KR102421301B1 - 호흡기 바이러스성 질환 치료를 위한 라도티닙의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 호흡기 바이러스성 질환 치료를 위한 라도티닙(라도티닙)의 새로운 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 화학식1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 코로나 바이러스 감염을 예방, 개선 및 치료하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명은 특히, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 감염으로 유발되는 질병의 예방 및 치료에 유용한 항바이러스제로 사용할 수 있다.

Description

호흡기 바이러스성 질환 치료를 위한 라도티닙의 용도{Use of Radotinib for treatment of viral respiratory disease}

본 발명은 코로나 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가지는, 특히 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 의해 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료를 위한 라도티닙(Radotinib)의 용도에 관한 것이다.

코로나바이러스는 외피가 있는 단일가닥의 양성 RNA 바이러스이며 게놈 크기는 25-32kb로 지금까지 알려진 RNA 바이러스 중에서는 비교적 큰 바이러스에 속한다. 외피에 곤봉모양의 돌기인 스파이크(spike) 단백질이 박혀 있어 화염 또는 왕관 모양의 특이적 구조를 가지고 있으며 라틴어 Corona로부터 바이러스 이름이 유래되었다고 한다.

1937년 닭에서 처음으로 발견된 후 박쥐, 새, 고양이, 개, 소, 돼지, 쥐 등 다양한 조류와 동물에서 발견된 코로나바이러스는 4개의 그룹(Alpha-, Beta-, Gamma-, Deltacoronavirus)으로 나누어진다. 알파와 베타코로나바이러스 그룹은 포유류에 주로 감염되고 감마와 델타코로나바이러스 그룹은 조류에서 찾을 수 있다. 코로나바이러스는 동물들에서 위장병 및 호흡기질환과 같은 다양한 질환을 일으킬 수 있다고 알려져 있다.

사람에게 감염되는 사람 코로나바이러스는 1960대 발견된 HCoV-229E와 HCoV-OC43, 사스 대유행 이후 발견된 HCoV-NL63(2004년)과 HCoV-HKU1(2005년)로 이들은 일반적으로 상기도감염증과 관계가 있다고 알려져 있으나 면역결핍환자들에게는 심각한 폐질환을 유도하기도 한다. 주로 겨울이나 이른 봄에 코로나바이러스에 대한 감염률이 증가된다고 보고되고 있고, 성인 감기환자 중 코로나바이러스가 원인 병원체인 비율이 상당히 높다고 알려져 있다. 2003년 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)을 일으키는 사스 코로나바이러스(SARS-CoV)가 처음 발견되었으며 세계보건기구(WHO)보고에 따르면 2002년에서 2003년 동안 전 세계적으로 8,273명의 환자와 775명의 사망자(치사율 약 10%)가 발생하였고, 2004년까지 추가적인 환자 발생과 사망자가 보고되었다.

2012년 9월 사스와 유사한 고열, 기침, 호흡곤란 등의 호흡기 증상을 나타내는 중중 호흡기질환 환자가 발생하였고, 이 원인 병원체는 기존의 알려진 바이러스와는 다른 신종 코로나바이러스(HCoV-EMC)로 밝혀졌다.

신종 코로나바이러스는 2013년 5월 국제바이러스 분류위원회(International Committee on Taxonomy of Viruses)의 코로나바이러스 스타디그룹에서 “Middle East respiratory syndrome-coronavirus (MERS-CoV)이라는 이름으로 분류하였다. 이 바이러스는 유전자 염기서열(genetic sequencing)이 박쥐에서 발견되는 Pipistrellus Bat CoV-HKU5, HKU4와 유사하다 하여 박쥐가 가장 유력한 감염원일 것으로 추정하였다. 그러나 최근 란셋전염병(The Lancet Infectious Diseases) 학술지를 통해 발표된 논문에서는, 오만의 단봉 낙타 50마리의 혈액샘플을 분석한 결과 모두 MERS-CoV 항체 흔적이 발견됐다고 밝혔다. 그러나 카나리아제도에서는 105마리 가운데 15마리에서 항체 양성 반응을 보였다.

바이러스 자체가 발견되지는 못했지만 연구 결과는 이 낙타들이 어느 시점에 메르스 또는 유사 바이러스에 감염되었음을 의미하며, 바이러스 숙주가 낙타일 가능성이 매우 높음을 보여주었다.

중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 감염은 2012년 9월 사우디아라비아에서 첫 감염사례가 확인된 후 2014년 6월까지 WHO에 공식적으로 보고된 환자는 전 세계적으로 808명이며, 313명이 사망하였다(34.5%).

중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 초기 확진환자 발생 당시 환자의 임상증세가 사스와 상당히 유사했기에 사스 코로나바이러스와 상당한 연관성을 가지고 있지 않을까 하는 우려가 있었으나, 전장 유전자가 분석된 이후 분자 유전학적으로 사스 바이러스와는 상당한 차이를 보이는 새로운 바이러스라는 것이 밝혀졌다.

우선 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)는 사스 코로나바이러스와는 55% 정도의 낮은 뉴클레오타이드 상동성을 보였으며, 계통학적 분석에 있어서도 두 바이러스는 서로 다른 진화적 차이를 보였는데, 사스 코로나바이러스는 베타코로나바이러스의 B 그룹에 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)는 베타코로나바이러스의 C 그룹에 속해 있었다. 베타코로나바이러스 그룹에 속하는 것으로는 사스 코로나바이러스 그리고 사람 코로나바이러스인 HCoV-HKU1과 HCoV-OC43이 알려져 있다.

또한 사스와 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)는 세포내로 들어가는 경로도 차이를 보이는데 사스 바이러스는 사람 기도의 섬모세포에 분포되어 있는 ACE2 수용체를, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)는 비섬모세포내 DDP4(CD26이라고도 불림)를 이용한다. 두 수용체 모두 사람의 상기도 보다는 하기도에 많이 분포하고 있고, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)와 사스 바이러스가 높은 치사율을 나타내기는 하나 폐렴으로 진행된 후 큰 비말을 통해서 전파가 이루어져야 하기에 인플루엔자나 홍역 경우처럼 에어로졸에 전파되는 질환에 비교하여 전염성은 그만큼 떨어질 수 있다는 것을 제시한다. 그러나 사스환자 발생의 경우를 보면 사스환례에 밀접하게 노출되는 경우나 호흡기비말의 에어로졸화를 유발하는 환경에서는 그 전파력은 상당히 높아 질 수 있기에 감염성 위험은 여전히 높다고 할 수 있다.

중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 최초 감염원이 무엇인지 어떤 방법으로 사람에게 전파되어 병을 일으키게 되었는지에 대해서는 아직까지 밝혀져 있지 않다. 다만 발생한 신종 코로나바이러스 확진 환자 중 2명의 사례는 농장방문과 동물접촉 사실이 밝혀졌다. 이것은 신종 코로나바이러스의 인수공통감염 가능성을 보여주고 있다.

주요 임상증상은 발열(87%), 기침(89%), 호흡곤란 등으로 폐렴 증상을 보이며, 일부 환자는 구토와 설사(35%)도 나타난다. 면역기능이 저하된 환자에서 신부전(renal failure)도 일으키는데 사망률은 34.5%로 매우 높다. 중동지역(사우디아라비아, 카타르 등)에서 많이 발생하여 이들 지역을 감염지역으로 추정되고 있으나 정확한 감염경로는 정확하게 밝히지 못하고 있다. 그러나 그동안 사람끼리 광범위하게 감염이 나타난다는 증거는 없었으나 가족이나 의료진과 밀접하게 접촉하는 경우(close contact) 전파된다는 사실이 확인되었다. 잠복기는 9일~12일로 추정하는데 사람마다 잠복기의 차이가 많다. MEJM(2008.02) 보고에서는 1.9일~14.7일 (평균5.2일) 이라고 했다.

아직까지 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 치료 효과가 확인된 약물 및 예방 백신이 개발되어 있지 않은 상황이다. 따라서 현재까지는 바이러스 감염이 의심되는 환자와의 접촉을 피하고, 개인위생을 철저히 하는 것 이외에는 특별한 치료 및 예방방법이 없는 실정이다. 현재, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 감염 치료를 위하여 항생제, 리바비린, 인터페론 그리고 환자의 혈청 등이 사용되기도 하였으나 이들 치료제는 특이적인 효과를 발휘하지 못하고 있다.

따라서 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 대한 질병 치료 및 예방을 위한 대체 약물의 개발이 매우 시급한 실정이다.

본 발명은 코로나 바이러스에 대해 강력한 항바이러스 활성을 나타내는 항바이러스제를 제공하는 것이다.

본 발명은 코로나바이러스에 의해 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료를 위한 라도티닙 (화학식 1) 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 치료용 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물은 라도티닙 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하며, 코로나 바이러스 질환 예방 및 치료의 목적으로 사용될 수 있다.

본원 발명은 환자에서 바이러스성 호흡기 질환의 치료 또는 예방을 위한 수용체 티로신 키나아제 억제제, 그리고 특히, 라도티닙 또는 약제학적으로 수용 가능한 그의 염의 용도를 제공한다. 본원 발명의 비 제한적인 일 실시예에서, 코로나바이러스의 복제, 전염 또는 복제 및 전염 모두의 억제를 위한 라도티닙의 용도를 제공한다. 본 발명은 동물 환자, 바람직하게는 포유류 환자, 그리고 더욱더 바람직하게는 인간 환자에서 바이러스성 호흡기 질환 치료를 위한 라도티닙과 같은 수용체 티로신 키나아제 억제제의 용도를 제공한다.

본 발명의 "라도티닙" 이라는 용어는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 4-메틸-N-[3-(4-메틸이미다졸-1-일)-5-트리플루오르메틸-페닐]-3-[4-(3-메틸피라진-2-일)-피리미딘-2-일아미노)벤즈아미드이다.

화학식 1의 화합물은 1종 이상의 티로신 키나아제, 예를 들어 c-Abl, Bcr-Abl, 수용체 티로신 키나아제인 PDGFR, Flt3, VEGF-R, EGF-R 및 c-Kit를 억제하는 것으로 알려 졌으며, 폐암, 위암, 대장암, 췌장암, 간암, 전립선암, 유방암, 만성 또는 급성백혈병, 혈액암, 뇌종양, 방광암, 직장암, 자궁경부암, 림프종 등 여러 부위의 암에 대해서도 우수한 항암효과를 갖는다고 대한민국 특허등록번호:10-0674813에 개시되어 있다. 그러나 호흡기바이러스인 코로나바이러스(Coronavirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 인플루엔자바이러스(Influenza virus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory syncytial virus) 등과 같은 호흡기바이러스 질환에 효과를 나타낸다는 보고는 없다.

본 발명의 화합물은 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 산 부가 염들은 본 발명의 화합물과 염산, 브롬산, 황산, 인산, 메탄술폰산, 톨루엔술폰산, 벤젠술폰산, 아세트산, 프로피온산, 아스코르브산, 시트르산, 말론산, 푸마르산, 말레산, 락트산, 살리실산, 설팜산 또는 타르타르산을 포함하나 이에 한정되지 않는 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기산으로부터 형성된다. 이 염들은, 예를 들어, 적절한 용매의 존재하에서 화합물을 적절한 산을 처리함으로써, 공지된 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물들은 결정 형태 또는 용매 화합물(예를 들어, 수화물)의 형태일 수 있고 양 형태는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다. "용매 화합물" 이란 용어는 용질(본 발명에서, 본 발명의 화합물) 및 용매에 의해 형성된 다양한 화학양론의 착물이다. 이런 용매들은 용질의 생물학적 활성을 방해하지 않아야 한다. 예를 들어, 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트 또는 아세톤 일 수 있다. 용매화 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.

화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 용매화되지 않은 형태 및 용매화된 형태 둘 다를 포함한다.

본 발명은 포유류에 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 포유류의 코로나바이러스의 감염을 막기 위한 방법이 제공된다.

비록 본 발명은 코로나바이러스, 특히 인간 코로나바이러스를 치료하는 것에 관해 기술하지만, 본 발명은 코로나바이러스과(Coronaviridae), 더욱 구체적으로 베타코로나바이러스(Betacoronavirus) 더욱 구체적으로 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 동물 및 인간 균주 치료에 유용할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있는데, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는 담체는 약제학적으로 허용되는 불활성 담체일 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 바이러스성 호흡기 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다. 환자가 인간인 경우의 치료 용량은 일반적으로 상태의 심각성 및 라도티닙이 단독으로 또는 다른 약물과 조합하여 투여되는가에 따라 50 mg 내지 2000 mg/day, 더욱 바람직하게는 100 mg 내지 1000 mg/day이다. 1일 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화 될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여 될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하, 정맥 주사 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화 될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화 될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 캡슐 및 카트리지는 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화 할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 코로나바이러스(Coronavirus)의 RNA 바이러스의 복제 또는 전염 억제를 위한 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염의 용도가 제공된다.

상기 조성물은 호흡기바이러스성 감염질환을 예방하고 치료하기 위해 항바이러스 약효를 갖는 하나 또는 그 이상의 부가적 약물과 조합하여 투여될 수 있다.

상기 조성물은 항생제, 인터페론(Interferon) 그리고 리바비린(Ribavirin)등과 같은 항바이러스 효과를 갖는 약물과 함께 호흡기바이러스성 감염 질환 예방 및 증상을 치료하기 위해 이들 약물중 하나 또는 그 이상의 약물과 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 화학식 1의 화합물이 코로나바이러스에 의해 유발되는 호흡기 질환에 대하여 항바이러스 활성을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 실시예 1과 실시예 2를 통하여 항바이러스제의 효능을 평가 하였다. 비교 약물인 리바비린이 처리된 조건에서는 농도별 바이러스 억제효과가 나타나지 않았다. 그러나 도1 내지 2에서의 결과와 같이 라도티닙은 처리된 대부분의 농도조건에서 대조군에 비해 RNA copy number가 감소하는 결과를 나타내고 있어 MERS-CoV에 대한 항바이러스 효능을 갖고 있음을 확인 하였다.

따라서, 본 발명은 라도티닙 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것으로 코로나바이러스에 의해 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물인 4-메틸-N-[3-(4-메틸이미다졸-1-일)-5-트리플루오르메틸-페닐]-3-[4-(3-메틸피라진-2-일)-피리미딘-2-일아미노)벤즈아미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기바이러스성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

더욱 바람직하게는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에서 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공한다.

상기의 설명은 청구된 발명을 어떠한 방식으로도 한정하지 않으며, 나아가 논의된 특징의 조합은 본 발명의 해결 방법에 절대적으로 필요한 것은 아니다.

본 발명은 라도티닙 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 호흡기바이러스성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 의해 유발되는 호흡기 질환을 효과적으로 억제하여 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 화합물과 MERS-CoV을 먼저 반응시킨 뒤 세포에 감염 후 12시간 및 24시간에서의 바이러스 유전자 역가분석 결과를 나타낸다.
도 2는 MERS-CoV를 먼저 세포에 감염시킨 후 본 발명의 화합물이 농도별로 포함된 세포 배양액을 넣은 후 8시간 및 24시간에서의 바이러스 유전자 역가분석 결과를 나타낸다.

본원 발명은 이하의 실시예를 통하여 더 상세히 설명될 것이다. 그러나 실시예는 예시적인 목적일 뿐 어떠한 방식으로도 본원 발명의 범위를 제한하여서는 안된다.

<실시예>

실시예 1

실시예 1에서는 MERS-CoV (한국 분리주, P4) 를 세포에 감염시키기 전에 직접 바이러스에 라도티닙을 처리한 것으로 약물이 바이러스 표피단백질(envelop protein)에 직접 작용하여 바이러스의 감염을 억제하는 효능을 평가 하였다.

1) 바이러스

- MERS-CoV 한국 분리주 (P4)

- 바이러스 역가 : 1×105 PFU/ml

- 바이러스 접종 역가 : MOI 0.01 (3×103 PFU/ml)

2) 세포주 - Vero cells (24-well plate)

3) 시험방법

라도티닙을 200μM, 50μM, 12.5μM, 3.13μM, 그리고 0.0μM (라도티닙을 처리하지 않은 대조군)로 희석한 뒤, 104 PFU의 MERS-CoV와 37℃ 5% CO₂ incubator에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 Vero 세포주에 1시간 동안 감염시킨 후 PBS를 이용하여 세포를 washing 한 뒤, 바이러스 감염 후 12시간과 24시간에 세포 상층액을 수득하여 RNA를 추출한다. 추출된 RNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행하여 RNA copy number를 비교하여 항바이러스 효능을 평가하였다.

그 결과, 도 1에서와 같이 라도티닙 12.5μM이 처리된 조건을 제외하고 200μM, 50μM 그리고 3.13μ로 처리된 실험군에서는 RNA copy number가 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 1은 라도티닙을 먼저 바이러스와 반응시킨 뒤 세포에 접종하고, 세포 배양액내엔 약물을 넣지 않아 바이러스의 세포내 감염(entry)의 억제효과만 확인한 실험이다. 즉, 세포 배양액에 라도티닙 이 들어있지 않아 더 이상의 지속적인 바이러스 억제효과를 기대하기 어렵다. 이 경우에는 약물의 억제 효과를 뚫고 세포내로 침투해 들어온 일부 바이러스의 수적 차이가 처음에는 농도별로 나타날 수 있다. 그러나 약물의 억제 효과로 아주 적은 양의 바이러스가 들어온 경우에도 시간이 지남에 따라 유전자의 복제가 폭발적으로 이루어져 대조군과의 RNA copy number가 비슷해질 것으로 예측된다. 따라서 실시예 1의 실험과 같이 바이러스의 세포내 침투를 억제한 후 배양액에 더 이상 약물을 추가하지 않는 경우, 감염 후 24시간이 지난 시점에는 약물의 농도별 바이러스의 RNA copy number에는 차이가 없음을 확인하였다.

실시예 2

실시예 2는 MERS-CoV(한국 분리주, P4)를 먼저 세포에 감염시킨 후 라도티닙을 세포배양액에 첨가한 것으로 감염세포 밖으로 방출되는 바이러스의 감염 및 복제를 억제하는 효능을 대조약물인 리바비린과 비교/분석을 통하여 항바이러스제의 효능을 평가하였다.

1) 바이러스

- MERS-CoV 한국 분리주 (P4)

- 바이러스 역가 : 1×105 PFU/ml

- 바이러스 접종 역가 : MOI 0.01 (3×103 PFU/ml)

2) 세포주 - Vero cells (24-well plate)

3) 시험방법

MERS-CoV를 MOI 0.01로 Vero 세포주에 37℃에서 1시간 동안 감염시킨다. 세포를 PBS로 washing 한 뒤, 각 농도별(50μM, 12.5μM, 3.13μM, 0.0μM) 약물이 들어있는 세포배양액을 넣고 5% CO₂, 37℃ incubator에서 배양한다. 정해진 시간인 8시간 과 24시간에 세포 상층액을 수득한 뒤, RNA를 추출한다. 추출된 RNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행하여 RNA copy number를 비교하여 항바이러스 효능을 평가한다.

그 결과, 도 2에서와 같이 라도티닙 이 처리된 실험군의 경우, 바이러스 감염 후 8시간과 24시간에 수득한 상층액에서 RNA copy number가 50% 이상 감소된 결과를 확인하였다. 특히, 라도티닙 이 처리된 실험군의 경우 바이러스 감염 후 24시간이 지난 상층액을 취득하여 RNA copy number를 비교한 결과를 살펴보면, 라도티닙을 처리하지 않은 대조군에 비하여 orf1a 유전자 기준으로는 최소 56%에서 최대 71%, 그리고 upE 유전자 기준으로는 최소 66%에서 최대 78% 정도의 RNA copy number가 감소하였다. 이에 반하여 리바비린 이 처리된 실험군의 경우 바이러스 감염 후 8시간에는 RNA copy number의 감소가 관찰되지 않았으며, 24시간 후의 12.5μM 처리 실험군에서만 orf1a 기준 29%의 RNA copy number가 감소하였다.

본 시험의 결과를 종합하여 볼 때, 리바비린 이 처리된 조건에서는 농도별 바이러스 억제 효과가 거의 보이지 않았다. 그러나 라도티닙 이 처리된 대부분의 농도조건에서 대조군에 비해 RNA copy number가 감소하는 패턴을 보이고 있어 MERS-CoV에 대한 항바이러스 효능을 갖고 있는 것을 확인하였다.

본원 발명은 바람직한 실시예로 설명되었다. 그러나 이 분야의 당업자에게 여기 개시된 본 발명의 범위 이내에서 벗어나지 않는 수많은 변화 및 변형을 할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 또한, 본 발명은 라도티닙 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하여 바이러스성 호흡기 질환 예방 및 치료를 위한 항바이러스제를 개발할 수 있다.

Claims (9)

1. 라도티닙 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 환자의 바이러스성 호흡기 감염질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
   상기 바이러스성 호흡기 감염질환이 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 감염으로 유발되는 질병인 것인, 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 라도티닙은 하기 화학식 1의 화합물 및 그의 염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
   <화학식 1>
   

   

   .
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 환자는 동물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 동물은 포유류임을 특징으로 하는 약학 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 포유류는 인간임을 특징으로 하는 약학 조성물.
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 불활성 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

Images