KR102407939B1 - 터미날리아 비아라타 추출물을 이용한 항균용 조성물 - Google Patents

터미날리아 비아라타 추출물을 이용한 항균용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 터미날리아 비아라타(Croton poilanei) 추출물을 이용한, 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아(Streptococcus pseudopneumoniae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 등에 대한 항균용 조성물을 개시한다.

Description

터미날리아 비아라타 추출물을 이용한 항균용 조성물{Composition having Antimicrobial Effects Using Terminalia bialata Extract}
본 발명은 터미날리아 비아라타 추출물을 이용한 항균용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아(Streptococcus pseudopneumoniae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균용 조성물에 관한 것이다.
세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나이다. 특히 병원성 미생물에 의한 직접 혹은 간접적인 피해는 경제, 환경, 의학적으로 많은 문제를 야기시키고 있다. 병원성 미생물은 식품 산업에서의 식품 유통 과정 중의 부패로 인한 손실, 농산업에서의 농작물에 대한 과량의 화학 살충제의 사용으로 인한 인체의 유해성 및 환경오염, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성 균주의 출현 등 사회 전반에서 많은 문제들을 야기시키고 있다.
스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아는 구강과 호흡기에 상재하고 있는 그람양성 세균으로 감기, 독감, 인두염, 기관지염, 천식, COPD(chronic obstructive pulmonary disease) 등 호흡기 질환의 병인으로 알려져 있다(J Clin Microbiol. 2006;44:923; 박희국 중앙대학교 박사 학위 논문, 2013).
스타필로코쿠스 아우레우스는 비강, 인후의 점막이나 피부에 상재하는 그람양성 세균으로 균혈증(혈액 속에 균이 침투하는 질병), 심내막염, 폐렴, 관절염, 골수염, 연조직감염, 뇌수막염 등의 병인으로 알려져 있다(Acta Med Okayama. 2004, 58: 207-214; J Bacteriol. 2007, 189: 531-539).
프로테우스 미라빌리스는 요로 감염을 일으키는 그람음성 세균으로 신장결석과 패혈증의 병인으로 알려져 있다(Clin Microbiol Rev. 2008, 21(1):26-59).
캔디다 알비칸스는 분변(棄便), 질(膣), 인두, 구강, 소화관, 피부 등에 존재하는 진균의 일종으로 캔다지증의 원인균이며, 드물질만 내막염, 수막염, 패혈증의 원인균이기도 하다(Trends Microbiol. 2001, 9(7):327-35).
한편, 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아를 비롯한 여러 병원균의 항생제 내성이 증가하고 있는 것이 보고됨에 따라(J.Antimicrob.Chemother. 2000, 46(4):621-624), 질병 예방 및 치료를 목적으로 항생제를 오·남용함으로서 출현이 빈번해지고 있어서 공중보건 상에 있어서 중요한 위험요인으로 대두되고 있다(J. Antimicrob. Agents0 2008. 32(S1):S2-9). 이와 관련하여,기존의 항생제의 오·남용에 따른 내성균 출현과 같은 부작용을 최소화하기 위해 한약재(J.FoodProt. 2007. 70:641-647), 프로바이오틱스(Rev.Med.Chil. 2008. 136:981-988), 프로폴리스(J.Ethnopharmacol. 2006. 105:95-98) 등을 대상으로 항생제를 대체할 수 있는 항균활성을 탐색하기 위한 연구가 최근 활발히 진행되고 있다.
본 발명은 토멘토스산(tomentosic acid), 사포닌(saponin), 플라보노이드(flavonoid), 찰콘(chalchone) 등의 성분을 함유하여 의학적 가치가 높다고 알려진 터미날리아 비아라타 추출물의 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아 등에 대한 항균 활성을 개시한다.
이용한 항균용 조성물
본 발명의 목적은 터미날리아 비아라타 추출물을 이용한 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아 등 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 포일라네이 추출물을 이용한 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아 등 미생물의 감염증에 대한 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 터미날리아 비아라타 추출물이 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아, 스타필로코쿠스 아우레우스, 프로테우스 미라빌리스, 캔디다 알비칸스 등에 대해 항균 활성을 가짐을 확인함으로서 완성된 것이다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 일 측면에 있어서, 터미날리아 비아라타 추출물을 유효성분으로 하는, 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아, 스타필로코쿠스 아우레우스, 프로테우스 미라빌리스, 또는 캔디다 알비칸스에 대한 항균용 조성물로 파악할 수 있고, 다른 측면에 있어서는스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아, 스타필로코쿠스 아우레우스, 프로테우스 미라빌리스, 또는 캔디다 알비칸스의 감염증에 대한 개선용 조성물로 파악할 수 있다.
본 명세서에서, "터미날리아 비아라타 추출물"이란 추출 대상인 조팝나무 잎, 줄기, 가지, 뿌리, 수피 또는 이들의 혼합물을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방식이 적용될 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.
또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서, "스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아 감염증"은 전술한 바와 같이 등을 의미한다.
또 본 명세서에서, "스타필로코쿠스 아우레우스 감염증"은 전술한 바와 같이 등을 의미한다.
또 본 명세서에서, "프로테우스 미라빌리스 감염증"은 전술한 바와 같이 등을 의미한다.
또 본 명세서에서, "캔디다 알비칸스 감염증"은 전술한 바와 같이 등을 의미한다.
또 본 명세서에서, "감염증 개선"이란 그 증상의 경감, 예방 또는 치료를 의미한다.
본 발명의 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아 등에 대한 항균용 조성물 또는 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아 등의 감염증의 예방 또는 치료용 조성물에서, 그 유효성분은 그것의 해당 미생물에 대한 항균 활성, 해당 미생물의 감염증에 대한 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의사, 약사 등 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 해당 미생물의 항균 효과, 해당 미생물 감염증 개선 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 약제학적 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 건강기능식품에관한법률에 따른 건강기능식품이거나, 식품위생법의 식품공전(식약처 고시, 식품의 기준 및 규격)상 각 식품유형에 따른 두유류, 발효음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해되는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 복용되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품위생법에 따른 식품첨가물공전(식약처 고시, 식품첨가물 기준 및 규격)에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 화학적 합성품, 천연 첨가물, 혼합 제제류로 구분하여 한정적으로 규정되어 있다.
이들 식품첨가물은 기능적 측면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분될 수 있다.
감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수도 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우에도 그 화장료 조성물은 그 용도상, 법률상 임의의 제품 구분을 띨 수 있으며, 구체적으로 피부 트러블 개선, 피부 미백 증진, 아토피 피부염 개선 등의 용도를 가진 기능성 화장품, 비기능성 일반 화장품 등일 수 있다. 제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등의 제품 형태를 띨 수 있다. 구체적인 제품 형태에 있어서는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형 등일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 항균 활성을 나타내는 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 터미날리아 비아라타 추출물을 이용한 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아 등에 대한 항균용 조성물, 및 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아 등의 감염증에 대한 치료 또는 예방용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 약품 또는 기능성 식품으로 제품화될 수 있다.
도 1은 HPLC 크로마토그램 상에서 터미날리아 비아라타 추출물의 3가지 분획물을 표시한 것이다.
도 2는 터미날리아 비아라타 추출물의 항균 활성 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 터미날리아 비아라타 추출물의 3가지 분획물 시료의 항균 활성 결과이다.
도 4는 터미날리아 비아라타 추출물의 정량적 항균 활성 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 터미날리아 비아라타 추출물 및 분획물 제조
<실시예 1> 터미날리아 비아라타 추출물 제조
터미날리아 비아라타(Terminalia bialata) 줄기 껍질의 건조 분말 100g에 10배 중량의 70% 에탄올을 가하여 상온에서 24 시간 1회 침지추출 후 여과지로 여과하였다.얻어진 70% 에탄올 여액을 감압농축 후 동결건조하여 추출물을 얻었다.
<실시예 2> 터미날리아 비아라타 추출물 분획물 제조
상기 실시예 1의 분말상의 70% 에탄올 추출물에 3배의 정제수를 가하여 희석시킨 후, 희석액 200g을 HP-20 이온교환 흡착수지 100g을 충진시킨 컬럼에 통과시켰다. 통과시킨 희석액의 5배수에 해당하는 정제수로 컬럼을 세척한 다음, 컬럼에 50% 에탄올을 통과시켜 이온교환수지 컬럼에 부착된 효능 성분 분획물을 회수하였다. 얻어진 분획물의 용매를 완전히 증발시킨 후에 분획물에 정제수를 넣고 -70℃에서 동결시키고, 동결건조기에 넣고 건조시켜 고형분을 얻었다.
다음 상기 추출물을 HPLC로 분획하였다. HPLC 분획 조건은 아래와 같다.
Detector : Shimadzu SPD-20A (220 nm, photo diode array detector)
Column: SUPELCOSIL™ LC-18 (column size: L 250 cm× I.D. 4.6 mm, particle size: 5㎛)
Stationary phase : Octadecyl-silica (spherical particle platform)
Flow rate: 1㎖/min
Solvent: solvent A: 100% ACN,
solvent B: 10%(v/v) acetonitrile (ACN) with distilled water
10% ACN : 0 min 100%-> 7.5 min 0%, 20 min 0% -> 22min 100%
100% ACN : 0 min 0%-> 7.5 min 100%, 20 min 100% -> 22min 0%
Running time: 28 min
Loading amount : 500μg (100μl of 1mg/ml extracts in distilled water)
분획물의 회수: 정체 시간(Retention Time) 1 분에서 4분까지의 첫번째 두번째 주요 피크를 포함하는 제1 분획물(#1), 5분에서 10분까지의 세번째와 네번째 주요 피크를 포함하는 제2 분획물(#2), 10.03분에서 16.3분까지의 제3 분획물(#3) 각각 회수하였다. HPLC 크로마토그램 상의 각 분획물을 도 1에 나타내었다.
<실험예> 항균 활성 실험
1. 항균 활성 실험 대상 미생물 및 사용 배지
항균 활성 실험은, KCTC 로부터 분양받은 아래의 [표 1]의 미생물에 대해 아래의 표 1의 각 미생물의 생육에 적합한 배지를 사용하여, 원판 확산법(Disc diffusion assay)과 정량적 분석 방법에 따라 수행하였다.
항균 활성 실험 대상 미생물 및 사용 배지
병 원 균 기탁번호 배지
Streptococcus pseudopneumoniae KCTC 5764 Luria Bertani agar plate medium
Staphylococcus aureus KCTC 1928 Nutrient agar plate medium
Proteus mirabilis KCTC 2510 Nutrient agar plate medium
Candida albicans KCTC 17485 GPYA(Glucose-Peptone-Yeast extract) agar plate medium
2. 항균 실험 - 원판 확산법
Streptococcus pseudopneumoniae (gram positive), Staphylococcus aureus (gram positive), P. mirabilis (gram negative)는 37℃에서 nutrient broth에서 배양했다. 그리고 C. albicans (yeast)는 35℃에서 Glucose-Peptone-Yeast extract broth에서 배양했다. 모든 균은 18시간동안 seed culture와 4-6시간의 본 배양을 진행한 후 사용되었다. Nanodrop기기로 OD600값을 측정해 균체수를 확인했고 모두 1.5*108cfu의 균농도로 묽혀주었다. 묽힌 균액을 면봉으로 적셔 agar plate에 세방향으로 발라주었다. 시료는 6mm의 disc위에 10mg/ml의 농도로 20μL 를 가해주었다. 시료를 가한 disc를 말려준 후 disc에 올려놓았다. 그 후 18h 동안 세포에 해당되는 온도에서 배양한 후 카메라로 찍어 imageJ 프로그램을 이용하여 생육 저해환의 크기(mm)를 측정했다.
실시예 1의 70% 에탄올 추출물 시료의 3번 반복실험에 따른 항균 활성 결과를, 도 2에 사진(a)과, 측정된 생육 저해환의 크기(mm)(b)(3번 반복실험의 평균값과 함께 나타내었다. 양성대조군(Con)은 S. pseudopneumoniae(gram positive), S. aureus(gram positive), P. mirabilis(gram negative)에 대하여 젠타마이신(Gentamicin)을 C. albicans(yeast)에 대하여 플루코나졸(Fluconazole)를 사용하였다. 실시예 1의 70% 에탄올 추출물 시료는 S. aureus, P. mirabilis에 대해서는 양성대조군보다 우수한 항균 활성을 보였다.
또 실시예 2의 각 분획물 시료의 항균 활성 결과를 도 3에 나타내었다. 제2 분획물(#2)이 모든 균주에 대해서 항균 활성을 보였다.
3. 정량적 항균 활성 실험 - alamarBlue 기반
배양은 원판 확산법 때와 동일하게 진행하고, 106cfu로 묽혀서 alamarBlue(10X)를 넣고 60분간 배양한다. 각각 chemical compound의 농도가 1mg/ml, 0.1mg/ml, 0.01mg/ml, 1E-3mg/ml, 1E-4mg/ml, 1E-5mg/ml, 1E-6mg/ml이 되도록 미리 묽혀둔 것을 well에 처리한다. Fluorescence plate reader를 이용하여 530 nm exitation filter를 이용하여 590 nm에서의 emission 형광 파장을 측정한다. Data 처리는 Origin9.0을 이용하였으며 그래프로 나타냈으며, IC50값은 Graphpad prism 4.0 소프트웨어를 이용하여 계산했다.
결과를 IC50과 함께 도 4에 타내었다. 도 4에서 a 그래프는 S.pseudopneumoniae에 대한 결과, b 그래프는 S.aureus에 대한 결과, c 그래프는 P.mirabilis에 대한 결과, d 그래프는 C.albicans에 대한 결과이다. (e) 표는 실시예 1의 70% 에탄올 추출물과 양성대조군의 IC50를 정리한 것이다.
S.pseudopneumoniae 및 C.albicans에 대해서는 양성대조군(Con)보다 IC50이 작은 값을 보여 우수한 항균 활성을 나타내었다(도 4의 (e) 표 참조).

Claims (8)

  1. 터미날리아 비아라타의 물과 에탄올의 혼합용매 추출물을 유효성분으로 하는, 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아(Streptococcus pseudopneumoniae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 터미날리아 비아라타의 줄기 껍질의 물과 에탄올의 혼합용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 터미날리아 비아라타의 물과 에탄올의 혼합용매 추출물을 유효성분으로 하는, 스트렙토코쿠스 슈도뉴모니아(Streptococcus pseudopneumoniae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 캔디다 알비칸스(Candida albicans)의 감염증 개선용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 추출물은 터미날리아 비아라타의 줄기 껍질의 물과 에탄올의 혼합용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.

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Advances in Natural and Applied Sciences, 2009, 3(2), 188-191*
The battle against microbial pathogens: basic science, technological advances and educational programs. Spain: Formatex Research Center.(A. Méndez-Vilas, Ed.), 2015, 236-245*

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