KR102450293B1 - 셀룰로오스로 코팅된 세리아 나노입자를 포함하는 세리아 나노복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 액상 플라즈마를 이용하여 세리아 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것으로, 신속한 생성이 가능하고, 제조과정에 화학적 첨가물의 추가가 요구되지 않으며, 초순도로 합성되므로, 의약 용도로 활용할 수 있다는 장점을 갖는다.

Description

셀룰로오스로 코팅된 세리아 나노입자를 포함하는 세리아 나노복합체 및 이의 제조방법{Ceria nanocomposite comprising Cellulose-Coated Nanoceria and manufacturing method of thereof}
본 발명은 셀룰로오스로 코팅된 세리아 나노입자와 이를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체적합성이 우수하면서도 항산화 활성이 현저히 개선된 셀룰로오스로 코팅된 세리아 나노입자를 신속하고 빠르게 합성할 수 있는 방법에 관한 것이다.
최근 퇴행성 질환을 극복하거나 예방하는 새로운 치료제로, 나노의약이 각광받고 있다. 그러나 종래 나노입자들은 화학적 또는 물리적 방법으로 제조되고, 이러한 방법으로 제조된 나노입자들은 독성 화학물질, 고가의 장비 및 강수량, 열, 전자파, 안정화 등등의 복잡하고 민감한 공정들을 필수적으로 요구한다. 게다가 각 공정에 따라 첨가제, 계면활성제 또는 완전히 제거되지 않는 화학물질들이 혼입되어야 하며, 공정이 완료된 후에도 완전히 제거되지 않을 수 있고, 세포 독성에 영향을 미칠 수 있다.
세리아(ceria, CeO2)는 고온에서 열적 안정하고, 격자 구조에 의해 주위의 산소 농도에 따라 Ce4+/Ce3+의 산화 환원 작용을 하며, 우수한 산소 저장 능력을 가지고 있어, 촉매, 고체 전지의 전해질, UV 필터의 물질, 산소 센서, 광학 기기와 같이 다양한 산업 분야에서 유용한 소재로 활용되고 있다.
생체의약 분야에서도 세리아 입자를 활용하기 위한 다양한 기술들이 개발되어 오고 있다. 일반적으로 세리아 입자는 수열법(hydrothermal)을 통해 합성되어 왔다. 수열법으로 합성된 세리아 입자는 대개 수백 nm에서 수 마이크론의 입경을 가지지만, 이후 수소결합에 의해 응집되어 수백 nm에서 수 마이크론 크기의 2차 입자를 이루게 되므로, 입도의 제어가 매우 어렵다는 단점이 있다.
또한, 일반적으로 널리 사용되는 sol-gel법을 통해서는 세리아 나노입자의 합성 자체도 어려울 뿐 아니라, 합성하더라도 입자의 분산성을 유지하기 힘들고 사용 용매에 제한이 있다. 또한, 공정이 복잡하며 제조 공정의 경제성 및 수율이 낮다.
한편, 종래 세리아 나노입자는 세포의 복잡한 시스템에 대해서는 고려하지 않고 단지 항산화 활성만을 집중적으로 분석하였다. 그러나 세리아 나노입자를 다양한 세포(HepG2, A549, CaCo2)에 다양한 시간(1 내지 10 일)동안 노출한 결과, 세리아 나노입자는 장기 노출에 대해 모든 세포주에 대해 독성을 나타내는 것으로 확인된 바 있으며, 24시간 단기 노출에서는 유전 독성이 나타남이 확인된 바 있다(비특허문헌 1).
특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-1996-0004212호\
비특허문헌 1. De Marzi, L.; Monaco, A.; Lapuente, J. E.; Ramos, D.; Borras, M.; Gioacchino, M. D.; Santucci, S.; Poma, A. Cytotoxicity and Genotoxicity of Ceria Nanoparticles on Different Cell Lines In Vitro. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 3065-3077.
본 발명자들은 새로운 구조의 세리아 나노복합체 및 이를 제조할 수 있는 새로운 방법을 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 액상 플라즈마를 활용한 전략을 고안하였고, 이를 이용하여 물리적 화학적 파라미터가 최적화된 새로운 구조의 세리아 나노복합체를 빠르고, 정확하게 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 생체적합성이 우수한 세리아 나노복합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 액상 플라즈마를 이용해 빠르고, 정확하게 최적화된 물리적 화학적 파라미터를 갖는 새로운 구조의 세리아 나노복합체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 제조방법으로 제조된 생체적합성이 우수하면서도 세포의 산화 스트레스를 현저히 감소시키고 조직 손상의 회복을 촉진하는 효과를 나타내는 세리아 나노복합체를 포함하는 항산화용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 대표적인 일 측면에 따르면, 세리아 나노입자 및 상기 세리아 나노입자 표면을 둘러싸고 있고, 셀룰로오스를 포함하는 코팅층;을 포함하는 세리아 나노복합체에 관한 것이다.
상기 세리아 나노복합체는 다공성일 수 있다.
상기 세리아 나노복합체는 해면 모양의 타원형 기공과, 마이크로섬유를 갖는 기공이 형성되어 있고, 상기 마이크로 섬유를 갖는 기공은 상기 세리아 나노복합체의 엣지에 위치하는 것일 수 있다.
상기 세리아 나노복합체는 평균 입경이 1 내지 40 ㎚일 수 있다.
상기 세리아 나노복합체는 1 ㎚ 거리의 뚜렷한 격자 가장자리(Distinct lattice fringes)를 갖는 구형의 입자일 수 있다.
상기 세리아 나노복합체의 EDS 맴핑 결과, 세리아 나노복합체의 표면에는 2가(bivalent) Ce(청색)와 O(녹색)가 전체적으로 고루 분포되어 있는 것일 수 있다.
에너지 분광 분석(Energy Dispersive Spectroscopy, EDS)를 통하여 상기 세리아 나노복합체를 분석하였을 때, O(K-series)와 Ce(L-series) 원소를 제외하고는 검출되지 않은 것일 수 있다.
X-선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)을 통하여 상기 세리아 나노복합체를 분석하였을 때, 상기 세리아 나노입자의 표면 상에 세륨 원자들이 두 다른 산화 상태(Ce3+ 및 Ce4+)로 존재하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 다음 단계들을 포함하는 세리아 나노복합체의 제조방법에 관한 것이다.
1) 세리아 전구체와 셀룰로오스를 용매에 용해시켜 반응액을 제공하는 단계; 및
2) 상기 반응액 내에 플라즈마를 발생시켜 제1항에 따른 세리아 나노복합체를 합성하는 액상 플라즈마 반응단계.
상기 세리아 전구체는 세륨 질산염일 수 있다.
상기 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 반응액에서 세리아 전구체의 농도는 1 내지 5 mM일 수 있다.
상기 액상 플라즈마 반응 단계는 상기 반응액에 노출된 전극으로 공급되는 전원의 전압 800V, 주파수 30 KHz일 수 있다.
상기 액상 플라즈마 반응 단계는 1 내지 25 분일 수 있다.
본 발명의 또 다른 대표적인 일 측면에 따르면 상기 제조방법에 따라 제조된 세리아 나노복합체를 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대표적인 일 측면에 따르면 세리아 나노복합체를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 산화적 스트레스에 의한 질환은 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 당뇨병, 간질, 파킨슨씨병 및 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 여러 구현예에 따르면, 액상 플라즈마를 통해 합성된 세리아 나노복합체는 신속한 생성이 가능하고, 제조과정에 화학적 첨가물의 추가가 요구되지 않으며, 초순도로 합성되므로, 의약 용도로 활용할 수 있다는 장점을 갖는다.
또한 본 발명의 제조방법에 따라 합성된 세리아 나노복합체는 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않는 바람직한 생체 적합성을 가지며, 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성, ˙OH 라디칼 소거 활성과 O2-˙ 라디칼 소거 활성 및 과산화수소 라디칼 소거 활성을 가질 뿐만 아니라 세포 내에서 향상된 항산화활성을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 세리아 나노복합체는 세포의 산화적 스트레스로 인해 야기된 다양한 질환을 치료, 예방 또는 개선하는데 활용될 수 있다.
도 1은 세리아 나노복합체를 합성하기 위한, 액상 플라즈마 장치를 개략적으로 도시한 도면과 사진이고, 도 2는 세리아 나노복합체를 합성하기 위한 공정과정을 개략적으로 도시한 도면과 사진이다. 900 V에서 1 ㎜의 갭을 두고 나란히 배치된, 텅스텐 전극이 장착된 반응기로, 상기 반응기에서 1 내지 5 mM의 Ce(NO3)2 및 1% 셀룰로오스를 함유한 반응액을 넣고 0-25 분동안 플라즈마를 방전시키면, 다양한 이온 및 라디칼이 생성되어 다양한 반응을 촉진하여 세리아 나노복합체를 합성할 수 있다.
도 3은 실시예 1 및 실시예 2로부터 제조된 세리아 나노입자의 물리적 특성 분석결과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 3a는 5 mM Ce(NO3)2 및 1% 셀룰로오스 반응액을 사용한 다양한 방출시간으로 제조된 세리아 나노복합체(실시예 2)의 흡광도 변화를 측정한 UV-Vis 스펙트럼이다.
도 3b는 5 mM Ce(NO3)2 반응액을 사용한 다양한 방출시간으로 제조된 세리아 나노입자(실시예 2-15)에 대한 C1Ce0 및 C1Ce5의 FTIR 스펙트럼으로, 대조군으로 셀룰로오스에 대해서 FTIR 분석을 실시하였다.
도 3c는 실시예 2-15로부터 제조된 세리아 나노복합체에 대한 Ce 및 O2의 신호를 측정한 EDS 스펙트럼이다.
도 3d는 실시예 2-15로부터 제조된 세리아 나노복합체에 대한 2가 산화 상태(Ce3+ and Ce4+)를 나타낸 XPS 분석결과이다.
도 4는 실시예 2-15로부터 제조된 세리아 나노복합체의 3D 스캐폴드 구조를 FESEM으로 분석한 결과이다. 구체적으로 도 4a는 세리아 나노복합체(실시예 2-15)의 C1Ce0의 마이크로기공(microporous) 구조를 FESEM으로 분석하여 나타낸 도면이고, 도 4b 및 도 4c는 세리아 나노복합체(실시예 2-15)의 C1Ce5의 마이크로기공(microporous) 구조를 FESEM으로 분석하여 나타낸 도면이다. 스케일 바는 10 μm이다.
도 4d는 세리아 나노복합체(실시예 2-15) 중에서 선택된 표면에 대한 EDS 매핑결과이다. 스케일 바는 10 μm이다.
도 5는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체를 TEM로 측정한 결과이다. 구체적으로 도 5a는 15 분 동안 플라즈마를 방출하여 합성된 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 C1Ce5에 대한 TEM 이미지이고, 도 5b는 도 5a의 구조를 개략적으로 도시한 것이며, 도 5c는 15 분 동안 플라즈마를 방출하여 합성된 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 격자 가장자리(lattice fringes)를 확인하기 위한, HRTEM 이미지이다. 도 5d는 15 분 동안 플라즈마를 방출하여 합성된 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 크기 분포를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 pH, 농도에 따른 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 항산화제 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 6a는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 6b는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 ˙OH 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 6c는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 6d는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 과산화수소 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 7a는 다양한 농도(0-1600 ㎍/㎖)의 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체를 HeLa 세포에 24 시간동안 처리하여 측정한, 세포의 생존율을 나타낸 그래프이고, 도 7b는 다양한 농도(0-1600 ㎍/㎖)의 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체를 HeLa 세포에 48 시간동안 처리하여 측정한, 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다. STS를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 8은 생체 외에서(in vitro), 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 항산화 활성을 측정하여 나타낸 결과로, 도 8a 및 d는 아무것도 처리하지 않은 HeLa 세포(정상 대조군), 도 8b 및 e는 ROS가 형성되는 STS(1 μM)로 처리된 ROS 세포(음성 대조군)(b), 손상된 핵(nucleus)(e)이고, 도 8c 및 f는 세포 감소와 핵 손상이 없는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체(1000 ㎍/㎖)로 처리된 세포(실험군)이다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명은 액상 플라즈마를 활용한 세리아 나노복합체의 새로운 합성방법에 관한 것으로, 공정시 환원제, 안정화제 및 계면활성제와 같은 유해 화학물질을 사용하지 않으면서, 물리적, 화학적 파라미터가 최적화된 세리아 나노복합체를 신속하고 정확하게 제조할 수 있다는 강점을 갖는다.
상기 방법을 통해 합성된 세리아 나노복합체를 X-선 광전자 분광기(XPS), 고해상도 투과 전자 현미경(HRTEM), 전계 방출 전자 분광기(FESEM), 에너지 분산 분광기(EDS) 및 UV-Vis 분광법을 통해 특성을 분석하고, 인 비트로 상에서의 생리활성을 분석한 결과, 정상세포 또는 암세포 모두에서 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었고 세포에 대한 ROS 저해효과를 나타냈으며, 산화스트레스를 현저하게 감소시키고 조직 손상의 회복을 촉진시키는 항산화 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 측면은 세리아 나노입자 및 상기 세리아 나노입자 표면을 둘러싸고 있고, 셀룰로오스를 포함하는 코팅층;을 포함하는 세리아 나노복합체에 관한 것이다.
상기 세리아 나노복합체는 다공성인 것을 확인하였다. 구체적으로 상기 세리아 나노복합체는 해면 모양의 타원형 기공과, 마이크로섬유를 갖는 기공이 형성되어 있고, 상기 마이크로 섬유를 갖는 기공은 상기 세리아 나노복합체의 엣지에 위치한다.
상기 세리아 나노복합체는 평균 입경이 1 내지 40 ㎚일 수 있다.
또한, 상기 세리아 나노복합체는 1 ㎚ 거리의 뚜렷한 격자 가장자리(Distinct lattice fringes)를 갖는 구형의 입자임을 후술하는 HRTEM 분석을 통해 확인하였다.
에너지 분광 분석(Energy Dispersive Spectroscopy, EDS)를 통하여 상기 세리아 나노복합체를 분석하였을 때, O(K-series)와 Ce(L-series) 원소를 제외하고는 검출되지 않은 것을 확인하였다. 또한 X-선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)을 통하여 상기 세리아 나노복합체를 분석하였을 때, 상기 세리아 나노복합체의 표면 상에 세륨 원자들이 두 다른 산화 상태(Ce3+ and Ce4+)로 존재하는 것을 확인하였다.
종래의 방법으로 합성된 세리아 나노입자들의 ˙OH 소거 활성은 고농도(1 μM)에서 최고 ˙OH 소거 활성이 60%였는데 반해, 본 발명의 액상 플라즈마 공정으로 제조된 세리아 나노복합체는 60 ㎍/㎖ 농도에서 모두 60% 이상의 ˙OH 라디칼 소거 활성을 나타내어, ˙OH 라디칼에 대한 강력한 항산화 효과를 가지는 것을 확인하였다. 나아가 본 발명의 액상 플라즈마 공정으로 합성된 세리아 나노복합체는 O2 - , DPPH 및 과산화수소에 대해서도 우수한 소거 활성을 갖는다.
본 발명에 따라 제조된 세리아 나노복합체는 농도가 증가함에 따라, 산화 손상으로부터 세포를 보다 효과적으로 보호하고, 세포 내 ROS 생성을 억제하는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 세리아 나노복합체는 세포 내에서 현저히 우수한 항산화 특성도 가지고 있음을 확인한 바, 산화적 스트레스에 의해 야기되는 질환 예컨대 퇴행성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 효과적임을 알 수 있다. 종래 침전법으로 합성된 세리아 나노입자는 세포독성을 가져, 유전적 손상을 야기하였고, HepG2 및 A549 세포에 대해 가장 낮은 농도에서 높은 독성을 나타내는 부작용이 있음을 확인하였다. 이렇듯 기존의 세리아 나노입자들은 세포독성과 부작용으로 인해 치료제로써 활용이 제한되었다
본 발명은 환원제 또는 안정화제로서 유해 화학물질이 필요없다는 장점이 있다. 전자현미경 연구를 통해 확인한 결과, 본 발명의 세리아 나노복합체는 응집이 없는 단분산 형태의 입방형의 세리아 나노입자가 셀룰로오스에 의해 표면이 둘러쌓인 형태였다. 세리아 나노복합체는 생체 외에서(in vitro) pH 의존적으로 ㅇOH 및 O2- 라디칼에 대한 높은 소거 활성을 나타내었다. 게다가, 상기 세리아 나노복합체는 고농도로 존재할 때에도 어떠한 세포의 형태학적 변화나 세포 생존율 저하를 일으키지 않는, 현저히 우수한 생체 적합성을 가지고 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따라 제조된 세리아 나노복합체는 그 표면에 형성된 원자가 상태로 인해, 세포 독성을 야기하지 않으며, ROS 소거활성이 우수함을 알 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 다음 단계들을 포함하는 세리아 나노복합체의 제조방법이 개시된다.
1) 세리아 전구체와 셀룰로오스를 용매에 용해시켜 반응액을 제공하는 단계; 및
2) 상기 반응액 내에 플라즈마를 발생시켜 상기 세리아 나노복합체를 합성하는 액상 플라즈마 반응단계.
세리아 나노입자는 촉매, 고체 전지의 전해질, UV 필터의 물질, 산소 센서, 광학 기기와 같이 다양한 산업 분야에서 큰 주목을 받아왔다. 그러나, 세리아 나노입자는 세포에서 독성이 유도될 수 있음을 확인한 바, 본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하고 생명, 화학, 의약 및 약물전달 분야에서도 활용될 수 있는 물리적 화학적 특성을 갖는 새로운 구조의 세리아 나노복합체를 경제적이고 효율적으로 제조하고자 한다.
구체적으로 1) 세리아 전구체와 셀룰로오스를 용매에 용해시켜 반응액을 제공한다.
상기 세리아 전구체는 세륨 질산염(cerium nitrate, Ce(NO3)2)을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세륨 질산염을 용매에 용해시켜 세리아 이온이 함유된 반응액을 제조하게 되고, 상기 반응액 내에는 세리아 이온(Ce3+, Ce4+)이 존재하게 된다.
본 발명에서 상기 셀룰로오스는 상기 셀룰로오스는 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 미정질 셀룰로오스를 사용할 수 있다.
상기 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 보다 바람직하게는 물일 수 있다. 물이 사용될 경우에는 세리아 나노복합체를 초순도로 얻을 수 있다. 이외에 다른 용매가 사용될 경우에는 부가적인 화학물질이 포함되므로, 물을 사용하는 경우에 비하여 순도가 낮아질 수 있기 때문에, 의약용도로 사용하기 위해서는 추가적인 정제 공정이 필요하다. 나아가 이 경우 물을 용매로 하여 합성된 본 발명의 세리아 나노복합체의 물리적 화학적 특성이 달라지게 되므로, 항산화 활성과 생체적합성이 저하되므로 바람직하지 못하다.
상기 반응액에서 세리아 전구체의 농도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 용액 내 농도가 바람직하게는 1 내지 5 mM일 수 있다. 상기 세리아 전구체의 농도에 따라 세리아 나노복합체에서 코어에 위치하는 세리아 나노입자의 평균 직경에 영향을 줄 수 있다. 따라서 평균 입경이 1 내지 40 ㎚가 되도록 하기 위해서는 세리아 전구체의 농도가 1 내지 5 mM인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 5 mM 인 것일 수 있다. 5 mM 미만일 경우에는 셀룰로오스 대비 낮은 세륨염의 농도로 인해, 제대로 된 코어-쉘 구조의 세리아 나노복합체를 얻을 수 없고, 5 mM을 초과할 경우에는 액상 플라즈마의 방출에 의한 합성이 어려워질 수 있다.
상기 반응액에서 셀룰로오스의 농도는, 반응액 총 부피를 기준으로 0.1 내지 10 중량%일 수 있고, 바람직하게는 0.5 내지 5 중량% 일 수 있고, 0.5 내지 1 중량%일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 중량%이다. 예를 들어 반응액 100 ml 당 0.5 내지 1 mg 포함되는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 100 ml 당 1 mg 포함될 수 있다.
이후 2) 상기 반응액 내에 플라즈마를 발생시켜 세리아 나노복합체를 합성하는 액상 플라즈마 반응단계이다.
본 발명에 적용된 액상 플라즈마(solution phase plasma, SPP)는 고밀도 고에너지 플라즈마를 유체 속에서 발생시켜 하나의 공정으로 합성 및 분산하는 기술로, 경제적이고 생산성 확보가 용이하며, 물리적 화학적 특성이 제어됨으로써 우수한 생체 적합성 및 항산화 활성을 갖는 세리아 나노복합체를 제조할 수 있다.
액상 플라즈마는 액체 중에 전기에너지 인가에 다른 이온과 전자의 흐름은 액체 중에 플라즈마를 발생시키고, 인가되는 전기 에너지양이 증가함에 따라 이온과 전자의 흐름이 증가되어 플라즈마의 강도가 달라진다. 본 발명에서는 플라즈마의 발생은 전자의 흐름과 관계되며 액체 내에 존재하는 세리아 전구체(세리아 이온)에 전자가 제공되어 세리아 나노복합체를 합성하게 된다. 이때 셀룰로오스에 의해, 세리아 나노입자의 핵 형성을 방지하므로, 세리아 나노입자가 응집 및 성장하지 못하고, 입방체 구조로 형성되게 된다.
본 발명에서 사용한 액체 플라즈마 장치는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 것이 이용되며, 본 발명의 실험예에서 사용된 액상 플라즈마 반응장치의 구조를 하기 도 1에 나타내었고, 과정은 도 2에 나타내었다. 구체적으로 본 발명에서 사용한 액상 플라즈마 반응장치는 원통형의 테플론 반응기와, 반응기 내에 반응액을 순환시켜 일정한 온도로 유지하기 위한 냉각 시스템과 순환펌프, 반응기에 설치된 한 쌍의 전극과, 전극에 전원을 공급하기 위한 전원공급기(bipolar pulse power supply)로 이루어진 것을 사용하였다. 전극은 텅스텐 소재로 이루어지며, 두 전극 간 거리는 약 1 ㎜로 유지되는 것을 사용하였다.
상기 원통형의 테플론 반응기는 도 1에서와 같이, 밀폐되어 있는 것이 바람직하다.
상기 액상 플라즈마 반응장치에서, 원통형의 테플론 반응기 내에 반응액을 넣고, 상기 반응액에 전원이 공급되면 전기 방전에 의해 용액 중에서 플라즈마가 형성되어 세리아 나노복합체가 합성된다. 이때 반응액의 온도가 상승되는 것을 방지하고자 냉각 시스템을 통해 온도를 20~30 ℃로 유지하였다. 상기 반응기와 냉각 시스템은 연결되어 있으며, 순환펌프를 순환될 수 있다. 또한 상기 액상 플라즈마 반응장치는 반응액의 일정한 혼합 및 용질의 완전한 분산을 위해 자기 교반기를 더 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 반응액 중에 다양한 시간(1 내지 15 분) 동안 30 kHz, 800 V의 조건으로 액상 플라즈마를 방출하여 세리아 나노복합체를 합성하였다. 상기 액상 플라즈마 반응 단계는 상기 반응액에 노출된 전극으로 공급되는 전원의 전압 800V, 주파수 30 KHz인 것이 바람직한데, 상기 전압보다 높고, 주파수가 낮을 경우 세리아 나노복합체를 제조하기 위해 2~10배의 시간이 더 소요되며, 정밀하게 제어된 크기의 세리아 나노복합체를 얻을 수 없다는 문제점이 있다.
상기 반응액에 액상 플라즈마를 방출함으로써, 낮은 온도, 대기 조건 하에서 세리아의 핵생성과 성장이 이루어지며, 핵생장과 성장이 셀룰로오스에 의해 방지되게 되므로 정밀하게 제어된 크기(1 내지 40 nm)의 입방형 구조의 세리아 나노입자와 이의 표면을 둘러싼 셀룰로오스 코팅층을 갖는 세리아 나노복합체가 합성되게 된다.
이에 반해 본 발명의 따른 제조방법은 정밀하게 제어된 구조를 갖는 세리아 나노복합체를 얻기 위해 상기 액상 플라즈마 반응 단계가 1 내지 25 분이면 충분하며, 바람직하게는 15 내지 25 분부터 충분한 생리활성 기능을 갖는 세리아 나노복합체를 얻을 수 있다는 큰 장점을 갖는다.
상술한 과정을 통해 제조된 세리아 나노복합체는 별도의 계면활성제를 첨가하지 않으면서도, 초순도로 합성할 수 있으므로 추후 생체재료로서 우수한 특성을 나타낼 수 있게 된다.
추가적으로 상기 2) 단계를 통해 합성된 세리아 나노복합체만을 회수하기 위하여, 상기 세리아 나노복합체를 원심분리하여, 분리할 수 있다. 필요에 따라 건조하여 분말화할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 세리아 나노복합체는 항산화 활성을 가지며, 고농도에서도 부작용이 없으므로 항산화용 식품 조성물, 피부외용제, 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 항산화용 조성물은 피부외용제일 수 있으며, 구체적으로 용액제, 현탁제, 스프레이제, 패취제, 패드제, 크림제, 연고제, 겔제로 제조될 수 있다.
상기 용액제는 유효성분 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면 물, 에틸알코올, 이소프로필알코올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 특히 면실유, 낙화생유, 동백유, 알로에베라, 글리세린, 천연옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유, 아몬드유 및 참깨유, 글리세롤, 글리세롤 포름알코올, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있으며, 보존제로서 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 솔브산 등을 포함할 수 있다.
현탁제는 유효성분 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 액상 희석제 (예: 물, 에틸알코올 및 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 및 현탁제 (예: 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 소르비탄 에스테르, 셀룰로오스 유도체 및 수소화 식용유지), 미세 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.
연고제, 크림제 및 겔제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 동물성 및 식물성 지방, 왁스 파라핀, 전분, 타르가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 산화 아연 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있으며, 그 제형에 있어 특별히 한정되지 않고 통상의 제형을 가질 수 있다. 구체적으로 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 액체 또는 고체 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징 로션, 클렌징크림, 바디 로션, 바디 클렌저 및 입욕제를 포함한다.
상기 화장료 조성물은 세리아 나노복합체 외에 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제 또는 지질 소낭과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다. 본 발명의 항산화용 조성물 총 중량에 상기 세리아 나노복합체는 바람직하게 0.00001 내지 50 중량부, 보다 바람직하게 0.0001 내지 10 중량부, 가장 바람직하게 0.001 내지 0.1 중량부로 포함될 수 있다.
또한 상기 조성물은 산화적 스트레스와 활성산소종의 작용에 의해 악화된 피부 상태를 개선하기 위한 용도로 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 피부의 산화에 의한 손상, 예를 들면 반점(갈색반), 주근깨, 피부균열, 자외선 손상(햇볕에 탐), 피부 표면의 주름 생성, 탄력의 감소와 같은 증상들을 예방 또는 개선할 수 있으므로, 피부 노화 억제용, 피부 탄력 유지용, 피부 주름 개선용, 피부 미백용으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 세리아 나노복합체는 항산화 활성이 있으므로, 화장품 자체의 산화를 방지함으로써 화장품의 품질을 유지하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 조성물은 항산화 효과가 우수하므로, 산화 스트레스를 예방하기 위해 섭취가능한 식품 조성물로 활용할 수 있다.
상기 식품 조성물은 그 종류가 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품으로 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수도 있다. 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화 될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류 등으로 제조될 수도 있다. 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적절하게 선택하여 배합할 수 있음은 물론이다.
또한, 본 발명의 식품 조성물에 포함되는 세리아 나노복합체는 항산화 활성이 우수하여 산화에 의해서 일어나는 식품의 냄새나 풍미의 변화, 유지의 산패, 그리고 식품의 변색을 효과적으로 방지할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 조성물을 통상의 각종 식품류에 배합함으로써 이들 식품류를 보존하거나 식품의 신선도 및 품질을 장기간에 걸쳐 유지하기 위해 사용할 수도 있다.
상기 식품류로는 전형적인 식품뿐만 아니라, 음료(알콜성 음료도 포함함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용 식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 제조방법을 통해 제조된 세리아 나노복합체를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 산화적 스트레스에 의한 질환은 노인성 질환 중 심장질환, 암, 당뇨병, 뇌혈관 질환, 동맥경화증 등일 수 있으며, 특히 당뇨병에서 혈관합병증의 발생 및 노화관련 질병에 산화적 스트레스가 중요한 요인이라고 인식되고 있다.
생체에서 호흡을 통한 에너지의 생산, 면역 활동을 통한 병의 예방, 독성물질이 생체 내 투여되었을 때 간에서의 무독화반응, 생체의 균형을 유지하는 활동, 및 운동 등 일상생활의 한 부분인 정상적인 생활의 활동임에도 불구하고 이런 활동으로부터 ROS(Reactive Oxygen Species)가 생산된다. 건강한 상태에서는 ROS의 생성속도가 생체조직이 보유한 항산화 체계의 ROS 제거속도에 미치지 못한다. 따라서 산소를 이용하는 모든 생물체는 친산화성물질(prooxidants)과 항산화성 물질(antioxidants)간의 균형을 유지하는 것이 필수적이다. 본 발명에서 산화적 스트레스(oxidative stress)란, 상기 생물체 내에서 균형이 무너져 친산화성물질이 우세하여 산화적 손상이 발생할 수 있는 경우를 의미한다.
상기 산화적 손상은 생체 내의 DNA에 손상을 초래하여 발암 및 돌연변이 등의 세포기능장애를 유발하며, 노화, 동맥경화, 피로, 성인병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 적정량의 활성산소는 생체 내의 면역기능에 관계된 체내 식세포나 대식세포의 살균작용 등에서 긍정적인 효과를 나타내지만, 균형을 깨뜨리는 과다한 양의 활성산소는 단백질의 변성이나 생체막의 지질과산화, DNA의 변성 등을 일으켜 산화적 스트레스를 발생시킨다. 즉, 단백질의 -SH기와 활성산소가 반응하여 효소의 활성을 잃게 하고 생체막의 산화에 따른 막 손상에 의해 세포 사멸을 유발한다.
구체적으로 상기 산화적 스트레스 관련 세포의 병태로서는 미토콘드리아 기능이상, 라이소좀 및 프로테아좀 기능 이상, 핵산(예를 들어, RNA 및 DNA)의 산화, 아폽토시스의 개시, 지질 퍼옥사이드화 및 막지질 환경의 파괴가 있을 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 약학 조성물을 적용할 수 있는 질환으로는 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 당뇨병, 간질, 파킨슨씨병 및 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 질환이 있으나, 이에 한정하지 아니하며 본 발명에 따른 약학적 조성물은 활성 산소로 인해 발생하는 질환 또는 증상을 완화시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물은 피부외용제의 형태로 제공되는 것이 가장 바람직할 수 있다. 구체적으로, 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 겔제 또는 에어로졸제 등의 피부외용제의 형태로 사용될 수 있다.
또한 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경구제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 가질 수 있다. 예컨대, 해당 부위에 국부적으로 사용되는 피부외용제인 경우에는 통상적인 첨가제, 예를 들어 보존제, 의약 침투를 보조하는 용매, 연고 및 크림의 경우 연화제 등을 포함할 수 있으며, 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 통상적 담체를 함유할 수 있다. 해당 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학 조성물을 제제화나 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 성분들은 유효성분, 즉 애기땅빈대 분획물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 1~10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
실험재료
셀룰로오스 분말은 한국 삼성 정밀 화학으로부터 구매하여 사용하였다. Ce(NO3)2는 Sigma Aldrich Co., USA로부터 구입하여 사용하였다. HeLa 세포는 10% 태아소혈청(FBS, Biowest, France), 형광 염색 염료(DCFH-DA) 및 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies, USA)을 함유한 Dulbecco Modified Eagle 's Medium(DMEM, Biowest, France)에서 배양하였다. 상기 세포는 5% CO2로 채운 인큐베이터(MCO-20AIC-PR, Panasonic, Japan)에서 37 ℃의 T-24 플라스크를 사용하여 배양하였다. Staurosporine(STS, Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA)을 DMSO(dimethyl sulfoxide)(Sigma, USA)에 1 mM의 농도로 용해하여, stock을 제조하였고, 이는 성장 배지에 1 μM의 최종농도가 되도록 첨가하여 ROS를 유도하는데 사용되었다.
본 발명에서 사용된 다른 모든 화학물질 및 시약은 최고 품질을 사용하였다. 탈이온수(Deionized water)를 사용하여 시약을 제조하였다. 세포 독성 및 ROS 분석을 위해 HeLa 세포를 사용하였다.
<실험방법 1. 세리아 나노복합체의 특성 분석>
액상 플라즈마를 사용하여 합성된 세리아 나노복합체는, UV-Visible 분광 광도계(UV-3600, UV-Vis spectrophotometer, Shimadzu, Japan)를 사용하여 200-1200 ㎚의 범위에서 확인하였다.
3D 스캐폴드에서 세리아 나노복합체의 구조를 확인하기 위하여, FE-SEM(field-emission scanning electron microscope)(JEOL-JSM-7001F, Japan)을 사용하여 분석하였다. 산화상태는 X-선 광전자 분광법(X-ray photospectroscopy)(VersaProbe II, PHI, Japan)에 의해 확인하였다. 세리아 나노복합체의 기능적 연관성을 추론하기 위하여 400 내지 4000 cm-1 범위를 갖는 FTIR(Fourier transform infrared spectroscope)(Vertex 8VBruker, Germany)를 사용하여 확인하였다.
세리아 나노복합체의 성질(nature), 크기 분포를 축정하기 위해, 가속전압(acceleration voltage) 200 keV인 HRTEM(high-resolution transmission electron microscope)(JSM-2010, JOEL, Japan)을 이용하여 확인하였다. 측정된 나노세리아의 직경을 통해 크기 분포를 평가하였다.
<실험방법 2. 항산화 활성 분석>
1) 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)( ㅇ OH) 소거활성 분석
다양한 농도의 세리아 나노복합체에 대한 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)(·OH) 소거활성 분석을 위해, 데옥시리보스(deoxyribose) 방법을 사용하여 수행되었다. 구체적으로 2-데옥시-2-리보스(2.8 mM), 인산 완충액(0.1 mM; pH 7.4), 염화 제2철(ferric chloride)(20 μM), EDTA(100 μM), 과산화수소(hydrogen peroxid)(500 μM), 아스코르브산(ascorvic acid)(100 μM) 및 다양한 농도의 세리아 나노복합체(0 내지 1000 μg/ml)를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였다. 다음, 37 ℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이 혼합액에 트리클로로아세트산 2.8중량%와 트리바르비툴산 용액 1중량%을 각각 첨가하여 10 분간 가열한 후 냉각시켜 540㎚에서 흡광도를 측정(실험군)하였고, 이로부터 ·OH 소거 활성(%)을 식 1로 계산하였다. 본 실험방법은 pH 6, 7 및 8에서 수행하였다.
2) 수퍼옥시드 라디칼 소거(Superoxide Radical Scavenging) 분석.
세리아 나노복합체(0 내지 1000 μg/ml)의 다양한 농도에서, 이전에 기술된 광 환원법을 사용하여 수퍼옥시드(superoxide) 음이온 라디칼(O2-·)을 검출하였다. 구체적으로 EDTA(0.1 M), 시안화나트륨(sodium cyanide)(0.0015 %), 리보플라빈(riboflavin)(0.12 mM), NBT(1.5 mM) 및 인산완충액(phosphate buffer)(67 mM; pH7.8)에 용해된 다양한 농도의 세리아 나노복합체(0 내지 1000 μg/ml)로 구성된 반응 혼합물(3 ml)을 제조하였다. 상기 반응 혼합물을 10 내지 20 분 동안 백색광에 노출시키고, 530 nm에서 흡광도를 측정(실험군)하였다. O2- 라디칼 소거능은 하기 식 2에 따라 계산하였다. 본 실험방법은 pH 6, 7 및 8에서 수행하였다.
3) 과산화수소 라디칼 소거(Hydrogen Peroxide Radical Scavenging) 분석
과산화수소 라디칼 소거는 인산완충액(50 mM; pH 7.4)에 용해된 H2O2(2 mM)로 분석하였다. 구체적으로, 서로 다른 pH 조건 하에서, 100 μL의 세리아 나노복합체를 인산 완충액(50 mM; pH 7.4)과 H2O2 용액(600 μL)을 사용하여 400 μL까지 제조하였다. 내용물을 혼합한 후, 10 내지 15 분 동안 배양하고, blank에 대하여 230 nm에서 흡광도를 측정하였다. H2O2 소거능은 하기 식 3에 따라 계산하였다.
[식 1]
·OH 소거 활성(%) = AbsControl- AbsTest/AbsControl × 100
[식 2]
O2-· 소거 활성(%) = AbsControl- AbsTest / AbsControl × 100
[식 3]
H2O2 소거 활성(%) = AbsControl- AbsTest / AbsControl × 100
상기 식 1, 2, 3에서,
AbsControl은 세리아 나노복합체를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도이고,
AbsTest은 세리아 나노복합체를 첨가한 실험군의 흡광도이다.
4) DPPH 라디칼 소거 활성
세리아 나노복합체의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성으로 평가하였다. 다양한 pH 조건(pH 6, 7 또는 8) 하에서, 세리아 나노복합체의 농도를 다양하게 하여, 종래 DPPH 라디칼 소거 활성 측정방법으로 측정하였고(6시간), 소거 활성(%)을 나타내었다.
<실험방법 3. 세포독성 분석>
세리아 나노복합체 세포 독성은 rapid kit 방법(EZ-CyTox, Daeil Lab Service, Korea)을 사용하여 WST-1 분석으로 평가하였다. 우선, HeLa 세포를 WST-1 분석을 위해 96 웰 플레이트에 분주(seed)하고, 10% FBS 및 항생제가 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포 카운팅을 위해 24 웰 플레이트에도 분주(seed)하였고, 이때, 접종밀도는 5 × 104 cells/㎠ 이었다. 24 시간 배양한 후, 세포에 각각 세리아 나노복합체를 다양한 농도로(0-1600 ㎍/㎖) 첨가한 다음, 24 시간 및 48 시간 동안 추가 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 제조사의 EZ-Cytox(Daeil Lab Service, Korea) 프로토콜에 따라 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 구하였다. 또한 역광학현미경(TMS-F, Nikon, Japan)하에 혈구미터를 사용하여 트립판 블루 염료 배제 방법(trypan blue dye exclusion method)을 사용하여 세포를 계수하였다.
<실험방법 4. in vitro 상에서 항산화활성 분석>
우선, HeLa 세포(5 × 104 cells/㎠)를 챔버 슬라이드에 접종하고 치오황산(Silver thiosulphate, STS)(1 μM)과 세리아 나노복합체(1000 ㎍/㎖)를 24-48 시간 동안 각각 처리하였다. 핵 응측(Nuclear condensation)과 핵 분열(Nuclear fragmentation)은, ROS 활성의 하위특성에 해당하므로, 세포의 형태를 형광 현미경으로 분석하여, 세리아 나노복합체의 ROS 활성을 평가하고자 하였다.
구체적으로 HeLa 세포에 세리아 나노복합체(실시예 2-15)와 STS(1 μM)를 다양한 농도로 처리하고, 이를 Opti-MEM에서 2 ㎍/㎖ Hoechst 33342 형광염료를 사용하여 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 30 분간 시각화하였다. 상기 세포는 현미경 검사 전에 인산염 완충액(PBS, pH 7.4)을 사용하여 2 회 세척한 후 사용하였다.
실시예
<실시예. 세리아 나노복합체(C/nanoceria)의 합성>
1 또는 5 mM 농도의 세륨 질산염(cerium nitrate)[Ce(NO3)2, Sigma Aldrich, USA] 및 1% 셀룰로오스(w/v)를 증류수에 용해시켜 반응액을 제조하였다. 하기 도 1에 도시된 액상 플라즈마 반응기에 구비된 500 ㎖ 테플론 반응기에 상기 반응액 300 ㎖를 넣었다. 전압, 주파수, 펄스 폭, 전극 간 거리 및 방전 시간(discharge time)을 각각 800 V, 30 kHz, 2 μS, 1 ㎜ 및 0-25 min으로 하여 a pulsed field unipolar Power Supply(IAP-1010, EN Technology, Korea)로 사용하여, 상기 반응액 상에서 플라즈마를 생성하여, 세리아 나노복합체(C/nanoceria)를 합성하였다. 이때, 용액에서 일정한 혼합 및 용질의 완전한 분산을 위해 자기 교반기가 사용되었고, 각 실시예의 합성조건은 하기 표 1에 나타내었다. 전체적인 합성과정은 도 2에 구체적으로 도시하였다.
Ce(NO3)2 농도(mM) cellulose 전압 주파수 펄스 폭 전극 간 거리 방전 시간(min)
실시예 1-0 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 0
실시예 1-1 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 1
실시예 1-3 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 3
실시예 1-5 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 5
실시예 1-7 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 7
실시예 1-9 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 9
실시예 1-11 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 11
실시예 1-13 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 13
실시예 1-15 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 15
실시예 1-18 1 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 18
실시예 2-0 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 0
실시예 2-1 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 1
실시예 2-3 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 3
실시예 2-5 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 5
실시예 2-7 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 7
실시예 2-9 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 9
실시예 2-11 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 11
실시예 2-13 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 13
실시예 2-15 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 15
실시예 2-17 5 3mg 800 V 30 kHz 2 μS 1 ㎜ 18
상기 액상 플라즈마 공정(SPP)은 대기조건하에서 수행되었으며, 용액 플라즈마 공정 과정에서 연속적으로 교반되면서 세륨 염 용액(1 및 5 mM) 및 1% 셀룰로오스를 함유하는 용액에서 반응성 산소종, UV 및 가시광선이 생성되었다. 이 과정을 통해 셀룰로오스는 세리아 나노입자의 표면에 코팅됨으로써, 세리아 나노입자의 핵생성을 방지하여, 셀룰로오스가 코팅된 세리아 나노입자인 세리아 나노복합체가 제조된다. 상기 반응액은 합성 초기에는 중성(pH 7.0), 온도(28 ℃) 및 옅은 색을 나타내었고, 플라즈마 방전 과정 중에 pH가 산성 pH로(6.0에서 3.0)으로 감소되면서, 온도는 90 ℃까지 상승하고, 용액은 탁해지고 옅은 황색을 나타냈다. 액상 플라즈마 공정(SPP)은 환경친화적인 제조방법으로, 어떤 환원제도 사용하지 않았으며, 그럼에도 안정적인 세리아 나노복합체를 합성할 수 있었다.
상기 과정을 통해 제조된 세리아 나노복합체는 10,000 rpm에서 30 분간 원심분리하더라도 침전이 없는, 우수한 수분 안정성을 가지고 있었고, 이는 종래 수계 합성법으로 제조된 세리아 나노입자(수성매질에 용해시 나노입자의 응집이 야기됨) 혹은 고분자로 코팅된 세리아 나노입자에서는 관찰되지 않는 우수한 특성이다.
<실험예 1. 세리아 나노복합체의 특성 분석-1>
액상 플라즈마 공정을 통해 합성된 세리아 나노복합체의 특성을 실험방법 1에 따라 분석하였다.
도 3은 실시예 1 및 실시예 2로부터 제조된 세리아 나노입자의 물리적 특성 분석결과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 3a는 5 mM Ce(NO3)2 및 1% 셀룰로오스 반응액을 사용한 다양한 방출시간으로 제조된 세리아 나노복합체(실시예 2)의 흡광도 변화를 측정한 UV-Vis 스펙트럼으로, 이에 따르면 셀룰로오스와 세륨염을 함유한 반응액을 사용하여, 액정 플라즈마(SPP)를 통해 세리아 나노복합체로 성공적으로 합성됨을 알 수 있다.
또한, Ce(NO3)2의 농도가 5 mM인 것이, 300 내지 310 nm에서 가장 높은 흡수 피크를 나타냄을 확인한 바, 세리아 나노복합체 제조를 위해서는 세륨염(Ce(NO3)2)이 5 mM 사용되는 것이 바람직함을 알 수 있다. Ce(NO3)2의 농도가 1 mM인 세리아 나노복합체에 대한 UV-Vis 스펙트럼은 피크에 변화가 거의 나타나지 않았다. 이는 셀룰로오스 대비 낮은 세륨염(Ce(NO3)2)의 농도 때문인 것으로 여겨진다(미도시).
또한, 5 mM Ce(NO3)2 반응액으로부터 합성된 실시예 2의 세리아 나노복합체는 플라즈마 방전시간이 길어짐에 따라 흡광도 피크가 높아짐을 알 수 있다.
또한, 304 nm에서의 높은 흡수 피크가 관찰되는데, 이는 세리아 나노입자가 성공적으로 합성되었고, 이 표면에 셀룰로오스가 효과적으로 코팅되었음을 알 수 있다.
도 3b는 5 mM Ce(NO3)2 반응액을 사용한 다양한 방출시간으로 제조된 세리아 나노입자(실시예 2-15)에 대한 C1Ce0 및 C1Ce5의 FTIR 스펙트럼으로, 대조군으로 셀룰로오스에 대해서 FTIR 분석을 실시하였다.
도 3b에 따르면, 본원발명의 실시예 2로부터 제조된 세리아 나노복합체는 스펙트럼이 넓었고, 피크의 존재와 부재는 Ce3+ 또는 Ce4+과 상호작용하는 셀룰로오스 분자에 의존적임을 확인하였다. 3419 cm-1(OH bending)과 2932 cm-1(CH2 bending)에서의 진동(vibration)은 CeO2-셀룰로오스 복합체의 형성을 가능하게 하였다. 또한, 1646 cm-1(C=H)와 728 cm-1(CH3)에서의 진동(vibration)은 HPMC에 존재하였다, 2361과 2116 cm-1에서의 진동은 각각 CH2 스트레치(stretch)와 CH 스트레치(stretch)를 나타내는 것으로, 세리아 복합체의 형성과 관련이 있는 것으로, 셀룰로오스(대조군)에서는 관찰되지 않았다. O??H, C??H, C??O stretching, C??H bending, 및 C??H와 같은 피크는 900-3500 cm-1 범위에서 볼 수 있다. 이는 셀룰로오스와 관련이 있는 피크이다. 3400 cm-1(O-H stretching)에서의 다른 IR 피크는 고분자의 하이드록실기를 나타낸다. 셀룰로오스 대신 덱스트란이 사용되면, 800-1300 cm-1 범위에서 진동이 발생하여, 세리아 나노입자에 덱스트란이 코팅되었음을 알 수 있다.
도 3c는 실시예 2-15로부터 제조된 세리아 나노복합체에 대한 Ce 및 O2의 신호를 측정한 EDS 스펙트럼이다. 도 3d는 실시예 2-15로부터 제조된 세리아 나노복합체에 대한 2가 산화 상태(Ce3+ and Ce4+)를 나타낸 XPS 분석결과이다.
도 3c에 나타난 바와 같이 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 원소조성과 순도를 EDS를 통해 분석한 결과, 세리아 나노복합체에서 O(K-series)와 Ce(L-series) 원소의 존재를 확인할 수 있었다. 게다가 본원발명의 실시예 2-15를 통해 합성된 세리아 나노복합체는 EDS 스펙트럼에서 불순물이 전혀 검출되지 않았으므로, 세리아 나노복합체가 초순도로 합성됨을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 방법으로 합성된 세리아 나노복합체는 의료용으로 적합할 정도의 매우 높은 순도를 갖고 있음을 확인하였다.
도 3d에 나타난 바와 같이, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체에서의 Ce3+ 및 Ce4+로써 세리아 나노입자의 발생률을 확인할 수 있는데, 이는 880, 888, 898, 905 및 918 eV에서의 결합에너지를 통해 확인할 수 있다. 이 스펙트럼은 셀룰로오스 매트릭스가 세리아 나노입자의 2가 상태(bivalent state)dp 영향을 미치지 않았음을 의미한다. 혼합 원자가 상태(mixed valence states)는 입자의 표면에서 Ce3+ 및 Ce4+에 의한 항산화 활성과 관련하여 세리아 나노입자에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 높은 수준의 Ce3+는 세리아 나노입자의 원자가(valence) 상태에 관한 잠재적인 수퍼옥사이드(superoxide) 제거제(scavengers)로서의 역할을 수행하며, 구체적으로 수퍼옥사이드(superoxide)와의 반응을 촉진시키는 것으로 확인되었다. Ce3+의 높은 농도는, Ce4+를 Ce3+으로 전환시키는 아르곤(Ar) 이온으로 처리함으로써, 형성되는 산소결손(oxygen vacancies)으로 얻을 수 있다. 이론적으로 Ce3+는 각각 5-10 ㎚와 15-20 ㎚ 크기의 세리아 나노입자 표면에, 30.4% 및 20.9% 존재할 것이라 평가되어 왔다. 그러나, 종래방법들로 합성된 세리아 나노입자에서는 이보다 더 작은 크기인 나노입자에서만, Ce3+가 풍부하게 존재하는 것으로 확인되었다. 즉, 이론적인 수치가 실질적인 세리아 나노입자에는 적용되지 않음을 알 수 있다.
이에 본원발명에 따라 합성된 세리아 나노복합체 역시 산화를 억제하고, ·OH 라디칼을 보다 쉽고 효과적으로 포착할 수 있는 Ce3+가 풍부하게 입자 표면에 존재함을 확인할 수 있다.
<실험예 2. 세리아 나노복합체의 특성 분석-2>
실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 3D 스캐폴드 구조를 분석하기 위하여, 세리아 나노복합체의 마이크로 기공(porous) 구조를 FESEM(field-emission electron spectroscopy)을 사용하여 분석하였다.
도 4는 실시예 2-15로부터 제조된 세리아 나노복합체의 3D 스캐폴드 구조를 FESEM으로 분석한 결과이다. 구체적으로 도 4a는 세리아 나노복합체(실시예 2-15)의 C1Ce0의 마이크로기공(microporous) 구조를 FESEM으로 분석하여 나타낸 도면이고, 도 4b 및 도 4c는 세리아 나노복합체(실시예 2-15)의 C1Ce5의 마이크로기공(microporous) 구조를 FESEM으로 분석하여 나타낸 도면이다. 스케일 바는 10 μm이다.
도 4a, 도 4b 및 도 4c에 따르면, 세리아 나노복합체(실시예 2-15)의 미세기공 특성을 확인하였고, 구체적으로 셀룰로오스의 타원형(oval-shaped) 마이크로 기공과 세리아 나노복합체의 스폰지, 원형(round) 사이에 약간의 차이가 존재함을 확인하였다. 도 4b에서 C1Ce5는 해면 모양의 타원형 기공을 가졌음을 확인하였고, 도 4c에서 C1Ce5의 엣지에 마이크로섬유(microfibril)을 갖는 기공이 형성되어 있음을 확인하였다. 이들 기공의 직경은 6 내지 47 μm였다.
도 4d는 세리아 나노복합체(실시예 2-15) 중에서 선택된 표면에 대한 EDS 매핑결과이다. 스케일 바는 10 μm이다.
도 4d에 나타난 바와 같이, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체는 가장자리에 미세섬유형(micro-fibrillike) 구조를 갖고 있음을 알 수 있다. 미세섬유 구조는 셀룰로오스에 의해 유도된 것으로 여겨지며, 이는 조직 공학 분야에서 3D 세포를 배양하거나, 인공조직과 피부의 발달을 위한 스캐폴드로 유용하 특징이다.
또한, EDS 맵핑 결과, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체에서 Ce(청색), O(녹색) 및 C(적색)가 전체적으로 고루 분포되어 있음을 확인하였다. 탄소을 나타내는 적색이 맵핑 상에서 관찰되었는데, 이는 샘플 홀더에 있는 전도성 카본 테이프로부터의 검출된 것이다.
도 5는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체를 TEM로 측정한 결과이다. 구체적으로 도 5a는 15 분 동안 플라즈마를 방출하여 합성된 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 C1Ce5에 대한 TEM 이미지이고, 도 5b는 도 5a의 구조를 개략적으로 도시한 것이며, 도 5c는 15 분 동안 플라즈마를 방출하여 합성된 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 격자 가장자리(lattice fringes)를 확인하기 위한, HRTEM 이미지이다. 도 5d는 15 분 동안 플라즈마를 방출하여 합성된 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 크기 분포를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 모양과 크기를 확인하기 위하여 TEM으로 분석하였고, 그 결과 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체는 응집없이 3.2 내지 32.4 nm 평균직경을 갖는 입방체 구조를 갖고 있음을 확인하였다.
또한, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체는 셀룰로오스 매트릭스에 세리아 나노입자가 매립되면서, 입자 핵 형성(Oswald ripening)이 이뤄지지 않고 안정화되는 것을 알 수 있다. 즉, 세리아 나노입자는 셀룰로오스 매트릭스에서 입방체 구조를 유지하고 있는 것을 확인하였다. 이 전체 구조는 도 5b에 나타내었다.
액상 플라즈마 공정이라고 하더라도 세리아 나노입자를 제조할 경우에는, 합성되는 과정에 나타나는 핵 형성과정을 겪으며, 이로 인해 입자간 유착(coalescence)이 형성되어, 입방체 형태의 세리아 나노입자를 온전히 얻을 수 없다는 문제가 있었으나, 본 발명에서는 상술한 문제를 해결하였음을 알 수 있다.
도 5c에 나타난 바와 같이, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 HRTEM 이미지를 살펴보면, 1 ㎚ 거리의 뚜렷한 격자 프린지(Distinct lattice fringes)가 관찰되었다. 일반적으로 마름모꼴 형태(rhombohedral shape)의 세리아 나노입자가 구형의 세리아 나노입자보다 큰 표면적을 가지며, 이러한 형태는 세리아 나노입자의 촉매 능력에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 즉, 입자의 크기가 작을수록 상대적으로 보다 많은 산소결손(oxygen vacancies)을 갖고, 높은 용해도를 나타낸다. 이를 바탕으로 살펴보았을 때, 액상 플라즈마 공정을 통해 합성된 세리아 나노복합체는, 종래 다른 제조공정으로 합성된 세리아 나노복합체보다 크기 분포가 현저히 좁은 것을 확인하였다(1 내지 10 ㎚)(도 5d).
구체적으로 침전을 통해 제조된 세리아 나노입자는 평균 직경이 25 ㎚이고 CeO2 나노입자 클러스터의 직경도 약 40 ㎚였으며, 나노입자의 평균 직경은 16 내지 22 ㎚사이였다. 마이크로웨이브 방법으로 제조된 세리아 나노입자는 직경이 15 내지 20 ㎚인 입자가 응집되어 존재하였으며, 수열법(hydrothermal method)으로 합성된 다면체(polyhedral)의 세리아 나노입자는 직경이 8-14 ㎚였다.
뿐만 아니라 액상 플라즈마로 제조된 세리아 나노입자는 각각의 세리아 나노입자의 크기는 작더라도 응집된 형태로 존재하기 때문에, 실제 작용시에는 입자의 크기 대비 상대적으로 작은 활성을 나타낸다. 그러나 본 발명은 응집되지 않은 형태로 세리아 나노입자가 존재하기 때문에, 크기에 따른 효과적은 활성을 나타낼 수 있다는 장점을 갖는다. 즉, TEM 분석결과, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체는 모양이 변하지 않고, 그대로 유지되는 것을 확인할 수 있다.
<실험예 3. 세리아 나노복합체의 항산화 활성 분석>
실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 항산화 활성을 분석하고자 하였다.
도 6은 pH, 농도에 따른 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 항산화제 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 6a는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 6b는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 ˙OH 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 6c는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 6d는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 과산화수소 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 자유라디칼은 세포가 호기성 환경에 노출되어있는 한, 끊임없이 생성되는 것으로, ˙OH 라디칼은 활성산소종 중에서 가장 반응성이 크고 인접한 생체 분자(DNA, 지질, 단백질 등)에 심각한 손상을 야기하는 것으로 알려져 있다.
도 6a에 나타난 바와 같이, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체를 DPPH 라디칼과 6시간동안 반응시킨 후, 색상 변화로부터 세리아 나노입자 유도 DPPH 소거를 확인하였다. DPPH 소거는 세리아 나노복합체의 농도가 증가함에 따라 현저히 증가하였다. 구체적으로 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체가 500 ㎍/㎖일 때, pH 8, 7, 6 조건하에서 각각 54.12, 40.38, 37.8%임을 확인하였다. 이는 천연 항산화제인 아스코르브산의 소거활성보다 87.15% 느렸으나, 금속 복합체인 점을 고려한다면 유의적으로 현저한 효과임을 알 수 있다.
도 6b에 따르면, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체 60 ㎍/㎖ 농도인 경우, ˙가장 높은 하이드록실 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 구체적으로 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체 60 ㎍/㎖ 농도인 경우, OH 라디칼 소거 활성이 pH 6에서 76.2%, pH 7에서 78.5%인 것으로 확인되었다.
대부분의 세리아 나노복합체는 모든 pH(6-8)에서 비슷한 수준의 ˙OH 소거 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 종래의 방법으로 합성된 세리아 나노입자들 역시 ·OH 소거 활성이 확인되긴 하였으나, 고농도(1 μM)에서 최고 ·OH 소거 활성이 60%임을 확인하였다. 즉, 본 발명의 액상 플라즈마 공정으로 제조된 세리아 나노입자는 60 ㎍/㎖ 농도에서 모두 60% 이상의 ·OH 라디칼 소거 활성을 나타내어, ˙OH 라디칼에 대한 강력한 항산화 효과를 가지는 것으로 확인되었다.
산화적 스트레스는 체내에서 자유라디칼과 항산화 방어 시스템 간의 균형이 깨어진 상태에서 발생하며, 이러한 불균형으로 자유라디칼의 과생성, 또는 산화적 스트레스 보다 적은 항산화제의 섭취량 등으로 인해 발생할 수 있다. 이전의 많은 연구들을 통해 자유라디칼이 질병의 발생에 기여한다는 사실이 명명백백히 밝혀져 있는 바, 본 발명을 통해 합성된 세리아 나노입자 역시 이러한 라디칼 소거 효과를 통해 체내 또는 체외에서 발생하는 산화적 스트레스를 줄여줄 것으로 기대된다. 따라서 본 발명의 세리아 나노입자는 합성시 의약소재로 사용할 수 있을 정도로 초순도로 제조되며, 우수한 항산화 활성도 가지고 있으므로, 생체 내, 외에 활용할 수 있음을 알 수 있다.
도 6c에 나타난 바와 같이, 다양한 농도(25 내지 500 ㎍/㎖)에서 실시예 2-15의 세리아 나노복합체에 대한 수퍼옥시드 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 구체적으로 실시예 2-15의 세리아 나노복합체가 200 ㎍/㎖의 농도일 때는, 소거 활성이 pH 7에서 가장 높았고(90 %), pH 8에서 96%였고, 더 높은 농도(300-500 ㎍/㎖)에서는 더 이상 증가하지 않았다.
수퍼옥사이드 라디칼은 잠재적으로 ROS의 유해한 공급원 중에서 가장 해로운 요인이다. 수퍼옥사이드는 일중항 산소 및 하이드록실 라디칼에 비해서는 약하지만, 하이드록실 라디칼 및 과산화수소를 포함한 유해한 ROS 전환을 통해 산화스트레스를 유발하는 다른 산화제보다 만성질환을 유발하는 것으로 알려져있다. 따라서, 본 발명의 세리아 나노복합체는 잠재적인 관사화물 소거 특성을 가지는 것으로 확인되고, 이를 통해 산화 스트레스 관련 질환의 치료에 대한 치료적 적용도 가능할 것임을 충분히 알 수 있다.
구체적으로, 산화적 스트레스가 지속될 경우, 염증 반응 역시 지속될 수 있고, 만성적인 염증상태에서 활성화된 백혈구는 돌연변이를 야기하며, 그 결과 암으로 진행될 수 있다. 또한 산화적 스트레스는 알츠하이머성 치매와 같은 신경퇴행성 질환을 초래할 수 있는데, 이는 불포화지방산을 많이 포함하는 뇌가 산화적 스트레스에 취약하기 때문이다. 이러한 본 발명을 통해 합성된 세리아 나노입자는 O2- 에 대해 우수한 소거 활성을 갖는 것으로 확인되며, 이는 자유라디칼에 산화적 스트레스 상태를 개선, 예방 또는 치료할 수 있음을 의미한다. 즉, 본 발명의 세리아 나노입자는 산화 스트레스에 대한 치료적 효과를 갖는 우수한 수퍼옥사이드 음이온 소거 활성(superoxide anion scavenger) 갖는다.
한편, 본 발명에서 제안하는 방법이 아닌, 종래 극초단파 방법을 사용하여 합성된 세리아 나노입자는 어떠한 O2- 라디칼 소거 활성도 나타내지 못한다는 점에서, 본 발명의 세리아 나노입자는 매우 중요한 의미를 갖는다. 이는 종래 합성방법들과 본 발명의 합성방법 상에 있어서, Cy4+ 의 존재여부 차이 때문인 것으로 여겨진다.
도 6d에 나타난 바와 같이, 본 발명의 세리아 나노복합체는 과산화수소 소거 효과도 갖는 것을 알 수 있다. 구체적으로 실시예 2-15의 세리아 나노복합체 100 ㎍/㎖인 경우, pH 6 및 7에서 가장 높은 과산화수소 소거 활성(94%)를 보였고, pH 8에서는 88% 과산화수소 소거활성을 나타내었다. 이는 과산화수소에대한 세리아 나노복합체의 활성이 다른 자유 라디칼에 비해 현저히 강력함을 알 수 있다. 현재까지 세리아 나노입자가 과산화수소에 대한 소거 활성을 갖는다는 것에 대한 보고는 없었다. 본 발명에 따른 세리아 나노복합체는 아주 낮은 농도(25 ㎍/㎖)에서도 과산화수소에 대한 우수한 소거 활성을 나타냄을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 세리아 나노복합체는 DPPH, 하이드록실, 수퍼옥사이드 및 과산화수소 라디칼 모두에 대해 매우 강력한 항산화활성을 나타낸다.
<실험예 4. 세리아 나노복합체의 세포 독성 분석>
실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체에 의한 세포 독성을 측정하기 위하여, WST 분석을 통해 분석하였다.
도 7은 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 7a는 다양한 농도(0-1600 ㎍/㎖)의 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체를 HeLa 세포에 24 시간동안 처리하여 측정한, 세포의 생존율을 나타낸 그래프이고, 도 7b는 다양한 농도(0-1600 ㎍/㎖)의 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체를 HeLa 세포에 48 시간동안 처리하여 측정한, 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다. STS를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 7에 나타난 바와 같이 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체 200 ~ 1600 ㎍/㎖를 HeLa 세포에 처리하여 배양한 결과, 세포 생존율에 변화가 없음을 확인하였다. 도 7a와 도 7b의 경향이 유사한 것을 보았을 때, 세리아 나노복합체에 세포가 노출되는 시간이 길어지더라도 세포 생존율은 크게 변화되지 않는 것을 확인하였다.
다만, 세리아 나노입자의 농도가 증가하거나, 배양시간이 길어질 경우 세포 생존율이 저하되었으나, 이는 유의미하지 않은 범주내에서의 현저히 미미한 수치변화로, 세리아 나노입자에 의한 세포독성이라 여길 수 없는 수준이였다. 세리아 나노복합체가 고농도로 존재하는 경우 배양조건의 변화로 인해 발생되는 일반적인 현상에 의한 것일 뿐, 세리아 나노복합체에 의한 독성은 아니라 할 것이다. 본 발명에서 음성 대조군으로 사용된 치오황산(Silver thiosulphate, STS)은 1 μM의 농도에서 HeLa 세포의 성장을 80%까지 억제하는 것을 확인하였다. 이에 반해 본 발명을 통해 제조된 세리아 나노복합체(실시예 2-15)는 세포의 생존율에 영향을 거의 미치지 않는 것으로써, 세포에 대한 독성을 나타내지 않는다 할 것이다.
종래, 세리아 나노입자는 전립선 암세포(PC2), 폐암세포(A549) 및 HepG2에 대해서 유의하게 세포독성이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 최근에 개발된 Ce(NO3)3를 에틸렌 글리콜과 NH4OH로 처리하여 합성한 세리아 나노입자는, 2000 ㎍/ℓ농도에서, Caco-2 세포를 제외하고 A549 세포와 HepG2 세포의 생존율을 크게 저하시켰다. 한편 침전법으로 합성된 세리아 나노입자는 HeLa 세포의 증식을 억제하였고, HeLa 세포의 생존율은 100 ㎍/㎖의 농도에서 65%로 감소시켰다.
상술한 종래기술과의 결과를 비교하면, 세리아 나노복합체는 정상세포와 암세포 모두에 대하여 어떠한 세포 생존율 억제효과도 관찰되지 않은 바, 액상 플라즈마 공정을 통해 합성된 세리아 나노복합체는 고농도에서도 모든 세포에 대하여 독성을 거의 나타내지 않는 매우 안정적인 물질임을 알 수 있다.
<실험예 5. 세리아 나노복합체의 항산화활성>
생체 외에서(in vitro) ROS 형성은 산화에 민감한 염색물질인 DCFH-DA를 형광성 탐침으로 사용하여 평가하였다, 이는 세포 내에서 산화작용을 관찰하는데 널리 적용되어온 방법이다.
DCFH-DA는 비형광성의 세포 투과성 형광염료로, 쉽게 세포내로 투과되어, 세포 내 에스터라제에 의해 형광성이 높은 DCFH로 가수분해되며, 세포 내에 갇히게 된다. 이는 세포 내에 존재하는 산화적 대사에 반응하여 산소 반응종을 정량화할 수 있는 민감하고 신속한 방법이다.
도 8은 생체 외에서(in vitro), 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체의 항산화 활성을 측정하여 나타낸 결과로, 도 8a 및 d는 아무것도 처리하지 않은 HeLa 세포(정상 대조군), 도 8b 및 e는 ROS가 형성되는 STS(1 μM)로 처리된 ROS 세포(음성 대조군)(b), 손상된 핵(nucleus)(e)이고, 도 8c 및 f는 세포 감소와 핵 손상이 없는 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체(1000 ㎍/㎖)로 처리된 세포(실험군)이다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다.
도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체는 HeLa 세포의 성장에 전혀 영향을 주지 않으면서, 세포 내 산화스트레스, 특히 ROS 생성을 감소시켜 세포의 생장을 증가시키는 것을 확인하였다.
도 8a, d를 살펴보면 아무것도 처리되지 않고, 정상적으로 성장한 HeLa 세포는 결로(shrinkage) 및 수축(condensation)없이 잘 발달되어 있음을 확인하였다.
도 8b, e를 살펴보면 음성 대조군인 STS가 24시간 처리된 세포는, STS로 인해 유도된 ROS 때문에, 세포 분리(cell detachment), 반올림(rounding up) 및 수축(shrinkage)과 같은 세포의 형태 변화가 야기되었음을 알 수 있다.
이에 반해, 실시예 2-15로부터 합성된 세리아 나노복합체(1000 μgmL-1)에 노출된 HeLa 세포의 경우(도 8c, f), ROS 생성의 징후가 없고 세포분리, 반올림 및 수축이 없으며, 정상 대조군보다 더 정상적으로 성장하였음을 알 수 있다.
종합하면, 본 발명에 따라 제조된 세리아 나노복합체는 농도가 증가함에 따라, 산화 손상으로부터 세포를 보다 효과적으로 보호하고, 세포 내 ROS 생성을 억제하는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 세리아 나노복합체는 세포 내에서 현저히 우수한 항산화 특성도 가지고 있음을 확인한 바, 산화적 스트레스에 의해 야기되는 질환 예컨대 퇴행성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 효과적임을 알 수 있다. 종래 침전법으로 합성된 세리아 나노입자 또는 세리아 나노복합체는 세포독성을 가져, 유전적 손상을 야기하였고, HepG2 및 A549 세포에 대해 가장 낮은 농도에서 높은 독성을 나타내는 부작용이 있음을 확인하였다. 이렇듯 기존의 세리아 나노입자와 세리아 나노복합체들은 세포독성과 부작용으로 인해 치료제로써 활용이 제한되었다.
이에 본 발명의 세리아 나노복합체는, 별도의 첨가제가 요구되지 않는 액상 플라즈마 공정을 통해 초순도, 응집되지 않은 입방형 구조로 제조되므로, 5 또는 10 μg/㎖ 농도에서도 사람 수정체 상피세포의 DNA 손상이나 염색분체 교환횟수 증가 등과 같은 유의미한 부작용이 관찰되지 않았다.
즉, 단순히 생체 외에서의 항산화활성 및 세포독성이 세리아 나노복합체의 크기나, 산화상태에 의존적인 것만은 아니며, 본 발명의 공정방법을 통해 합성된 세리아 나노복합체가, 공정과정의 복합적인 관계에 의해 세포적합성(cytocompatibility)과 산화 손상의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 는 것이라 할 수 있다. 본 발명으로부터 합성된 세리아 나노복합체의 항산화활성은 용량 의존적이었고, 수퍼옥사이드(superoxide)로 처리한 베타세포의 대사활성을 1.5배 가량 향상시키는 것을 확인하였다.
본 발명에 따라 제조된 세리아 나노복합체는 현저히 우수한 항산화활성을 나타내며, 이와 관련된 질환 치료에 효율적으로 사용가능함을 알 수 있다.

Claims (17)

  1. 세리아 나노입자 및 상기 세리아 나노입자 표면을 둘러싸고 있고, 셀룰로오스를 포함하는 코팅층;을 포함하며,
    다공성 나노복합체인 것을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세리아 나노복합체는 해면 모양의 타원형 기공과, 마이크로섬유를 갖는 기공이 형성되어 있고, 상기 마이크로 섬유를 갖는 기공은 상기 세리아 나노복합체의 엣지에 위치하는 것을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세리아 나노복합체는 평균 입경이 1 내지 40 ㎚인 것을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세리아 나노복합체는 1 ㎚ 거리의 뚜렷한 격자 가장자리(Distinct lattice fringes)를 갖는 구형의 입자인 것을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세리아 나노복합체의 EDS 맴핑 결과, 세리아 나노복합체의 표면에는 2가(bivalent) Ce(청색)와 O(녹색)가 전체적으로 고루 분포되어 있는 것을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
  7. 제1항에 있어서,
    에너지 분광 분석(Energy Dispersive Spectroscopy, EDS)를 통하여 상기 세리아 나노복합체를 분석하였을 때, O(K-series)와 Ce(L-series) 원소를 제외하고는 검출되지 않은 것을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
  8. 제1항에 있어서,
    X-선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)을 통하여 상기 세리아 나노복합체를 분석하였을 때, 상기 세리아 나노입자의 표면 상에 세륨 원자들이 두 다른 산화 상태(Ce3+ 및 Ce4+)로 존재하는 것을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
  9. 1) 세리아 전구체와 셀룰로오스를 용매에 용해시켜 반응액을 제공하는 단계; 및
    2) 상기 반응액 내에 플라즈마를 발생시켜 제1항에 따른 세리아 나노복합체를 합성하는 액상 플라즈마 반응단계;를 포함하는 세리아 나노복합체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세리아 전구체는 세륨 질산염인 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 반응액에서 세리아 전구체의 농도는 1 내지 5 mM인 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자의 제조방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 액상 플라즈마 반응 단계는 상기 반응액에 노출된 전극으로 공급되는 전원의 전압 800V, 주파수 30 KHz인 것을 특징으로 하는 액상 플라즈마 반응을 이용한 세리아 나노입자의 제조방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 액상 플라즈마 반응 단계는 1 내지 25 분인 것을 특징으로 하는 세리아 나노입자의 제조방법.
  15. 제1항에 따라 제조된 세리아 나노복합체를 포함하는 항산화용 조성물.
  16. 제1항에 따른 세리아 나노복합체를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 산화적 스트레스에 의한 질환은 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 당뇨병, 간질, 파킨슨씨병 및 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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