기재 내용을 참고할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 개체에게 투여될 수 있으며, 또는 다중 투여량(multiple dose)으로 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적절한 유효 투여량 또는 유효성분의 함량은 투여 경로, 투여 횟수, 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이, 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량을 고려하여, 당해 분야의 통상적인 지식을 가진 자가 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물의 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏당 약 0.01 μg 내지 1,000 mg, 또는 0.1 μg 내지 100 mg일 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 나타내는 한 그 제형, 투여 경로, 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
또한 본 발명의 일 양태는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 개체의 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물을 면역 증강을 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우, 개체 내 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 전체 또는 부분적으로 감소시켜 T-세포 매개성 면역반응의 수준을 증대시킬 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 약학적 조성물은 면역증강 용도로 사용할 수 있다. 예를 들어, 면역결핍, 면역저하 또는 면역계 손상으로 인한 질환의 예방, 치료 또는 개선을 필요로 하는 개체에게 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 일 양태는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 일 양태는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 면역 증강 방법을 제공한다. 이들 방법에 있어서 특별히 달리 언급되지 않는 한, 관련 용어들은 앞서 약학적 조성물에서 설명된 용어들과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해된다.
또한 본 발명의 일 양태는 하기 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 항암제 후보 물질로 암세포를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 암세포 내 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 측정하는 단계.
선택적으로, 상기 항암제 스크리닝 방법은 항암제 후보 물질로 처리하지 않은 군에 비해 항암제 후보 물질로 처리한 군에서 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 감소하거나 또는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상에 의한 T 세포의 활성 억제 수준이 감소하는 경우 상기 항암제 후보 물질을 항암제인 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 수준이 감소한다는 것은 유의적으로 감소하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 수준이 감소하는 것 또는 유의적으로 감소하는 것은 5% 내지 95% (예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%) 감소된 양을 의미하는 것일 수 있다. 상기 항암제 후보 물질로 처리하지 않은 군은 아무런 물질도 첨가되지 않은 암세포이거나, 또는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 활성 또는 발현 억제 물질이 아닌 항암제 등의 다른 물질로 처리된 암세포일 수 있다.
용어 "스크리닝"은 단백질, 융합 단백질, 항체, 펩티드, 항생물질, 효소, 화합물 등의 물질에 대하여 감수성 또는 활성 등의 특정 성질을 갖고 있는 특정 물질을 찾아내는 것을 의미한다.
용어 "항암제 후보 물질"은 통상적인 선정방식에 따라 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 핵산, 단백질, 항체, 화합물, 추출물 또는 천연물 등일 수 있다. 상기 항암제 후보 물질은 바람직하게는 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 발현 및/또는 활성을 저해하는 물질일 수 있다.
상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 발현 또는 활성의 측정은 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하거나 또는 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351에 의한 T 세포의 활성 억제 정도를 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다.
상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 방법은 당해 기술분야에서 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던블롯, DNA칩, RNA칩 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 당해 기술분야에서 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면 웨스턴블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351에 의한 T 세포의 활성 억제 정도를 측정하는 방법은 당해 기술분야에서 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면 RT-PCR, 웨스턴블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, FACS 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 스크리닝 방법에서 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 활성 억제 확인은 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351 단백질과 후보물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.
상기 항암제 스크리닝 방법은, 인 비트로 또는 인 비보에서 모두 가능하다. 인 비보의 경우, 상기 항암제 후보 물질로 암세포를 처리하는 단계는 항암제 후보 물질을 암세포를 갖는 개체 또는 암 질환을 갖고 있는 개체에게 투여함으로써 수행될 수 있다. 상기 개체는 예를 들면 인간, 마우스 등과 같은 동물일 수 있다.
상기 항암제 스크리닝 방법은 KIRREL3, CNTN4 및/또는 CD351의 활성 또는 발현을 억제하면 암세포의 T 세포 회피 기능을 저해할 수 있다는 본 발명에서 신규로 밝혀낸 점에 기반한다. 본 발명의 스크리닝 방법에 따르면 신규 항암제를 저렴하고 간단한 방법으로 용이하게 개발할 수 있으므로 매우 유리하다.
또한 본 발명의 일 양태는 개체에서 분리한 세포 또는 조직에서 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는 암 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 발현 또는 활성 및 이의 측정과 관련된 용어는 특별한 언급이 없는 한 상기 조성물 및 상기 스크리닝 방법에서 설명한 바와 동일하다.
용어 "예후"는 질병의 진행, 질병의 차도, 질병의 재발, 전이 및 죽음 가능성 측면에서의 예측을 가리킨다. 예를 들어, 본 발명에서의 예후는 암 환자의 질병이 완치되거나 환자의 상태가 개선될 가능성을 의미한다.
상기 개체에서 분리한 세포 또는 조직은 암세포이거나 또는 암이 발생하거나 암세포가 존재하는 조직일 수 있다.
상기 암 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법은 암세포의 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 활성 또는 발현 수준이 낮을수록 T 세포의 활성이 높아져 이로 인해 암 치료 효과가 높아질 수 있다는 점에 기반한다.
본 명세서에서 "A, B 및/또는 C"는 A, 또는 B, 또는 C, 또는 A 및 B, 또는 A 및 C, 또는 B 및 C, 또는 A, B 및 C를 의미하는 것으로서 사용된다.
본 발명은 암 치료를 위한 새로운 타겟으로 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상이 이용될 수 있음을 최초로 밝혀낸 것에 기초한다.
본 발명에 따르면, KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제를 사용하여 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 억제제를 사용하여 개체의 면역을 증강시킬 수 있다. 또한, KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 하나 이상의 활성 또는 발현 측정을 통해 새로운 항암제 후보물질을 효과적으로 선별할 수 있으며, 암 예후 진단 및 예측에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 KIRREL3에 의해 저해되는 CD4+ T 세포의 증식율(%)을 나타낸다.
도 2는 KIRREL3에 의해 저해되는 CD8+ T 세포의 증식율(%)을 나타낸다.
도 3은 CNTN4에 의해 저해되는 CD4+ T 세포의 증식율(%)을 나타낸다.
도 4는 CNTN4에 의해 저해되는 CD8+ T 세포의 증식율(%)을 나타낸다.
도 5은 CD351에 의해 저해되는 CD4+ T 세포의 증식율(%)을 나타낸다.
도 6는 CD351에 의해 저해되는 CD8+ T 세포의 증식율(%)을 나타낸다.
도 7a 내지 7d는 폐암세포주 A549와 PBMC를 KIRREL3 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 8a 내지 8d는 결장암세포주 HCT-116과 PBMC를 KIRREL3 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 9a 내지 9d는 유방암세포주 MDA-MB-231과 PBMC를 KIRREL3 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 10a 내지 10d는 위암세포주 MKN-74와 PBMC를 KIRREL3 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 11a 내지 11d는 백혈병세포주 U937과 PBMC를 KIRREL3 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 12a 내지 12d는 폐암세포주 A549와 PBMC를 CNTN4 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 13a 내지 13d는 결장암세포주 HCT-116과 PBMC를 CNTN4 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 14a 내지 14d는 유방암세포주 MDA-MB-231과 PBMC를 CNTN4 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 15a 내지 15d는 위암세포주 MKN-74와 PBMC를 CNTN4 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 16a 내지 16d는 백혈병세포주 U937과 PBMC를 CNTN4 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 17a 내지 17d는 폐암세포주 A549와 PBMC를 CD351 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 18a 내지 18d는 결장암세포주 HCT-116과 PBMC를 CD351 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 19a 내지 19d는 유방암세포주 MDA-MB-231과 PBMC를 CD351 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 20a 내지 20d는 위암세포주 MKN-74와 PBMC를 CD351 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 21a 내지 21d는 백혈병세포주 U937과 PBMC를 CD351 억제제로 처리하였을 때 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 22는 KIRREL3 억제제로 처리한 마우스에서 종양 크기의 변화를 나타낸 것이다.
도 23는 CNTN4 억제제로 처리한 마우스에서 종양 크기의 변화를 나타낸 것이다.
도 24a 내지 24c는 CD351 억제제로 처리한 마우스에서 종양 크기의 변화를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. T 세포의 증식 및 활성 억제능
본 실시예에서는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351이 T 세포의 증식 및 활성을 저해하여 암세포로 하여금 T-세포 매개 면역시스템을 회피하도록 하는지 여부를 확인하고자 하였다.
1.1. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 준비
인간 혈액을 EDTA(또는 헤파린)로 코팅된 10mL 튜브에 넣고 1:1의 비율로 PBS와 혼합하였다. 그리고 나서 50mL 튜브에 Ficoll-Paque PLUS를 넣고, 상기 혈액 시료를 첨가하였다. 원심분리한 후, 인간 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 수거하였다. 수거된 결과물을 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 이어서, RBC lysis (1x)을 첨가하고, 피펫팅한 후 아이스에서 3분 동안 보관하였다. 이어서, 10% FBS RPMI1640 50ml를 첨가하고, 혼합물을 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그리고나서, FACS 버퍼를 첨가하고 상층액을 원심분리에 의해 제거하였다. 그 후, 50ml의 MACS 버퍼(0.5% BSA 및 2mM EDTA 포함 PBS)를 첨가하고, 세포 수를 카운팅하고, 원심분리에 의해 상층액을 제거하였다.
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 1x107 세포 수 기준 40μl MACS 버퍼를 이용하여 재현탁시키고, 튜브에 항 CD4 및 항 CD8 바이오틴 항체를 각각 10μl 넣은 후 5분 동안 냉장고에 보관하였다. 그 후, 1x107 세포 수 기준 MACS 버퍼 30μl를 상기 생성물에 첨가하고, 항-바이오틴 마이크로비드 20μl를 첨가하여 혼합하였다. 이어서, LS 컬럼을 이용하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 분리하고 세포 수를 카운팅하였다.
이와 같이 준비된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 2x106 세포 수 기준 CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester) 1μl와 혼합하고, 37℃에서 3분 동안 보관하였다. 그리고 나서 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 각각 함유하고 있는 튜브에 FBS를 첨가하고, 10분 동안 아이스에서 보관하였다. 그 후, 원심분리에 의해 상층액을 제거하였다. 생성물에 FACS 버퍼 30ml를 첨가한 후 피펫팅하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그리고 나서 10% FBS RPMI1640을 첨가한 후 피펫팅하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그 후, 생성물을 10% FBS RPMI1640 10ml와 혼합한 후, 세포 수를 카운팅하였다.
1.2. T 세포의 활성 측정
1.2.1. KIRREL3에 의한 T 세포의 활성 저해 측정
재조합 인간 IgG1 Fc protein (Cat. No. 110-HG) 및 재조합 인간 PD-L1/B7-H1 Fc chimera protein (Cat. No. 156-B7)을 R&D systems에서 구입하였다. 또한, 재조합 인간 KIRREL3 His Tag protein (Cat. No. 4910-K3)을 R&D systems에서 구입하였다.
이들 protein 각각 7.5μg/ml 또는 10μg/ml를 PBS 중 anti-CD3 항체 (BioLegend, Cat. No. 317325) 2.5μg/ml와 혼합하였다. 생성된 혼합물로 96-웰 플레이트를 4℃에서 코팅하고 PBS로 3회 세척하였다.
앞서 실시예 1.1에서 준비한 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 96-웰 플레이트의 웰마다 200μl씩 2x106개 첨가하고 인큐베이션하였다.
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 anti-CD3 항체에 의해 72시간 동안 활성화시켰다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식은 CFSE 염색의 정도에 의해 확인할 수 있으며, 이는 FACSDiVa 소프트웨어 (BD Biosciences)를 이용하여 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다.
1.2.2. CNTN4에 의한 T 세포의 활성 저해 측정
재조합 인간 IgG1 Fc protein (Cat. No. 110-HG) 및 재조합 인간 PD-L1/B7-H1 Fc chimera protein (Cat. No. 156-B7)을 R&D systems에서 구입하였다. 또한, 재조합 인간 CNTN4 His Tag protein (Cat: 2205-CN)을 R&D systems에서 구입하였다.
이들 protein 각각 7.5μg/ml 또는 10μg/ml를 PBS 중 anti-CD3 항체 (BioLegend, Cat. No. 317325) 2.5μg/ml와 혼합하였다. 생성된 혼합물로 96-웰 플레이트를 4℃에서 코팅하고 PBS로 3회 세척하였다.
앞서 실시예 1.1에서 준비한 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 96-웰 플레이트의 웰마다 200μl씩 2x106개 첨가하고 인큐베이션하였다.
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 anti-CD3 항체에 의해 72시간 동안 활성화시켰다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식은 CFSE 염색의 정도에 의해 확인할 수 있으며, 이는 FACSDiVa 소프트웨어 (BD Biosciences)를 이용하여 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다.
1.2.3. CD351에 의한 T 세포의 활성 저해 측정
재조합 인간 IgG1 Fc protein (Cat. No. 110-HG) 및 재조합 인간 PD-L1/B7-H1 Fc chimera protein (Cat. No. 156-B7)을 R&D systems에서 구입하였다. 또한, 재조합 인간 CD351 His Tag protein (Cat.No. 9278-FC)을 R&D systems에서 구입하였다.
이들 protein 각각 10μg/ml를 PBS 중 anti-CD3 항체 (BioLegend, Cat. No. 317325) 1.0μg/ml, 2.0μg/ml, 4.0μg/ml, 또는 6.0μg/ml와 혼합하였다. 생성된 혼합물로 96-웰 플레이트를 4℃에서 코팅하고 PBS로 3회 세척하였다.
앞서 실시예 1.1에서 준비한 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 96-웰 플레이트의 웰마다 200μl씩 2x106개 첨가하고 인큐베이션하였다.
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 anti-CD3 항체에 의해 72시간 동안 활성화시켰다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식은 CFSE 염색의 정도에 의해 확인할 수 있으며, 이는 FACSDiVa 소프트웨어 (BD Biosciences)를 이용하여 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다.
1.3. 결과
1.3.1. KIRREL3에 의한 T 세포의 활성 저해
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식율(%)을 각각 도 1 및 2에 나타내었다.
PD-L1로 처리한 대조군은 IgG1로 처리한 대조군에 비해 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식이 모두 억제되었다. PD-L1은 T 세포 표면에 있는 단백질 PD-1과 결합하고, T 세포의 증식을 억제한다. 이에 따라, T 세포가 암세포를 공격하고 살상하는 기능을 저하시키는 결과를 가져온다.
KIRREL3으로 처리한 군은 IgG1로 처리한 대조군에 대비하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식이 현저하게 억제되었으며, PD-L1로 처리한 대조군에 대비하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식 억제 수준이 유사하였다.
이는 KIRREL3을 블로킹하거나 넉다운시킴으로써 중화시킨다면 KIRREL3의 T 세포 증식 억제능을 저하시킬 수 있다는 것을 의미한다. 그 결과, 효율적인 암 치료가 가능해진다.
1.3.2. CNTN4에 의한 T 세포의 활성 저해
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식율(%)을 각각 도 3 및 4에 나타내었다.
PD-L1로 처리한 대조군은 IgG1로 처리한 대조군에 비해 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식이 모두 억제되었다.
CNTN4로 처리한 군은 IgG1로 처리한 대조군에 대비하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식이 현저하게 억제되었으며, PD-L1로 처리한 대조군에 대비하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식 억제 수준이 유사하였다.
이는 CNTN4를 블로킹하거나 넉다운시킴으로써 중화시킨다면 CNTN4의 T 세포 증식 억제능을 저하시킬 수 있다는 것을 의미한다. 그 결과, 효율적인 암 치료가 가능해진다.
1.3.3. CD351에 의한 T 세포의 활성 저해
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식율(%)을 각각 도 5 및 6에 나타내었다.
PD-L1로 처리한 대조군은 IgG1로 처리한 대조군에 비해 CD4+ T 세포의 증식이 유의적으로 억제된 반면, CD8+ T 세포의 증식에 대해서는 IgG1로 처리한 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
CD351로 처리한 군은 IgG1로 처리한 대조군 및 PD-L1로 처리한 대조군 모두에 대비하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식이 현저하게 억제되었다.
이는 CD351을 블로킹하거나 넉다운시킴으로써 중화시킨다면 CD351의 T 세포 증식 억제능을 저하시킬 수 있게 된다. 그 결과, 효율적인 암 치료가 가능해진다.
실시예 2. PBMC 세포독성 어세이
본 실시예에서는 KIRREL3, CNTN4 또는 CD351을 KIRREL3, CNTN4 또는 CD351 억제제를 이용하여 중화시켰을 때 PBMC의 암세포에 대한 세포독성, 즉 살상능을 증가시킬 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.
2.1. PBMC 준비
인간 혈액을 EDTA(또는 헤파린)로 코팅된 10mL 튜브에 넣고 1:1의 비율로 PBS와 혼합하였다. 그리고 나서 50mL 튜브에 Ficoll-Paque PLUS를 넣고, 상기 혈액 시료를 첨가하였다. 원심분리한 후, 인간 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 수거하였다. 수거된 결과물을 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 이어서, RBC lysis (1x)을 첨가하고, 피펫팅한 후 아이스에서 3분 동안 보관하였다. 이어서, 10% FBS RPMI1640 50ml를 첨가하고, 혼합물을 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그리고나서, FACS 버퍼를 첨가하고 상층액을 원심분리에 의해 제거하였다. 그 후, 50ml의 MACS 버퍼(0.5% BSA 및 2mM EDTA 포함 PBS)를 첨가하고, 세포 수를 카운팅하고, 원심분리에 의해 상층액을 제거하였다.
96-웰 플레이트를 4℃에서 PBS 중 anti-CD3 항체(BioLegend, Cat. No. 317325) 1.0 μg/ml으로 코팅하였다. 96-웰 플레이트의 웰은 PBMC를 첨가하기 전에 PBS로 3회 세척하였다. 앞서 수득한 PBMC를 10% FBS RPMI1640과 혼합하고, 96-웰 플레이트의 각 웰마다 6x105 개를 100μl씩 첨가하였다. PBMC는 72시간 동안 anti-CD3 항체에 의해 활성화시켰다.
2.2. 암세포 준비
폐암세포주 A549, 결장암세포주 HCT-116, 유방암세포주 MDA-MB-231, 위암세포주 MKN-74, 및 백혈병세포주 U937을 각각 1μl의 CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)와 혼합하고, 37℃에서 3분 동안 보관하였다. 그 후, 각각의 세포주를 함유한 튜브에 FBS를 첨가하고, 10분 동안 ice에서 보관하였다. 이어서, 상층액을 원심분리에 의해 제거하였다. 이에 따라 수득된 생성물에 FACS 버퍼 30ml를 첨가한 후 피펫팅하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그리고 나서 10% FBS RPMI1640을 첨가한 후 피펫팅하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이에 따라 수득된 생성물을 10% FBS RPMI1640 10ml와 혼합한 후, 세포 수를 카운팅하였다.
상기 암세포를 앞서 실시예 2.1에서 준비한 96-웰 플레이트의 PBMC 함유 웰마다 100μl씩 3x104개 첨가하고 인큐베이션하였다.
2.3. 암세포주에 대한 PBMC의 세포독성 측정
앞서 실시예 2.2에서 PBMC 및 암세포주의 혼합물이 준비되었다. 이들 혼합물을 10μg/mL의 anti-human KIRREL3 항체, anti-human CNTN4 항체 또는 anti-human CD351 항체, 또는 50nM의 KIRREL3 siRNA, CNTN4 siRNA 또는 CD351 siRNA와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다.
KIRREL3을 블로킹하기 위해 4종의 중화 항체를 사용한 실험군과 무처리 대조군은 하기 표 1에 나타내었으며, KIRREL3을 넉다운하기 위해 3종의 siRNA를 사용한 실험군과 무처리 대조군은 하기 표 2에 나타내었다.
human KIRREL3 중화 항체
대조군 무처리
실험군 1 anti-human KIRREL3 항체 (R&D사, AF4910)
실험군 2 anti-human KIRREL3 항체 (Bioss사, bs-11864R)
실험군 3 anti-human KIRREL3 항체 (genetex사, GTX32140)
실험군 4 anti-human KIRREL3 항체 (LSbio사, LS-C336219)
human KIRREL3 siRNA
대조군 무처리
실험군 5 Sense (5’-CUCUCAAGUUACCCACAGUtt-3’) (서열번호 1)
Antisense (5’-ACUGUGGGUAACUUGAGAGtt-3’) (서열번호 2)
실험군 6 Sense (5’-GGAGAGGUGUACAGGACCAtt-3’) (서열번호 3)
Antisense (5’-UGGUCCUGUACACCUCUCCtt-3’) (서열번호 4)
실험군 7 Sense (5’-UCUCAAGUUACCCACAGUAtt-3’) (서열번호 5)
Antisense (5’-UACUGUGGGUAACUUGAGAtt-3’) (서열번호 6)
CNTN4를 블로킹하기 위해 5종의 중화 항체를 사용한 실험군과 무처리 대조군은 하기 표 3에 나타내었으며, CNTN4를 넉다운하기 위해 3종의 siRNA를 사용한 실험군과 무처리 대조군은 하기 표 4에 나타내었다.
human CNTN4 중화 항체
대조군 무처리
실험군 1 anti-human CNTN4 항체 (R&D사, MAB2205)
실험군 2 anti-human CNTN4 항체 (abcam사, ab137107)
실험군 3 anti-human CNTN4 항체 (abcam사, ab131285)
실험군 4 anti-human CNTN4 항체 (LSbio사, LS-C119876)
실험군 5 anti-human CNTN4 항체 (Abnova사, PAB27653)
human CNTN4 siRNA
대조군 무처리
실험군 6 Sense (5’-CAGUAUCUUUGCCAGAAGUtt-3’) (서열번호 7)
Antisense (5’-ACUUCUGGCAAAGAUACUGtt-3’) (서열번호 8)
실험군 7 Sense (5’-GAUAAUGAGUCGGAAGUAAtt-3’) (서열번호 9)
Antisense (5’-UUACUUCCGACUCAUUAUCtt-3’) (서열번호 10)
실험군 8 Sense (5’-GUGACAAUAGACGAAAUCAtt-3’) (서열번호 11)
Antisense (5’-UGAUUUCGUCUAUUGUCACtt-3’) (서열번호 12)
CD351을 블로킹하기 위해 3종의 중화 항체를 사용한 실험군과 무처리 대조군은 하기 표 5에 나타내었으며, CD351을 넉다운하기 위해 3종의 siRNA를 사용한 실험군과 무처리 대조군은 하기 표 6에 나타내었다.
human CD351 중화 항체
대조군 무처리
실험군 1 anti-human CD351 항체 (Biolegend사, 13730)
실험군 2 anti-human CD351 항체 (Creative diagnostics사, CABT-BL4657)
실험군 3 anti-human CD351 항체 (Biobyt사, orb183662)
human CD351 siRNA
대조군 무처리
실험군 4 Sense (5’-GAGAGAUGAACUGCUCAGUtt-3’) (서열번호 13)
Antisense (5’-ACUGAGCAGUUCAUCUCUCtt-3’) (서열번호 14)
실험군 5 Sense (5’-GAGAACUUCCAACUCAGUAtt-3’) (서열번호 15)
Antisense (5’-UACUGAGUUGGAAGUUCUCtt-3’) (서열번호 16)
실험군 6 Sense (5’-AGAGAACUUCCAACUCAGUtt-3’) (서열번호 17)
Antisense (5’-ACUGAGUUGGAAGUUCUCUtt-3’) (서열번호 18)
PBMC 및 세포주의 혼합물과 항체 또는 siRNA를 함께 인큐베이션하고, 24시간 후에 용균된 세포를 확인하기 위하여 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD; BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)로 세포를 염색하였다. FACSDiVa 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 FL-1(CFSE) 및 FL-3(7-AAD)에 대한 염색을 측정함으로써 암세포주에 대한 PBMC의 세포용해능을 확인하였다.
2.4. 결과
폐암세포주 A549에 대해 KIRREL3 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때의 실험결과를 도 7a 내지 7d에 나타내고, CNTN4 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때의 결과를 도 12a 내지 12d에 나타내고, CD351 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때의 결과를 도 17a 내지 17d에 나타내었다.
폐암세포주 A549와 PBMC를 KIRREL3 중화 항체, CNTN4 중화 항체 또는 CD351 중화 항체로 처리하였을 때, 항체의 종류에 따라 정도의 차이는 있으나 무처리 대조군에 비해 폐암세포 살상능이 유의적으로 증가되었음을 확인할 수 있다. 또한, 폐암세포주를 KIRREL3 siRNA, CNTN4 siRNA 또는 CD351 siRNA로 처리한 경우에도 폐암세포 살상능이 유의적으로 증가되었음이 확인되었다.
KIRREL3 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때, 결장암세포주 HCT-116에 대한 실험결과를 도 8a 내지 8d에 나타내고, 유방암세포주 MDA-MB-231에 대한 실험결과를 도 9a 내지 9d에 나타내고, 위암세포주 MKN-74에 대한 실험결과를 도 10a 내지 10d에 나타내고, 백혈병세포주 U937에 대한 실험결과를 도 11a 내지 11d에 나타내었다.
또한, CNTN4 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때, 결장암세포주 HCT-116에 대한 실험결과를 도 13a 내지 13d에 나타내고, 유방암세포주 MDA-MB-231에 대한 실험결과를 도 14a 내지 14d에 나타내고, 위암세포주 MKN-74에 대한 실험결과를 도 15a 내지 15d에 나타내고, 백혈병세포주 U937에 대한 실험결과를 도 16a 내지 16d에 나타내었다.
또한, CD351 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때, 결장암세포주 HCT-116에 대한 실험결과를 도 18a 내지 18d에 나타내고, 유방암세포주 MDA-MB-231에 대한 실험결과를 도 19a 내지 19d에 나타내고, 위암세포주 MKN-74에 대한 실험결과를 도 20a 내지 20d에 나타내고, 백혈병세포주 U937에 대한 실험결과를 도 21a 내지 21d에 나타내었다.
항체 또는 siRNA를 이용하여 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 어느 하나를 중화시켰을 때 PBMC의 살상능이 증가되는 결과는 도 8a 내지 11d, 도 13a 내지 16d 및 18a 내지 21d에서 볼 수 있듯이 결장암, 유방암, 위암, 백혈병에서도 마찬가지로 확인되었다.
실시예 3. 종양 마우스 모델 실험
본 실시예에서는 KIRREL3, CNTN4 또는 CD351을 KIRREL3, CNTN4 또는 CD351 억제제를 이용하여 중화시켰을 때 마우스 종양의 성장이 억제되는지 여부를 인비보에서 확인하고자 하였다.
3.1. 종양 마우스 모델 구축
C57BL6 결장 선암종 세포에서 유래된 MC38 세포주를 50μl PBS 중에 2.0x105 세포수 농도로 재현탁시키고, 6주령 암컷 C57BL6 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다.
하기 표 7에 KIRREL3을 넉다운하기 위해 siRNA를 사용한 실험군과 무처리 대조군을 나타내었다.
mouse KIRREL3 siRNA
대조군 무처리
실험군 8 Sense (5’-GUAAAGGAGAGGUCAUCAA-3’) (서열번호 19)
Antisense (5’-UUGAUGACCUCUCCUUUAC-3’) (서열번호 20)
하기 표 8에 CNTN4를 넉다운하기 위해 siRNA를 사용한 실험군과 무처리 대조군을 나타내었다.
mouse CNTN4 siRNA
대조군 무처리
실험군 9 Sense (5’-GUGUAGACAAACUCUCUGU-3’) (서열번호 21)
Antisense (5’-ACAGAGAGUUUGUCUACAC-3’) (서열번호 22)
하기 표 9에 CD351을 넉다운하기 위해 3종의 siRNA를 사용한 실험군과 무처리 대조군을 나타내었다.
mouse CD351 siRNA
대조군 무처리
실험군 7 Sense (5’-GUCCAUCCAACACCACCUA-3’) (서열번호 23)
Antisense (5’-UAGGUGGUGUUGGAUGGAC-3’) (서열번호 24)
실험군 8 Sense (5’-CUGAUGAGGGAAAGAACUU-3’) (서열번호 25)
Antisense (5’-AAGUUCUUUCCCUCAUCAG-3’) (서열번호 26)
실험군 9 Sense (5’-CAGCUAAGCCCAGUGAACA-3’) (서열번호 27)
Antisense (5’-UGUUCACUGGGCUUAGCUG-3’) (서열번호 28)
모든 실험군은 MC38 세포주를 주사한지 11일째 되는 날부터 마우스 KIRREL3, CNTN4 또는 CD351을 타겟하는 siRNA를 5일 간격으로 총 3회 마우스의 종양에 주사하였다. 구체적으로, siRNA 10 μg을 PBS 중 올리고펙타민(Invitrogen사) 7.5 μl 와 제조사 지시에 따라 혼합한 후, 마우스에 유도한 종양 조직에 직접 0.5 mg/kg의 투여량으로 주사하였다.
3.2. 결과
무처리 대조군과 KIRREL3이 넉다운된 실험군 8에서 마우스의 종양 크기를 측정한 결과를 도 22에 나타내고, CNTN4가 넉다운된 실험군 9에서 마우스의 종양 크기를 측정한 결과를 도 23에 나타내고, CD351이 넉다운된 실험군 7 내지 9에서 마우스의 종양 크기를 측정한 결과를 도 24a 내지 24c에 나타내었다.
무처리 대조군은 마우스에서 종양이 생성된 이후 지속적으로 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 어느 하나가 넉다운된 마우스의 종양은 무처리 대조군에 비해 그 성장속도가 현저하게 억제됨을 알 수 있다. 이는 KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 어느 하나 이상을 블로킹 또는 넉다운시켜 그 활성 또는 발현을 억제할 경우 암의 발달이 지연 또는 중지되고 암의 발생이 억제된다는 것을 보여주는 것이다. 따라서, KIRREL3, CNTN4 및 CD351 중 어느 하나 이상의 억제제는 암을 예방하기 위하여 유용하게 사용될 수 있다.
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Claims (13)

  1. KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물로서,
    상기 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 억제제는 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA 또는 리보자임; 또는 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 림프종, 또는 섬유선종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 억제제는 암세포의 T 세포 회피 기능을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 개체 내 T-세포 매개성 면역반응의 수준 증대에 의한 면역증강에 의해 암을 치료 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 하기를 포함하는 항암제 스크리닝 방법:
    a) 항암제 후보 물질과 암세포를 접촉시키는 단계; 및
    b) 암세포 내 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 측정하는 단계.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 발현 또는 활성 측정은 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 또는 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상에 의한 T 세포 활성 억제 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 항암제 후보 물질이 처리되지 않은 대조군에 비해 항암제 후보 물질이 처리된 군에서 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 유의적으로 감소하거나 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 T 세포 활성 억제 수준이 유의적으로 감소하는 경우 상기 항암제 후보 물질을 항암제라고 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  8. 개체에서 분리한 세포 또는 조직에서 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 암 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 발현 또는 활성 측정은 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 또는 KIRREL3 및 CD351 중 하나 이상에 의한 T 세포 활성 억제 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 암 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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