KR102448581B1

KR102448581B1 - 식물추출물과 아미노산을 함유하는 탈모방지 및 육모용 조성물

Info

Publication number: KR102448581B1
Application number: KR1020200080232A
Authority: KR
Inventors: 이상욱
Original assignee: 이상욱
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-09-28
Also published as: KR20210003055A

Abstract

본 발명은 알기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린을 필수적인 유효성분으로 포함하고, 선택적으로 시스테인, 글루타민, 플로린, 하이드록시플로닌 및 타우린 조성물 및/또는 글라이신, 알라닌, 발린, 세린, 및 글루탐산 조성물을 포함하는 탈모방지 및 육모용 조성물에 관한 것으로 본 발명의 아미노산 조성물 및 추가로 포함하는 식물추출물의 조성물은 우수한 탈모방지 및 발모촉진 효과를 나타낸다.

Description

식물추출물과 아미노산을 함유하는 탈모방지 및 육모용 조성물{A Composition for Preventing Alopecia And Promoting Hair Growth Comprising Amino Acids and Plants Extracts}

본 발명은 식물추출물과 아미노산을 함유하는 탈모방지 및 육모용 조성물에 관한 것이다.

모발은 머리보호, 외향에 대한 영향, 머리의 온도유지 등 인체에서 다양한 역할을 담당하고 있으며, 생명유지에 중요한 기관은 아니지만, 건강상태의 척도이자 외모를 결정짓는 신체의 중요한 일부분이다.

인체의 모발은 10만 ~ 15만개 정도로, 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며 정상모발의 90%를 차지하는 성장기(anagen, growing phase), 생장정지와 모근이 위축되는 퇴행기(catagen, transitional phase), 모구가 건조되고 곤봉모가 되는 휴지기(telogen, resting phase) 등 모주기(hair cycle)를 거치면서 모발은 성장과 탈모를 거듭한다. 이러한 주기는 3 ~ 6년에 걸쳐 반복되는데 그 결과 정상적으로 하루 평균 50 ~ 100개의 모발이 탈락하게 된다.

모발은 단백질, 멜라닌 색소, 지질, 미량원소, 수분 등으로 구성되어 있으며, 전체의 80 ~ 90%을 차지하는 단백질은 주로 케라틴(keratin)으로 구성되어 있다. 케라틴은 18종의 아미노산으로 구성되어 있다.

모발에서 발견되는 18종의 아미노산은 주로 3가지 결합에 의해서 모발의 구조를 형성하는데, 수소들의 결합인 수소결합, 염류가 결합하는 이온결합 그리고 황(sulfur)을 이용한 결합인 시스틴결합이 이에 해당 된다.

모발의 성장은 여러 유전자와 성장인자 및 그 수용체, 전신적 호르몬의 작용 등으로 인한 복잡한 기전에 의해 일어난다. 모유두세포(human hair dermal papilla cell)는 모발의 발생과 성장 및 모낭의 발생에 관여하는 세포로 모모세포와 함께 모낭의 기초부를 형성하는 세포이다. 또한 모모세포(keratinocyte cell)는 모세혈관과 모유두로부터 영양을 공급받아 지속적으로 새로운 세포분열과 증식을 되풀이하여 모간부 및 모낭을 생성하며, 모발을 형성한다. 생성된 모발은 모공 가까이로 밀려 올라가며, 모구부와 피지선 아래 부위에 존재하는 각화 이행부를 거치는 과정에서 점차적으로 수분이 빠져나가 타원형의 형태로 변화되고, 시스틴결합이 형성되어 모발이 안정화된다.

불균형적 영양섭취, 외부자극으로 인한 두피 및 모발의 손상 및 강한 자외선으로 인한 윤기 없고 푸석한 모발, 끊어지고 갈라져 연약한 머릿결, 빈약해지는 머리숱 등의 원인이 되며, 최종적으로는 탈모의 주요 원인이 된다.

한편, 탈모(alopecia)는 모발의 성장 주기에서 성장기의 모발 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 많아져 비정상적으로 모발의 탈락이 증가하고, 정상적으로 자라던 모발이 어떤 원인에 의해 빠지게 되는 현상을 일컫는다. 모근이 손상되는 것도 문제이지만, 스트레스나 질병으로 인한 탈모가 아닌 대부분의 탈모는 모발이 영양을 잃어가며 자연스럽게 그 굵기가 가늘어지고 약해져서 빠지게 되고 이런 주기가 빨라지면서 모발이 재생되지 않는 탈모가 되는 것이다. 이러한 과정은 남성호르몬으로 인해 생기는 작용기전뿐만 아니라, 스트레스, 환경오염, 불규칙한 식습관, 유전 등 다양한 요인으로 만들어진 탈모유발물질들이 윈트 신호전달계(Wnt signaling pathway)에 영향을 미쳐 베타 카테닌(β-catenin)을 분해시켜 모유두세포와 모모세포의 세포사멸을 유도해 모발의 성장기를 단축시키고, 퇴행기로 전환시켜 탈모를 유발시키는 것이다.

현재 모발성장 촉진제제로서 미녹시딜(minoxidil, 경피도포제) 및 피나스테리드(finasteride, 경구복용제) 등이 FDA 승인을 얻어 임상적으로 상용되고 있다. 특히 미녹시딜은 1970년 초에 혈관확장제로 최초로 소개되어 약물 효과 이외의 부작용이 발모임이 밝혀져 현재 발모촉진제로 사용되고 있으며, 그의 작용기전은 현재까지 명확히 밝혀지지 않았으나, 여러 연구에서 혈관확장을 통한 영양 공급 촉진 및 칼륨 채널 열림(potassium channel opening) 효과 등이 모발 성장을 유도하는 것으로 생각되고 있다. 또한, 최근 임상적 적용이 증가하고 있는 피나스테리드제제는 남성호르몬 대사에 작용하는 효소인 5 알파-리덕타아제(5a-reductase)의 활성을 억제시키는 물질로서 이 제제 또한 전립선 비대증 치료제 개발로부터 유래된 탈모 억제 제제로 사용되고 있다.

그러나 현재 주로 사용되는 발모제의 약물 이상반응(미녹시딜-체중증가, 부종, 심장박동 증가, 협심증, 피부염, 가려움증 등; 피나스테리드-남성 성기능 장애, 기형아 출산 등)이 보고되고 있어 적극적 치료에 상당한 제한성을 가지고 있다. 이러한 문제점을 고려하여, 소비자가 믿고 사용할 수 있는 안전하며 효능이 우수한 천연 원료 개발이 절실히 요구되고 있으며, 다양한 연구가 진행되고 있다.

대한민국 공개특허 제2001-0075000호에서는, 산화적 스트레스에 의해 유발되거나 촉진되는 피부의 나이가 들어가는데 따른 변화 또는 피부의 미용상 바람직하지 않은 변화를 예방하고 지연시켜 개선하거나 치료하는 방법 및 산화적 스트레스 억제제를 유효성분으로서 함유하는 화장품 또는 피부 외용제를 개시한다. 상기 화장품 또는 피부 외용제는 시스테인 또는 시스틴 유도체 및 이들의 염으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

대한민국 공개특허 제2017-0114773호에서는, 브로콜리 추출물의 항염증 효과를 개시하면서, 브로콜리 추출물을 포함하는 항염증용 조성물 또는 피부염증 완화용 화장료 조성물을 개시하고 있다.

대한민국 등록특허 제10-147600호에서는, 양파껍질과 비파잎 추출물을 포함하는 모발 성장 촉진용 화장료 조성물을 개시하고 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 우수한 탈모방지 및 발모촉진 효과를 가지는 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 알기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린을 필수적인 유효성분으로 포함하고,

선택적으로 시스테인, 글루타민, 프롤린, 하이드록시프롤린 및 타우린 조성물 및/또는

글라이신, 알라닌, 발린, 세린, 및 글루탐산 조성물을 포함하는 탈모방지 및 육모용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물이 필수적인 아미노산 유효성분을 단독으로 포함할 경우에 상기 아미노산들의 조성비는 동량이며, 전체 조성물에서 200ppm 내지 300ppm을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물이 필수적인 아미노산 유효성분과 선택적으로 포함되는 다른 아미노산 군을 포함할 경우에 상기 필수적인 아미노산들의 조성비는 동량이며, 전체 조성물에서 200ppm 내지 400ppm을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 느룹나무 뿌리 껍질 추출물, 당금잔화 꽃 추출물 및 대나무 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물이 필수적인 아미노산 유효성분과 선택적으로 포함되는 다른 아미노산 군 및 식물 추출물을 더욱 포함할 경우에 상기 필수적인 아미노산들의 조성비는 동량이며, 전체 조성물에서 300ppm 내지 400ppm을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

여기서, 본 발명의 식물추출물을 얻는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 다양한 추출 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산의 용매를 각각 단독으로 또는 이들을 2종 이상 혼합한 용매를 추출 용매로 이용하여 추출할 수 있다.

또한, 본 발명의 식물추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라 다른 방법으로 추출된 추출물도 포함한다. 예컨대, 초고압 추출법에 의한 추출; 초음파 추출법에 의한 추출; 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리; 다양한 크로마토그래피, 예를 들어 크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 식물추출물에 포함된다.

상기 추출 용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디메틸에테르로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종을 이용하는 것이 바람직하다. 추출된 시료는 여과하고 감압농축 후 동결건조하여 제조하였다.

이렇게 제조된 추출물은, 원하는 농도로, 예를 들면 0.001 ~ 300중량% 농도로 정제수, 에탄올, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분산 및 용해하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 식물추출물은 유근피, 당금잔화 꽃, 대나무을 세척, 건조 및 분쇄한 분쇄물로부터 통합적으로 추출되거나, 또는 유근피,당금잔화 꽃, 또는 대나무 각각 세척 건조 및 분쇄한 개별분쇄물로부터 각각 개별적으로 추출된 개별추출물이 혼합되어 제조된다.

또한, 본 발명의 식물추출물은 상기 추출물을 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출물 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

한편, 본 발명에서 식물추출물은 바람직하게 조성물 총 중량에 대해 0.001 ~ 100 중량% 함유되는 것이 좋은데, 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 탈모방지 및 발모촉진 효과가 미미하고, 100 중량%를 초과하는 경우에는 용량에 비례하는 효과를 얻지 못하고 제형 유지에 어려움이 있다.

또한, 본 발명에 있어서 조성물 총 중량에 대하여, 아미노산은 0001 ~ 50 중량% 함유하는 것이 좋은데, 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 탈모방지 및 발모촉진 효과가 미미하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 용량에 비례하는 효과를 얻지 못하고 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 아미노산과 식물추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 예를 들면, 항산화제, 노화방지 성분, 주름개선 성분, 미백 성분, 보습 성분 및 항균 성분 등을 더욱 함유할 수 있다.

한편, 본 발명에서 유효성분으로 포함된다는 의미는 본 발명의 조성물로부터 우수한 탈모방지 및 발모촉진 효과를 나타낼 수 있는 정도로, 조성물에 아미노산과 식물추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 성분 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션(formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.

또한, 본 발명의 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0001 ~ 300 중량%이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

또한, 본 발명의 조성물의 제형은 특정의 종류에 한정되는 것은 아니나, 일예로 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 에멀전, 오일 및 왁스로 이루어진 모발용 화장료에서 선택될 수 있다. 또한, 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있다.

바람직하게는, 상기 조성물은, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 에멀전, 오일 및 왁스로 이루어진 군에서 선택된 제형을 가질 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 아미노산과 식물추출물 복합물의 발모 및 육모효과를 확보하려 하였고, 아미노산의 경우도, 특성에 따라 분류하고, 분류에 따라 다른 조합으로서 최적 농도를 찾지위한 시험을 실시하였다.

이에 인간모유두 세포에서 발근육이 높아지는 것을 확인하고, 이러한 효과가 아미노산에서 인지 혹은 식물추출물의 효과인지 확인하기 위해, 각각 대조구를 설정하고 시험을 진행하였고, 결과적으로 식물추출물 복합물의 경우는 발모 발근 유전자의 발현을 유도하고, 아미노산복합물의 경우, 기타 유전자 발현후의 실질적인 효과를 나타내도록 돕는것으로 확인되었다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 아미노산과 식물추출물의 조성물은 우수한 탈모방지 및 발모촉진 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 조성물 및/또는 추출물의 인간 모유두 세포에서의 세포 독성시험 결과를 나타낸 그래프,
도 2는 본 발명의 조성물 및/또는 추출물의 인간 모유두 세포 증식률을 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명의 조성물의 인간 모유두 세포에서의 모근생성율 시험 결과를 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명의 조성물의 인간 모유두 세포에서의 베타-카테닌 발현 유도 효과 평가를 나타낸 그래프,
도 5와 6은 인간 모유두 세포에서의 탈모방지 또는 육모 촉진 관련 유전자 발현량 측정 결과를 나타낸 그래프
도 7은 인체모델에서의 모발밀도시험 결과를 나타낸 그래프

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

<제조예-1> 아미노산 복합물의 제조

아미노산의 경우, 다양한 방법에 의해 분류 가능한데, 인체에서 생성되지 않아 외부 영양분으로서만 흡수 가능한 필수 아미노산과 생체에서 합성되는 아미노산으로 나눌수 있는데, 현대인의 경우, 다이어트나 불규칙한 식사습관등으로 모발, 모근, 모근세포에 전달되는 필수 아미노산이 부족한 경우가 발생할 수 있다. 이에 본 발명에서는 필수 아미노산 계열 (10종)의 혼합물(제조예 1 내지 4)과 인체조건에 따라 필수적일 수 있는 조건적 필수 아미노산과 대사물(5종)(제조예 5 내지 8)과 자연보습인자활성(NMF) 아미노산(5종)(제조예 9 내지 12)에 대한 함량에 따른 최적의 조합으로서 발모 및 양모효과를 확보하고자 한다.

본 발명에서 사용된 아미노산 등 모든 시약은 시그마 알드리지(미국)에서 구입하였다.

각 제조예는 성분별로 동일한 함량의 복합물로서 정제수에 진탕하여 가용화하여 세포시험용으로 사용하였다. 함량 및 조성은 하기 표 1을 참고.

	제조예-1	제조예-2	제조예-3	제조예-4
Arginine HCl	200ppm (each 20ppm)	250ppm (each 25ppm)	300ppm (each 30ppm)	350ppm (each 35ppm)
Histidine HCl
Isoleucine
Leucine
Lycine HCl
Methionine
Phenylalanine
Threonine
Tryptophan
Valine
	제조예-5	제조예-6	제조예-7	제조예-8
Cysteine HCl	100ppm(each 20ppm)	125ppm(each 25ppm)	150ppm(each 30ppm)	175ppm(each 35ppm)
Glutamine
Proline
hydroxy proline
Taurine
	제조예-9	제조예-10	제조예-11	제조예-12
Glycine	100ppm(each 20ppm)	125ppm(each 25ppm)	150ppm(each 30ppm)	175ppm(each 35ppm)
alanine
Valine
Serine
Glutamic acid

<제조예-2> 식물추출물 복합물의 제조

본 발명에서는 3개의 식물추출물의 제조 방법에 대해 설명하고 있으며, 해당 식물은 느릅나무[Ulmus davidiana] 뿌리 껍질과 당금잔화[Calendula Officinalis]의 꽃 그리고 대나무[Bambusoideae]이며, 상기 세 식물은 국립 한의학 연구소에서 입수하였다.

추출방법은 프로필렌글라이콜 10%와 에탄올 30%을 포함한 정제수를, 총 3회에 투입(식물생체량의 3배)하여 추출하였고, 3회에 걸쳐 추출된 용매를 최대 농축 및 건조하였다. 최종적으로 복합물 제조를 위해, 건조물 무게를 칙량하고, 100mg씩 분주하여 세포시험이나 임상시험전까지 보관하였다.

<실시예-1> 인간 모유두 세포에서의 세포 독성시험

인간 모유두 세포(Human hair dermal papilla cell: HHDPC)에서의 세포독성을 확인하기 위해, 탈수소효소 작용에 의하여 미토콘드리아의 환원력을 측정함으로써 세포 독성을 확인 가능한 MTT 방법을 실시하였다.

인간 모유두 세포를 HDP 키트 배지(Human hair dermal papilla cell media kit)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기(미국 써모 피셔 사이언티픽 사 제조)에서 배양하였다. 상기 배양된 세포를 24-웰 플레이트에 3x10⁴ 세포/웰의 농도로 분주하고, 18시간 후 각 웰에 제조예 (1-1) 내지 (1-12)에 따른 혼합물, 및 제조예 2의 세가지 추출물 각각을 각각 50μg/ml, 100μg/ml 및 200μg/ml의 농도로 처리하였다. 이후, 37℃ 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하였다. 48시간 배양 후 각 웰을 PBS(인산 완충 식염수) 용액으로 1회 세척하고, 5mg/mL MTT 시약(미국 시그마 사 제조) 50㎕과 새 배지 450㎕을 첨가하여 2.5시간 배양한 후 상등액을 제거하였다. 각 웰에 포마잔(formazan) 결정이 관찰되면 DMSO(다이메틸설폭사이드)를 첨가하여 차광 상태에서 30분간 흔들어 포마잔 결정을 녹인 후, 분광 광도계를 이용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과를 하기 도 1에 나타내었으며, 처리 농도에 관계없이 독성이 나타나지 않음이 확인되었다.

<실시예-2> 인간 모유두 세포에서의 증식 효과

세포 증식 효능의 비교를 위하여 제조예-1 내지 -12와 식물추출물을 각 100 μg/ml, 150ug/ml, 200ug/ml와 무처리구를 시험하였고, <실시예 1>에서 세포증식을 확인하기 위해 절반의 농도[24-웰 플레이트에 1.5x10⁴세포/웰의 농도] 로 분주하여 시험하였으며, 그 결과는 도 2와 같았다.

도 2에서 해당 결과는 무처리구의 세포 증식치를 “1”로 하였을때, 처리구의 증식효과를 나타내고 있으면, 필수 아미노산 처리구(제조예-1~4)의 경우, 농도가 높은 경우 증식효과가 컸으나. 고농도인 제조예-4에서는 저해효과가 나타났다. 본 증식 효과 실험은 세포독성시험 보다 낮은 세포수를 시험에 사용하기 때문에, 세포증식수를 보았을 때 생장이 상대적으로 낮다는 의미이다.

조건적 아미노산 처리구와 자연보습인자활성 아미노산 처리구에서도 특정 농도에서 증식효과를 나타냄이 확인되었다. 그리고 처리농도에서는 100ug/ml부터 200ug/ml사이에서 중간정도 수준의 결과를 확보하였다. 또한 식물 추출물의 경우, 느릅나무 외에는 증식효과가 나타나지 않았다.

<제조예-3> 아미노산과 식물추출복합물의 제조

인간 모유두 세포의 독성과 증식 효과 시험을 통해, 각 아미노산 처리구의 최적 구간을 설정하고, 이를 식물 추출물과의 복합물을 제조하여, 모유두 세포의 아미노산과 식물 추출물의 복합물질의 기능을 위한 시료를 제조하였다. 3개 아미노산 처리구와 식물 추출물은 150ug/ml과 300ug/ml을 정량해서 정제수에 혼합하였다.

그리고 하기 표에서 필수 아미노산과 조건적 아미노산군, NMF 군 및 식물 추출물의 혼합비는 아래와 같이 각각 동량 비율로 혼합하였다.

	저농도군		고농도군
	비교예-1	비교예-2	비교예-3	비교예-4
필수아미노산	제조예-3	제조예-3	제조예-4	제조예-4
조건적 아미노산 및 대사체	제조예-6	제조예-6	제조예-7	제조예-7
자연보습인자활성 아미노산	제조예-9	제조예-9	제조예-10	제조예-10
느릅나무	150ug/ml	150ug/ml	300ug/ml	300ug/ml
당금잔화	150ug/ml	150ug/ml	300ug/ml	300ug/ml
대나무	150ug/ml	150ug/ml	300ug/ml	300ug/ml

또한 아미노산과 식물추출물의 각각으로서의 효능을 확보하고자 아래와 같은 비교예를 제조하였다.

하기 표에서 느릅 나무를 포함한 3종의 추출물은 동량으로 혼합하였고, 3군의 아미노산 군도 동량비율로 혼합하였다.

	비교예-5	비교예-6
필수아미노산	-	제조예-3
조건적 아미노산 및 대사체	-	제조예-6
자연보습인자활성 아미노산	-	제조예-9
느릅나무	150ug/ml
당금잔화	150ug/ml
대나무	150ug/ml

<실시예-3> 인간 모유두 세포에서의 모근생성율 시험

인간 모유두 세포에서 모발 생성에 필요한 모근생성율을 측정하였다. 모유두 세포를 실시예 1에 기재된 방법에 의해 배양한 후 시험하였다.

배양된 모유두 세포에 제조예 3에서의 복합물을 세포배양액 중에 처리하였고, 농도별 특징을 살펴보기 위해, 각 농도의 0.5배수, 1배수, 1.5배수, 2배수로서 처리하였고, 무처리군은 정제수를 처리하였다. 결과는 현미경으로 모근의 형성수를 측정하였다.

<실시예-4> 인간 모유두 세포에서의 베타-카테닌 발현 유도 효과 평가

인간 모유두 세포에서 발모와 관현한 유전자는 베타-카테닌이고, 해당 유전자 발현을 유도하는 물질은 발모 혹은 육모에 효과적이라고 판단할수 있다. 이에 효과적으로 베타-카테닌의 유전자 발현을 확인하는 방법으로서 상용화된 방법으로서 확인하였다.

탑플래쉬 발광효소 리포터 어세이(TOPFlash luciferase reporter assay, Promega사, 미국)에 의한 TCF(T Cell Factor)의 전사활성도 조사를 통해 본 발명의 복합물이 인간 모유두 세포에서 베타-카테닌 발현을 유도하는 효과를 확인하였다. 이때, 인간 모유두 세포는 상기 실시예와 동일한 방법으로 배양하였다. 상기 배양된 인간 모유두 세포를 6-웰 플레이트에 1x10⁵ 세포/웰의 농도로 분주하고, 18 시간 후 G418을 이용하여 pTOPFLASH와 pFOPFLASH를 각각 0.3μg/ml, 발광효소 벡터 1μg/ml으로 형질전환(transformation)을 시키고 형질전환된 세포를 선발하기 위해 네오마이신계 항생제인 G418을 처리하였다. TOPFLASH 이중발광효소 리포터 진 어세이는 제조사가 제공하는 방법에 의해서 실험하였고 이중발광을 위해, pTOPFLASH와 pFOPFLASH의 두 가지 플라스미드(plasmid)를 형질전환 전달체(vector)로서 사용하였고, 이들은 모두 네오마이신 저항 유전자를 보유하고 있으므로, 형질전환에 성공하는 경우, G418 항생제를 투여하더라도 생존한다. 이와 같이 형질전환을 시킨 세포에 대하여 비교예-1~비교예-4와 비교예-5, 비교예-6의 아미노산과 식물추출물 복합물을 각각 0.01ppm, 0.05ppm, 0.1ppm 및 0.5ppm을 처리하고, 무혈청 배지에서 24 시간 동안 배양시켰다. 이어서, 배양시킨 세포를 PBS를 이용하여 2번 세척하고, Reporter lysis buffer(Promega)를 이용하여 용해시켰다. 발광효소(luciferase)의 활성을 발광효소 활성화 어세이 키트(Luciferase activity assay kit, Promega)를 이용하여 측정하였다.

결과는 발광효소의 활성 정도를 상대적으로 판단하게 되며 결과는 도 4와 같았다. 이때 시험의 유의성 확보를 위해, 베타-카테닌의 발현 저해제로 알려진 IWP-2[N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide]를 동시에 처리하였다. 비교예-1과 비교예-2에서 높은 수준의 베타-카테틴 유전자 발현 유도를 나타내고 있다.

<실시예-5> 인간 모유두 세포에서의 탈모방지 또는 육모 촉진 관련 유전자 발현량 측정

본 발명의 아미노산 및 식물추출물 복합물의 인간 모유두 세포에서의 탈모 방지 또는 육모에 관련되는 유전자인 LEF-1(lymphoid enhancer-binding factor 1) 및 TGF-βgrowth factor) 발현량을 측정하였다. 이때, LEF-1는 탈모 방지 또는 육모에 관련되는 유전자이고, TGF-β는 모발의 퇴행기를 유도하고 모낭의 성장을 억제시키는 유전자이다.

인간 모유두 세포는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다. 상기 배양된 인간 모유두 세포를 6-웰 플레이트에 3x10⁵ 세포/웰의 농도로 분주하고, 18 시간 후 10nM의 DHT(Dihydrotestosterone)에 대하여 비교예-1 내지 비교예-2, 비교예 1-3의 아미노산과 식물추출물 혼합물 용액을 기존 실시예-4에서 최적 농도인 0.1ppm농도로 처리하였다. 24 시간이 경과한 이후에 세포로부터 RNA를 분리하여 PCR(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 LEF-1(Hs01547250_m1) 및 TGF-β발현량을 태크맨 프로브(TaqMan®probe,Promega, 미국)를 이용한 태크맨 어세이(Life technologies, 미국)를 이용하여 실시간 PCR(Applied Biosystems, 미국)로 관련 유전자양의 변화를 측정하였다. 측정 결과를 하기 도 5와 도 6에 나타내었다.

탈모방지 및 육모에 관현된 LEF-1유전자 발현에 대해서, 아미노산과 식물추출물 복합물(비교예-1,-2, -3, -4)의 의해서 DHT단독 처리구에 비해, 발현증가가 유도 됨이 나타났고, 비교예-5와 비교예-6의 경우, 식물추출물(비교예-5)이 발모 및 육모, 탈모 관련 유전자 발현에 직접적인 효과가 있으나 단순 아미노산 복합물에 의해서는 효과가 없음이 확인되었다.

<실시예-6> 인체모델에서의 모발밀도시험

본 발명에 따른 아미노산과 식물추출물의 인체 적용을 위한 시험을 실시하였는데, 구체적으로 한국의 식품의약품안전처에서 제공하는 가이드에 의해 진행되었다. 24주 동안 시험하였으며, 만20세 내지 54세의 안드로겐성 탈모증으로 진단된 남녀를 피험자로 선정한 후, 각 20명씩 시험군과 대조군으로 구분하였다. 각각의 제형을 24주간 적용하였고, 각각의 모발 밀도를 측정하였으며, 모발 밀도는 1 내지 10의 점수표로서 평가하고, 그 결과를 하기 도 7에 나타내었다.

(중량%)	비교 제형예 1	비교 제형예 2	제형예 1	제형예 2
정제수	52.9	52.5	42.7	42.5
글리세린	3	3	3	3
EDTA-Na	0.05	0.05	0.05	0.05
아미소프트(Amisoft) CS-22	30	30	30	30
미코네이트(Miconate) LES	12	12	12	12
시트르산	0.1	0.1	0.1	0.1
페녹시에탄올	0.7	0.7	0.7	0.7
에틸헥실글리세린	0.05	0.05	0.05	0.05
NaCl	1	1	1	1
향료(Perfume)	0.2	0.2	0.2	0.2
아미노산 복합물	-	-	10% (제조예-3 제조예-6 제조예-10)	10% (제조예-4 제조예-7 제조예-11)
식물추출물 복합물	-	0.4	0.2	0.4
계	100	100	100	100

Claims

알기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린을 필수적인 유효성분으로 포함하고,
여기서, 상기 아미노산들은 전체 조성물에서 각각 30ppm씩 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 및 육모용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 추가적으로 시스테인, 글루타민, 프롤린, 하이드록시프롤린 및 타우린 조성물 및/또는 글라이신, 알라닌, 발린, 세린, 및 글루탐산 아미노산을 포함하는 탈모방지 및 육모용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 조성물에서 시스테인, 글루타민, 프롤린, 하이드록시프롤린 및 타우린은 각각 25ppm씩 포함되고, 글라이신, 알라닌, 발린, 세린, 및 글루탐산 아미노산은 각각 20ppm 씩 포함되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 및 육모용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 느룹나무 뿌리 껍질 추출물, 당금잔화 꽃 추출물 및 대나무 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 추출물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 및 육모용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물에서 상기 추출물은 150ug/ml 포함되는 특징으로 하는 탈모방지 및 육모용 조성물.