KR102493040B1 - 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자 및 그 제조방법 - Google Patents

고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 파쇄하여 고려엉겅퀴 잎 분말로 제조하는 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10), 상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고 농축하여 고려엉겅퀴 잎 추출물을 제조하는 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20) 및 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 추출물에 아셀렌산나트륨을 혼합하고 배양하여 고려엉겅퀴-셀레늄나노입자를 제조하는 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30)를 포함하는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 파쇄한 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고, 농축하여 얻어진 고려엉겅퀴 잎 추출물에 아셀렌산나트륨을 혼합하고 배양하여 형성된 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자에 관한 것이다.

Description

고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자 및 그 제조방법 {Selenium nanoparticles using Cirsium Setidens leaf extract and its manufacturing method}
본 발명은 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 자세하게는 고려엉겅퀴의 잎으로부터 추출한 고려엉겅퀴 잎 추출물을 아셀렌산나트륨과 혼합하여 형성되며, 항균, 항산화 및 항암효과를 갖는 셀레늄 나노 입자와 그 제조방법에 관한 것이다.
셀레늄은 주기율표 제6B족에 속하는 산소족원소의 하나로 원소기호는 Se, 원자번호는 34이다. 기본적으로 반도체의 재료로 많이 쓰이며, 생명활동에 반드시 필요한 미량원소로서 이용되고 있다.
한편, 전통적인 셀레늄 화합물질은 강한 독성을 갖고 있어, 환자가 목용하기 어려우며 그 효과도 미미한 문제가 있었다. 셀레늄 나노입자는 셀레늄 화합물질의 부작용과 단점을 보와하고자 개발된 것으로, 중국 상하이 쓰퉁나노기술항유한공사에서 개발하였다.
일례로, 나노테크놀러지(나노기술)와 생명과학기술을 결합해 활성 붉은색 단체 물질인 셀레늄 제조법을 이용해 나노 크기의 셀레늄 미세 입자인 셀레늄 나노 입자를 합성한 바 있다. 이 셀레늄 나노 입자는 같은 양을 사용할 경우 기존의 셀레늄 화합물질보다 생물체의 면역 지표를 훨씬 효율적으로 향상시킬 뿐 아니라, 생명의 노화현상을 억제하는 데도 큰 효능을 갖는다.
이러한, 셀레늄 나노입자를 제조하기 위한 종래의 기술로, 대한민국 등록특허공보 제10-1719236호에는 "셀레늄 나노 입자 제조 방법"이 개시된 바 있는데, 이는 (a) 셀레늄 다이옥사이드(SeO2) 499g를 순수 23,700g에 녹인 후, 유기 고분자인 폴리비닐 알코올 718g를 첨가하여 셀레늄 전구체 용액을 형성하는 단계; (b) 환원제로 비타민 C(Ascorbic acid) 1,580g을 순수 17,950g에 녹여 환원제 용액을 형성하는 단계; (c) 상기 셀레늄 전구체 용액을 냉각한 후, 균질기를 이용한 균질화 처리를 실시하면서 초음파를 인가한 후, 상기 환원제를 일시에 투입하여 셀레늄 혼합 분산액을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 셀레늄 혼합 분산액을 교반한 후, 원심 분리 및 건조하여 셀레늄 나노 입자를 수득하는 단계; 를 포함하며, 상기 (c) 단계에서, 상기 냉각은 4℃ 이하로 냉각하고, 상기 균질화 처리는 2,000rpm의 속도로 60분 동안 실시하고, 상기 초음파는 20KHz 및 100W의 에너지량을 갖는 고밀도 초음파(high-intensity ultrasound)를 인가하고, 상기 교반은 150rpm의 속도로 1시간 동안 실시하며, 상기 수득된 셀레늄 나노 입자는 45.1nm의 평균 직경을 가지면서 최대 입자 크기와 최소 입자 크기의 편차가 50nm 이하이며, 최대 직경은 66.2nm이고 최소 직경은 21.3nm인 균일한 입자 분포를 갖는 것을 특징으로 하는 셀레늄 나노 입자 제조 방법에 관한 것이다.
그러나, 상기 종래의 셀레늄 나노 입자 제조 방법은 제조공정이 복잡하여, 비용이 많이 드는 문제점이 있었으며, 상기 셀레늄 나노 입자 제조 방법을 통해 생산된 셀레늄 나노 입자는 항균, 항산화 및 항암효과가 미미하다는 문제점이 있었다.
대한민국 등록특허공보 제10-1719236호(2017.03.24.공고), "셀레늄 나노 입자 제조 방법"
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 고려엉겅퀴의 잎으로부터 추출한 고려엉겅퀴 잎 추출물을 아셀렌산나트륨과 혼합하여 형성되며, 항균, 항산화 및 항암효과를 갖는 셀레늄 나노 입자와 그 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 파쇄하여 고려엉겅퀴 잎 분말로 제조하는 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10); 상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고 농축하여 고려엉겅퀴 잎 추출물을 제조하는 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20); 및, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 추출물에 아셀렌산나트륨을 혼합하고 배양하여 고려엉겅퀴-셀레늄나노입자를 제조하는 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30);를 포함하는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자의 그 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서의 추출용매는 메탄올(MeOH)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서의 교반은 300 ~ 900rpm의 속도로 48 ~ 96 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 여과는 Whatman 여과지를 이용하며, 농축은 회전증발기를 이용하여 40 ~ 60℃에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30)에서의 아셀렌산나트늄은 5mM 내지 10mM의 농도인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30)의 고려엉겅퀴 잎 추출물과 아셀렌산나트륨은 5 : 95 ~ 10 : 90의 중량비로 혼합되어 12 ~ 48시간 동안 배양되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 파쇄한 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고, 농축하여 얻어진 고려엉겅퀴 잎 추출물에 아셀렌산나트륨을 혼합하고 배양하여 형성된 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자를 제공한다.
또한, 상기 추출용매는 메탄올(MeOH)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물은, 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 300 ~ 900rpm의 속도로 48 ~ 96 시간 동안 교반하고, 여과하고, 농축하여 얻어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물은 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고, 회전증발기를 이용하여 40 ~ 60℃에서 농축하여 얻어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 아셀렌산나트늄은 5mM 내지 10mM의 농도인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물과 아셀렌산나트륨은 5 : 95 ~ 10 : 90의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자는 고려엉겅퀴의 잎으로부터 추출한 고려엉겅퀴 잎 추출물을 아셀렌산나트륨과 혼합하여 형성되며, 항균, 항산화 및 항암효과를 갖는다.
도 1은 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 2에 대한 UV 분광 광도 분석 그래프.
도 2는 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 대한 XRD 분석 그래프.
도 3은 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 대한 FTIR 분석 그래프.
도 4는 실시예 1에 대한 TEM 분석 이미지.
도 5는 실시예 1에 대한 EDS 크로마토그래피 이미지.
도 6 및 도 7은 실시예 1에 대한 제타 사이즈 및 제타 전위의 DLS 분석 그래프.
도 8은 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 대한 DPPH 소거능을 나타낸 그래프.
도 9는 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 대한 ABTS 소거능을 나타낸 그래프.
도 10은 NIH3T3에 실시예 1 및 비교예 1 내지 2를 농도별로 투입하여 NIH3T3가 생존하는 정도를 나타낸 그래프.
도 11은 A549에 실시예 1 및 비교예 1 내지 2를 농도별로 투입하여 A549가 생존하는 정도를 나타낸 그래프.
도 12는 실시예 1과 비교예 1 내지 2를 처리한 암세포(A549)에 대해, 각각
이하의 본 발명에 관한 상세한 설명들은 본 발명이 실시될 수 있는 실시 예이고 해당 실시 예의 예시로써 도시된 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당 업자가 본 발명의 실시에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시 예에 관련하여 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 기재된 실시 예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.
따라서 후술되는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 적절하게 설명된다면 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
이하, 본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자의 제조방법에 대하여 설명한다.
본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자의 제조방법은 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 파쇄하여 고려엉겅퀴 잎 분말로 제조하는 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10); 상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고 농축하여 고려엉겅퀴 잎 추출물을 제조하는 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20); 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 추출물에 아셀렌산나트륨을 혼합하고 배양하여 고려엉겅퀴-셀레늄나노입자를 제조하는 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30)를 포함한다.
우선, 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)를 수행한다.
상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서는 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 파쇄하여 고려엉겅퀴 잎 분말로 제조한다.
상기 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀이다. 상기 고려엉겅퀴는 산과 들에서 높이 약 1m까지 자라고, 뿌리가 곧으며 가지가 사방으로 퍼진다. 상기 고려엉겅퀴의 뿌리에 달린 잎과 밑부분의 잎은 꽃이 필 때 시든다. 상기 고려엉겅퀴의 줄기에 달린 잎은 타원 모양 바소꼴 또는 달걀 모양으로 밑쪽 잎은 잎자루가 길고 위쪽 잎은 잎자루가 짧다. 상기 고려엉겅퀴 잎의 앞면은 녹색에 털이 약간 나며 뒷면은 흰색에 털이 없고 가장자리가 밋밋하거나 가시 같은 톱니가 있다. 상기 고려엉겅퀴는 한국 특산종으로 전국에 분포한다. 본 발명에서는 상기 고려엉겅퀴의 잎을 사용한다.
상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서는 고려엉겅퀴의 잎을 깨끗이 세척하고 건조하여, 수분이 없도록 하는 것이 적절하며, 건조된 고려엉겅퀴의 잎은 100 ~ 200메쉬 크기의 미세한 입자가 되도록 파쇄하는 것이 바람직하다.
상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 분말은 직사광선이 들지 않는 실온에서 보관하는 것이 좋다.
다음으로, 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)를 수행한다.
고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서는 상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고 농축하여 고려엉겅퀴 잎 추출물을 제조한다.
한편, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서의 추출용매는 정제수, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올, 부틸렌글리콜 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것이 적절할 것이다. 가장 적절하게 상기 추출용매는 메탄올(MeOH)인 것이 바람직하다.
또한, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서의 교반은 300 ~ 900rpm의 속도로 48 ~ 96 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서의 교반은 600rpm의 속도로 72 시간 동안 수행되는 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 여과는 Whatman 여과지를 이용하며, 농축은 회전증발기를 이용하여 40 ~ 60℃에서 수행되는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 농축은 회전증발기를 이용하여 50℃에서 수행되는 것이 가장 바람직하다.
다음으로, 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30)를 수행한다.
상기 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30)에서는 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 추출물에 아셀렌산나트륨을 혼합하고 배양하여 고려엉겅퀴-셀레늄나노입자를 제조한다.
상기 아셀란산나트륨(Na2SeO3)은 아셀렌산의 진한 용액에 계산량의 수산화나트륨을 첨가하고 염화칼슘의 데시케이터 안에 방치하여 얻을 수 있으며, 백색 바늘 모양 또는 기둥 모양의 결정이다. 상기 아셀란산나트륨은 공기 중에서 안정되는데 건조 공기 중에서는 탈수된다. 상기 아셀란산나트륨은 40℃에서 무수염으로 변한다. 상기 아셀란산나트륨은 산화제(KMnO4, H2O2, MnO2 등)가 공존할 때 유기산에 의해 쉽게 환원된다.
한편, 상기 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30)에서의 아셀렌산나트늄은 5mM 내지 10mM의 농도인 것이 바람직하다.
또한, 상기 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30)의 고려엉겅퀴 잎 추출물과 아셀렌산나트륨은 5 : 95 ~ 10 : 90의 중량비로 혼합되어 12 ~ 48시간 동안 배양되는 것이 바람직하다.
상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10), 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20), 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30)를 거치면 본 발명이 제공하고자하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자가 완성된다.
이하, 본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자에 대하여 설명한다.
본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자는 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 파쇄한 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고, 농축하여 얻어진 고려엉겅퀴 잎 추출물에 아셀렌산나트륨을 혼합하고 배양하여 형성된 것을 특징으로 한다.
이 때, 상기 추출용매는 메탄올(MeOH)인 것이 바람직하다.
한편, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물은, 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 300 ~ 900rpm의 속도로 48 ~ 96 시간 동안 교반하고, 여과하고, 농축하여 얻어진 것이 바람직하다.
한편, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물은 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고, 회전증발기를 이용하여 40 ~ 60℃에서 농축하여 얻어진 것이 바람직하다.
한편, 상기 아셀렌산나트늄은 5mM 내지 10mM의 농도인 것이 바람직하다.
한편, 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물과 아셀렌산나트륨은 5 : 95 ~ 10 : 90의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자는, 셀레늄 나노 입자의 표면에 고려엉겅퀴 추출물에 포함되는 단백질 및 대사 산물이 유체학적으로 코팅되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자는, 셀레늄 나노입자 및 고려엉겅퀴 추출물 유효성분의 결합을 통해 항균, 항산화 및 항암효과가 증대된다.
이에, 하기 실험예를 통하여, 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자가 갖는 효과에 대하여 확인한다.
실시예 1. 5mM의 아셀렌산나트륨을 적용한, 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자(Cs-SeNPs(5mM)) 제조
하기 제조과정에 따라, 실시예 1의 5mM의 아셀렌산나트륨을 적용한, 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자를 제조하였다.
고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10): 고려엉겅퀴의 잎을 깨끗이 세척하고 건조하고 100메쉬의 고운 입자가 되도록 파쇄하여 고려엉겅퀴 잎 분말을 제조하였다.
고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20): 상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 분말에 메탄올을 가하면서 600rpm의 속도로 72 시간 동안 교반하고, Whatman 여과지를 이용하여 여과하고, 회전증발기를 이용하여 50℃에서 농축하여 고려엉겅퀴 잎 추출물을 제조하였다.
고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30): 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 추출물에 5mM 아셀렌산나트륨을, 각각 5 : 95의 중량비가 되도록 혼합하고 24시간 동안 배양하여 고려엉겅퀴-셀레늄나노입자(Cs-SeNPs(5mM))를 제조하였다.
실시예 2. 10mM의 아셀렌산나트륨을 적용한, 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자(Cs-SeNPs(10mM)) 제조
하기 제조과정에 따라, 실시예 2의 10mM의 아셀렌산나트륨을 적용한, 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자를 제조하였다.
고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10): 고려엉겅퀴의 잎을 깨끗이 세척하고 건조하고 100메쉬의 고운 입자가 되도록 파쇄하여 고려엉겅퀴 잎 분말을 제조하였다.
고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20): 상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 분말에 메탄올을 가하면서 600rpm의 속도로 72 시간 동안 교반하고, Whatman 여과지를 이용하여 여과하고, 회전증발기를 이용하여 50℃에서 농축하여 고려엉겅퀴 잎 추출물을 제조하였다.
고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30): 상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 추출물에 10mM 아셀렌산나트륨을, 각각 5 : 95의 중량비가 되도록 혼합하고 24시간 동안 배양하여 고려엉겅퀴-셀레늄나노입자(Cs-SeNPs(10mM))를 제조하였다.
비교예 1. 고려엉겅퀴 잎 추출물( WF - CS )의 제조
하기 제조과정에 따라, 비교예 1의 고려엉겅퀴 잎 추출물을 제조하였다.
고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10): 고려엉겅퀴의 잎을 깨끗이 세척하고 건조하고 100메쉬의 고운 입자가 되도록 파쇄하여 고려엉겅퀴 잎 분말을 제조하였다.
고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20): 상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 분말에 메탄올을 가하면서 600rpm의 속도로 72 시간 동안 교반하고, Whatman 여과지를 이용하여 여과하고, 회전증발기를 이용하여 50℃에서 농축하여 고려엉겅퀴 잎 추출물(WF-CS)을 제조하였다.
비교예 2. 아스코르브산을 이용한 셀레늄 나노 입자( AA - SeNPs ) 제조
하기 제조과정에 따라, 비교예 2의 아스코르브산(Ascorbic acid)을 이용한 셀레늄 나노 입자를 제조하였다.
아스코르브산 준비단계(S10): 아스코르브산 용액을 준비하였다.
셀레늄 나노입자 제조단계(S20): 아스코르브산 준비단계(S10)에서 준비된 아스코르브산에 5mM 아셀렌산나트륨을, 각각 5 : 95의 중량비가 되도록 혼합하고 24시간 동안 배양하여 아스코르브산-셀레늄나노입자(AA-SeNPs)를 제조하였다.
실험예 1. 셀레늄 나노 입자의 특성 확인
실시예 1 내지 4에 대하여 셀레늄 나노 입자의 특성을 확인하였다.
셀레늄 나노 입자의 안정성, 크기 및 다 분산 지수(PDI)는 Zeta Potential Particle Analyzer를 사용하여 평가하였다. 셀레늄 나노 입자의 결정질 물질의 종류와 양, 물질의 구소와 관련된 평가를 위해 XRD(X'Pert PRO MPD, Netherland)를 사용하여 셀레늄 나노입자의 결정상을 정량적으로 평가하였다. 분자의 작용기 유형에 대한 정보를 확인하기 위하여 FT-IR을 이용하였다.
우선, 도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 1 내지 2와 비교예 2의 경우 278nm에서 표면 플라스몬 공명(SPR)이 나타나 셀레늄 나노 입자가 성공적으로 합성되었음을 확인할 수 있었다. 260 ~ 280nm의 플라스몬 공명은 셀레늄 나노 입자에 해당한다. 한편, 비교예 1의 경우에는 셀레늄 나노 입자에 해당하는 피크가 나타나지 않았다.
한편, 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 대한 XRD 분석에서, 도 2에 도시된 바와 같이, 비교예4(AA-SeNPs)는 100, 101, 012 및 201의 피크를 나타냈으며, 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM))의 경우 100 및 101의 피크를 나타내었다.
또한, 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 대한 FTIR 분석에서, 도3에 도시된 바와 같이, 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM))은 3183 cm-1 (O-H stretching) 1582.93 cm-1 (N-H bending, amide), and 1399.90 cm-1 (O-H bending)에서 피크를 나타냈고, 비교예 1(CS)은 3276.36 cm-1 (NH-H- stretching, aliphatic primary amine), 2923.59 cm-1 (O-H stretching), 1735.41 cm-1 (C-H bending, aromatic compound), 1364.85 cm-1 (O-H bending), 1042.79 cm-1 (C-N stretching, amide), 823.64 cm-1 (C=C bending)에서 피크를 나타냈으며, 비교예4(AA-SeNPs)는 3160.02 cm-1 (O-H bending), 1717.12 cm-1 (C=O stretching), 1400.03 cm-1 (O-H bending)에서 피크를 나타냈다.
이는, 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM)), 비교예 1(CS) 및 비교예 2(AA-SeNPs)가 서로 상이한 결정학적 특징과, 작용기를 갖고 있음을 나타낸다. 또한, 고려엉겅퀴 추출물을 이용하여 셀레늄 입자를 합성하는 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM))의 경우에는 고려엉겅퀴 추출물에 포함되는 단백질과 대사 산물이 셀레늄 나노입자를 코팅하여, 셀레늄 나노입자를 안정화시킬 수 있음을 나타낸다. 특히, 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM))의 FTIR 분석에서 나타나는 3183 cm-1 (O-H stretching)의 피크는 고려엉겅퀴 추출물에 포함되는 페놀과 플라보노이드의 셀레늄 입자에 대한 캡핑을 입증한다.
한편, 고려엉겅퀴 추출물을 이용하여 셀레늄 입자를 합성한 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM))에 대한 TEM 분석은, 도 4에 도시된 바와 같다. 고려엉겅퀴 추출물을 이용하여 합성된 셀레늄 입자는 100nm 미만의 크기를 갖는 구형이었다.
또한, 고려엉겅퀴 추출물을 이용하여 셀레늄 입자를 합성한 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM))에 대한 EDS 크로마토그래피는, 도 5에 도시된 바와 같으며, 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM))이 O와 Se를 포함하고 있음을 나타낸다.
또한, 고려엉겅퀴 추출물을 이용하여 셀레늄 입자를 합성한 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM))에 대한 크기 및 제타전위 분석은 DLS를 통해 분석되었으며, 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같다. 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이, 실시예 1(Cs-SeNPs(5mM))의 나노입자는 평균 크기가 117.8nm이고, PDI가 0.162이며, 제타 전위가 -27.4 mV임을 나타낸다. TEM 분석과 DLS분석에서 나노 입자의 크기가 다르게 나타나는 것은 셀레늄 나노입자의 표면에 고려엉겅퀴 추출물의 분자가 유체역학적 코팅된 것에 기인한다. 한편, 하기 표 1은, 실시예 1 및 비교예 1 내지 2의 제타 전위 및 크기 분석에 관해 나타낸다.
Zeta Size PDI Zeta Potential
비교예1 - - -17.7
실시예1 117.8　±0.56 0.162±0.002 -27.4
비교예2 108.9　± 1.25 0.062±0.004 -32.4
비교예 1의 경우 셀레늄 나노 입자가 나타나지 않았으며, 이에 반해 실시예 1 과 비교예 2는 모두 셀레늄 나노 입자가 나타났다. 한편, 실시예 1과 비교예 2는 서로 상이한 수치를 나타내는 것을 확인할 수 있어, 고려엉겅퀴 추출물을 이용하여 합성된 셀레늄 입자는 상이한 방식으로 합성되는 셀레늄 나노입자와는 상이한 특성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 항산화 활성 확인
실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 대하여 항산화 활성을 확인하였다. 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 대한 자유 라디칼 소거능은 UV 분광 광도계 (UV-vis)를 사용하여, 자유 라디칼의 분자량 감소를 통한 흡광도 변화를 측정함으로써 확인되었다. 실험은 DPPH 및 ABTS에 대해 수행되었다.
DPPH 분석을 위해 100μL의 DPPH에, 각각 상이한 농도(0.3125 ~ 10mM)를 갖는 실시예 1 및 비교예 1 내지 2를 100μL를 혼합하고 어두운 조건에서 30분 동안 배양한 후 자유 라디칼 감소를 517nm에서 흡광도를 측정하였다.
ABTS 분석을 위해 100μL의 ABTS에, 각각 상이한 농도(0.3125 ~ 10mM)를 갖는 실시예 1 및 비교예 1 내지 2를 50μL를 혼합하고 10분간 어두운 상태에서 실온에 방치하고 734nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 8 및 도9에 도시된 바와 같으며, 고려엉겅퀴 추출물을 이용하여 셀레늄 입자를 합성한 실시예 1이 높은 항산화 활성을 가짐을 확인할 수 있다.
실험예 3. 항균 활성 확인
실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 대하여 항균 활성을 확인하였다.
Bacillus cereus, E. coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus와 같은 세균성 병원체는 대한민국 서울에 있는 KCCM (한국 미생물 문화원)에서 얻었다. 실시예 1 및 비교예 1 내지 2의 항균 활성은 미세 희석법으로 각 세균성 병원체에 대해 분석되었다. MIC 측정을 위해, 미리 성장한 박테리아 세포(109 CFU.mL- 1)를, 다른 농도(0.310-10μg. mL- 1)의 실시예 1 및 비교예 1 내지 2가 투입된 Muller-Hinton Broth(MHB)를 포함하는 96 웰 플레이트에 파종했다. 37℃에서 24시간 동안 배양하고 박테리아 성장 억제는 600nm에서 다른 시간 간격(3, 6, 9, 12 및 24h)에서 흡광도로 측정되었고, 이를 통해 최소 억제 농도를 계산하였다. 최소억제 농도는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
Samples MIC (mM)
Bacillus cereus Escherichia coli Salmonella enterica Staphylococcus aureus
비교예1 0.62 1.25 1.25 0.62
실시예1 0.31 0.31 0.31 0.31
비교예2 1.25 1.25 0.62 0.62
그 결과, 고려엉겅퀴 추출물을 이용하여 셀레늄 입자를 합성한 실시예 1이 높은 항균 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 생체 적합성 및 항암 효과 확인
NIH3T3 및 A549에서 SeNP의 세포 독성은 WST 분석 키트 (CELLO MAX ™)를 사용하여 테스트되었다. 먼저 DMEM 및 RPMI 배지의 작동 배지는 10 % FBS 및 1 % PS를 통합하여 준비되었다. NIH3T3는 DMEM에서 배양하고 A549 세포는 5 % CO2 가습 인큐베이터에서 RPMI에서 37℃에서 24시간 동안 배양하여 잘 부착되도록했다. 트립신 EDTA를 사용하여 세포를 수집하고 세포 현탁액 100μL / 웰 (1 X 104 세포)을 96 웰 플레이트에 분주하고, 상기 언급된 조건에서 24시간 동안 성장시켰다. 세포 합류점에 도달한 후 세포를 16시간 동안 다른 농도의 실시예 1 및 비교예 1 내지 2로 처리했다. 처리 기간 후 WST 시약 10μL를 각 웰에 첨가하고 다시 CO2 인큐베이터에서 37℃로 2시간 동안 배양한 후 96 웰 플레이트 리더와 세포 독성 백분율을 사용하여 450nm에서 세포 독성을 측정했다. 결과는 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같다.
도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이, 실시예 1과 비교예 1 내지 2는 모두 NIH3T3에서는 독성을 적게 나타내, NIH3T3세포의 세포생존율이 높게나타나며, A549세포에서는 독성을 높게 나타내, A549세포의 세포생존율은 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 1의 경우 이러한 경향이 상대적으로 더욱 도드라지게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 실시예 1과 비교예 1 내지 2를 처리한 암세포(A549)에 대해 각각 상이한 염색을 적용하여, 그에 따른 결과를 확인하였다.
암세포(A549) 활성 산소 종 생성 분석을 확인하기 위하여 DCFH-DA 염색을 수행하였다. 암세포(A549)의 미토콘드리아 막 전위 손실을 확인하기 위하여, RH123 염색을 수행하였다. 암세포(A549)의 핵 손상을 관찰하기 위하여 PI 염색을 수행하였다. 또한, 암세포(A549)의 세포사멸을 관찰하기 위하여 AO/EB 염색을 수행하였다. 한편, 암세포(A549)의 Annexin V-FITC를 기반으로 세포 사멸 단계를 측정하였다.
DCFH-DA염색, RH123염색 및 PI염색에 대한 결과는 도 12에 도시된 바와 같다. DCFH-DA 염색을 수행한 결과, 실시예 1(CS-SeNPs)에서 활성 산소 종이 가장 많이 생성되었음을 확인할 수 있었다. 또한, RH123염색을 수행한 결과, 실시예 1(CS-SeNPs)에서 미토콘드리아 막 손실이 높게 나타났음을 확인할 수 있었다. 또한, PI 염색을 수행한 결과, 실시예 1(CS-SeNPs)에서 핵 손상이 높게 나타났음을 확인할 수 있었다.
한편, AO/EB 염색에 대한 결과는 도 13의 a에 도시된 바와 같다. AO/EB 염색 분석 및 유세포 분석 분석에 의해 다른 처리와 비교할 때 실시예 1로 처리된 암세포에서 세포 사멸이 더 높게 관찰되었다. 또한, 암세포의 세포 사멸 단계 분석은 도 13의 b에 도시된 바와 같다. 이 역시 실시예 1로 처리된 암세포에서 세포 사멸이 더 많이 일어났음을 나타낸다.
결론.
상기 실시예, 비교예, 실험예에서 확인한 바와 같이, 본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자를 통해 셀레늄 나노 입자를 제조할 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 실시예, 비교예, 실험예에서 확인한 바와 같이, 본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자는, 항산화, 항균 및 항암 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 고려엉겅퀴에서 단순히 추출한 추출물인 비교예 1과 다른 방식으로 제조된 셀레늄 나노입자인 비교예 2에 비하여, 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용하여 형성한 셀레늄 나노입자의 항균, 항산화 및 항암효과가 더 개선됨을 확인하였다.
즉, 본 발명은 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자가 생의학 응용 분야에 우호적임을 입증하였다.
이에, 본 발명은 고려엉겅퀴의 잎으로부터 추출한 고려엉겅퀴 잎 추출물을 아셀렌산나트륨과 혼합하여 형성되며, 항균, 항산화 및 항암효과를 갖는 셀레늄 나노 입자와 그 제조방법을 개발하였음을 명시한다.
본 발명을 첨부된 도면과 함께 설명하였으나, 이는 본 발명의 요지를 포함하는 다양한 실시 형태 중의 하나의 실시 예에 불과하며, 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 하는 데에 그 목적이 있는 것으로, 본 발명은 상기 설명된 실시예에만 국한되는 것이 아님은 명확하다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 하기의 청구범위에 의해 해석되어야 하며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 변경, 치환, 대체 등에 의해 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리에 포함될 것이다. 또한, 도면의 일부 구성은 구성을 보다 명확하게 설명하기 위한 것으로 실제보다 과장되거나 축소되어 제공되는 것임을 명확히 한다.
(S10): 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계
(S20): 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계
(S30): 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계

Claims (12)

  1. 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 파쇄하여 고려엉겅퀴 잎 분말로 제조하는 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10);
    상기 고려엉겅퀴 잎 분말 제조 단계(S10)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고 농축하여 고려엉겅퀴 잎 추출물을 제조하는 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20); 및,
    상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 제조된 고려엉겅퀴 잎 추출물에 5mM 내지 10mM 의 아셀렌산나트륨을 5 : 95의 중량비로 혼합하고 24시간 동안 배양하여, 셀레늄 나노입자의 표면에 고려엉겅퀴 추출물의 분자가 유체역학적 코팅된 고려엉겅퀴-셀레늄나노입자를 제조하는 고려엉겅퀴-셀레늄 나노 입자 제조 단계(S30);를 포함하는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자의 그 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서의 추출용매는 메탄올(MeOH)인 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자의 그 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서의 교반은 300 ~ 900rpm의 속도로 48 ~ 96 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자의 그 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 고려엉겅퀴 잎 추출물 제조 단계(S20)에서 여과는 Whatman 여과지를 이용하며, 농축은 회전증발기를 이용하여 40 ~ 60℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자의 그 제조방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 파쇄한 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고, 농축하여 얻어진 고려엉겅퀴 잎 추출물에 5mM 내지 10mM 의 아셀렌산나트륨을 5 : 95의 중량비로 혼합하고 24시간 동안 배양하여, 셀레늄 나노입자의 표면에 고려엉겅퀴 추출물의 분자가 유체역학적 코팅된 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 추출용매는 메탄올(MeOH)인 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 고려엉겅퀴 잎 추출물은, 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 300 ~ 900rpm의 속도로 48 ~ 96 시간 동안 교반하고, 여과하고, 농축하여 얻어진 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 고려엉겅퀴 잎 추출물은 고려엉겅퀴 잎 분말에 추출용매를 가하면서 교반하고, 여과하고, 회전증발기를 이용하여 40 ~ 60℃에서 농축하여 얻어진 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자.
  11. 삭제
  12. 삭제
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