KR102404898B1 - 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 생합성 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 생합성 시스템에 관한 것으로, 종래 알돌라아제의 활성에 비해 2배 이상의 활성을 가져지고 있어 다양한 고부가 화합물 생산에 기여할 수 있다.

Description

2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 생합성 시스템 {BIOSYNTHETIC SYSTEM FOR 2-KETO-4-HYDROXYBUTYRATE}

본 발명은 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 생합성 시스템에 관한 것이다.

최근 다양한 C1 가스 활용 기술이 등장하고 있으나, 메탄올, 포름산 등 기본적 C1 케미칼 또는 연료 생산에 집중되어 있다. 그러나 톤당 약 300-500$에 불과한 C1 케미칼의 가격으로 인해 C1 가스 리파이너리에 의해 단순 C1 물질을 생산할 경우 경제성을 확보하는 것이 어렵다. 따라서 C1 케미칼을 이용하여 C3 이상의 고부가가치 물질을 생산하는 것이 매우 중요하다. 이중에, 포름알데히드는 C1 화합물의 대사과정에서 매우 중요한 중간체로 알려져 있다.

현재까지 밝혀진, formaldehyde-pyruvate 탄소결합을 하는 효소는 대장균 유래의 2-keto-4-hydroxybutyrate aldolase 임이 알려져 있다. (ACS Synth. Biol. 2019, 8, 2483-2493) 그러나, 아직까지는 그 활성이 미미하고, 효소 안정성이 떨어지는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 오랜 연구 끝에 formaldehyde-pyruvate 탄소결합을 하는 효소를 확인하였고, 이는 기존에 알려진 효소보다 2배 이상 활성이 뛰어난 신규 효소군 3개를 발굴하였다.　이 후 알돌라아제의 활성 증진을 위해 활성 부위에 돌연변이를 유발하여 Pseudomonas aeruginosa PAO1 유래의 알돌라아제 중 야생형 효소보다 활성이 1.7배 증가된 단일 돌연변이 효소 2개와 Deinococcus radiodurans R1 유래의 알돌라아제 중 야생형 효소보다 1.33, 1.64, 1.71배 증가된 단일 돌연변이 효소 3개를 확보하였다. 또한 적은 효소 및 기질로 최대의 생산량을 끌어내기 위하여 생산량이 포화가 되는 최적의 반응 조건을 확인하였다. 최종적으로 실험관 내에서 메탄올과 피루베이트를 기질로 메탄올 디하이드로게네이즈와 알돌라아제를 함께 반응시켰을때 최종 산물이 합성되는 것을 명확하게 증명하여 본 발명을 완성하였다.

1. ACS Synth. Biol. 2019, 8, 2483-2493

본 발명의 일 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 P195, G196, S222, L227, L247 및 R250 중 어느 하나의 아미노산이 치환된 알돌라아제 변이체 또는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 V121, V237 및 L241 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 알돌라아제 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 알돌라아제 변이체 또는 서열번호 1 내지 3중 어느 하나의 알돌라아제를 포함하는 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 (2-keto-4-hydroxybutyrate) 생합성용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 알돌라아제 변이체 또는 알돌라아제를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그리고, 본 발명의 다른 일 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포름알데히드 및 피루브산으로부터 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 생성능을 가진 재조합 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 일 양상은 상기 재조합 미생물을 포름알데히드 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 P195, G196, S222, L227, L247 및 R250 중 어느 하나의 아미노산이 치환된 알돌라아제 변이체 또는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 V121, V237 및 L241 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 알돌라아제 변이체를 제공한다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 후술되는 바와 같이 Deinococcus radiodurans R1 유래인 알돌라아제이고 서열번호 3은 Pseudomonas aeruginosa PAO1 유래의 알돌라아제의 아미노산 서열이다.

본 발명의 일 구체예로서 상기 서열번호 2의 아미노산 서열에서 P195 는 세린 (S) 또는 글루타민 (Q)으로 치환되는 것이고, G196 및 S222 는 알라닌 (A)로 치환되는 것이고, L227 및 L247 은 발린 (V)으로 치환되는 것이며, R250 는 알라닌 (A)로 치환되는 것이고,

상기 서열번호 3의 아미노산 서열에서 V121, V237 및 L241은 알라닌 (A)로 치환되는 알돌라아제 변이체이다.

상기 알돌라아제 변이체는 전술한 돌연변이를 통해 서열번호 2의 Deinococcus radiodurans R1 유래 알돌라아제 또는 서열번호 3은 Pseudomonas aeruginosa PAO1 유래의 알돌라아제에 비하여 우수한 활성을 가지는 효과가 있다 (도 19 및 20).

본 발명의 다른 일 양상은 상기한 알돌라아제 변이체 또는 서열번호 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 (2-keto-4-hydroxybutyrate) 생합성용 조성물을 제공한다.

상기 알돌라아제 변이체는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열에서 P195 는 세린 (S) 또는 글루타민 (Q)으로 치환되는 것이고, G196 및 S222 는 알라닌 (A)로 치환되는 것이고, L227 및 L247 은 발린 (V)으로 치환되는 것이며, R250 는 알라닌 (A)로 치환되는 것이고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열에서 V121, V237 및 L241은 알라닌 (A)로 치환되는 것이고, 서열번호 1 내지 3중 어느 하나의 알돌라아제는 구체적으로, 서열번호 1은 Achromobacter xylosoxidans 유래 알돌라아제이고, 서열번호 2는 Deinococcus radiodurans R1 유래 알돌라아제이며, 서열번호 3은 Pseudomonas aeruginosa PAO1 유래의 알돌라아제이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "생합성"은 화학적으로 합성되지 않고, 생물학적으로 합성되는 것을 의미하고, 구체적으로는 전술한 서열번호 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열, 알돌라아제에 의해 합성되는 것을 의미한다.

본 발명에서 알돌라아제는 구체적으로 피루브산 알돌라아제로서, 알돌과 같은 당을 분해 또는 알돌 축합반응을 일으키는 효소이다.

본 발명의 일 구체예로서 상기 알돌라아제 변이체 또는 알돌라아제는 포름알데히드와 피루브산을 결합하는 것일 수 있다. 구체적으로 아래의 화학식 1과 같이 메탄모노옥시게나아제, 메탄올 디하이드로게나아제에 의해 생성된 포름알데히드와 해당과정에 의해 생성된 피루브산의 알돌축합반응을 일으키고 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트를 생성한다. 상기 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트는 1,3-프로판 다이올의 전구체로서 추가적인 반응을 거쳐 바이오디젤, 접착제, 라미네이션, 코팅, 거푸집, 지방족 화합물, 공폴리에스터 등의 산업 물질들에 활용될 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 상기 알돌라아제는 기존에 알려진 알돌라아제 (YfaU)보다 >2배 이상의 활성을 가지고 있음을 확인하였고 (도17 및 18 참조), 상기 알돌라아제 변이체는 서열번호 2의 Deinococcus radiodurans R1 유래 알돌라아제 또는 서열번호 3은 Pseudomonas aeruginosa PAO1 유래의 알돌라아제에 비하여 우수한 활성을 가지고 있어 다양한 고부가 화합물 생산에 기여할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 알돌라아제 변이체 또는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 DNA의 T(티민)이 우라실(U)로 대체되는 것으로 이해할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 공지된 화학적 합성법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포름알데히드 및 피루브산으로부터 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 생성능을 가진 재조합 미생물을 제공한다.

상기 재조합 미생물은 상기 알돌라아제 변이체 또는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 미생물의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 미생물의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 재조합 발현벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λ△z1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli DH5α, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli BL21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다. 상기 E.coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.

본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체 상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, microinjection(세포에 DNA를 직접 넣는 것), liposome, directed DNA uptake, receptor mediated DNA transfer 또는 Ca ++ 을 이용한 DNA 운반 방법 등이 있으며, 최근에는 바이러스(virus)를 이용한 유전자 운반 방 법이 많이 사용되고 있다. 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 방법 등이 있으며, 특히, 레트로바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 gross deletion이나 숙주 DNA와 재정렬(rearrangement : 숙주 DNA 중 자기 DNA와 유사한 부위를 바꾸는 것으로 숙주 DNA 기능의 변화를 초래함)에 의한 결합 없이 넓은 범위 의 세포들에서 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 Agrobacterium 속, Aspergillus 속, Acetobacter 속, Aminobacter 속, Agromonas 속, Acidphilium 속, Bulleromyces 속, Bullera 속, Brevundimonas 속, Cryptococcus 속, Chionosphaera 속, Candida 속, Cerinosterus 속, Escherichia 속, Exisophiala 속, Exobasidium 속, Fellomyces 속, Filobasidium 속, Geotrichum 속, Graphiola 속, Gluconobacter 속, Kockovaella 속, Curtzmanomyces 속, Lalaria 속, Leucospoidium 속, Legionella 속, Psedozyma 속, Paracoccus 속, Petromyc 속, Rhodotorula 속, Rhodosporidium 속, Rhizomonas 속, Rhodobium 속, Rhodoplanes 속, Rhodopseudomonas 속, Rhodobacter 속, Sporobolomyces 속, Spridobolus 속, Saitoella 속, Schizosaccharomyces 속, Sphingomonas 속, Sporotrichum 속, Sympodiomycopsis 속, Sterigmatosporidium 속, Tapharina 속, Tremella 속, Trichosporon 속, Tilletiaria 속, Tilletia 속, Tolyposporium 속, Tilletiposis 속, Ustilago 속, Udenlomyce 속, Xanthophilomyces 속, Xanthobacter 속, Paecilomyces 속, Acremonium 속, Hyhomonus 속, Rhizobium 속 등일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 재조합 미생물을 포름알데히드 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트를 생산하는 방법을 제공한다.

전술한 바와 같이 상기 재조합 미생물은 상기 알돌라아제 변이체의 아미노산 서열 또는 서열번호 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하기 때문에 배양 시 상기 알돌라아제 변이체의 아미노산 또는 서열번호 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산, 알돌라아제를 발현할 수 있고, 상기 알돌라아제는 포름알데히드와 미생물 내에서 생성된 피루브산을 알돌 축합반응시켜 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트를 생성할 수 있다.

본 발명의 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 생합성 시스템은 종래 알돌라아제의 활성에 비해 우수한 활성을 가지고 있어 다양한 고부가 화합물 생산에 기여할 수 있다.

도 1 내지 도 12는 실시예 2의 온도 (도1, 도3, 도5), pH (도2, 도4, 도6), 금속이온 (도7, 도9, 그리고 도 11) 및 MgCl₂농도 (도8, 도10, 도12)에　따른　알돌라아제의 활성을　나타내는　그래프이다.
도 １３　내지 16은 실시예 2에 따른 결과로, 알돌라아제 농도 (도 13), 기질농도 (도 14, 15) 및 반응시간 (도 16)에 따른 알돌라아제의 활성을 나타내는 결과이다.
도 17 및 18은 실시예　３에　따른　종래　알돌라아제와　본　발명의　알돌라아제의　상대　활성을　비교한　그래프이다.
도 19 및 20은 실시예　４에　따른　본　발명의　알돌라아제　변이체의　활성을　비교한　그래프이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 알돌라아제의 선정

현재까지 알려져있는 피루베이트 알돌라아제 중 활성이 가장 좋은 것으로 보고된 효소는 Escherichia coli K12 유래의 2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase(YfaU)이다. 상기 효소와 신규로 발굴된 효소군의 비교를 통하여 가장 활성이 높은 피루베이트 알돌라아제를 선별하고 분자진화를 통해 개량하여 효소 활성 및 기질 친화도가 증가된 효소를 확보하였다．

구체적으로，　Escherichia coli K12 유래의 피루베이트 알돌라아제 서열을 바탕으로　서열을　검색하였고，　필수 효소인 알돌라아제의 후보 효소군을 sequence mining을 통하여 서열을 확보하였다．　그　결과　Achromobacter xylosoxidans, Deinococcus radiodurans R1, Pseudomonas aeruginosa PAO1 유래의 3개의 피루베이트 알돌라아제를　선정하였다．

이들　알돌라아제　후보군　유전자들을 T7 프로모터 기반 및 Maltose binding site, TEV cleavage site, His tag이 포함된 pET28a 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 각각의 유전자를 C2566 대장균(NEB)에 형질 전환하여, 37℃에서 16시간 배양한 후 단일 콜로니를 선별하였다． 단일 콜로니를 10㎖ tube에 50㎍/㎖ 앰피실린이 함유된 LB에 접종하여 37℃에서 4시간 이상 배양하고 OD₆₀₀ 가 0.6일 ‹š 0.1mM IPTG를 첨가하였다. 1시간동안 배양한 후 20℃ 배양기에서 150rpm으로 20시간 배양하였다．　그리고，　배양액에서 세포를 원심분리기를 이용하여 회수한 후 sonicator로 cell을 파쇄하고 상등액만을 선별하여 FPLC 및 His tag affinity 크로마토그래피를 이용하여 정제하여　알돌라아제를　확보하였다 (서열번호 1 내지 3)．

실시예 2: 본　발명의 알돌라아제의 활성　평가

실시예　１에서　확보된　알돌라아제의　활성을　평가하였다．　

2-1 서열번호 1, 2, 3 의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인

구체적으로, 상기 실시예 [1]에서 정제 및 분리한 서열번호 1,2,3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.05 ㎎/㎖, 100mM 피루베이트, 100mM 포름알데히드 과 1mM의 CoCl₂가 포함된 50mM의 PIPES 완충용액(pH 7.0)에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, -80℃에서 상기 반응을 종료시킨 다음, 반응이 종료된 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하였다.

상기 생성된 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트는 o-benzylhydroxylamine hydrochloride로 전처리한 후 HPLC를 통해 분석하였다. 상기 전처리 과정은 21㎎의 BnONH₂(o-benzylhydroxylamine hydrochloride)와 660㎕의 피리딘, 900㎕의 메탄올 그리고 40㎕의 증류수 혼합액에 녹여 BnONH₂ 용액을 만들고, 15㎕의 분석할 샘플을 BnONH₂ 용액 80㎕에 넣어 상온에서 2시간동안 반응시켰다. 그 후 13000rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 추출하여 0.2㎛ 필터로 필터링한 뒤 HPLC를 통해 성분을 분석하였다.

상기와 같이 준비된 전처리된 샘플 50㎕을, VWD(Variable wavelength detector), 215nm와 역상 C18 컬럼(Gemini® 5 μm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm 컬럼)(Phenomenex)이 장착된 고압 액체 크로마토그래피에 주입하여, 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하였다. 상기와 같은 고압 액체 크로마토그래피를 수행함에 이용된 이동상은 0.1% trifluoroacetic acid (이동상 A)과 0.095% TFA가 포함된 acetonitrile과 H₂O를 4:1의 비율로 혼합한 것 (이동상 B)으로 구성되고, 1㎖/분의 유속으로 30분 동안 흘려주었는데, 이동상 B의 농도를 10%~100%로 올려주었다.

그 결과, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서는 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트이 모두 검출되었고, 위 반응 결과 생성된 결과로부터 상기 실시예 1에서 정제 및 분리한 서열번호 1,2,3의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 피루베이트와 포름알데히드로터 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트를 생성하는, 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성 효소로서의 활성을 가짐을 확인하였다.

2－2．　온도　및　ｐＨ에　따른　활성평가

상기 서열번호 1, 2, 3 의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1]에서 정제 및 분리하여, 50mM PIPES pH7.0, 1mM CoCl₂에 들어있는 서열번호 1, 2, 3 의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.05 ㎎/㎖, 100mM 피루베이트, 100mM 포름알데히드를 섞어서, 각각 20,25,30,35,40,45,50 그리고 55℃에서 10분동안 반응시켰다. 그리고 상기 실시예 [2-1] 에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하여 그 상대값을 비교하였다. 그 결과, 도1, 도3, 도5에서 확인되는 바와 같이 AxADL와 DrADL은 50℃에서, PaADL은 45℃에서 가장 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

상기 서열번호 1, 2, 3 의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1]에서 정제 및 분리한 서열번호 1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.05㎎/㎖, 100mM 피루베이트, 100mM 포름알데히드 및 1mM CoCl₂와 함께, 각각 pH 6.5 내지 7.5의 PIPES완충용액, pH 7.5 내지 8.5의 EPPS 완충 용액 및 pH 8.5 내지 10의 CHES 완충 용액에 각각 첨가하여, pH 6.5 내지 10의 범위에서 각각 반응시켰다. 그리고 상기 실시예 [2-1] 에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하여 그 상대값을 비교하였다. 그 결과, 도2, 도4, 도6에서 확인되는 바와 같이 AxADL는 pH9.0에서, DrADL와 PaADL은 pH8.5에서 가장 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

２－3．　금속염종류　및　농도에　따른　활성평가

실시예　１의 알돌라아제에　대한 금속 이온에　따른 활성 영향을　확인하였다．

상기 서열번호 1,2,3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 종류가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1]에서 정제 및 분리한 서열번호 1,2,3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.05 ㎎/㎖, 100mM 피루베이트, 100mM 포름알데히드가 포함된 AxADL는 pH9.0에서, DrADL와 PaADL은 pH8.5 완충용액에 1mM의 EDTA 또는 1mM 금속 양이온(MgCl₂, CaCl₂, MnCl₂, NiCl₂, CoCl₂, CuCl₂ 그리고 ZnCl₂)과 함께 첨가하여 각각 AxADL와 DrADL은 50℃에서, PaADL은 45℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그리고 상기 실시예 [2-1] 에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량를 측정하여 그 상대값을 비교하였다. 그 결과, 도7, 도9, 그리고 도 11에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 알돌라아제들이 1mM MgCl₂에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 이를 바탕으로 금속염의 최적화 농도를 찾기 위해 효소 혼합물에 첨가되는 금속염을 0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 그리고 10mM의 MgCl₂로 변경하여 실험한 결과, 도8, 도10, 도12에서 나타나듯이 AxADL은 5mM에서, DrADL와 PaADL은 1mM에서 활성이 포화되는 것을 확인하였다.

2-4. 알돌라아제 농도에 따른 활성평가

상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 효소의 농도가 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 [1]에서 정제 및 분리하여, 50mM EPPS pH 8.5, 1mM MgCl₂, 100mM 피루베이트, 100mM 포름알데히드에 들어있는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5 그리고 5.0 ㎎/㎖ 섞어서, 각각 45℃에서 10분동안 반응시켰다. 그리고 상기 실시예 2 에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하여 비교하였다.

그 결과, 도 13에서 확인되는 바와 같이 같이 0.1 ㎎/㎖의 효소 농도에서 활성이 포화됨을 확인하였다.

2-5. 기질 농도에 따른 활성평가

상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 포름알데히드가 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로 상기 실시예 [1]에서 정제 및 분리한 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.1 ㎎/㎖, 100 mM 피루베이트 및 1 mM MgCl₂를 50 mM EPPS pH 8.5 완충용액에 섞고, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 300 그리고 400mM 포름알데히드를 각각 첨가하여 반응시켰다. 그리고 상기 실시예 [2-1] 에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하여 비교하였다.

그 결과, 도 14에서 확인되는 바와 같이 150mM 포름알데히드에서 가장 높은 활성을 나타내었고, 그 이상의 포름알데히드 농도에서는 효소 활성이 억제되는 것을 확인하였다.

또한, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 피루베이트가 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 [1]에서 정제 및 분리한 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.1 ㎎/㎖, 150 mM 포름알데히드 및 1 mM MgCl₂를 50 mM EPPS pH 8.5 완충용액에 섞고 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200 그리고 300mM 피루베이트를 각각 첨가하여 반응시켰다. 그리고 상기 실시예 [2-1] 에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하여 비교하였다.

그 결과, 도 15에서 확인되는 바와 같이 150mM 피루베이트에서 활성이 포화됨을 확인하였다.

2-6. 반응 시간에　따른　활성평가

상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 효소의 활성에 효소 반응 시간이 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 [1]에서 정제 및 분리한 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.1 ㎎/㎖, 1 mM MgCl, 150 mM 피루베이트, 150 mM 포름알데히드가 포함된 50 mM EPPS pH8.5 완충액을 45℃에서 0, 10, 30, 60, 90, 120, 150 그리고 180분 동안 반응시켰다. 그리고 상기 실시예 [2-1] 에서와 같은 방법으로, 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그 결과, 도 16에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 야생형 알돌라아제가 60분, L241A 돌연변이체가 20분만에 활성이 포화되는 것을 확인하였다.

실시예 3: 본　발명의　알돌라아제의 활성비교

상기 서열번호 1,2,3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성의 기존에 피루베이트와 포름알데히드로부터 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트가 생성된다고 보고되어 있던 E.coli 유래의 YfaU와 활성을 비교해보았다.

각각의 활성은 도 18의 테이블에 제시한대로 최적조건에서 진행하였다. 그리고 상기 실시예 2-1 에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그　결과，　도　１7　및　１8에서　확인되는　바와　같이　YfaU의 활성에 비해 PaADL는 약 2배, AxADL은 약 9배, DrADL은 약 31배 활성이 높고　（도　１7　참고）, 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생산량 또한 종래 YfaU에 비하여 본 발명의 AxADL, PaADL 및 DrADL의 생산량이 우수한 것을　확인하였다.

실시예 4: 본　발명의　알돌라아제　변이체　활성　확인

전술한　본　발명의　알돌라아제의　활성을　확인한　결과　Deinococcus radiodurans R1의　알돌라아제가　우수한　활성을　가지는　것을　알　수　있었다．

４－１．　점돌연변이의　선정

상기 서열번호 2 및 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 확보하였고, 결정구조의 활성부위에서 기질인 피루베이트와 20 Å 거리에서 상호작용하는 잔기들을 선별하였다 (표 1 및 표 2 참조). 서열번호 2 및 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질에서 선별된 잔기들을 치환하기 위해 서열번호 2 및 3의 염기 서열을 기초로, 다음 [표 1]과 [표 2]와 같이 서열번호 4 내지 109의 프라이머를 각각 설계하였다.

DrADL 돌연변이	서열번호	프라이머 쌍	서열 (5'->3')
Trp28Ala	4	정방향 프라이머	gcagatcggtctggcgctgggtctggcg
Trp28Ala	5	역방향 프라이머	cgccagacccagcgccagaccgatctgc
Asp51Ala	6	정방향 프라이머	tggctgctgatcgccggtgaacacgcg
Asp51Ala	7	역방향 프라이머	cgcgtgttcaccggcgatcagcagcca
Arg79Ala	8	정방향 프라이머	GGTTGCGCCGGTTGTTGCTCCGCCGGTTGG
Arg79Ala	9	역방향 프라이머	CCAACCGGCGGAGCAACAACCGGCGCAACC
Val127Ala	10	정방향 프라이머	CGTGGTGCTGGTTCT
Val127Ala	11	역방향 프라이머	GATACCCTGCGGCGG
Leu131Ala	12	정방향 프라이머	CGTGCGTCTCGTTGG
Leu131Ala	13	역방향 프라이머	CGCCGCCGCAGAACCAAC
Asn138Ala	14	정방향 프라이머	CGTTGGGCCGCGGTTCCG
Asn138Ala	15	역방향 프라이머	AGACGCACGCGCCAG
Pro182Ala	16	정방향 프라이머	acggtgttttcatcggtgcggcggacc
Pro182Ala	17	역방향 프라이머	ggtccgccgcaccgatgaaaacaccgt
Pro195Ala	18	정방향 프라이머	GTCACCTGGGTCACGCGGGTCACCCGGACG
Pro195Ala	19	역방향 프라이머	CGTCCGGGTGACCCGCGTGACCCAGGTGAC
Pro195Ser	20	정방향 프라이머	cacctgggtcactcgggtcacccgGA
Pro195Ser	21	역방향 프라이머	Tccgggtgacccgagtgacccaggtg
Pro195Val	22	정방향 프라이머	tcacctgggtcacgtgggtcacccggac
Pro195Val	23	역방향 프라이머	gtccgggtgacccacgtgacccaggtga
Pro195Glu	24	정방향 프라이머	tcacctgggtcacgagggtcacccggac
Pro195Glu	25	역방향 프라이머	gtccgggtgaccctcgtgacccaggtga
Pro195Gln	26	정방향 프라이머	cctgggtcaccagggtcacccggAC
Pro195Gln	27	역방향 프라이머	GTccgggtgaccctggtgacccagg
Pro195Arg	28	정방향 프라이머	GTccgggtgaccccggtgacccagg
Pro195Arg	29	역방향 프라이머	cctgggtcaccggggtcacccggAC
Gly196Ala	30	정방향 프라이머	CACCCGGCTCACCCGGACGTTG
Gly196Ala	31	역방향 프라이머	CAACGTCCGGGTGAGCCGGGTG
Gly196Leu	32	정방향 프라이머	cctgggtcacccgctacacccggacgttg
Gly196Leu	33	역방향 프라이머	caacgtccgggtgtagcgggtgacccagg
Gly196Val	34	정방향 프라이머	cctgggtcacccggttcacccggacgttg
Gly196Val	35	역방향 프라이머	caacgtccgggtgaaccgggtgacccagg
Gly196Glu	36	정방향 프라이머	cctgggtcacccggagcacccggacgttg
Gly196Glu	37	역방향 프라이머	caacgtccgggtgctccgggtgacccagg
Gly196Gln	38	정방향 프라이머	cctgggtcacccgcagcacccggacgttg
Gly196Gln	39	역방향 프라이머	caacgtccgggtgctgcgggtgacccagg
Gly196Lys	40	정방향 프라이머	cctgggtcacccgaagcacccggacgttg
Gly196Lys	41	역방향 프라이머	caacgtccgggtgcttcgggtgacccagg
Leu221Ala	42	정방향 프라이머	GGTATCGCGTCTGCGGAC
Leu221Ala	43	역방향 프라이머	CGCCGCTTTACCCGC
Ser222Ala	44	정방향 프라이머	ggcgggtatcctggctgcggacgaacg
Ser222Ala	45	역방향 프라이머	cgttcgtccgcagccaggatacccgcc
Ala223Gln	46	정방향 프라이머	AGCGGCGGGTATCCTGTCTCAGGACGAACGT
Ala223Gln	47	역방향 프라이머	acgttcgtcctgagacaggatacccgccgct
Asp224Ala	48	정방향 프라이머	GCGGCCGAACGTCTG
Asp224Ala	49	역방향 프라이머	AGACAGGATACCCGC
Glu225Ala	50	정방향 프라이머	GCGGACGCACGTCTG
Glu225Ala	51	역방향 프라이머	AGACAGGATACCCGC
Arg226Ala	52	정방향 프라이머	atcctgtctgcggacgaagctctggcgcgt
Arg226Ala	53	역방향 프라이머	acgcgccagagcttcgtccgcagacaggat
Leu227Ala	54	정방향 프라이머	TGCGGACGAACGTGCGGCGCGTCACTACCT
Leu227Ala	55	역방향 프라이머	AGGTAGTGACGCGCCGCACGTTCGTCCGCA
Leu227Val	56	정방향 프라이머	tgtctgcggacgaacgtgtggcgcgtc
Leu227Val	57	역방향 프라이머	gacgcgccacacgttcgtccgcagaca
Val243Ala	58	정방향 프라이머	cgttgcggttggtgctgacaccaccctgc
Val243Ala	59	역방향 프라이머	gcagggtggtgtcagcaccaaccgcaacg
Thr246Ala	60	정방향 프라이머	GACACCGCCCTGCTG
Thr246Ala	61	역방향 프라이머	AACACCAACCGCAAC
Leu247Ala	62	정방향 프라이머	TGTTGACACCACCGCGCTGGCGCGTGCGGC
Leu247Ala	63	역방향 프라이머	GCCGCACGCGCCAGCGCGGTGGTGTCAACA
Leu247Val	64	정방향 프라이머	gttgacaccaccgtgctggcgcgtgCGG
Leu247Val	65	역방향 프라이머	CCGcacgcgccagcacggtggtgtcaac
Arg250Ala	66	정방향 프라이머	CCCTGCTGGCGGCTGCGGCGCGTACCCTGG
Arg250Ala	67	역방향 프라이머	CCAGGGTACGCGCCGCAGCCGCCAGCAGGG

PaADL 돌연변이	서열번호	프라이머 쌍	서열 (5'->3')
Trp22Ala	68	정방향 프라이머	gcagatcggtctggcgctgggtctggcg
	69	역방향 프라이머	cgccagacccagcgccagaccgatctgc
Asp45Ala	70	정방향 프라이머	ggctgctgctggccggtgaacacgc
	71	역방향 프라이머	gcgtgttcaccggccagcagcagcc
Arg73Ala	72	정방향 프라이머	ggtcagccggttatcgctccggttcagggtg
	73	역방향 프라이머	caccctgaaccggagcgataaccggctgacc
Val121Ala	74	정방향 프라이머	gggtgttcgtggtgctggttctgcgctgg
	75	역방향 프라이머	ccagcgcagaaccagcaccacgaacaccc
Leu125Ala	76	정방향 프라이머	gtgttggttctgcggcggcgcgtgcgtctc
	77	역방향 프라이머	gagacgcacgcgccgccgcagaaccaacac
Asn132Ala	78	정방향 프라이머	gcgtgcgtctcgttgggcctctgttgcggaatac
	79	역방향 프라이머	gtattccgcaacagaggcccaacgagacgcacgc
Pro176Ala	80	정방향 프라이머	acggtgttttcatcggtgcggcggacc
	81	역방향 프라이머	ggtccgccgcaccgatgaaaacaccgt
Pro189Ala	82	정방향 프라이머	caccgtggtaacgcgggtcacccgg
	83	역방향 프라이머	ccgggtgacccgcgttaccacggtg
Gly190Ala	84	정방향 프라이머	cgtggtaacccggctcacccggaagtt
	85	역방향 프라이머	aacttccgggtgagccgggttaccacg
Leu215Ala	86	정방향 프라이머	aaagcggcgggtatcgcgtctgcggacgaaac
	87	역방향 프라이머	gtttcgtccgcagacgcgatacccgccgcttt
Ser216Ala	88	정방향 프라이머	ggcgggtatcctggctgcggacgaaac
	89	역방향 프라이머	gtttcgtccgcagccaggatacccgcc
Ala217Gln	90	정방향 프라이머	gcggcgggtatcctgtctcaggacgaaaccc
	91	역방향 프라이머	gggtttcgtcctgagacaggatacccgccgc
Asp218Ala	92	정방향 프라이머	atcctgtctgcggccgaaaccctggcg
	93	역방향 프라이머	cgccagggtttcggccgcagacaggat
Glu219Ala	94	정방향 프라이머	tgtctgcggacgcaaccctggcgcg
	95	역방향 프라이머	cgcgccagggttgcgtccgcagaca
Leu221Ala	96	정방향 프라이머	ctgcggacgaaaccgcggcgcgtcgttacc
	97	역방향 프라이머	ggtaacgacgcgccgcggtttcgtccgcag
Val237Ala	98	정방향 프라이머	cgttgcggttggtgctgacacctctctgc
	99	역방향 프라이머	gcagagaggtgtcagcaccaaccgcaacg
Ser240Ala	100	정방향 프라이머	ggttggtgttgacaccgctctgctgatgcgttc
	101	역방향 프라이머	gaacgcatcagcagagcggtgtcaacaccaacc
Leu241Ala	102	정방향 프라이머	ggttggtgttgacacctctgcgctgatgcgttctct
	103	역방향 프라이머	agagaacgcatcagcgcagaggtgtcaacaccaacc
Leu241Val	104	정방향 프라이머	cggttggtgttgacacctctgtgctgatgcgt
	105	역방향 프라이머	acgcatcagcacagaggtgtcaacaccaaccg
Leu241Gly	106	정방향 프라이머	ggttggtgttgacacctctgggctgatgcgttctct
	107	역방향 프라이머	agagaacgcatcagcccagaggtgtcaacaccaacc
Arg244Ala	108	정방향 프라이머	cacctctctgctgatggcttctctgcgtgaactg
	109	역방향 프라이머	cagttcacgcagagaagccatcagcagagaggtg

㈜마크로젠에 의뢰하여 서열번호 4 내지 109의 염기 서열 프라이머를 합성하였고, 상기 서열번호 2 및 3의 염기서열을 주형으로 하여, 상기 설계된 서열번호 4 내지 109의 프라이머 쌍 각각을 이용한 PCR을 수행하였다. Phusion, STAR max 등 중합효소들을 이용하여 PCR 증폭된 각각의 PCR 산물은 그 자체로 이용하거나 라이게이션/카이네이션 방법으로 염기서열 말단부위를 각각 연결하였고, 염기 서열 분석(sequencing)(㈜마크로젠)을 통해 해당 잔기들이 의도한 아미노산을 암호화하는 염기서열로 정확히 치환되었음을 확인하였다. 해당 염기서열들은 각각 대장균 C2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환 하였고, 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.

４－２．　알돌라아제　변이체　활성　확인

선정된　점돌연변이를　적용한　알돌라아제　변이체의　활성을　확인하기 위하여, 단일 콜로니를 10㎖ tube에 50㎍/㎖ 앰피실린이 함유된 LB에 접종하여 37℃에서 4시간 이상 배양하고 OD₆₀₀ 가 0.6일 때 0.1mM IPTG를 첨가하였다. 1시간동안 배양한 후 20

배양기에서 150rpm으로 20시간 배양하였다. 배양액에서 세포를 원심분리기를 이용하여 회수한 후 sonicator로 cell을 파쇄하고 상등액만을 선별하여 His tag affinity 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제된 돌연변이 효소들을 BSA assay를 이용하여 농도를 측정하였고, DrADL의 변이체 단백질 0.005 ㎎/㎖ 또는 PaADL 변이체 단백질 0.05 ㎎/㎖ 과 100mM 피루베이트, 100mM 포름알데히드 및 1mM MgCl₂ 와 함께 pH8.5 완충용액에서 50℃ 또는 45℃ 에서 10 분 반응시켰다. 그리고 상기 실시예 [2-1] 에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트의 생성량을 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그　결과，　도　１9에서　확인되는　바와　같이 서열번호 2로부터 유래한 점돌연변이 변이체들 중 G196A, S222A 그리고 L247V 돌연변이체를 가진 알돌라아제가 야생형 효소에 비해 각각 1.71, 1.33 그리고 1.64 배 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다． 또한, 도 20에서 확인되는 바와 같이 서열번호 3으로부터 유래한 점돌연이 변이체들 중 V121A, L241A 그리고 V121A/L241A 돌연변이체를 가진 알돌라아제가 야생형 효소에 비해 약 1.4배 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다．

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> BIOSYNTHETIC SYSTEM FOR 2-KETO-4-HYDROXYBUTYRATE <130> PN200312-P1 <150> KR 10-2020-0134556 <151> 2020-10-16 <160> 109 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Achromobacter xylosoxidans(AX) aldolase <400> 1 Met Asp Ile Leu Thr Asn Gln Phe Lys Arg Ala Leu Arg Ala Gly Thr 1 5 10 15 Pro Gln Ile Gly Leu Trp Ala Gly Leu Ala Ser Ala Tyr Thr Ser Glu 20 25 30 Ile Ile Ala Gly Ala Gly Phe Asp Trp Leu Leu Ile Asp Gly Glu His 35 40 45 Ala Pro Asn Thr Leu Gln Thr Thr Leu Ala Gln Leu Gln Ser Val Ala 50 55 60 Ala Tyr Pro Val Ala Pro Val Val Arg Pro Ala Trp Asn Asp Pro Val 65 70 75 80 Gln Ile Lys Gln Ile Leu Asp Thr Gly Ala Gln Thr Leu Leu Val Pro 85 90 95 Met Val Gln Ser Ala Glu Glu Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Val Arg 100 105 110 Tyr Pro Pro Ala Gly Ile Arg Gly Val Gly Ser Ala Leu Ala Arg Ser 115 120 125 Ser Arg Trp Asn Arg Ile Pro Asn Tyr Leu Glu Arg Ala Asn Asp Glu 130 135 140 Met Cys Val Leu Val Gln Ile Glu Thr Pro Arg Gly Val Asp Ala Leu 145 150 155 160 Glu Asp Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Asp Gly Ala Phe Ile Gly Pro 165 170 175 Ala Asp Leu Ser Ala Ser Met Gly Tyr Leu Gly Gln Pro Glu His Pro 180 185 190 Glu Val Ala Arg Thr Ile Asp Ala Ala Ile Gly Arg Ile Val Lys Ser 195 200 205 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Leu His Ser Gly Val Ala Gln Ala Arg His 210 215 220 Tyr Leu Ser Leu Gly Ala Thr Phe Val Ala Val Gly Val Asp Ala Val 225 230 235 240 Leu Leu Ala Arg Ala Ala Glu Lys Leu Ala Gly Glu Phe Lys Asp Leu 245 250 255 Lys Pro Val Gly Lys Ala Gly Gly Pro Tyr 260 265 <210> 2 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Deinococcus radiodurans R1(DR) aldolase <400> 2 Met Pro Gln Pro Met Lys Leu Asp Pro Leu Ser Asn Thr Phe Lys His 1 5 10 15 Ala Leu Ala Gly Gly Arg Pro Gln Ile Gly Leu Trp Leu Gly Leu Ala 20 25 30 Asp Pro Tyr Cys Ala Glu Ile Cys Ala Gly Ala Gly Phe Asp Trp Leu 35 40 45 Leu Ile Asp Gly Glu His Ala Pro Asn Asp Val Arg Ser Thr Leu Ala 50 55 60 Gln Leu Gln Ala Leu Ala Ala Tyr Pro Val Ala Pro Val Val Arg Pro 65 70 75 80 Pro Val Gly Asp Thr His Leu Ile Lys Gln Tyr Leu Asp Leu Gly Val 85 90 95 Gln Thr Leu Leu Val Pro Met Val Asp Thr Pro Glu Gln Ala Arg Gln 100 105 110 Leu Val Gln Ala Thr Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Ile Arg Gly Val Gly 115 120 125 Ser Ala Leu Ala Arg Ala Ser Arg Trp Asn Ala Val Pro Asp Tyr Leu 130 135 140 Thr Arg Ala Asn Asp Glu Ile Cys Leu Leu Val Gln Val Glu Ser Arg 145 150 155 160 Leu Gly Leu Glu Asn Leu Asp Glu Ile Ala Ala Val Glu Gly Val Asp 165 170 175 Gly Val Phe Ile Gly Pro Ala Asp Leu Ser Ala Ser Leu Gly His Leu 180 185 190 Gly His Pro Gly His Pro Asp Val Ala Gln Ala Ile Glu Asp Ala Leu 195 200 205 Arg Arg Ile Val Gly Ala Gly Lys Ala Ala Gly Ile Leu Ser Ala Asp 210 215 220 Glu Arg Leu Ala Arg His Tyr Leu Ala Leu Gly Ala Thr Phe Val Ala 225 230 235 240 Val Gly Val Asp Thr Thr Leu Leu Ala Arg Ala Ala Arg Thr Leu Ala 245 250 255 Ala Ser Phe Lys Asp Lys Ser Arg Glu Glu Ala Glu Pro Glu Pro Gln 260 265 270 Gly Gly Ser Val Tyr 275 <210> 3 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas aeruginosa PAO1(PA) Aldolase <400> 3 Met Asp Leu Pro Val Asn Arg Phe Lys Gln Arg Leu Arg Ser Gly Glu 1 5 10 15 Ala Gln Ile Gly Leu Trp Leu Gly Leu Ala Asp Pro Tyr Cys Ala Glu 20 25 30 Leu Ala Ala Asn Ala Gly Phe Asp Trp Leu Leu Leu Asp Gly Glu His 35 40 45 Ala Pro Asn Asp Leu Arg Ser Leu Leu Gly Gln Leu Gln Ala Leu Ala 50 55 60 Pro Tyr Pro Gly Gln Pro Val Ile Arg Pro Val Gln Gly Asp Thr Ala 65 70 75 80 Leu Ile Lys Gln Leu Leu Asp Ile Gly Ala Gln Thr Leu Leu Val Pro 85 90 95 Met Val Asp Ser Ala Ala Gln Ala Glu Gly Leu Val Arg Ala Val Arg 100 105 110 Tyr Pro Pro Ala Gly Val Arg Gly Val Gly Ser Ala Leu Ala Arg Ala 115 120 125 Ser Arg Trp Asn Ser Val Ala Glu Tyr Leu Asn His Ala Asp Glu Gln 130 135 140 Met Cys Leu Leu Val Gln Val Glu Asn Leu Glu Gly Leu Ala Asn Leu 145 150 155 160 Asp Ala Ile Ala Ala Val Glu Gly Val Asp Gly Val Phe Ile Gly Pro 165 170 175 Ala Asp Leu Ser Ala Ala Met Gly His Arg Gly Asn Pro Gly His Pro 180 185 190 Glu Val Gln Ala Ala Ile Glu Asp Ala Ile His Arg Ile Arg Thr Ala 195 200 205 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Leu Ser Ala Asp Glu Thr Leu Ala Arg Arg 210 215 220 Tyr Leu Glu Leu Gly Cys Ala Phe Val Ala Val Gly Val Asp Thr Ser 225 230 235 240 Leu Leu Met Arg Ser Leu Arg Glu Leu Ala Gly Arg Phe Lys Gly Gly 245 250 255 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Gly 260 265 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trp28Ala forward primer <400> 4 gcagatcggt ctggcgctgg gtctggcg 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trp28Ala backward primer <400> 5 cgccagaccc agcgccagac cgatctgc 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp51Ala forward primer <400> 6 tggctgctga tcgccggtga acacgcg 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp51Ala backward primer <400> 7 cgcgtgttca ccggcgatca gcagcca 27 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg79Ala forward primer <400> 8 ggttgcgccg gttgttgctc cgccggttgg 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg79Ala backward primer <400> 9 ccaaccggcg gagcaacaac cggcgcaacc 30 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val127Ala forward primer <400> 10 cgtggtgctg gttct 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val127Ala backward primer <400> 11 gataccctgc ggcgg 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu131Ala forward primer <400> 12 cgtgcgtctc gttgg 15 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu131Ala backward primer <400> 13 cgccgccgca gaaccaac 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asn138Ala forward primer <400> 14 cgttgggccg cggttccg 18 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asn138Ala backward primer <400> 15 agacgcacgc gccag 15 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro182Ala forward primer <400> 16 acggtgtttt catcggtgcg gcggacc 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro182Ala backward primer <400> 17 ggtccgccgc accgatgaaa acaccgt 27 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Ala forward primer <400> 18 gtcacctggg tcacgcgggt cacccggacg 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Ala backward primer <400> 19 cgtccgggtg acccgcgtga cccaggtgac 30 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Ser forward primer <400> 20 cacctgggtc actcgggtca cccgga 26 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Ser backward primer <400> 21 tccgggtgac ccgagtgacc caggtg 26 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Val forward primer <400> 22 tcacctgggt cacgtgggtc acccggac 28 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Val backward primer <400> 23 gtccgggtga cccacgtgac ccaggtga 28 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Glu forward primer <400> 24 tcacctgggt cacgagggtc acccggac 28 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Glu backward primer <400> 25 gtccgggtga ccctcgtgac ccaggtga 28 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Gln forward primer <400> 26 cctgggtcac cagggtcacc cggac 25 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Gln backward primer <400> 27 gtccgggtga ccctggtgac ccagg 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Arg forward primer <400> 28 gtccgggtga ccccggtgac ccagg 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro195Arg backward primer <400> 29 cctgggtcac cggggtcacc cggac 25 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Ala forward primer <400> 30 cacccggctc acccggacgt tg 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Ala backward primer <400> 31 caacgtccgg gtgagccggg tg 22 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Leu forward primer <400> 32 cctgggtcac ccgctacacc cggacgttg 29 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Leu backward primer <400> 33 caacgtccgg gtgtagcggg tgacccagg 29 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Val forward primer <400> 34 cctgggtcac ccggttcacc cggacgttg 29 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Val backward primer <400> 35 caacgtccgg gtgaaccggg tgacccagg 29 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Glu forward primer <400> 36 cctgggtcac ccggagcacc cggacgttg 29 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Glu backward primer <400> 37 caacgtccgg gtgctccggg tgacccagg 29 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Gln forward primer <400> 38 cctgggtcac ccgcagcacc cggacgttg 29 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Gln backward primer <400> 39 caacgtccgg gtgctgcggg tgacccagg 29 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Lys forward primer <400> 40 cctgggtcac ccgaagcacc cggacgttg 29 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly196Lys backward primer <400> 41 caacgtccgg gtgcttcggg tgacccagg 29 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu221Ala forward primer <400> 42 ggtatcgcgt ctgcggac 18 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu221Ala backward primer <400> 43 cgccgcttta cccgc 15 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser222Ala forward primer <400> 44 ggcgggtatc ctggctgcgg acgaacg 27 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser222Ala backward primer <400> 45 cgttcgtccg cagccaggat acccgcc 27 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ala223Gln forward primer <400> 46 agcggcgggt atcctgtctc aggacgaacg t 31 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ala223Gln backward primer <400> 47 acgttcgtcc tgagacagga tacccgccgc t 31 <210> 48 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp224Ala forward primer <400> 48 gcggccgaac gtctg 15 <210> 49 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp224Ala backward primer <400> 49 agacaggata cccgc 15 <210> 50 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu225Ala forward primer <400> 50 gcggacgcac gtctg 15 <210> 51 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu225Ala backward primer <400> 51 agacaggata cccgc 15 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg226Ala forward primer <400> 52 atcctgtctg cggacgaagc tctggcgcgt 30 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg226Ala backward primer <400> 53 acgcgccaga gcttcgtccg cagacaggat 30 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu227Ala forward primer <400> 54 tgcggacgaa cgtgcggcgc gtcactacct 30 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu227Ala backward primer <400> 55 aggtagtgac gcgccgcacg ttcgtccgca 30 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu227Val forward primer <400> 56 tgtctgcgga cgaacgtgtg gcgcgtc 27 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu227Val backward primer <400> 57 gacgcgccac acgttcgtcc gcagaca 27 <210> 58 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val243Ala forward primer <400> 58 cgttgcggtt ggtgctgaca ccaccctgc 29 <210> 59 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val243Ala backward primer <400> 59 gcagggtggt gtcagcacca accgcaacg 29 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thr246Ala forward primer <400> 60 gacaccgccc tgctg 15 <210> 61 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thr246Ala backward primer <400> 61 aacaccaacc gcaac 15 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu247Ala forward primer <400> 62 tgttgacacc accgcgctgg cgcgtgcggc 30 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu247Ala backward primer <400> 63 gccgcacgcg ccagcgcggt ggtgtcaaca 30 <210> 64 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu247Val forward primer <400> 64 gttgacacca ccgtgctggc gcgtgcgg 28 <210> 65 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu247Val backward primer <400> 65 ccgcacgcgc cagcacggtg gtgtcaac 28 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg250Ala forward primer <400> 66 ccctgctggc ggctgcggcg cgtaccctgg 30 <210> 67 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg250Ala backward primer <400> 67 ccagggtacg cgccgcagcc gccagcaggg 30 <210> 68 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trp22Ala forward primer <400> 68 gcagatcggt ctggcgctgg gtctggcg 28 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trp22Ala backward primer <400> 69 cgccagaccc agcgccagac cgatctgc 28 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp45Ala forward primer <400> 70 ggctgctgct ggccggtgaa cacgc 25 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp45Ala backward primer <400> 71 gcgtgttcac cggccagcag cagcc 25 <210> 72 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg73Ala forward primer <400> 72 ggtcagccgg ttatcgctcc ggttcagggt g 31 <210> 73 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg73Ala backward primer <400> 73 caccctgaac cggagcgata accggctgac c 31 <210> 74 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val121Ala forward primer <400> 74 gggtgttcgt ggtgctggtt ctgcgctgg 29 <210> 75 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val121Ala backward primer <400> 75 ccagcgcaga accagcacca cgaacaccc 29 <210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu125Ala forward primer <400> 76 gtgttggttc tgcggcggcg cgtgcgtctc 30 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu125Ala backward primer <400> 77 gagacgcacg cgccgccgca gaaccaacac 30 <210> 78 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asn132Ala forward primer <400> 78 gcgtgcgtct cgttgggcct ctgttgcgga atac 34 <210> 79 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asn132Ala backward primer <400> 79 gtattccgca acagaggccc aacgagacgc acgc 34 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro176Ala forward primer <400> 80 acggtgtttt catcggtgcg gcggacc 27 <210> 81 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro176Ala backward primer <400> 81 ggtccgccgc accgatgaaa acaccgt 27 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro189Ala forward primer <400> 82 caccgtggta acgcgggtca cccgg 25 <210> 83 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro189Ala backward primer <400> 83 ccgggtgacc cgcgttacca cggtg 25 <210> 84 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly190Ala forward primer <400> 84 cgtggtaacc cggctcaccc ggaagtt 27 <210> 85 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly190Ala backward primer <400> 85 aacttccggg tgagccgggt taccacg 27 <210> 86 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu215Ala forward primer <400> 86 aaagcggcgg gtatcgcgtc tgcggacgaa ac 32 <210> 87 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu215Ala backward primer <400> 87 gtttcgtccg cagacgcgat acccgccgct tt 32 <210> 88 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser216Ala forward primer <400> 88 ggcgggtatc ctggctgcgg acgaaac 27 <210> 89 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser216Ala backward primer <400> 89 gtttcgtccg cagccaggat acccgcc 27 <210> 90 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ala217Gln forward primer <400> 90 gcggcgggta tcctgtctca ggacgaaacc c 31 <210> 91 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ala217Gln backward primer <400> 91 gggtttcgtc ctgagacagg atacccgccg c 31 <210> 92 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp218Ala forward primer <400> 92 atcctgtctg cggccgaaac cctggcg 27 <210> 93 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp218Ala backward primer <400> 93 cgccagggtt tcggccgcag acaggat 27 <210> 94 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu219Ala forward primer <400> 94 tgtctgcgga cgcaaccctg gcgcg 25 <210> 95 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu219Ala backward primer <400> 95 cgcgccaggg ttgcgtccgc agaca 25 <210> 96 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu221Ala forward primer <400> 96 ctgcggacga aaccgcggcg cgtcgttacc 30 <210> 97 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu221Ala backward primer <400> 97 ggtaacgacg cgccgcggtt tcgtccgcag 30 <210> 98 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val237Ala forward primer <400> 98 cgttgcggtt ggtgctgaca cctctctgc 29 <210> 99 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val237Ala backward primer <400> 99 gcagagaggt gtcagcacca accgcaacg 29 <210> 100 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser240Ala forward primer <400> 100 ggttggtgtt gacaccgctc tgctgatgcg ttc 33 <210> 101 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser240Ala backward primer <400> 101 gaacgcatca gcagagcggt gtcaacacca acc 33 <210> 102 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu241Ala forward primer <400> 102 ggttggtgtt gacacctctg cgctgatgcg ttctct 36 <210> 103 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu241Ala backward primer <400> 103 agagaacgca tcagcgcaga ggtgtcaaca ccaacc 36 <210> 104 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu241Val forward primer <400> 104 cggttggtgt tgacacctct gtgctgatgc gt 32 <210> 105 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu241Val backward primer <400> 105 acgcatcagc acagaggtgt caacaccaac cg 32 <210> 106 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu241Gly forward primer <400> 106 ggttggtgtt gacacctctg ggctgatgcg ttctct 36 <210> 107 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu241Gly backward primer <400> 107 agagaacgca tcagcccaga ggtgtcaaca ccaacc 36 <210> 108 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg244Ala forward primer <400> 108 agagaacgca tcagcccaga ggtgtcaaca ccaacc 36 <210> 109 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg244Ala backward primer <400> 109 cagttcacgc agagaagcca tcagcagaga ggtg 34

Claims (7)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열에서 P195Q, G196A, S222A, L247V 및 R250A 중 어느 하나가 치환된 알돌라아제 변이체 또는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 V121A, V237A 및 L241A 중 어느 하나가 치환된 알돌라아제 변이체.
   
2. 삭제
3. 청구항 1의 알돌라아제 변이체 또는 서열번호 1 내지 3중 어느 하나의 알돌라아제를 포함하는 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 (2-keto-4-hydroxybutyrate) 생합성용 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 알돌라아제 변이체 또는 알돌라아제는 포름알데히드와 피루브산을 결합시키는 조성물.
   
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6. 제1항의 알돌라아제 변이체 또는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 알돌라아제를 발현하는, 포름알데히드 및 피루브산으로부터 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트 생성능을 가진 재조합 미생물.
   
7. 제6항의 재조합 미생물을 포름알데히드 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는 2-케토-4-하이드록시뷰트레이트를 생산하는 방법.
   

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