KR102501683B1 - 마이크로나노 버블을 포함하는 초음파 조영제 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로나노 버블을 포함하는 액체 초음파 조영제 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
본 발명의 액체 초음파 조영제는 임상현장에서 혈관이 아닌 체강에 광범위하게 사용될 수 있으며, 입자가 기존 조영제보다 크므로 일반 초음파기기로도 용이하게 사용 가능하다. 따라서 임상현장에서 쉽고, 빠르며 저렴하게 진단할 수 있게 한다. 제조시 동결건조 단계가 포함되지 않으므로, 제조단가를 매우 낮출 수 있고, 장기 보관 및 남은 용액은 재사용이 가능하다.

Description

마이크로나노 버블을 포함하는 초음파 조영제 및 이의 제조방법 {Contrast agent comprising micronano bubbles and manufacturing method thereof}

본 발명은 마이크로나노 버블을 포함하는 액체 초음파 조영제 및 이의 제조방법에 대한 것이다.

초음파(ultrasound)는 인간의 가청음역보다 높은 범위인 20,000Hz 이상의 주파수를 가진 음파를 지칭하며, 이러한 초음파를 이용하여 인체 내부 장기나 뼈, 근육조직, 혈액 등 다양한 경계면에서 음파의 확산, 반사, 흡수 및 산란을 통해 생성된 수신 차이를 영상으로 구현한 것을 초음파 영상(ultrasonography)이라고 한다. 의료 진단용 초음파 영상 장치는 현재 가장 널리 사용되는 진단 기술 중 하나로 이동성과 접근성이 뛰어난 동시에 다른 영상 기술과 비교해 상대적으로 저렴한 비용으로 진단이 가능한 장점을 가지고 있다. 2008년 연구에 따르면 근골격계의 진단에 Magnetic resonance imaging(MRI)의 대체제로 초음파를 이용할 경우 진단 비용이 5배가량 줄어드는 것을 발견했으며, Computed tomography (CT)보다도 4배 낮은 비용이 발생했다고 밝혔다. 또한 실시간으로 진단이 가능하여 빠르게 결과를 도출할 수 있으며, 음파를 이용하여 체외에서 비침습적으로 진단이 가능하기 때문에 다른 의료 영상화 기술에 비하여 인체에 안전한 것으로 평가받고 있다.

조영제용 마이크로버블은 수 ~ 수십 마이크로미터의 직경을 가지는 미세기포로, 내부에 기체를 포함하고 있으며 표면물질(예컨대, 지질, 단백질, 고분자 등의 유기물질)이 상기 기체를 에워싸는 형태를 가진다. 상기 조영제용 마이크로 버블은 초음파 등의 영상 진단시 주로 혈액 내로 주입되어 조직과 내부 기체 간의 높은 임피던스 차이를 통한 초음파 신호의 조직 간 구분을 명확히 하기 위해 사용된다. 초음파는 기본적으로 주파수에 따른 특성(고주파수일수록 분해능은 좋지만 체내 깊은 조직 영상의 획득이 어려움)을 지니고, 마이크로버블은 그 크기에 따라 특정 주파수에 민감하게 반응하는 공명현상을 나타내기 때문에, 상기 특성을 상황에 맞게 적절히 조절할 경우 초음파 영상의 질을 획기적으로 높일 수 있다.

이상적인 초음파 조영제는 체내에서 쉽게 파괴되지 않고 안정적이어야 하며, 크기도 모세혈관을 통과할 수 있을 정도로 작아야 한다. 일반적으로, 기체 비함유 초음파 조영제의 효율은 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 현재까지 마이크로버블로써 개발된 기체 함유 초음파 조영제는 '퍼플루오르프로판(C3F8)', '설퍼헬사프루오라이드(SF6)', 또는 '퍼플루오르펜탄(perfluorophentane)' 등 퍼플루오르화 기체 및 이산화탄소, 헬륨, 질소, 아르곤 등의 비활성 기체를 사용하고 있다. 다만, 상기 마이크로버블은 균일한 크기 및 요구되는 특성을 갖는 기포를 제조하기가 어려웠으며, 제조된 기포 또한 생체 내 안정도가 매우 낮아 진단을 위한 장시간 그 형태를 유지하거나 수성 매체 내에 존재하기에는 한계가 있었다. 이에 마이크로 버블의 생존 한계를 해결하기 위해서 용액을 얼리고(deep freezing), 그 뒤에 동결건조(Freeze-drying or Lyophilization) 로 가루화를 만든 뒤, 사용시에는 희석액으로 희석을 통해 체내에 주입하는 연구가 진행되었으나, 동결건소시 마이크로 버블이 소멸된다는 문제는 여전히 존재하고 있다.

KR 10-2018-0036968 (2018-03-30)

이에 본 발명자는 마이크로버블의 생존한계 극복을 위한 새로운 방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, 임상학적으로 동결건조 과정을 생각하고 액체상에서 초음파 조영제를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 마이크로나노버블을 포함하는 초음파 조영제 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 i) 증류수로 마이크로버블수를 제조하는 단계;

ii) 상기 마이크로버블수에 애플워시(proteol APL) 및 PS(polyoxyethylene 40 stearate) 을 혼합하여 증류수에 녹이는 단계;

iii) 상기 ii) 용액에 덱스트로오스(dextrose)를 첨가하는 단계; 및

iv) 교반 및 초음파파쇄(sonification) 하는 단계;

를 포함하는 마이크로나노버블을 포함하는 초음파 조영제 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii) 의 애플워시 및 PS 는 2 : 1 내지 20 : 1 의 부피비로 첨가되는 것이다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii) 의 덱스트로오스는 전체 용액의 1 내지 10 % 몰농도로 첨가되는 것이다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv) 의 교반은 10 ~30 분, 초음파파쇄는 1분 ~10분 동안 수행되는 것이다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 마이크로나노버블의 크기는 1 ~ 200 ㎛ 인 것이다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 초음파 조영제는 액체인 것이다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 초음파 조영제를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 초음파 조영제는 20 ~ 40 ℃의 온도로 사용되는 것이다.

본 발명의 액체 초음파 조영제는 임상현장에서 혈관이 아닌 체강에 광범위하게 사용될 수 있으며, 입자가 기존 조영제보다 크므로 일반 초음파기기로도 용이하게 사용 가능하다. 따라서 임상현장에서 쉽고, 빠르며 저렴하게 진단할 수 있게 한다. 제조시 동결건조 단계가 포함되지 않으므로, 제조단가를 매우 낮출 수 있고, 장기 보관 및 남은 용액은 재사용이 가능하다.

도 1은 마이크로버블(MB)의 안전성을 평가하기 위한 생존 GRADE 기준을 나타낸다.
도 2 는 마이크로버블(MB) 제조시 애플워시(APL) 및 PS(polyoxyehtylene 40 stearate) 의 부피비에 따른 마이크로버블의 생존 GRADE 를 나타낸다(A: APL과 PS 를 각각 1 ml, 0.25 ml, B: APL과 PS 를 각각 1 ml, 0.13 ml, C: APL과 PS 를 각각 2 ml, 0.25 ml, D: APL과 PS 를 각각 5 ml, 0.5 ml ,E: 대조군).
도 3 은 1차 실험 후 마이크로버블의 시간 흐름에 따른 안전성을 나타낸다.
도 4 는 2차 실험 후 마이크로버블의 시간 흐름에 따른 안전성을 나타낸다.
도 5 는 애플워시(APL) 및 PS(polyoxyehtylene 40 stearate) 를 포함하는 조영제 샘플 내 마이크로버플의 크기를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6 은 애플워시(APL) 및 Co(CoCo glucoside) 를 포함하는 조영제 샘플 내 마이크로버플의 크기를 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 조영제를 이용하여 방광을 관찰한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 1 ~ 200 ㎛ 의 다양한 크기의 버블을 포함하여 과불화프로판(perfluoropropane, C3F8) 등을 초음파분쇄하여 제조된 액체 초음파 조영제에 대한 것이다.

본 발명은 체강용이기 때문에 종래의 혈관용 조영제를 사용하기 위해서는 초음파기기에서 조영제 이용과 관련한 프로그램(CEUS; Contrast-Enhancement Ultrasound) 없이도 일반 초음파 프르브로도 강력한 에코발생(echogenicity)를 나타내는 고 에코성(hyper-echoic) 영상을 관찰할 수 있으며 생체의 체강(body cavity)인 방광, 담낭 및 소확관내의 내부 구조상의 이상여부, 그리고 천공(penetration), 누출(leaking) 및 탈장(hernia) 진단 등에 쓰여질 수 있다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 액체 초음파 조영제는 제조시 동결건조 단계가 포함되지 않기 때문에 동결건조로 인한 버블의 소멸을 방지할 수 있다. 또한, 마이크로 버블과 나노 버블을 함께 포함함으로써 장기간 보관 가능하고, 마이크로 버블과 나노 버블을 분리하지 않고도 실제 임상시에 환자 또는 검사방법에 맞추어 사용할 수 있다. 또한, 사용하고 남은 용액에는 여전히 나노와 마이크로 버블이 존재하므로 1-2달 이내에도 흔들어서 재사용(약 3회) 이 가능한데, 이는 흔들게 되면 나노 버블의 크기가 커지고 뭉쳐지기 때문이다.

따라서, 본 발명은 증류수로 마이크로버블수를 제조하는 단계;

ii) 상기 마이크로버블수에 애플워시(proteol APL) 및 PS(polyoxyethylene 40 stearate) 을 혼합하여 증류수에 녹이는 단계;

iii) 상기 ii) 용액에 덱스트로오스(dextrose)를 첨가하는 단계; 및

iv) 교반 및 초음파파쇄(sonification) 하는 단계;

를 포함하는 마이크로나노버블을 포함하는 초음파 조영제 제조방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii) 의 애플워시 및 PS 는 2 : 1 내지 20 : 1 의 부피비로 첨가되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 단계 ii) 의 애플워시 및 PS 는 3 : 1 내지 15 : 1 의 부피비로 첨가되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 단계 ii)의 애플워시 및 PS 는 4 : 1 내지 10 : 1 의 부피비로 첨가되는 것일 수 있다.

본 발명의 제조방법에 애플워시, 코코 글루코사이드 및/또는 PS 을 적용할 수 있으며, 그 이외의 다른 계면활성제(Tween 용액, PE(polyoxyethylene), 글리세롤(glycerol) 또는 CMC(carboxymethyl cellulose))를 사용하는 경우 약물에 대한 과민반응을 나타낼 수 있다. 특히 상기 애플워시는 무독성 및 피부에 무자극적이었으며 적은 용량으로도 마이크로 버블을 제조할 수 있었다.

또한, 상기 애플워시, 코코 글루코사이드 및 PS 를 각각 단독으로 사용하는 경우에 비하여 애플워시 및 PS를 혼합하는 경우 마이크로나노 버블 발생률이 증가하였으며, 보다 오래 보존되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii) 의 덱스트로오스는 전체 용액의 1 내지 10 % 몰농도로 첨가되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 단계 iii) 의 덱스트로오스는 전체 용액의 3 내지 7 % 몰농도로 첨가되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv) 의 교반은 10 ~30 분, 초음파파쇄는 1분 ~10분 동안 수행되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 단계 iv) 의 교반은 15 ~25 분, 초음파파쇄는 5분 ~10분 동안 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 마이크로나노버블의 크기는 1 ~ 200 ㎛ 인 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 마이크로나노버블의 크기는 10 ~ 100 ㎛ 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 초음파 조영제는 액체인 것일 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 초음파 조영제를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 초음파 조영제는 20 ~ 40 ℃ 의 온도로 사용되는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

계면활성제 선별

<1-1> APL, PS 및 Co 비교

계면활성제(Surfactants) 중에서 마이크로 버블의 형성이 양호한 APL(애플워시, Sodium cocoyl apple amino acids), PS(Polyoxyethylene 40 stearate) 또는 Co (Cocoglucoside)를 선택하여 2차 증류수에 각각 5%, 5% 및 1% (v/v) 농도로 각각 제조하였다. 이를 370 ㎖ 플라스틱 컵 3개에 각 1㎖ 씩 담았다. 그리고 여기에 mb(마이크로 버블) 제조기(Milky Spa, Micro Bubble Generator)를 통해서 만든 mb수를 약 300 ㎖ 씩 각각 담고 잘 휘저어서 마이크로 버블을 만들었다. 이때 버블수의 온도는 약 26° 이었다. 대조군은 계면활성제 없이 오직 mb수만 넣었다. 그리고 육안 및 초음파 영상을 통하여 mb 생존 시간을 측정하였다. 초음파 영상 측정은 초음파기기를 통하여 초음파 프로브를 각 surfactants-mb수 표면에 약간 넣은 뒤에 초음파 모니터에 나오는 영상을 하기 [표 1]에 따른 Grade 0이 될 때까지 그 시간을 정해서 mb의 안정성을 판정하였다. 측정횟수는 3회로 하였다.

Grade 0	Grade 1	Grade 2	Grade 3	Grade 4
mb 가 거의 확인되지 않으며 저에코성의 물로만 확인됨.	mb의 조성이 소성(조밀도가 떨어짐)해 지며, 대부분 저에코성 물로 확인됨.	mb의 조성의 조밀도가 떨어지면서 각 버블의 개체인식이 뚜렷이 확인되고 저에코성의 물도 확인되기 시작함.	mb의 조성의 조밀도가 떨어지면서 각 버블의 개체인식이 확인되기 시작함.	mb의 조성이 조밀하고 각 버블의 개체인식이 불가능함.

육안 관찰시의 각 surfactants-mb수에서는 PS 가 3분, 2.5분, 2.5(평균: 2.7)분 유지하였고, APL 2 분, 2분, 1.5 분(평균:1.8) 유지하였으며, Co에서는 2분, 1.5 분, 1.0(평균 1.5) 분 유지하였다. 대조군은 1분 이내(2회), 1.5분 이내(1.2) 이내로 유지하였고, 그 이후에는 mb가 확인되지 않았다.

초음파 영상 판정의 결과는 하기 [표 2] 와 같다.

계면활성제	APL	PS	Co	대조군
시간(분)	15, 10, 7	7, 10, 14	3, 0, 0	2, 0, 0
평균(Average)(분)	7.3	7.0	1.0	0.7

따라서 육안적으로는 PS가 2.7 분으로 우수하게 보였으나, 초음파기기를 통하여 본 결과는 APL 로 제조한 mb 이 다른 계면활성제로 제조한 mb 보다 우수한 것을 확인할 수 있었다.

<1-2> APL 및 PS 비교

상기 실시예 <1-1> 에서 선별된 APL과 PS를 비교하기 위해서 각각의 5% 수용액 1 ㎖를 370 ㎖ 플라스틱 컵에 넣은 뒤에, mb 제조기를 통해 제조한 mb를 컵에 300 ㎖ 정도 넣고 잘 섞는다. 그 후 초음파기기 상에서 Grade 1, 혹은 0까지 되는 시간을 측정하였다.

Surf./ 시간	제조후 17분	20분후	25분 후	30분 후	40분 후
APL	Grade 4	Grade 4	Grade 3	Grade 2	Grade 2
PS	Grade 1, 2	Grade 0	Grade 0	Grade 0	Grade 0

그 결과, 상기 [표 3] 에서 나타나는 바와 같이 APL-mb수가 20-25분간 Grade 3이상을 유지하며, 40분 이후에는 소성하게 되고, PS-mb수는 약 15분간은 Grade 3을 유지하나 그 이후에는 급속히 mb수가 소멸하는 현상을 보였다.

따라서 APL-mb수가 PS-mb수 보다 mb의 안정성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

<1-3> APL, PS 및 APL+PS 합제 비교

상기 실시예 <1-1> 과 동일한 방법으로 제조된 APL-mb수와 PS-mb수는 각각 플라스틱 컵에 5% 농도의 용액을 1㎖ 씩 넣었으며, APL+PS 합제는 APL-mb수 5% 용액 및 PS-mb수 5% 용액을 각각 0.5 ㎖ 씩 넣었다. 그 후 각각 mb수 300㎖ 씩 채우고, 즉시 잘 섞은 뒤에 초음파 영상을 통해서 버블의 안정성을 확인하였다.

Surf./ 시간	제조 후 15분	20분 후	25분 후	30분 후	비고
APL+PS 합제	Grade 4	Grade 4	Grade 4	Grade 2 이하	*27분까지 Grade 4 유지
APL	Grade 3.5	Grade 3	Grade 1.5	Grade 1
PS	Grade 2	Grade 2	Grade 1	Grade 0

그 결과, 상기 [표 4] 에서 나타나는 바와 같이 단순 APL-mb수 또는 PS-mb수 보다는 이 둘의 합제가 약 27분까지는 Grade 4를 유지하고, 30분 이후는 소성해지는 것을 관찰할 수 있었다. 즉, 단독 보다는 이 두 계면활성제의 합제가 mb의 안정성을 유지하는데 더 효과적임을 확인하였다.

<1-4> APL+PS 합제의 혼합 비율에 따른 mb수의 안정성 비교

다양한 APL+PS 합제 비율에 따른 mb수의 안정성을 검사 및 비교하였다.

구체적으로, mb 제조수에서 나온 mb수보다는 mechanical stirring 을 심하게 하여 (2500rpm, 15 분 이상) 나노수를 만든 뒤, 이 나노수를 mb generator 의 기본물로 하여 나노+mb수(마이크로 나노버블수, mnb수)를 만들었다. 이어서 APL+PS의 합제 비율(부피비)을 4:1, 10:1 및 1:8(2가지) 그룹화하여(표 5) mnb수내 mb의 초음파상에서 안정성 확인 실험을 하였다.

그룹	각 계면활성제 비율 및 양
A	300㎖ 컵에 5% APL과 PS 를 각각 1ml, 0.25 ml 를 넣은 군(4:1 군)
B	300㎖ 컵에 5% APL과 PS 를 각각 1ml, 0.13 ml 를 넣은 군(8:1 군)
C	300㎖ 컵에 5% APL과 PS 를 각각 2ml, 0.25 ml 를 넣은 군(8:1 군)
D	300㎖ 컵에 5% APL과 PS 를 각각 5ml, 0.5 ml 를 넣은 군(10:1 군)
E	대조군(계면활성제를 넣지 않은 군)

그 결과, [도 2] 에서 나타나는 바와 같이 처음 10분에서는 A, C, D군이 비교적 우수하며 시간이 지나면서, 특히 A와 C군이 30분 까지는 우수한 것으로 확인되었다. 즉, APL:PS의 4:1 혹은 8:1(APL의 용량을 2배로 넣은 군)의 합제 비율로 섞은 군에서 mb의 안정성이 높은 것으로 나타났다. 그리고 45분 이후는 거의 mb가 소멸되는 것으로 나타났다. 특히 이는 APL:PS 를 1:1로 합제를 만들었을 때보다 40분까지도 유용한 mb의 안정성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

조영제의 안정성 검사

<2-1> 첫번제 안정화 이후 다시 shaking 한 후의 버블의 안정성 검사

mb-generator로 제조한 나노수를 플라스틱 컵 3개에 각각 300㎖씩 넣었다. 그 후, APL 5% 수용액 및 PS 5% 수용액을 각각 1㎖ 및 0.25 ㎖ 씩 첨가하고 이들 컵들을 강력하게 shaking 하였다. 그리고 초음파학적 영상을 관찰하면서 mb의 안정성을 확인하였다.

그 결과, mb는 초음파 영상에서 25분까지는 Grade 3 이상으로 유지하다가, 30분에서 급격히 mb가 소성해지기 시작하였다(도 3). 이렇게 소성해진 30분에서 이들을 다시 Shaking 하여 이들 mb의 안정성을 다시 확인하였다. 이들은 20분 까지는 Grade 3 이상을 유지하다가, 25분에는 소성하기 시작하였다. 즉, 나노수를 이용한 mb와 APL 및 PS의 용액을 가한 것은 1차 mb 형성 이후 및 2차적인 shaking 에도 재사용 가능성(안정성)을 확인하였다(도 4).

<2-2> 거품층(bubble layer)층을 이용한 APL/PS sol. 을 5번 가한 후 mb의 장기적인 안정성 검사

실시예 <1-4> 와 동일한 방법으로 제조한 마이크로 나노 버블수(mnb 수) 의 상층부(큰 거품과 mb이 농축된 부분)을 이용하여 버블수에 희석한 뒤, 이 용액에 다시 APL/PS solution(sol.)을 같은 비율로 가하고, 이 과정을 5회 반복하여 제조된mnb(마이크로 나노버블)의 장기적인 생존 및 안정성을 조사하였다.

구체적으로, 실시예 <1-4> 와 같이 2차 증류수 3L를 이용하여 제조한 마이크로 나노 버블수(mnb 수) 의 상층액(큰 거품과 mb이 농축된 부분)을 500 ㎖ 분리시켰다. 이 상층액에 다시 mnb수를 가하고, APL/PS solution(sol.)을 가한 뒤 교반시켰다. 그 후 다시 상층액의 500 ㎖의 거품층을 다시 분리하여 이 용액은 2차 mnb수로 하고 거품을 따로 보관하였다.

상기 분리된 500㎖ 거품층에다 mnb수를 가한뒤 2차로 APL/PS sol.을 첨가한뒤 교반시켰다. 그 후 거품층(약 500㎖)을 다시 모은다. 이에 다시 mnb 수를 가한뒤 상기와 같은 방법으로 APL/PS sol. 을 가하고 교반하여 3차 mnb 수를 만들고 거품을 따로 두었다.

상기와 동일한 방법으로 4차 mnb 및 5차 mnb 수를 각각 만들고 각각 1차내지 5차 mnb 수는 370 ml 플라스틱의 2개에 담아서 장기적으로 보관하였다.

상기 용액을 7개월이 지난 뒤(시작: 2020-10-25일, 7개월 뒤 검사일: 2021.5.21) 이들 1차에서 5차 mnb 용액을 초음파학적으로 mb의 Grade를 조사하였다.

제조 mnb 수	초음파학적 영상 Grade
1차 제조수	Grade 3
2차 제조수	Grade 3.8
3차 제조수	Grade 3.8, Grade 3.0
4차 제조수	Grade 3.8, Grade 3.8
5차 제조수	Grade 3.0, Grade 2.5

그 결과, 상기 [표 6] 에서 나타나는 바와 같이 mnb 수는 7개월이 지나도 조영효과를 나타낼 수 있어 장기적인 조영제의 안정성과 효능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

조영제 내 마이크로 버블 크기 확인

본 실험은 mnb(마이크로 나노 버블)수에 APL(proteol APL), PS(polyoxyethylene 40 stearate) 및/또는 Co(CoCo-glucoside) 를 혼합하여 1차 조영제를 만들었고, 여기에 덱스트로오스(dextrose)를 첨가하여 전체 용액의 5% w/v 농도가 되게 하였다. 이를 교반기로 2000 rpm 에서 20분 이상 교반하고 C3F8 가스와 5분 이상 sonification 한 뒤 조영제를 완성하였다. 이 용액 내 mnb의 크기를 알고자 농생대의 공동기기원(NICEM) 에서 레이저회절입도분석기를 통해서 mb의 크기를 측정하였다.

구체적으로, 처음 mnb 수 200㎖ 를 2개의 비이커에 준비하고, G1 샘플에는 5% APL 40㎖, 5% PS 10 ㎖, NaCl 2g 및 glucose 10g 을, G2 샘플에는 5% APL 2㎖, Co 용액 원액 1㎖, NaCl 2g 및 glucose 10g 을 제조하여 덱스트로오스 첨가 후 각각 C3F8 가스 50 ㎖를 충전하고 sonification 하여 조영제를 제조하였다. 이렇게 만든 G1 및 G2 샘플을 레이저입도 분석기로 mb을 관찰하였다.

	Record Number	Sample Name	Dx (10) (㎛)	Dx (50) (㎛)	Dx (90) (㎛)	Laser Obscuration (%)
	33	G1	42.7	68.1	106	5.07
	34	G1	42.5	67.9	106	4.89
	35	G1	42.3	68.5	108	4.93
Mean			42.5	68.2	107	4.96
1xStd Dev			0.173	0.310	1.24	0.09
1xRSD (%)			0.406	0.454	1.17	1.83

	Record Number	Sample Name	Dx (10) (㎛)	Dx (50) (㎛)	Dx (90) (㎛)	Laser Obscuration (%)
	13	G2	34.0	59.9	109	2.88
	14	G2	33.7	59.7	110	2.83
	15	G2	32.5	58.7	115	2.54
Mean			33.4	59.4	111	2.75
1xStd Dev			0.819	0.674	3.29	0.19
1xRSD (%)			2.45	1.13	2.96	6.73

그 결과, [도 5] 및 상기 [표 7] 에서 나타나는 바와 같이 G1 샘플에서는 주로 mb이 10-100 마이크로미터 의 크기로 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, [도 6] 및 상기 [표 8] 에서 나타나는 바와 같이 G2 샘플에서는 1-100 마이크로미터 의 버블이 존재하고 1 마이크로미터 보다 적은 나노 크기의 버블도 존재함을 확인할 수 있었다.

종합적으로, APL, PS 및/또는 Co로 만든 조영제는 1 마이크로 보다 작은 크기로부터 100 마이크로미터 정도의 마이크로버블이 존재하며, 상대적으로 크기가 1000배로 적은 나노버블은 상대적으로 작기 때문에 그래프에서는 상대적으로 적게 나타나 보이지만 존재하고 있는 것을 알 수 있었다.

조영제의 성능 확인

본 실험은 mnb(마이크로나노버블)수에 APL 및 PS 를 이용하여 1차 조영제를 만들었고, 여기에 C3F8 가스와 sonification 한 뒤 조영제를 완성하였다.

그리고 이것을 수컷 실험견(비글견, 20kg 체중) 을 초음파 검사 테이블에 복와형태(ventrodorsal position; VD )로 누인 뒤에, 요도 카테터(catheter)를 이용하여 생식기에 넣고, 일부 오줌(urine)을 제거하고, 이어서 만든 조영제를 방광내 주입하고 조영제의 초음파 영상을 관찰하였다.

그 결과, [도 7] 상단 왼쪽에 나타나는 바와 같이 조영제를 넣지 않은 방광의 초음파상을 보이고, 우측 그림은 요도를 통해서 조영제를 방광내 주입했을 때, 밝은 빛의 조영제가 무에코(anechoic)의 오줌부분을 대체(replaced)하는 것을 확인할 수 있었다.

[도 7]에서 하단 왼쪽에서는 조영제가 점차로 많아지면서 밝은 조영제가 방광의 대부분을 차지하여 아주 좋은 조영제의 효과를 확인하였다. 그리고 몇 분 지나서 조영제의 효과가 적게 나타날 때(밝은 조영효과가 없어지면서, 무에코의 물성분이 나타날 때), 다시 방광을 흔들었을 때(shaking 할 때), 방광내 저층에 가라앉았던 조영제가 다시 자극을 받아 조영 효과를 다시 나타내어서, 방광의 경계부위를 확인할 수 없을 정도로 다시 좋은 조영효과를 나타냈다(도 6의 오른쪽).

즉, 본 발명의 조영제는 1차적으로 조영효과가 뛰어나며, 시간이 잠시 지나(3-4분) 조영효과가 적어질 때, 다시금 방광을 흔들어서 조영제를 흔들어주면 처음과 같이 아주 밝은 고에코(hyperechoic)의 조영현상을 다시금 나타내어, 매우 우수한 신체내의 장기의 체강용 조영제로서 우수한 효과가 있음이 입증되었다.

Claims (9)

1. i) 증류수로 마이크로버블수를 제조하는 단계;
   ii) 상기 마이크로버블수에 애플워시(proteol APL) 및 PS(polyoxyethylene 40 stearate) 을 4 : 1 내지 10 : 1 의 부피비로 혼합하여 증류수에 녹이는 단계;
   iii) 상기 ii) 용액에 덱스트로오스(dextrose)를 첨가하는 단계; 및
   iv) 교반 및 초음파파쇄(sonification) 하는 단계;
   를 포함하는 마이크로나노버블을 포함하는 체강용 초음파 조영제 제조방법으로서,
   상기 마이크로나노버블의 크기는 10 ~ 100 ㎛ 인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 단계 iii) 의 덱스트로오스는 전체 용액의 1 내지 10 % 몰농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 단계 iv) 의 교반은 10 ~30 분, 초음파파쇄는 1분 ~10분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 초음파 조영제는 액체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
7. 제1항의 제조방법으로 제조된 체강용 초음파 조영제.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 초음파 조영제는 20 ~ 40 ℃의 온도로 사용되는 것을 특징으로 하는 초음파 조영제.
9. 마이크로버블수, 애플워시(proteol APL), PS(polyoxyethylene 40 stearate) 및 덱스트로오스(dextrose)를 포함하는 체강용 초음파 조영제로서,
   상기 마이크로나노버블의 크기는 10 ~ 100 ㎛ 인 것이고,
   상기 애플워시(proteol APL) 및 PS(polyoxyethylene 40 stearate) 은 4 : 1 내지 10 : 1 의 부피비로 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 체강용 초음파 조영제.

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