KR102428422B1

KR102428422B1 - 항산화 및 미백 활성을 지닌 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 함유하는 복합추출물 제조방법

Info

Publication number: KR102428422B1
Application number: KR1020200091476A
Authority: KR
Inventors: 박은경; 강금석
Original assignee: 주식회사 비비씨
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2022-08-03
Also published as: KR20220012564A

Abstract

본 발명은 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 카렌둘라 꽃을 유효성분으로 함유하고, 갈락토미세스 접종을 통해 발효시켜 항산화 활성, 미백 활성을 갖는 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법에 관한 것이다.

Description

항산화 및 미백 활성을 지닌 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 함유하는 복합추출물 제조방법{Method for preparing complex extract containing elder flower, chamomile flower, and calendula flower with antioxidant and whitening activity}

현대 사회에서는 깨끗하고 하얀 피부가 미(美)의 척도가 되고 있다. 생활수준 또한 향상되고 평균 수명이 연장됨에 따라 피부 미용에 대한 관심이 증가되었고, 자외선 노출의 증가와 환경오염으로 인해 피부 미용 및 미백에 대한 관심이 더욱 커지게 되었다. 이에 피부에 안정적이며 자극이 적은 미백 소재를 찾고자 하는 연구가 현재 활발하게 진행되고 있는 상황이다. 현재 미백에 관한 연구로서는 tyrosinase 활성을 억제하고, 3,4-dihydroxy-phenylalanine (DOPA)의 산화를 억제하는 연구와 자외선을 차단하는 방법 등이 행해지고 있다.

미백 효과를 검증하기 위해서는 멜라닌(melanin) 형성을 억제하는 것이 가장 중요한데, 이러한 이유는 각질형성세포(keratinocyte)에 있는 멜라닌 분포량에 따라 피부의 색소가 침착되고 피부색까지 결정되기 때문이다. 멜라닌(Melanin)은 자외선에 의해 파괴되기 쉬운 비타민 B군의 엽산과 리보플라빈, 비타민 E 등의 필수 비타민을 보호해 주며 비타민 D 합성의 촉진과 병원균의 감염 및 성장 억제 등의 긍정적인 역할을 하기도 한다. 또한 멜라닌(melanin)은 자외선에 대항하는 기능을 가지고 있으며 인체의 피부에 존재하면서 인체내 독성 제거역할을 하며, 최종적으로 피부를 보호한다. 하지만 과잉 생산되면 피부에 기미, 주근깨가 형성되며 피부의 노화를 더욱 촉진시키며 흑색종이라는 피부암을 유발하는 것으로 알려져 있다.

과도한 멜라닌(melanin) 합성을 조절하기 위한 피부 미백제의 개발 접근 방법으로는 크게 3가지로 분류된다. 첫 번째로 멜라닌 합성에 직접적으로 관여하는 효소인 tyrosinase와 TRP-1, TRP-2의 발현을 억제, 두 번째로 ROS와 같은 멜라닌 합성에 영향을 주는 요인을 조절, 마지막으로 멜라닌(melanin) 형성 세포에서 각질형성 세포로의 멜라닌 이동억제 방법이 있으며, 이렇게 멜라닌(melanin) 합성을 조절하는 주된 미백 원료로는 코직산(kojic acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 알부틴(arbutin) 등이 있다. 하지만 코직산(kojic acid)은 발암을 유발하거나 유전 독성이 있으며, 아스코르브산(ascorbic acid)은 수용성에서 분해되며, 알부틴(arbutin)은 세포 투과성의 문제로 화장품 미백원료로서 문제점이 대두되고 있다. 그러한 이유로 부작용이 적은 천연적인 미백 소재의 탐구가 지속적으로 이어지고 있다.

항산화 및 미백 활성에 효능이 있는 것들 중, 엘더, 카렌둘라, 및 캐모마일과 본 발명에서 사용되는 갈락토미세스 등이 주목받고 있는 데, 이들에 대해 간단히 설명하고자 한다.

우선, 갈락토미세스는 사카로미세스(Saccharomyces) 속의 효모(Yeast)로 예로부터 발효식품을 만드는 데 이용되어 왔으며, 천연보습인자(NMF, natural moisturizing factor)의 전구체인 프로필라그린(profilaggrin)을 천연보습인자로 전환시키는 것을 도와 피부 보습을 유지시켜 주는 것으로 보고된다.

또한, 갈락토미세스발효여과물에 함유되어 있는 아미노산, 비타민, 무기질, 다당류 성분이 피부 표면에서 수분이 증발되는 것을 방지하여 피부가 건조해지지 않고 탁월한 피부 보습 효과를 얻을 수 있다. 연구결과에 따르면 피부보습, 피부장벽 개선, 피부톤 개선, 각질 제거, 화이트닝, 피부 트러블 개선 등의 효과가 있다.

또한, 엘더(Sambucus nigra)나무는 유럽·아시아·북아프리카·북미대륙의 그늘지고 습한 지역에서 자라며 푸른 검정 엘더베리와 크림 화이트 엘더플라워가 있는 낙엽수로 약초학에서 염증과 당뇨병 증상을 줄이기 위해 이뇨제, 감기와 독감 치료에 오랜 시간 사용되었으며, 연구결과에 따르면 항산화, 항염증, 항바이러스, 항알레르기, 혈관 보호성 및 항암 등 다양한 약물 효능이 있다.

또한, 카렌둘라(Calendula officinalis)는 국화과에 속하는 쌍떡잎식물로 원산지는 지중해 지역이고, 카렌둘라 꽃은 유럽과 아프리카에서 오랫동안 민간요법으로 상처, 화상 및 피부질환에 사용되어왔으며 약용 목적으로 재배되고 있다. 카렌둘라 꽃은 페놀성 화합물 및 플라보노이드 성분들이 존재하며 항염증, 항균 및 항암 등의 활성이 있는 것으로 보고되었다. 카렌둘라는 식품 분야에 있어 염료 또는 향료, 의학 분야에서는 피부의 염증 질환에 사용되며, 살충제로도 활용될 수 있으며, 항균효과(antimicrobial), 방부효과(antiseptic), 상처 및 궤양의 치료제, 혈압 강하제(hypotensive properties)로 활용될 수 있으며, 자가 산화(auto-oxidation)의 억제 및 산화에 의하여 유도된 세포 손상의 방어기능으로 서양에서 민간요법(herbal remedy)으로 활용되어 왔다.

캐모마일(Matricaria chamomilla L.)은 유럽, 북아프리카, 북아시아가 원산지이며, 달콤하고 상쾌한 사과향을 지니며 피부 살균효과와 전신미용 효과가 있어서 미용을 위한 목욕제로 쓰이며, 자궁냉증에 효과를 가지고, 저염증, 방부, 구충약, 경련을 가라앉히는데 좋으며, 건위제 및 발한작용에 의한 감기 예방, 불면증 해소, 진정작용 등의 효과가 알려져 있기 때문에 염증성 질환, 발열, 설사, 소장과 간의 조양을 치료하기 위해 주로 차로 음용된다. 캐모마일의 꽃에는 terpenes, flavonoids, coumarin, calicacid, 무기질 등의 성분이 함유되어 있으며, 꽃을 증류 추출하여 얻은 에센셜 오일은 푸른빛을 띠고 28종류의 terpenes(α-bisabolol, chamazulene, bisabolol oxide 등)의 성분과 36가지의 flavonoids(apogenin 등), 52가지의 유기산 등 120여종의 화합물들이 함유되어 있는 것으로 보고되었으며, 이 성분들 중에서 특히 α-bisabolol은 통풍을 감소시키고, 위궤양의 진행을 억제시키며, 피부염 치료에 효과가 있고, chamazulene은 항염증 지질과산화 억제효과를 가지고 있어 염증을 가라앉히는데 효과적이다.

마지막으로 갈락토미세스는 Saccharomyces 속의 효모(Yeast)로 예로부터 발효식품을 만드는 데 이용되어 왔으며, 천연보습인자(NMF, natural moisturizing factor)의 전구체인 프로필라그린(profilaggrin)을 천연보습인자로 전환시키는 것을 도와 피부 보습을 유지시켜 주는 것으로 알려져 있고, 갈락토미세스발효여과물에 함유되어 있는 아미노산, 비타민, 무기질, 다당류 성분이 피부 표면에서 수분이 증발되는 것을 방지하여 피부가 건조해지지 않고 탁월한 피부 보습 효과를 얻을 수 있으며, 연구결과에 따르면 피부보습, 피부장벽 개선, 피부톤 개선, 각질 제거, 화이트닝, 피부 트러블개선 등의 효과가 있는 것으로 보고된다.

상기와 같은 원재료가 다양한 효과를 지니고 있으나 원재료 추출, 배양, 발효 기술, 및 미백과 항산화 활성에 유익한 비율로 추출하는 기술이 미약하여 상기와 같은 효과를 적극 구현하지 못하는 실정이다.

선행기술문헌 : KR 등록특허공보 제1998032호(2019.07.08 공고)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 특히, 엘더, 카렌둘라, 및 캐모마일을 유효성분으로 함유하고, 갈락토미세스 접종을 통해 발효시켜 항산화 활성, 미백 활성을 갖는 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위해 안출된 본 발명에 따른 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법은 건조된 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 분쇄기에 투입하고, 분쇄하는 혼합분쇄단계; 혼합분쇄단계로 분쇄된 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 미생물 배양 배지와 혼합하여 멸균하는 배지혼합 및 멸균단계; 배지혼합 및 멸균단계를 수행한 혼합물의 발효를 위해 갈락토미세스를 접종하는 갈락토미세스접종단계; 갈락토미세스접종단계를 수행한 혼합물을 배양기에서 배양하는 배양단계; 배양단계를 수행한 배양액에 이산화규소를 포함하는 여과조제를 혼합하여 지방질이나 중금속의 흡착, 탈색, 및 탈취를 수행하는 여과조제혼합단계; 여과조제혼합단계를 수행한 배양액에 필터프레스를 이용하여 감압여과하여 잔사를 제외한 순수 추출물만 수득하는 여과단계; 여과단계를 수행한 순수 추출물을 가열하여 세균활성 및 추가 발효를 억제시키는 살균단계; 및 살균단계를 수행한 순수 추출물에 1,2-헥산다이올, 부틸렌글라이콜을 포함하는 보존제를 첨가하는 제형화단계를 포함할 수 있다.

또한, 갈락토미세스접종단계는 배지혼합 및 멸균단계 수행 후, 추출 배지의 온도가 40℃ 이상 50℃ 이하가 되면 구연산을 첨가하여 pH를 3 내지 4로 조정하고, 추출 배지의 온도가 30℃ 이상 36℃ 이하로 진입하면 배지양의 1% 이상 5% 이하의 비율로 갈락토미세스를 접종하하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 배양단계는 갈락토미세스접종단계를 수행한 혼합물을 배양기에서 20℃ 이상 40℃ 이하에서 24시간 이상 48시간 이하 동안 배양하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 의하면, 엘더, 카렌둘라, 및 캐모마일을 유효성분으로 함유하여 갈락토미세스 접종을 통해 발효하여 항산화 활성, 미백 활성을 가지는 복합추출물을 제조할 수 있도록 하는 데 그 효과가 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 갈락토미세스접종단계에서 온도와 시간 조절 및 산도 조절로 세균 및 미생물의 감염을 억제시키고, 색상 변화 방지 및 이취를 최소화하는 데 그 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법의 순서도,
도 2 내지 도 6은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법을 이용한 실험결과를 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세히 설명한다. 우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법(S100)의 순서도이고, 도 2 내지 도 6은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법(S100)을 이용한 실험결과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법(S100)에 관한 것이다. 보다 상세하게는 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 카렌둘라 꽃을 유효성분으로 함유하고, 갈락토미세스 접종을 통해 발효시켜 항산화 활성, 미백 활성을 갖는 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법(S100)에 관한 것이다.

도 1을 참조하면, 본 발명은 혼합분쇄단계(S10), 배지혼합 및 멸균단계(S20), 갈락토미세스접종단계(S30), 배양단계(S40), 여과조제혼합단계(S50), 여과단계(S60), 살균단계(S70), 및 제형화단계(S80)로 구성되고, 혼합분쇄단계(S10)부터 상세히 설명하기로 한다.

혼합분쇄단계(S10)는 건조된 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 분쇄기에 투입하고, 분쇄한다. 이는, 원물의 표면적을 크게 하여 추출 수율을 높이고자 함이다.

배지혼합 및 멸균단계(S20)는 혼합분쇄단계(S10)로 분쇄된 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 미생물 배양 배지와 혼합하여 90℃ 이상 120℃ 이하의 온도에서, 1kgf/cm² 이상 2kgf/cm² 이하의 압력으로 15분 이상 30분 이하의 시간 동안 멸균한다.

이는, 분쇄된 원물과 미생물 배양 배지를 90℃ 미만에서 멸균할 경우 고온에서 생존하는 균을 살균할 수 없고, 120℃를 초과할 경우 이후 단계에서 쿨링 시간이 초과되어 공정시간이 길어지고 유의적 효과가 없기에 상기 온도 범위에서 멸균을 수행하도록 함이 바람직하다.

또한, 멸균 진행 시, 압력이 1kgf/cm² 미만일 경우, 미생물의 포자까지 멸균할 수 없고, 2kgf/cm² 초과일 경우, 안전장치 발동으로 밸브가 개방되어 압력이 빠질 수 있는 우려가 있기에 상기 압력 범위에서 멸균을 수행하도록 함이 바람직하다.

또한, 멸균 반응시간이 15분 미만일 경우, 미생물의 포자까지 멸균할 수 없고, 30분 초과일 경우, 쿨링 시간, 압력 배출시간을 포함하는 전체공정 시간이 길어지고 유의적 효과가 없어 상기 시간 동안 멸균을 진행함이 바람직하다.

또한, 배지혼합 및 멸균단계(S20)에서 갈락토미세스 배양 배지 조성은 정제수 1L 기준, 펩톤(peptones) 1g 이상 5g 이하, 효모추출물(yeast extract) 1g 이상 5g 이하, 맥아추출물(malt extract) 1g 이상 5g 이하, 덱스트로오스(dextroxse) 10g 이상 20g 이하로 구성하는 것이 바람직하다.

이는 상기 범위를 벗어날 경우 갈락토미세스의 성장속도 느려지거나 빨라져서 핸들링이 어려워지기에 상기 범위내에서 배양 배지를 조성함이 바람직하다.

갈락토미세스접종단계(S30)는 배지혼합 및 멸균단계(S20)를 수행한 혼합물의 발효를 위해 갈락토미세스를 접종한다.

또한, 갈락토미세스접종단계(S30)는 배지혼합 및 멸균단계(S20) 수행 후, 추출 배지의 온도가 40℃ 이상 50℃ 이하가 되면 구연산을 첨가하여 pH를 3 내지 4로 조정하고, 추출 배지의 온도가 30℃ 이상 36℃ 이하로 진입하면 배지 전체 중량의 1% 이상 5% 이하의 중량 비율로 갈락토미세스를 접종한다.

또한, 갈락토미세스접종단계(S30)에서 pH 조정 전 추출 배지의 온도가 40℃ 미만일 경우, pH를 적정할 때 미생물의 감염이 발생할 수 있고, 50℃ 초과일 경우, pH를 적정할 때 실온에서의 pH와 상이하게 변화하기에 pH 조정 전 추출 배지의 온도는 40℃ 이상 50℃ 이하로 조성함이 바람직하다.

또한, 갈락토미세스접종단계(S30)에서 pH 조정 시, pH 3 이상 내지 pH 4 이하로 조정하는 것은 배양 과정에서 세균 및 미생물의 감염이 발생할 수 있고, 이들의 생장을 억제하기 위한 환경을 조성하기 위함이다.

또한, 갈락토미세스접종단계(S30)에서 pH 조정 후, 추출배지의 온도를 20℃ 이상 40℃ 이하로 조성하는 것은 추출배지의 온도가 20℃ 미만에서는 갈락토미세스의 생장이 멈추고, 40℃ 이상에서는 효모 및 단백질이 불활성화 되어 갈락토미세스를 배양할 수 없기에 상기 온도범위로 조성하는 것이 바람직하다.

또한, 갈락토미세스 접종 중량 비율이 전체 배지 중량 대비 1% 미만일 경우, 갈락토미세스의 생장이 늦어져서 배양시간 및 공정시간이 길어져 대량생산에 부적합하고, 5% 초과일 경우 갈락토미세스의 생장속도가 빨라져서 물성, 색상, 향취가 변질되어 원료로 사용할 수 없기에 상기 접종 중량 비율로 접종을 수행함이 바람직하다.

배양단계(S40)는 갈락토미세스접종단계(S30)를 수행한 혼합물을 배양기에서 배양한다.

또한, 배양단계(S40)는 갈락토미세스접종단계(S30)를 수행한 혼합물을 배양기에서 20℃ 이상 40℃ 이하에서 24시간 이상 48시간 이하 동안 배양한다.

이는, 배양단계(S40)의 배양기 내 온도가 20℃ 미만일 경우, 갈락토미세스의 생장이 멈추고, 40℃ 초과일 경우, 효모 및 단백질이 불활성화되어 갈락토미세스를 배양할 수 없기에 상기 온도범위 내에서 배양함이 바람직하다.

또한, 배양단계(S40)의 갈락토미세스는 24시간 이상 48시간 이하의 시간 동안 배양(발효)되는 것이 바람직한데, 24시간 미만으로 발효할 경우, 배양시간이 짧아서 생리활성물질의 추출이 원활하지 않고, 48시간 이상 발효할 경우 발효 산물의 물성, 색상 및 향이 변질되어 원료로 사용할 수 없기 때문이다.

여과조제혼합단계(S50)는 배양단계(S40)를 수행한 배양액에 이산화규소를 포함하는 여과조제를 배양액 전체 중량 대비 1% 이상 2% 이하 혼합하여 20분 이상 40분 이하의 시간동안 반응시킨 후 여과하여 지방질이나 중금속의 흡착, 탈색, 및 탈취를 수행한다.

이는, 여과조제혼합단계(S50)에서 혼합되는 여과조제의 함량이 배양액 전체 중량 대비 1% 미만이면 반응량이 부족하여 지방질이나 중금속 흡착 등이 원활히 일어나지 않게 되고, 2% 초과 시 반응량이 많아져서 여과속도 및 추출 수율의 감소하며, 반응시간이 20분 미만일 경우, 반응시간이 짧아져서 지방질이나 중금속 흡착 등이 원활히 일어나지 않으며, 40분 초과일 경우, 반응시간이 길어져서 생리활성물질과의 흡착으로 인한 추출 수율이 감소하기에 상기 범위 내에서 여과조제와의 혼합을 진행함이 바람직하다.

여과단계(S60)는 여과조제혼합단계(S50)를 수행한 배양액에 필터프레스를 이용하여 500mmHg 이상 600mmHg 이하의 압력으로 감압여과하여 잔사를 제외한 순수 추출물만 수득한다.

이는, 여과단계(S60)의 압력값이 500mmHg 미만일 경우, 여과 속도가 느려져 공정시간이 길어지게 되고, 600mmHg 초과일 경우, 여과액의 거품 발생과 끓어 넘침에 따른 기기 고장, 추출물의 손실 및 안전사고의 위험성이 발생하기에 상기 압력 범위로 진행함이 바람직하다.

살균단계(S70)는 여과단계(S60)를 수행한 순수 추출물을 3분 이상 7분 이하 동안 가열하여 세균 활성 및 추가 발효를 억제시킨다.

살균단계(S70)에서 가열 시간이 3분 미만일 경우, 살균하는 시간이 짧아 미생물의 활성이 억제되지 않고, 7분 초과일 경우, 생리활성물질이 파괴되어 활성감소, 색상 및 향취에 변화가 생기기에 상기 시간 동안 가열하는 것이 바람직하다.

제형화단계(S80)는 살균단계(S70)를 수행한 순수 추출물에 1,2-헥산다이올, 부틸렌글라이콜을 포함하는 보존제를 첨가하여 보관을 용이하게 하고, 유통기한을 늘려주도록 한다.

<실시예 1>

본 실시예는 프리라디칼(DPPH) 소거작용효과를 관찰한 것이다. 0.2mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) methanol 용액 0.5㎖에 여러 농도의 각각의 시료를 넣고 10% 에탄올 용액 1㎖을 첨가하여 섞은 다음 37℃에서 10분간 방치 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 프리라디칼 소거작용은 아래의 수학식과 같이 구하였다.

프리라디칼 소거작용 (%) = 100 - [(실험군의 흡광도/대조군의 흡광도) × 100]

도 2를 참조하면, 농도에 따른 프리라디칼 소거율을 나타낸 것으로 시료(발효 복합추출물)의 농도가 31.25ug/mL일 때 45%, 62.5ug/mL일 때 54%, 125ug/mL일 때 67%, 250ug/mL일 때 77%, 100%일 때 92% 가량의 항산화 활성을 나타냈다.

<실시예 2>

본 실시예는 프리라디칼(ABTS) 소거작용을 관찰한 것이다. ABTS 시약을 0.142 g을 정확히 칭량하여 증류수 50mL에 잘 녹여 두고 potassium persulfate 0.033 g을 정확히 칭량하여 녹여둔 ABTS 시약에 혼합하였다. 잘 혼합된 시약은 포일로 빛을 차단하고 상온에 두어 반응시켰다. 12시간 이후 해당 시약을 흡광도 측정하여 흡광도 값이 1이 되는 것을 확인한 다음 실험을 진행하였다. 시료는 각각 100uL씩 96well에 분주하여 두고, ABTS 시약을 시료가 분주된 96well에 100uL씩 분주하였다. 분주한 후 잘 혼합한 다음 포일로 96well을 감싸서 빛의 영향을 최소화 하였고 30분간 상온에서 반응을 실시하였다. 측정은 micro-ELISA를 이용하였고 측정파장은 740nm로 고정하였다. 시료의 활성 비교 및 실험의 오류를 확인하기 위하여 positive control로 BHA를 이용하였고 blank에는 시료 대신 증류수를 이용하였다. 그 결과 프리라디칼 소거작용은 아래의 수학식과 같이 구하였다.

도 3을 참조하면, 농도에 따른 프리라디칼 소거율을 나타낸 것으로 트리플미세스의 농도가 31.25ug/mL일 때 50%, 62.5ug/mL일 때 68%, 125ug/mL일 때 78%, 250ug/mL일 때 94%, 100%일 때 98% 가량의 항산화 활성을 나타냈다.

<실시예 3>

본 실시예는 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성을 측정한 것이다. 실험군은 0.1M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 2.3 mL와 기질액 1.5 mM L-tyrosine 용액 0.4 mL 의 혼합액에 250 U/mL mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA) 0.1 mL와 50~200 ug/mL phenolic compounds 농도의 시료 0.2 mL를 넣고 대조군에는 시료 대신 증류수를 0.2 mL를 첨가하여 37°C에서 20분간 반응시킨 다음, 흡광도 475 nm에서 측정하여 저해율(%)을 (1-실험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100으로 계산하였다.

도 4를 참조하면, 농도에 따른 티로시나아제(tyrosinase) 저해율을 나타낸 것으로 트리플미세스의 농도가 31.25ug/mL일 때 6%, 62.5ug/mL일 때 18%, 125ug/mL일 때 23%, 250ug/mL일 때 31%, 100%일 때 40% 가량의 tyrosinase 저해 활성을 나타냈다.

<실시예 4>

본 실험에 이용한 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/steptomycin (100 U/mL) 을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37°C, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. 세포 확인 시 inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan)를 사용하였다. B16F10 mouse melanoma cell에 시료용액 농도별로 1시간 전처리 후 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 1 uM을 48시간 처리하였다.

세포 독성 측정은 Carmichael 등(1987)의 방법에 따라 측정하였다. B16F10 mouse melanoma cell을 48 well plate에 1x10⁴ cells/well이 되게 450uL 분주하고, 24시간 뒤 시료를 농도별로 조제하여 50uL 첨가한 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 48시간 처리하였다. 대조군은 시료와 동량의 DMEM(-) 배지를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 50 uL를 첨가하여 4시간 배양하여 배양액을 제거하고 각 well에 dimethyl sulfoxide (DMSO) 300uL를 가하여 실온에서 10분간 반응시킨 뒤 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

Cell viability (%) = (1 - 실험군 흡광도 / 대조군 흡광도 ) ×100

도 5를 참조하면, 농도에 따른 세포독성을 나타낸 것으로 트리플미세스의 B16F10 melanoma cell 에서 세포 생존율을 분석한 결과 농도에 따른 세포독성은 발견되지 않았으며 세포의 성장률이 약간 증가되는 것으로 나타났다..

<실시예 5>

멜라닌 양은 Hosoi 등(1985)의 방법을 준하여 사용하였다. B16F10 mouse melanoma cell를 6 well에 5x10⁴ cells/well이 되도록 분주하여 24시간 뒤, DMEM(+) 배지를 제거한 다음 각각의 well에 DMEM(-) 배지를 분주하고 α-MSH 200uL는 normal군을 뺀 모든 well에 분주하여 자극시켰다. 이후 시료를 농도별로 200uL 분주 후 48시간 동안 처리하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양시켰다. 배양 후 상등액을 모두 제거하고 PBS로 세척한 후 C eep reezer에서 하루 보관 뒤, 상온에서 M-PER를 20uL 분주하여 세포들을 모아 13,000 rpm, 4°C, 15분간 원심 분리하여 세포 침전물을 만들었다. 상등액을 제거 후 10% DMSO/1N NaOH 200uL를 분주하여 heating block 70°C에서 1시간 용해시킨 다음 흡광도 405 nm에서 O.D 값을 측정하였다.

멜라닌 함량 (%) = (1 - 실험군 흡광도 / 대조군 흡광도 ) ×100

도 6을 참조하면, 농도에 따른 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것으로 트리플미세스를 처리하였을 때 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 melanin 생성량이 감소하는 경향을 보였다. 31.25 ug/mL의 농도에서는 약 5%의 melanin 생성 억제를 보였지만, 최고 농도인 500 ug/mL의 농도에서는 약 38%의 melanin 생성 억제 효과를 보여주었다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도면에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

S10 - 혼합분쇄단계
S20 - 배지혼합 및 멸균단계
S30 - 갈락토미세스접종단계
S40 - 배양단계
S50 - 여과조제혼합단계
S60 - 여과단계
S70 - 살균단계
S80 - 제형화단계
S100 - 항산화 및 미백 활성을 지닌 트리플미세스 제조방법

Claims

건조된 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 분쇄기에 투입하고, 분쇄하는 혼합분쇄단계;
혼합분쇄단계로 분쇄된 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 미생물 배양 배지와 혼합하여 멸균하는 배지혼합 및 멸균단계;
배지혼합 및 멸균단계를 수행한 혼합물의 발효를 위해 갈락토미세스를 접종하는 갈락토미세스접종단계;
갈락토미세스접종단계를 수행한 혼합물을 배양기에서 배양하는 배양단계;
배양단계를 수행한 배양액에 이산화규소를 포함하는 여과조제를 혼합하여 지방질이나 중금속의 흡착, 탈색, 및 탈취를 수행하는 여과조제혼합단계;
여과조제혼합단계를 수행한 배양액에 필터프레스를 이용하여 감압여과하여 잔사를 제외한 순수 추출물만 수득하는 여과단계;
여과단계를 수행한 순수 추출물을 가열하여 세균활성 및 추가 발효를 억제시키는 살균단계; 및
살균단계를 수행한 순수 추출물에 1,2-헥산다이올, 부틸렌글라이콜을 포함하는 보존제를 첨가하는 제형화단계
를 포함하는 항산화 및 미백 활성을 지닌 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 함유하는 복합추출물 제조방법.
제1항에 있어서
갈락토미세스접종단계는
배지혼합 및 멸균단계 수행 후, 추출 배지의 온도가 40℃ 이상 50℃ 이하가 되면 구연산을 첨가하여 pH를 3 내지 4로 조정하고, 추출 배지의 온도가 30℃ 이상 36℃ 이하로 진입하면 배지양의 1 중량% 이상 5 중량% 이하의 비율로 갈락토미세스를 접종하하는 것
을 포함하는 항산화 및 미백 활성을 지닌 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 함유하는 복합추출물 제조방법.
제1항에 있어서
배양단계는
갈락토미세스접종단계를 수행한 혼합물을 배양기에서 20℃ 이상 40℃ 이하에서 24시간 이상 48시간 이하 동안 배양하는 것
을 포함하는 항산화 및 미백 활성을 지닌 엘더 꽃, 캐모마일 꽃, 및 카렌둘라 꽃을 함유하는 복합추출물 제조방법.