KR102412728B1

KR102412728B1 - 피라졸릴 피롤로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암 방사선 치료 민감제

Info

Publication number: KR102412728B1
Application number: KR1020200045553A
Authority: KR
Inventors: 최상운; 박지훈; 장성연; 이혁; 박철민; 강충효; 강승규; 손유화; 이흥경; 이소명; 정관령; 김영린; 이정옥
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2022-06-23
Also published as: KR20210127537A

Abstract

본 발명은 피라졸릴 피롤로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암 방사선 치료 민감제에 관한 것으로, 상기 유도체는 방사선 조사에 병용하여 투여함으로써, 암세포의 세포주기를 교란하고, 암세포를 사멸하는 효과가 있으므로, 항암 방사선 치료 민감제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

피라졸릴 피롤로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암 방사선 치료 민감제{RADIOSENSITIZER FOR ANTI-CANCER COMPRISING PYRAZOLYL PYRROLOPYRIMIDIN DERIVATIVES AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 피라졸릴 피롤로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암 방사선 치료 민감제에 관한 것이다.

통계적으로 암 환자 중, 국내는 약 35%, 미국의 경우 약 50% 정도가 방사선 치료를 받고 있다. 국내에서 방사선 치료를 받는 암 환자의 수는 매년 증가하고 있어 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성이 크게 증가하고 있다. 일반적으로 방사선 치료가 적용되고 있는 암은 두경부암, 후두암, 자궁경부암, 인두암, 폐암, 뇌암, 유방암, 직장암 및 대장암 등이 있다. 이들 암종이 방사선 치료의 주요 대상이 될지라도, 방사선 치료에 대한 예후가 좋지 않은 경우도 빈번하므로 치료 효율을 높이기 위한 전략이 필요하다.

또한, 방사선 치료에 대한 초기 효과가 좋을지라도 재발 또는 방사선에 저항성을 갖는 세포가 큰 문제가 될 수 있어, 이에 대한 대책을 세우는 것이 방사선 치료의 효율을 높이는데 중요하다. 암 세포에서 방사선 치료에 대한 감수성의 차이가 존재하므로 방사선 치료 전에 개인별로 방사선에 대한 감수성을 예측할 수 있거나 이를 증가시킬 수 있는 기술을 개발하면 맞춤형 치료를 제공할 수 있다.

이에, 방사선 치료 전에 방사선에 대한 암 세포의 감수성을 알아보기 위해, 분리된 암 세포에 방사선을 조사한 후, 암 세포의 사멸 정도를 분석하는 방법이 필요하다. 알려져 있는 방법들 중 가장 직접적이고 이상적인 방법은 세포를 트립판 블루(trypan blue)등의 염색약으로 염색하고 현미경과 세포 수 측정기를 이용하여 살아있는 세포의 수를 세는 것이지만 이는 시간과 너무 많은 노력이 요구되며, 검체 수가 많을 경우에는 사용할 수가 없는 문제점이 있다. 조직학적 소견이나 병기가 같은 암 환자라 하더라도 방사선 감수성은 매우 다르며, 이에 영향을 주는 많은 인자들이 있는 것으로 알려져 있다.

종양이 방사선 저항성을 가지게 되는 이유 중 가장 큰 요인으로 종양 세포의 내적인 방사선 감수성이다. 방사선에 조사된 암 세포는 복잡한 분자생물학적 변화에 의해 사멸하거나 회복 되는데 이러한 기전에 관여된 유전자와 단백질들이 밝혀졌으며, 밝혀진 모든 유전자나 단백질이 방사선 치료의 효과를 증진시킬 수 있는 표적이 될 수 있는 것으로 알려졌다(Park HJ., J Korean. Soc. Ther. Radiol. Oncol., 2004, 22:S6; Choi EK., J. Korean. Soc. Ther. Radiol. Oncol. 2004, 22:S7).

방사선 저항성에 대한 연구가 지속적으로 진행되었고 이들 연구는 방사선 저항성을 극복하기 위한 방사선 민감제의 개발에 기초가 되고 있다. 현재까지 밝혀진 방사선 저항성과 관련된 인자들로는 시클로옥시게나아제-2(Terakado N et al., Oral Oncol., 2004; 40:383-9), 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR)(Milas Let al., Int J Radiat Oncol Biol Phys., 2004; 58(3); 966-71), 시클린 D1(Milas L et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys., 2002; 52; 514-21), 인슐린-유사 성장인자 1 수용체(IGFBP-1 receptor), 망간 수퍼옥시드 디스뮤타아제 및 수르비빈(survivin) 등이 있다.

본 발명자들은 방사선 치료에 대한 민감성을 증진시킬 수 있는 물질을 찾기 위해 노력하던 중, 피라졸릴 피롤로피리미딘 유도체를 방사선과 병용처리 시에, 암 세포주의 세포주기를 변화시키고, 암의 크기를 감소시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성시켰다.

본 발명의 목적은 항암 방사선 치료 민감제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항암 보조제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에 따라, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 방사선 치료 민감제를 제공한다:

[화학식 1]

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본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 방사선 치료 민감제, 항암 보조제, 항암제 또는 건강기능식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 함유하는 암의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 암의 치료에 있어서의, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 항암 방사선 치료 민감제, 항암 보조제, 항암제 또는 건강기능식품 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 피라졸릴 피롤로피리미딘 유도체는 방사선 조사에 병용하여 투여함으로써, 암세포의 세포주기를 교란하고, 암세포를 사멸하는 효과가 있으므로, 항암 방사선 치료 민감제로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 인간 대장암 세포주인 HT29 세포에 대조군 또는 실시예 1 화합물을 처리한 후에 6 Gy의 방사선을 조사하고, 유세포분석기를 이용하여 세포주기 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 인간 유방암 세포주인 HDA-MB-231 세포에 대조군 또는 실시예 1 화합물을 처리한 후에 4 Gy의 방사선을 조사하고, 유세포분석기를 이용하여 세포주기 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 암컷 누드마우스에 인간 유방암 세포주인 BT 549 종양 세포를 이식하고, 약물투여 및/또는 방사선 조사를 수행한 후에, 경과한 날짜별로 종양의 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 암컷 누드마우스에 인간 유방암 세포주인 BT 549 종양 세포를 이식하고, 약물투여 및/또는 방사선 조사를 수행한 후에, 경과한 날짜별로 누드마우스의 체중을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 방사선 치료 민감제를 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 명칭은 2,6-디클로로-4-(4-(1-(피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)페놀이다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 이성질체, 용매화물, 수화물 등을 모두 포함한다.

용어 "이성질체(isomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 구조적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 이러한 이성질체에는 호변이성질체(tautomer) 등의 구조 이성질체와, 비대칭 탄소 중심을 가지는 R 또는 S 이성체, 기하이성질체(트랜스, 시스) 등의 입체 이성질체, 광학 이성질체(enantiomer)가 모두 포함된다. 이들 모든 이성체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

용어 "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이 있다.

용어 "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecμLar force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 수화물은 비공유적 분자간 힘으로 결합되는 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 물을 포함할 수 있다. 상기 수화물은 1당량 이상, 바람직하게는, 1 당량 내지 5당량의 물을 함유할 수 있다. 이러한 수화물은 물 또는 물을 함유하는 용매로부터 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 결정화시켜 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 항암 방사선 치료 민감제에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 보다 바람직하게는 비경구 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 항암 방사선 치료 민감제는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

상기 민감제는 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 민감제에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 10 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 또는 수회일 수 있다.

상기 화합물은 방사선 조사에 의한 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.

용어 "방사선 조사"는 악성 세포의 DNA를 손상시키는 국소 치료 방법을 의미한다. 정상 세포는 종양 세포에 비해 이런 손상을 수선하는 능력이 더 크다. 방사선 조사는 이런 차이를 이용하는 치료를 의미하며, 통상적으로 의미하는 방사선을 이용하여 치료하는 방법을 포함한다.

방사선 조사는 국소 요법의 형태이므로, 일반적으로 부작용은 치료된 부위에 제한된다. 그러나 공통된 전신 증상으로서 피로감이 있다. 많은 유전적 요인들이 일부 환자에서 2차 암의 소인이 되는 것이 사실이지만, 방사선 또한 관련 위험의 증가에 기여한다. 본 발명에 따른 방사선 민감성 증가용 조성물은 방사선의 필요량을 감소시킴으로써 이러한 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 방사선에 민감한 암세포뿐만 아니라, 방사선에 저항성이 있는 암세포에서도 방사선 민감도를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 실험예에서, 실시예 1 화합물의 방사선 병용처리 시에는 실시예 1 화합물 단독 처리 또는 방사선 조사 시보다 누드마우스에 이식된 암의 크기가 더 줄어들었음을 확인하였고, 이를 통해 본 발명에 따른 피라졸릴 피롤로피리미딘 유도체가 방사선 치료 민감도 증가에 따른 암 치료 효과가 우수함을 알 수 있었다(실험예 3 및 도 3 참조).

상기 화합물은 BRD4를 억제할 수 있다.

상기 화합물은 암세포의 세포주기를 교란시킬 수 있다.

상기 암세포는 대장암세포 또는 유방암세포일 수 있다.

본 발명의 실험예에서, 실시예 1 화합물을 인간 대장암 세포주 또는 인간 유방암 세포주에 처리한 후에 방사선을 조사하면 암세포의 세포주기가 교란되는 것을 확인하였다(실험예 1, 실험예 2, 도 1 및 도 2 참조).

상기 화합물은 암 치료 시 방사선 조사와 병용하여 투여될 수 있다.

용어 "병용하여 투여"는 다양한 종류의 암세포를 치료하는 항암 과정에서 방사선 조사를 함께 투여하는 것을 의미한다.

상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 삼중음성유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 혈액암 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

상기 화합물은 암 치료 시 방사선 조사와 병용하여 투여됨으로써 방사선 치료 민감도를 증가시킬 수 있다.

상기 화합물은 방사선 치료 민감도를 증가시킬 수 있다.

상기 항암 보조제는 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 삼중음성유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 혈액암 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암을 치료할 수 있다.

상기 화합물 및 항암 보조제에 대한 기타 구체적인 설명은 상기 항암 방사선 치료 민감제의 구체적인 설명과 동일하다.

본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 화합물은 BRD4를 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실험예에서, 실시예 1 화합물 단독 처리 시에 대조군보다 종양의 크기가 줄어들었음을 확인하였다(실험예 3 및 도 3 참조).

상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용, 경구 및 비경구의 투여방법에 대한 설명은, 상기 항암 방사선 치료 민감제에 있는 구체적인 설명과 동일하다.

본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 방사선 치료 민감제, 항암 보조제, 항암제 또는 건강기능식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 암의 치료에 있어서의, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 항암 방사선 치료 민감제, 항암 보조제, 항암제 또는 건강기능식품 조성물의 용도를 제공한다

본 발명의 다른 측면은, 항암 방사선 치료 민감제 또는 항암 보조제를 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료를 위한 방사선 병용처리 요법을 제공한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 2,6- 디클로로 -4-(4-(1-(피페리딘-4-일)-1H- 피라졸 -4-일)-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -5-일)페놀의 제조

4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (1.2 g, 7.84 mmol)에 DMF (15 mL)를 넣고, 0℃에서 NaH (0.36 g, 9.00 mmol)를 넣었다. 혼합물을 상온에서 20분 동안 교반하고, p-톨루엔설포닐 클로라이드 (1.7 g, 8.91 mmol)을 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후에, 용매를 고압 하에 제거해주고, 물에 녹인 후, 디클로로메탄 (50 mL x 3)로 추출하였다. 잔여물을 크로마토그래피(에틸아세테이트 : 헥산 = 2:3)로 정제하여 4-클로로-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (1.88 g, 78%)를 제조하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 300MHz): δ 8.77 (s, 1H), 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.71 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 2.40 (s, 3H).

4-클로로-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (1.0 g, 3.43 mmol), 삼차-부틸 4-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로란-2-일)-1H-피라졸-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (1.47 g, 3.89 mmol), 탄산칼륨 (1.35 g, 9.75 mmol), Pd(dppf)Cl₂ (0.19 g, 0.26 mmol)을 1,4-다이옥산:물 (2:1) 혼합용액에 녹인 후, 85℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응이 완료된 후에, 용매를 고압 하에 제거해주고, 물에 녹인 후, 에틸아세테이트 (50 mL x 3)로 추출하였다. 잔여물을 크로마토그래피로 정제하여 삼차-부틸 4-(4-(7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (1.24 g, 69%)를 제조하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 300MHz): δ 8.54 (s, 1H), 8.06 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.71 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.57 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.25-4.31 (m, 1H), 3.81-3.88 (m, 2H), 2.91 (t, J = 12.6 Hz, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.17 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 1.93-1.99 (m, 2H), 1.48 (s, 9H).

삼차-부틸 4-(4-(7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (1.4 g, 2.67 mmol)과 N-브로모석신이미드 (N-bromosuccinimide) (0.52 g, 2.93 mmol)을 DMF에 녹인 후, 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후, 용매를 고압 하에 제거해주고, 물에 녹인 후, 에틸아세테이트 (50 mL x 3)로 추출하였다. 잔여물을 크로마토그래피로 정제하여 삼차-부틸 4-(4-(5-브로모-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (1.53 g, 87%)를 제조하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 300MHz): δ 8.92 (s, 1H), 8.14 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 8.10 (s, 2H), 7.82 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.10-4.38 (m, 3H), 2.91 (t, J = 12.1 Hz, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.17-2.22 (m, 2H), 1.92-1.97 (m, 2H), 1.47 (s, 9H).

삼차-부틸 4-(4-(5-브로모-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (0.24 g, 0.40 mmol), 2,6-디클로로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-아옥사보롤란-2-일)페놀 (139 mg, 0.48 mmol), 탄산나트륨 (127 mg, 1.20 mmol), PdCl₂(PPh₃)₂ (6 mg, 0.008 mmol)을 1,4-다이옥산:물 (2:1) 혼합용액에 녹인 후, 100℃에서 마이크로웨이브 조건하에 20분 동안 가열하였다. 반응이 완결된 후, 용매를 고압 하에 제거해주고, 물에 녹인 후, 에틸아세테이트로 추출하였다. 잔여물을 크로마토그래피로 정제하여 삼차-부틸 4-(4-(5-(3,5-디클로로-4-하이드록시페놀)-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (123 mg, 45%)를 제조하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 300MHz): δ 8.92 (s, 1H), 8.12 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 1.5 Hz, 2H), 7.82 (s, 1H), 7.42 (s, 2H), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.21-4.37 (m, 1H), 2.91 (t, J = 12.5 Hz, 2H), 2.12-2.22 (m, 2H), 1.89-2.04 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.23-1.29 (m, 2H).

테트라히드로푸란 (2 mL)와 메탄올 (1mL)에 삼차-부틸 4-(4-(5-(3,5-디클로로-4-하이드록시페놀)-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (137 mg, 0.20 mmol)을 녹인 후, Cs₂CO₃ (228 mg, 0.70 mmol)을 넣고 상온에서 30분간 교반하였다. 반응이 완결된 후, 용매를 감압 하에 제거해주고, 물에 녹인 후, 에틸아세테이트로 추출하였다. 잔여물을 크로마토그래피로 정제하여 삼차-부틸 4-(4-(5-(3,5-디클로로-4-하이드록시페놀)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (45 mg, 42%)를 제조하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 300MHz): δ 12.09 (br s, 1H), 8.65 (s, 2H), 8.28 (s, 1H), 7.42 (s, 2H), 7.01 (s, 1H), 4.22-4.38 (m, 1H), 2.92 (t, J = 12.5 Hz, 2H), 2.12-2.23 (m, 2H), 1.89-2.04 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.22-1.30 (m, 2H).

삼차-부틸 4-(4-(5-(3,5-디클로로-4-하이드록시페놀)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (53 mg, 0.10 mmol)을 디클로로메탄 (3 mL)에 녹인 후, 1,4-다이옥산에 녹아 있는 4M HCl (0.5 mL, 2.0 mmol)을 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하여 크로마토그래피로 실시예 1의 화합물 (36 mg, 85%)을 제조하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 300MHz): δ 12.14 (br s, 1H), 8.67 (s, 2H), 8.01 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.03 (s, 2H), 6.40 (s, 1H), 4.32-4.40 (m, 1H), 2.91 (t, J = 12.5 Hz, 2H), 2.19-2.23 (m, 2H), 2.04 (d, J = 12.5 Hz, 2H), 1.46-1.58 (m, 2H).

< 실험예 1> 방사선 병용처리에 의한 세포주기 변화 유도 확인 1

본 발명에 따른 실시예 화합물의 방사선 병용처리에 의한 세포주기 변화 유도 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였고, 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다. 방사선 조사는 세포 내 DNA의 손상을 유발함과 동시에 DNA 손상 회복기전을 활성화시키므로, DNA 손상이 복구되기 위한 세포주기의 정지 (Cell cycle arrest)를 유도한다. 따라서 방사선 치료 민감제의 개발을 위해서는 세포주기를 교란시키는 바이오 분자가 약물개발 표적이 될 수 있다.

실시예 1 화합물이 세포주기의 변화를 유도하는지 확인하기 위해, 인간 대장암 세포주 HT29 세포에 대조군 또는 실시예 1 화합물을 각각 10 μM 농도로 처리한 후, 24시간 후에 6 Gy의 방사선을 조사하였다. 방사선 조사하고 24 시간 후에, 세포를 수집하여 PI로 염색한 다음 유세포분석기를 이용하여 세포주기를 분석하였다.

그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, M1은 sub-G1, M2는 G1, M3는 S, M4는 G2와 M을 합친 것을 의미하는데, 인간 대장암 세포주 HT29 세포에 실시예 1의 화합물을 처리하고 방사선을 조사하면 M4인 G2와 M 부분이 급격하게 증가하는 것을 확인하였다. 즉, 일반적으로 G2/M phase의 세포들이 방사선 치료에 민감하게 작용하는 것으로 알려져 있고, 실시예 1의 화합물과 방사선을 함께 인간 대장암 세포주 HT29 세포에 처리하면 G2/M arrest가 일어나게 되는 바, 실시예 1의 화합물은 인간 대장암 세포주에서 방사선 치료 민감성을 가지는 것을 의미한다.

< 실험예 2> 방사선 병용처리에 의한 세포주기 변화 유도 확인 2

본 발명에 따른 실시예 화합물의 방사선 병용처리에 의한 세포주기 변화 유도 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였고, 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다. 방사선 조사는 세포 내 DNA의 손상을 유발함과 동시에 DNA 손상 회복기전을 활성화시키므로, DNA 손상이 복구되기 위한 세포주기의 정지 (Cell cycle arrest)를 유도한다. 따라서 방사선 치료 민감제의 개발을 위해서는 세포주기를 교란시키는 바이오 분자가 약물개발 표적이 될 수 있다.

실시예 1 화합물이 세포주기의 변화를 유도하는지 확인하기 위해, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 세포에 대조군 또는 실시예 1 화합물을 각각 10 μM 농도로 처리한 후, 24시간 후에 4 Gy의 방사선을 조사하였다. 방사선 조사하고 24 시간 후에, 세포를 수집하여 PI로 염색한 다음 유세포분석기를 이용하여 세포주기를 분석하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, M1은 sub-G1, M2는 G1, M3는 S, M4는 G2와 M을 합친 것을 의미하는데, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 세포에 실시예 1의 화합물을 처리하고 방사선을 조사하면 M4인 G2와 M 부분이 급격하게 증가하는 것을 확인하였다. 즉, 일반적으로 G2/M phase의 세포들이 방사선 치료에 민감하게 작용하는 것으로 알려져 있고, 실시예 1의 화합물과 방사선을 함께 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 세포에 처리하면 G2/M arrest가 일어나게 되는 바, 실시예 1의 화합물은 인간 유방암 세포주에서 방사선 치료 민감성을 가지는 것을 의미한다.

< 실험예 3> 이식된 종양 크기 축소 확인

본 발명에 따른 실시예 화합물의 방사선 병용처리 시에, 방사선 치료 민감도 증가에 따른 암 치료 효과가 있는지를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였고, 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다.

본 실험예에서 이용한 누드마우스(BALB/c nu / nu, female)는 Charles River Japan, Inc.에서 구입하였으며, SPF(Specific Pathogen Free) 관리 하에서 사육, 실험하였다. 인간 유방암 세포주인 BT 549 세포주는 한국화학연구원에서 계대 유지한 것을 사용하였다.

구입 후 실험실에 적응시킨 암컷 누드마우스의 오른쪽 뒷다리 피하에 인간 유방암 세포주인 BT 549 종양 세포(1x10⁷ cells/mouse)를 이식한 뒤, 이식된 종양의 크기가 약 330 mm³에 도달하였을 때에 약물투여 및/또는 방사선 조사를 시작하였으며, 이때를 실험 1일차로 하였다. 상기 약물 투여 및/또는 방사선 조사는 표 2에 기재된 대로 그룹을(5 mice/group) 나누어 수행했는데, 구체적으로 대조군은 20% PEG400 및 3% Tween80 in DDW를 경구로 투여하였고, 동일 용매에 녹인 실시예 1(20mg/kg)를 경구로 1회 투여한 실험군, 상기와 같이 실시예 1을 투여하되 3시간 후 방사선을 약 1분간 1회 조사한 실험군을 두어 실험을 진행하였다. 그리고 또 다른 대조 실험군은 약물 투여 없이 방사선만 약 1분간 1회 조사하였다(표 1 참조). 표 1에서 p.o.는 경구 투여로 약물을 투여한 것을 의미하고, Schedule은 방사선 조사 횟수를 의미한다.

종양의 크기는 상술한 바와 같은 약물 투여 및/또는 방사선 조사 후에 2일 내지 3일마다 caliper를 이용하여, 종양의 직경(long diameter(a), short diameter(b))을 측정하고, 다음의 식에 따라 종양의 크기를(volume, V) 측정하였다.

Volume (mm³) = a × b²/ 2

	Route	Formulation	Dose / Day	Total Dose	Schedule
대조군 (control)	p.o.	20% PEG 400 및 3% Tween 80 in DDW (용매)	-	-	-
실시예 1 처리			50mg/kg (실시예 1)		-
실시예 1 처리 및 방사선 조사			50mg/kg (실시예 1)		1회
방사선 조사	-	-	-	-	1회

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 용매만 투여한 대조군은 실험 43일차에 암의 크기가 약 4000 mm³이었고, 실시예 1을 처리한 실험군의 경우는 3000 mm³로 대조군보다 줄어들었다. 방사선을 조사한 실험군은 실험 43일차에 암의 크기가 2200 mm³로 대조군 및 실시예 1 처리 실험군의 경우보다 줄어들었고, 실시예 1 처리 및 방사선 조사를 수행한 실험군의 경우는 1500 mm³로 방사선을 조사한 실험군보다도 더 줄었다(도 3 참조).

상기 결과는 실시예 1 화합물만 처리 시와 방사선 조사 시에 암 치료 효과가 있으나, 실시예 1의 방사선 병용처리 시에는 방사선 치료 민감도 증가에 의해 실시예 1 화합물만 처리 시 및 방사선 조사 시보다 더 우수한 암 치료 효과가 있음을 나타낸다. 이를 통해, 본 발명에 따른 피라졸릴 피롤로피리미딘 유도체가 방사선 치료 민감도 증가에 따른 암 치료 효과가 있으므로, 항암 방사선 치료 민감제로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 4> 누드마우스 체중 변화 측정

본 발명에 따른 실시예 화합물의 방사선 병용처리 시에, 누드마우스 체중 변화를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였고, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.

구입 후 실험실에 적응시킨 암컷 누드마우스의 오른쪽 뒷다리 피하에 인간 유방암 세포주인 BT 549 종양 세포(1x10⁷ cells/mouse)를 이식한 뒤, 이식된 종양의 크기가 약 330 mm³에 도달하였을 때에 약물투여 및 방사선 치료를 시작하였으며, 이때를 실험 1일차로 하였다. 상기 약물 투여는 상기 표 2에 기재된 대로 수행했는데, 구체적으로 대조군(5 mice/group)은 20% PEG400 및 3% Tween80 in DDW를 경구로 투여하였고, 동일 용매에 녹인 실시예 1(20mg/kg)를 경구로 1회 투여한 실험군, 상기와 같이 실시예 1을 투여하되 3시간 후 방사선을 약 1분간 1회 조사한 실험군을 두어 실험을 진행하였다. 그리고 또 다른 대조 실험군은 약물 투여 없이 방사선만 약 1분간 1회 조사하였다.

약물투여 및/또는 방사선 조사로 인한 누드마우스의 체중 변화를 확인하기 위하여, 실험에 사용한 누드마우스의 체중은 약물 투여 및/또는 방사선 조사를 수행한 날로부터 2일 내지 3일 간격으로 동물용 저울 (AND balance)을 이용하여 체중을 측정하였다. 실험 1일차의 체중 (Wo)과 실험 n일차의 체중 (Wn)을 측정하여, 각각의 대조군(Wc)과 실험군(Wt)의 평균값을 구하였다.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 20% PEG400 및 3% Tween80 in DDW를 경구로 투여한 대조군(5 mice/group)과 동일 용매에 녹인 실시예 1(20mg/kg)를 경구로 1회 투여한 실험군의 39일차의 평균 체중의 차이가 없었고, 약물 투여 없이 방사선만 약 1분간 1회 조사한 대조군과 실시예 1을 투여하되 3시간 후 방사선을 약 1분간 1회 조사한 실험군 간의 비교에서도 유의한 체중 차이를 보이지 않았다.

상기와 같은 결과에 따라, 실시예 1의 화합물을 처리시 체중에 영향이 없음을 확인하였는 바, 부작용없이 사용 가능함을 의미한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 방사선 치료 민감 증진용 약학적 조성물:
[화학식 1]

.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 방사선 조사에 의한 암세포의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는, 항암 방사선 치료 민감 증진용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 암세포의 세포주기를 교란시키는 것을 특징으로 하는, 항암 방사선 치료 민감 증진용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 암세포는 대장암세포 또는 유방암세포인 것을 특징으로 하는, 항암 방사선 치료 민감 증진용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 암 치료 시 방사선 조사와 병용하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 항암 방사선 치료 민감 증진용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 삼중음성유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 혈액암 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항암 방사선 치료 민감 증진용 약학적 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 화합물은 암 치료 시 방사선 조사와 병용하여 투여됨으로써 방사선 치료 민감도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 항암 방사선 치료 민감 증진용 약학적 조성물.
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