CN112891544A - H基因或其表达产物在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药能力的药物中的应用 - Google Patents

H基因或其表达产物在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药能力的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了H基因或其表达产物在制备抑制肝癌细胞和肝癌干细胞耐药能力的药物中的应用。本发明的研究证明H基因或其表达产物是肝癌干细胞的标志物，H表达阳性的肝癌细胞具有侵袭能力强、自我更新能力强、耐药性强的干细胞特性。H基因敲降、使用抑制H基因表达的小分子抑制剂以及抑制H基因功能的功能性抗体可抑制H表达阳性的肝癌细胞的侵袭能力、自我更新能力以及耐药能力。根据以上研究成果，本发明提供了H表达阳性的肝癌干细胞的广泛应用。

Description

H基因或其表达产物在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药 能力的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及H基因或其表达产物在制备抑制肝癌细胞 或肝癌干细胞耐药能力的药物中的应用。
背景技术
原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是恶性程度极高、预后极差的恶性肿瘤。目前肝癌在国内肿瘤发病率排名第三，肝癌防控形势十分严峻。肝 癌在诊断、治疗的预后等各方面的进展十分有限，其主要原因是对这些肿瘤发生 发展的确切分子机制所知有限，难以设计针对性的方案。
肝癌临床疗效不佳，常表现出肝癌细胞的多药耐药性。近10年多仅有两种 获FDA批准治疗晚期肝癌的疗法，即为索拉菲尼和regorafenib(瑞戈非尼)药物。 这两种均为多激酶抑制剂，主要是抑制肿瘤发生发展中VEGFR1-3、KIT、RET、 PDGFR及FGFR等多种重要激酶的活性，但这些药物对于晚期肝癌的改善并不 十分明显，缓解率不超过11％。另外，肝癌常常对标准化疗和放疗方案均不敏感。 多柔比星常规用作为晚期HCC单一治疗药物，表现出无效的应答率，约15-20％。 肝癌对一般化疗药物如5FU或顺铂的应答率表现更低。肝癌复发或转移在患者 中相当普遍。
肝癌耐药或复发的重要因素之一是其肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞不断增 殖分化，成为肿瘤细胞疯狂生长的源泉；同时，肿瘤干细胞具有干细胞的转移性， 使肿瘤在机体内蔓延；还有，并具有对化疗药物及靶向药物治疗均不敏感性，易 逃避凋亡而生存着。另外，近年来，人们的研究热点慢慢从肝癌细胞转移到肝癌 干细胞，但已取的研究成果仍远远不够用来解释肝癌干细胞的生活特性，对肝癌 干细胞的认识仍然不足。大部分研究主要针对特定信号通路在肝癌干细胞的耐药 性、增殖性、侵袭性和转移性能力的作用。在过去十年的研究，影响肝癌的耐药 性的细胞信号通路有STAT3(Signal transducer andactivator oftranscription 3)信号 通路、NOTCH信号通路、Hedgehog信号通路、TGF-β信号通路(Transforming growth factor-beta)等，这些信号通路与肝癌细胞的自我更新，分化和存活有着密 切关系。从而，阻断肝癌细胞的多药耐药性，寻找出逆转肝癌细胞化疗耐药性的 对策，将有助于为肝癌靶向治疗药物研发提供思路和解决方法。
发明内容
本发明的研究证明H基因或其表达产物是肝癌干细胞的标志物，H表达阳 性的肝癌细胞具有侵袭能力强、自我更新能力强、耐药性强的干细胞特性。H基 因敲降、使用抑制H基因表达的小分子抑制剂以及抑制H基因功能的功能性抗 体可抑制H表达阳性的肝癌细胞的侵袭能力、自我更新能力以及耐药能力。根 据以上研究成果，本发明提供了H表达阳性的肿瘤干细胞的广泛应用。
本发明提供了H基因或其表达产物的应用，所述应用包括以下任一项：
1)在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞侵袭的药物中的应用；
2)在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞自我更新能力的药物中的应用；
3)在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药能力的药物中的应用；
4)在筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞侵袭的药物中的应用；
5)在筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞自我更新能力的药物中的应用；
6)在筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药能力的药物中的应用。
进一步，肝癌细胞或肝癌干细胞耐药能力包括对化疗药物的耐药能力。
化疗药物包括但不限于阿霉素、顺铂、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶啶、 多西他赛、伊立替康。在本发明的具体实施方案中，化疗药物是顺铂。
进一步，所述药物包括抑制H基因或其表达产物的试剂。
更进一步，所述试剂包括抑制H基因或其表达产物的表达或活性的试剂。
更进一步，抑制H基因或其表达产物的表达的试剂包括dsRNA、小分子抑 制剂、多肽抑制剂、反义RNA、反义寡核苷酸、抗体、抗体片段、结合蛋白、 DNA的载体显性负和干扰素、核酶、适体。
更进一步，抑制H基因或其表达产物的活性的试剂包括特异性结合H蛋白 的抗体。
本发明的抑制H基因或其表达产物的试剂可以通过本领域任何已知的方式 配制成药物来使用。这种药物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、 稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。 本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、 玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、 水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保 湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中， 这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性 或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制 剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本 发明的抑制H基因或其表达产物的试剂可以单独给药，或以各种组合给药，以 及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的药物根据需要可选择本领域技 术人员已知的任何适当的方式把抑制H基因或其表达产物的试剂进行给药。使 用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有 效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人 健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、 口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂 或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内， 动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜， 局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内， 尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地 给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的效果即可，可以依据症状、 性别、年龄等来恰当的确定。
本发明还提供了一种利用H基因表达阳性的肝癌干细胞的方法，所述方法 包括以下任一项：
1)筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞侵袭的药物；
2)筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞自我更新的药物；
3)筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药的药物。
具体的方法包括步骤：
(a)在测试组中，向肝癌细胞或肝癌干细胞培养物中添加待筛选的候选物， 并检测肝癌细胞或肝癌干细胞的侵袭、自我更新、耐药情况；
(b)将步骤(a)测试组中肝癌细胞或肝癌干细胞的侵袭情况与未添加候选物 的对照组中肝癌细胞或肝癌干细胞的侵袭、自我更新、耐药情况进行比较，如果 测试组中的肝癌细胞或肝癌干细胞的侵袭、自我更新、耐药能力在统计学上低于 对照组，就表明该候选物是抑制肝癌细胞或肝癌干细胞侵袭、自我更新、耐药的 药物。
进一步，肝癌细胞或肝癌干细胞耐药包括对化疗药物耐药。
化疗药物包括但不限于阿霉素、顺铂、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶啶、 多西他赛、伊立替康。在本发明的具体实施方案中，化疗药物是顺铂。
在本文使用的术语“基因”指编码功能蛋白质、多肽或者肽的单元。如本领 域的技术人员所理解的，这一功能性的术语包括两个基因组序列、cDNA序列或 者其片段或组合，以及基因的产物，包括可以经人工改变的那些。经纯化的基因、 核酸、蛋白质等等用于指从至少一种通常与其相关的污染核酸或者蛋白质中鉴定 并分离出来的这些实体。术语“等位基因”或者“等位基因形式”指编码同样的 功能性蛋白的基因的可选择的形式，但是含有与同一基因的其他形式相关的核苷 酸序列上的差异。
“dsRNA”指含有双链RNA结构，通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达 的RNA，包括siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)。dsRNA不需要与靶 基因序列具有100％的同源性，只要它可抑制靶基因表达即可。为了稳定化或其 它目的，可以将dsRNA的一部分用DNA替代。优选的是，siRNA是21-23个碱 基的双链RNA。shRNA是具有发夹转角(hairpin turn)结构的短链RNA。
siRNAs或shRNAs的设计已建有标准(见如Elbashir et al.，Nature，411:494-8(2001)；Amarzguioui et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,316(4)： 1050-8(2004)；Reynolds et al·，Nat.Biotech·，22(3):326-30(2004)；Brummelkamp et al.，Science，296:550-553(2002))。使用合适的程序将siRNA或shRNA和基因 数据库如基因库(GenBank)或Ensembl中的核苷酸序列比对，检测任何候选 siRNA或shRNA的序列与其它核苷酸序列交叉反应的可能性。通常会生成并筛 选许多siRNAs或shRNAs从而比较他们的效力。
本发明的siRNA或shRNA可以通过任何方法生成，其中包括但不限于体外 转录，在宿主细胞中重组生产或化学合成。如siRNA或shRNA是通过使用重组 酶如T7RNA聚合酶体外转录DNA寡聚核苷酸模板生成的；如siRNA或shRNA 在培养细胞中重组制备，细胞可以是原核的或是真核的。制备siRNA或shRNA 的方法是本领域普通技术人员熟知的(见例如Elbashir et al·，Nature， 411:494-8(2001)；Brummelkamp et al.,Science,296:550-553(2002)；and Lee et al.,Nat.Biotech.,20:500-5(2002))。
在此使用的"适体"指非天然生成的，对目标具有理想作用的核苷酸。理想的 作用包括但不限于与目标连接，解除反应的改变目标，与目标以修饰/改变目标 或目标功能活性的方式反应，如在自杀性抑制剂中那样共价连接目标，和促进目 标和另一个分子的反应。
"反义寡核苷酸"指带有与特定核苷酸序列互补序列的低聚核苷酸并且能够 与目标序列杂交。本发明的反义寡核苷酸可以包括DNA，RNA或其混合物。反 义寡核苷酸的序列可以与目标序列100％互补或者接近互补(如75％或更多，85％ 或更多，95％或更多)。本发明的反义寡核苷酸可以通过核酸内切酶的作用阻碍 或抑制目标mRNA的翻译或抑制目标基因的转录从而产生降低目标mRNA水平 的作用。本发明的反义寡核苷酸可以包括带有上述修饰的碱基、糖和/或磷酸基 团的核苷酸。制备反义寡核苷酸的方法是本领域公知技术(见如CrookeandBennett， Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，36:107-129(1996)和美国专利6,107,094)。
"核酶"指能够催化化学反应的RNA分子，如以核苷酸碱基特定序列的方式 重复剪切其它独立核苷酸(即具有核酸内切酶活性)。这种具有核酸内切酶活性 的核酶可能与特定目标基因在该核酶的底物结合区有互补性，并且具有在目标中 准确剪切RNA或DNA的酶活性。也就是具有核酸内切酶活性的核酶能够在分 子间或分子内剪切RNA或DNA，以此减除目标RNA或DNA分子的活性。这 种互补功能使核酶与目标RNA或DNA充分杂交从而产生剪切。本发明的核酶 与目标RNA或DNA的互补性可以是50％或更多，75％或更多，90％或更多，95％或更多。优选的，互补性为100％。本发明的核酶可以包括带有上述修饰的 碱基、糖和/或磷酸基团核苷酸。制备核酶的方法在本领域是公知技术(见如美 国专利4,987,071和6,617,438；RobertsonandJoyce，Nature，344:467-468 (1990))。
作为实例，本发明的抑制H基因或其表达产物的活性的试剂包括特异性结 合H蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源 等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明抗体或其片段可以是单克 隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片 段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链 Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含 有CDR的肽。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部 分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗 原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以 获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的分 子标志物蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对分子标志 物蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物， 从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血 清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的 序列信息来获得抗体片段。
附图说明
图1显示MHCC97L亲本、sphere细胞及CD90阳性细胞自我更新能力结果图；
图2显示BEL7402亲本、sphere细胞及ESA阳性细胞自我更新能力的结果图；
图3显示流式细胞术检测H蛋白在MHCC97L、BEL7402亲本及Sphere细胞中 的表达情况的结果图，其中，A:BEL7402，B:BEL7402 sphere，C:MHCC97L， D:MHCC97L sphere；
图4显示流式细胞术检测MHCC97L细胞及其Sphere细胞中CD90比例的结果 图，其中，A:MHCC97L B:MHCC97L sphere；
图5显示利用双色流式细胞术检测H蛋白/基因与MHCC98L中CD90标志物， BEL7402中ESA标志物共表达情况的结果图，其中，A:CD90，B:ESA；
图6显示采用细胞免疫荧光对MHCC97L人肝癌细胞株sphere球体细胞中H蛋 白/基因与PKH26进行共染，其中，A:H；B:PKH26；C:DAPI；D:Merge；
图7显示采用细胞免疫荧光技术在人肝癌细胞株MHCC97L中进行CD90与H 蛋白/基因的共定位研究的结果图，其中，A:H；B:CD90；C:DAPI；D:Merge；
图8显示利用Transwell侵袭实验检测H蛋白/基因阳性细胞侵袭能力的结果图，其中A:统计图；B:亲本细胞染色图；C:H+细胞；D:H-细胞；
图9显示H蛋白/基因阳性细胞自我更新能力的结果图，其中，A:统计图；B: 亲本细胞染色图；C:H+细胞；D:H-细胞；
图10显示H蛋白/基因阳性细胞对顺铂耐药性的结果图；
图11显示人肝癌细胞株MHCC97L细胞中CD90+H+细胞侵袭能力的结果图，其 中，A:CD90+H+；B:CD90+H-；
图12显示人肝癌细胞株MHCC97L细胞中CD90+H+细胞自我更新能力的结果图， 其中，A:CD90+H+；B:CD90+H-；
图13显示人肝癌细胞株MHCC97L细胞中CD90+H+细胞对顺铂耐药性的结果图；
图14显示H基因敲降的结果图，其中，A:RT-PCR结果图；B:Western blotting 结果图；
图15显示H基因敲降对人肝癌干细胞自我更新能力的影响的结果图，其中，A: 统计图；B:Shpere；C:NC；D:siRNA-1；E:siRNA-2；
图16显示H基因敲降对人肝癌干细胞侵袭能力的影响的结果图，其中，A:统计 图；B:Shpere；C:NC；D:siRNA-1；E:siRNA-2；
图17显示H基因敲降对人肝癌干细胞耐药能力的影响；
图18显示小分子抑制剂干预对人肝癌干细胞自我更新能力的影响的结果图，其中，A:统计图；B:0mM细胞图；C:20mM细胞图；D:80mM细胞图；E:320mM 细胞图；
图19显示小分子抑制剂干预对人肝癌干细胞侵袭能力的影响的结果图，其中， A:统计图；B:0mM细胞图；C:20mM细胞图；D:80mM细胞图；E:320mM细 胞图；
图20显示小分子抑制剂干预对人肝癌干细胞耐药能力的影响的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 肝癌干细胞相关功能性抗原H基因分子表型的鉴定
1、无血清悬浮培养，肿瘤干细胞富集
无血清悬浮培养MHCC97L(为中国医学科学院肿瘤研究所细胞及分子生物 学实验室保存)细胞5天，收获sphere细胞，同时流式分选CD90细胞并设亲本 细胞为对照。上述各组细胞计数后按500细胞/孔种入已加入0.8％甲基纤维素的 低粘附24孔板中，37℃，5％CO2孵箱培养10天计数。MHCC97L亲本细胞、sphere细胞及其CD90阳性细胞成球率分别为16.4％，23.2％，29.2％(图1，表 1)。
表1 MHCC97L亲本、sphere细胞及CD90阳性细胞自我更新能力
亚群 parent sphere CD90
Figure BDA0002967794600000091
无血清悬浮培养BEL7402细胞5天，收获sphere细胞，同时流式分选ESA 细胞并设亲本细胞为对照。上述各组细胞计数后按500细胞/孔种入已加入0.8％ 甲基纤维素的低粘附24孔板中，37℃，5％CO2孵箱培养7天计数。BEL7402 亲本细胞、sphere细胞及其ESA阳性细胞成球率分别为27.2％，37.4％，41.2％。 (图2，表2)。
表2 BEL7402亲本、sphere细胞及ESA阳性细胞自我更新能力
上述结果表明无血清悬浮培养，肿瘤干细胞富集。
2、无血清悬浮培养，H蛋白/基因被富集
对MHCC97L、BEL7402细胞进行无血清悬浮培养，然后通过流式细胞技术 检测H蛋白/基因在亲本、sphere细胞中的表达。
结果显示，与亲本细胞相比，无血清悬浮培养基培养形成的细胞球中，H蛋 白/基因表达比例均出现上调，MHCC97L细胞中2.25％vs 17.8％，BEL7402中 1.78％vs 7.19％(表3，图3)，分别上调7.9倍，4倍，H蛋白在肝癌干细胞细胞 膜表面显著上调表达。
表3 流式细胞术检测H蛋白在MHCC97L、BEL7402亲本及Sphere细胞中的 表达
亲本细胞 Sphere细胞 富集倍数
BEL7402 1.78％ 7.19％ 4倍
MHCC97L 2.25％ 17.8％ 7.9倍
无血清悬浮培养MHCC97L细胞，采用流式细胞术检测CD90在亲本细胞及 无血清悬浮培养细胞球中的表达。结果显示，与亲本细胞相比，无血清悬浮培养 基培养形成的sphere细胞球中CD90表达出现富集，由2.37％上升到7.06％(表 4，图4)，富集2.9倍。
表4 流式细胞术检测MHCC97L细胞及其Sphere细胞中CD90比例
亲本细胞 Sphere细胞 富集倍数
MHCC97L 2.37％ 7.06％ 2.9倍
3、H蛋白/基因与肝癌干细胞标志物CD90、ESA共表达的研究
运用双色流式细胞术检测H蛋白/基因与MHCC98L中CD90标志物， BEL7402中ESA标志物共表达情况。结果显示，H蛋白/基因与CD90阳性细胞 共染比例为57.1％，即MHCC97L中57.1％的CD90阳性细胞表达肝癌干细胞功 能性H基因，与人肝癌细胞株BEL7402中ESA阳性细胞共染比例为40.9％，即 BEL7402中40.9％的ESA阳性细胞表达肝癌干细胞功能性H基因(图5)。
4、H蛋白/基因与PKH26共染的研究
PKH26可作为干细胞的一个标志，阳性细胞可视为干细胞。为进一步了解H 蛋白/基因与肝癌干细胞的关系，采用细胞免疫荧光对MHCC97L人肝癌细胞株 sphere球体细胞中H蛋白/基因与PKH26进行共染，结果显示二者能够进行共染 (图6)，表明MHCC97L细胞株中存在有肝癌干细胞，并且该干细胞表达H蛋 白/基因。
5、H蛋白/基因与肝癌干细胞标志物CD90共定位的研究
上述细胞流式技术检测表明H蛋白/基因能够与肝癌细胞株MHCC97L中 CD90共染，为进一步明确二者的关系，本研究又运用细胞免疫荧光技术在人肝 癌细胞株MHCC97L中进行了CD90与H蛋白/基因的共定位研究。结果显示， 在MHCC97L人肝癌细胞株sphere细胞球中含有CD90标志物(图7)，并且该 标志物能够与H蛋白/基因共定位。
实施例2 H蛋白/基因干性特征的研究
1、H蛋白/基因对侵袭的影响
流式细胞术分选获得MHCC97L细胞中H蛋白/基因阳性细胞 (H+MHCC97L)，H蛋白/基因阴性细胞(H-MHCC97L)及亲本假分选细胞进 行Transwell侵袭实验。结果显示，H+MHCC97L细胞侵袭穿过细胞数明显多于 亲本假分选细胞和H-MHCC97L细胞(表5，图8)，侵袭能力比较为H+MHCC97L 细胞>MHCC97L亲本细胞>H-MHCC97L细胞，差距具有统计学意义。该结果表 明H蛋白/基因/阳性细胞具有更强的侵袭能力。
表5 MHCC97L中H+、H-细胞侵袭能力比较
Figure BDA0002967794600000111
2、蛋白/基因阳性细胞自我更新特性的研究
流式细胞技术分选MHCC97L细胞中H蛋白/基因阳性细胞(H+MHCC97L)、 H蛋白/基因阴性细胞(H-MHCC97L)及亲本假分选细胞，将分选细胞接种到已 加入0.8％甲基纤维素的24孔低粘附培养板中，37℃，5％CO2培养10天后计数 成球数。结果显示，H+MHCC97L细胞的成球能力明显强于亲本假分选细胞和 H-MHCC97L细胞，并且成球体积也明显大于另两群细胞(表6，图9)，成球能 力比较为H+MHCC97L细胞>MHCC97L亲本细胞>H-MHCC97L细胞，差距具 有统计学意义。该结果表明H蛋白/基因阳性细胞具有更强的自我更新能力。
表6 MHCC97L中H+、H-细胞自我更新能力比较
Figure BDA0002967794600000112
3、H蛋白/基因阳性细胞耐药特性的研究
通过流式细胞术分选MHCC97L细胞中H蛋白/基因阳性细胞 (H+MHCC97L)、H蛋白/基因阴性细胞(H-MHCC97L)及亲本假分选细胞， 根据前期实验确定的合适细胞数接种入96孔板，37℃，5％CO2培养24小时后 加入含不同浓度顺铂的细胞培养基，连续培养5天，CCK8法进行细胞活度测定。 实验设MHCC97L假分选细胞为对照组。结果显示，H+MHCC97L细胞顺铂IC50 值为0.98μg/ml，H-MHCC97L细胞顺铂IC50值为0.51μg/ml，亲本细胞顺铂IC50 值为0.78μg/ml(图10)，提示H+MHCC97L细胞具有更强的顺铂耐药性。
4、H蛋白/基因阳性细胞体内致瘤能力研究
分选MHCC97L、BEL7402细胞中H蛋白/基因阳性细胞(H+MHCC97L)、 H蛋白/基因阴性细胞(H-MHCC97L)及亲本假分选细胞接种Nu/nu裸鼠皮下， 观察其致瘤性。结果显示，至接种细胞10周时，H+BEL7402细胞接种2×102细 胞已形成肿瘤(2/7)，H-BEL7402细胞只有接种2×104形成肿瘤(1/7)，BEL7402 亲本细胞接种2×103形成肿瘤(1/7)(表7)。H+MHCC97L细胞接种2×102细胞 也已形成肿瘤(1/7)，H-MHCC97L细胞接种2×104细胞10周形成肿瘤(1/7)。 MHCC97L亲本细胞接种2×103形成肿瘤(1/7)(表8)。
表7 BEL7402中H+、H-、亲本细胞接种裸鼠的致瘤性(n)
Figure BDA0002967794600000121
表8 MHCC97L中H+、H-、亲本细胞接种裸鼠的致瘤性(n)
Figure BDA0002967794600000122
Figure BDA0002967794600000131
实施例3 H蛋白/基因在肝癌干细胞中作用的研究
1、H蛋白/基因对肝癌干细胞侵袭作用的研究
采用细胞流式分选技术分选人肝癌细胞株MHCC97L细胞中CD90+H+细胞、 CD90+H-细胞、CD90-H+细胞、CD90-H-细胞进行侵袭实验。Transwell侵袭实验 结果显示，CD90+H+细胞侵袭穿过细胞数明显多于CD90+H-细胞侵袭数(表9， 图11)，侵袭能力比较为CD90+H+细胞>CD90+H-细胞>CD90-H+细胞>CD90-H- 细胞，差距具有统计学意义。该结果表明H蛋白/基因与肝癌干细胞的高侵袭特 性相关。
表9 MHCC97L中H+、H-细胞侵袭能力比较
Figure BDA0002967794600000132
2、H基因对肝癌干细胞自我更新作用的研究
采用流式细胞分选技术分选人肝癌细胞株MHCC97L细胞中CD90+H+细胞、 CD90+H-细胞、CD90-H+细胞、CD90-H-细胞，将分选细胞接种到已加入0.8％ 甲基纤维素的24孔低粘附培养板中，37℃，5％CO2培养10天后计数成球数。 结果显示，CD90+H+细胞的成球数及成球体积均明显强于CD90+H-细胞(表10， 图12)，成球能力比较结果为CD90+H+细胞>CD90+H-细胞>CD90-H+>CD90-H-， 差距具有统计学意义。该结果提示肝癌干细胞功能性H基因影响肝癌干细胞的 自我更新。
表10 MHCC97L中CD90+H+、CD90+H-、CD90-H+、CD90-H-细胞自我 更新能力比较
Figure BDA0002967794600000133
3、H蛋白/基因对肝癌干细胞耐药作用的研究
通过流式细胞分选技术获得人肝癌细胞株MHCC97L细胞中CD90+H+细胞、 CD90+H-细胞、CD90-H+细胞、CD90-H-细胞，根据前期实验确定的合适的细胞 数接种入96孔板，37℃，5％CO2培养24小时后加入不同浓度梯度的顺铂细胞 培养基，隔天更换含顺铂的培养基，连续培养5天，CCK8法测定细胞活度。实 验结果显示，CD90+H+细胞顺铂IC50值为1.18μg/ml，CD90+H-细胞顺铂的IC50 值为0.88μg/ml，CD90-H+细胞顺铂IC50值为0.69μg/ml、CD90-H-细胞顺铂IC50 值为0.31μg/m(图13)，H蛋白/基因阳性肝癌干细胞顺铂IC50值最高，提示H 基因与肝癌干细胞的耐药相关，促进肝癌细胞的耐药发生。
实施例4 肝癌干细胞相关功能性H蛋白/基因体外功能的研究
1.siRNA瞬时敲降H基因对肝癌干细胞体外功能的影响
1.1 H基因敲降效率的检测
使用RT-PCR检测结合Western blotting技术分别从mRNA水平和蛋白水平 鉴定肝癌干细胞相关性功能H基因-siRNA瞬时转染后基因转录和表达情况。本 研究设计了2个siRNA序列进行瞬时敲降，PCR结果显示两对序列均为有效序 列，因此选择这两个siRNA序列进行瞬时敲降。
siRNA1：CACCUACGGCUGGACAGCCAAUAUG(SEQ ID NO.1)；
siRNA2：UUUAGUACCAGACUUGGCAAUGGUU(SEQ ID NO.2)；
采用H-siRNA瞬时转染人肝癌细胞系MHCC97L，72小时后收获转染细胞， RT-PCR检测结果显示，siRNA转染后72小时，H基因转录的mRNA水平显著 降低，同时收获转染细胞并利用试剂盒提取总蛋白，使用BCA定量试剂盒进行 BCA定量，然后根据电泳结果取等量蛋白上样电泳进行Western blotting检测分 析蛋白表达水平的改变。结果显示，siRNA转染72小时后，H蛋白的表达水平 出现显著下降(图14)。
1.2 H基因敲降对人肝癌干细胞自我更新能力的影响
采用无血清培养基悬浮培养人肝癌细胞株MHCC97L的sphere细胞，并用H 基因的两组H-siRNA瞬时转染培养的sphere细胞，同时设NC-siRNA为阴性对 照，37℃，5％CO2孵箱中培养72小时后收获细胞，精确计数后种入已加入0.8％ 甲基纤维素的低粘附24孔板中进行甲基纤维素成球实验，检测H蛋白/基因对肝 癌干细胞自我更新能力的影响。甲基纤维素成球实验结果显示，两组H基因的 H-siRNA瞬时敲降后sphere细胞的成球数均明显少于未敲降组及NC对照组，同 时成球体积也均明显小于未敲降组及NC对照组(表11，图15)，差异具有统计 学意义。结果提示H蛋白/基因参与对肝癌干细胞自我更新的调节。
表11 H-siRNA基因敲降对肝癌sphere细胞自我更新能力的影响
Figure BDA0002967794600000151
1.3 H基因敲降对人肝癌干细胞侵袭能力的影响
为进一步研究H蛋白/基因对肝癌干细胞侵袭能力的影响，我们同样采用无 血清培养基悬浮培养人肝癌细胞株MHCC97L的sphere细胞，并用H基因的两 组H-siRNA瞬时转染培养的sphere细胞，同时设NC-siRNA为阴性对照，37℃， 5％CO2孵箱中培养72小时后收获细胞，精确计数后1×104个细胞/孔种入已铺入 1％的mtarigel胶的transwell小室上室中，下室加入完全培养基，置37℃，5％CO2孵箱中培养16小时后检测穿过细胞数，检测H基因对肝癌干细胞侵袭能力的影 响。甲基纤维素成球实验结果显示，两组H基因的H-siRNA瞬时敲降后穿过 transwell小室的细胞数均明显少于未敲降组及NC对照组(表12，图16)，差异具有统计学意义。该结果提示肝癌干细胞功能性H基因与肝癌干细胞的侵袭相 关，能够促进肝癌干细胞的侵袭。
表12 H-siRNA基因敲降对肝癌sphere细胞侵袭能力的影响
Figure BDA0002967794600000152
1.4 H基因敲降对人肝癌干细胞耐药能力的影响
采用无血清培养基悬浮培养人肝癌细胞株MHCC97L的sphere细胞，并用H 基因的两组H-siRNA瞬时转染培养的sphere细胞，同时设NC-siRNA为阴性对 照，37℃，5％CO2孵箱中培养72小时后收获细胞，精确计数后2×103个细胞/ 孔种入96孔板中，37℃，5％CO2孵箱中培养24小时待细胞贴壁后加入不同浓 度的顺铂，继续置37℃，5％CO2孵箱中培养，至对照组细胞长至70％-80％满后 弃去培养液，加入CCK8测定各孔OD450值，并计算IC50值以检测H基因对 肝癌干细胞耐药能力的影响。顺铂耐药实验结果显示，两组H基因的H-siRNA(E03/D11)瞬时敲降后顺铂敏感性增加，IC50值显著下降至0.96μg/ml，0.79μg/ml， 而对照组及NC-siRNA阴性对照组为1.24μg/ml，1.31μg/ml(图17)。该结果提 示肝癌干细胞功能性H基因与肝癌干细胞的耐药相关，能够显著增加肝癌干细 胞的耐药能力，降低药物敏感性。
2、小分子抑制剂干预对肝癌干细胞体外功能的影响
2.1小分子抑制剂干预对人肝癌干细胞自我更新能力的影响
无血清培养基悬浮培养人肝癌细胞株MHCC97L获得MHCC97L的sphere 细胞，以不同浓度的小分子抑制剂(17-AAG，购自Selleck Chemicals，货号： S1141)干预72小时收获细胞，精确计数后种入已加入0.8％甲基纤维素的低粘 附24孔板中进行甲基纤维素成球实验，检测H蛋白/基因对肝癌干细胞自我更新 能力的影响。结果显示，随着抑制剂浓度的增加，MHCC97L的sphere细胞成球 数逐渐下降，同时成球体积也逐渐减小(表13，图18)，差距具有统计学意义， 提示肝癌干细胞功能性H基因参与对肝癌干细胞自我更新的调节。
表13 小分子抑制剂对肝癌sphere细胞自我更新能力的影响
Figure BDA0002967794600000161
2.2小分子抑制剂干预对人肝癌干细胞侵袭能力的影响
采用无血清培养基悬浮培养人肝癌细胞株MHCC97L的sphere细胞，以不 同浓度的小分子抑制剂(17-AAG，购自Selleck Chemicals，货号：S1141)干预 72小时收获细胞，同时设未干预组为对照，精确计数后1×104个细胞/孔种入已 铺入1％的mtarigel胶的transwell小室上室中，下室加入完全培养基，置37℃， 5％CO2孵箱中培养16小时后检测穿过小室细胞数，检测H蛋白/基因对肝癌干 细胞侵袭能力的影响。Transwell小室侵袭实验结果显示，穿过小室的细胞数随 小分子抑制剂干预浓度的增加而减少，差距具有统计学意义(表14，图19)。该 结果提示肝癌干细胞功能性H蛋白/基因与肝癌干细胞的侵袭相关，能够促进肝 癌干细胞的侵袭。
表14 小分子抑制剂对肝癌sphere细胞侵袭能力的影响
Figure BDA0002967794600000171
2.3小分子抑制剂干预对人肝癌干细胞耐药能力的影响
采用无血清培养基悬浮培养人肝癌细胞株MHCC97L的sphere细胞，以不 同浓度的小分子抑制剂(17-AAG，购自Selleck Chemicals，货号：S1141)干预 72小时收获细胞，同时设未干预组为对照，精确计数后2×103个细胞/孔种入96 孔板中，37℃，5％CO2孵箱中培养24小时待细胞贴壁后加入不同浓度的顺铂， 继续置37℃，5％CO2孵箱中培养，至对照孔细胞长致70％-80％满后弃去培养液， 加入CCK8测定各孔OD450值，并计算IC50值以检测H蛋白/基因对肝癌干细 胞耐药能力的影响。结果显示，随着小分子药物干预浓度的增加，肝癌细胞株 MHCC97L的sphere细胞的顺铂敏感性逐渐增加，IC50值逐渐下降，由未干预 组的1.13μg/ml下降到高剂量的0.65μg/ml(图20)，下降接近50％。该结果提示 H蛋白/基因与肝癌干细胞的耐药相关，能够显著增加肝癌干细胞的耐药能力， 降低药物敏感性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 北京市创伤骨科研究所
<120> H基因或其表达产物在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药能力的药物中的应用
<141> 2021-03-09
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccuacggc uggacagcca auaug 25
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uuuaguacca gacuuggcaa ugguu 25

Claims (10)

1.H基因或其表达产物的应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项：
1)在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞侵袭的药物中的应用；
2)在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞自我更新能力的药物中的应用；
3)在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药能力的药物中的应用；
4)在筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞侵袭的药物中的应用；
5)在筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞自我更新能力的药物中的应用；
6)在筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药能力的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，肝癌细胞或肝癌干细胞耐药能力包括对化疗药物的耐药能力。
3.根据权利要2所述的应用，其特征在于，化疗药物是顺铂。
4.根据权利要1所述的应用，其特征在于，所述药物包括抑制H基因或其表达产物的试剂。
5.根据权利要4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括抑制H基因或其表达产物的表达或活性的试剂。
6.根据权利要5所述的应用，其特征在于，抑制H基因或其表达产物的表达的试剂包括siRNA、shRNA、小分子抑制剂、多肽抑制剂、反义RNA、反义寡核苷酸、抗体、抗体片段、结合蛋白、DNA的载体显性负和干扰素。
7.根据权利要5所述的应用，其特征在于，抑制H基因或其表达产物的活性的试剂包括特异性结合H蛋白的抗体。
8.一种利用H基因表达阳性的肝癌干细胞的方法，所述方法包括以下任一项：
1)筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞侵袭的药物；
2)筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞自我更新的药物；
3)筛选抑制肝癌细胞或肝癌干细胞耐药的药物。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，肝癌细胞或肝癌干细胞耐药包括对化疗药物耐药。
10.根据权利要5所述的方法，其特征在于，化疗药物是顺铂。
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘辉琦: "《肝癌干细胞相关功能性基因的研究》", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *

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