KR102403334B1 - 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법 - Google Patents
생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102403334B1 KR102403334B1 KR1020200017213A KR20200017213A KR102403334B1 KR 102403334 B1 KR102403334 B1 KR 102403334B1 KR 1020200017213 A KR1020200017213 A KR 1020200017213A KR 20200017213 A KR20200017213 A KR 20200017213A KR 102403334 B1 KR102403334 B1 KR 102403334B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- microvesicles
- biological sample
- aggregates
- vesicles
- capture filter
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 54
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 62
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 23
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 22
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 21
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- -1 molten microvesicles Substances 0.000 claims description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 11
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 10
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 8
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims description 7
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 claims description 5
- 210000002583 cell-derived microparticle Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 5
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 5
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 4
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000289 Polyquaternium Polymers 0.000 claims description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 4
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 4
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 4
- 239000011325 microbead Substances 0.000 claims description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 4
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- ISNICOKBNZOJQG-UHFFFAOYSA-O guanidinium ion Chemical compound C[NH+]=C(N(C)C)N(C)C ISNICOKBNZOJQG-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M lithium perchlorate Chemical compound [Li+].[O-]Cl(=O)(=O)=O MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229910001486 lithium perchlorate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 claims description 3
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 abstract description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 7
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 41
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 30
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102100033344 Programmed cell death 6-interacting protein Human genes 0.000 description 3
- 102100040879 Tumor susceptibility gene 101 protein Human genes 0.000 description 3
- 101710134332 Tumor susceptibility gene 101 protein Proteins 0.000 description 3
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108091070521 Homo sapiens let-7a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091070522 Homo sapiens let-7a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091070513 Homo sapiens let-7a-3 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091068993 Homo sapiens miR-142 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical class NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 101710087718 ALG-2 interacting protein X Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M Methanesulfonate Chemical compound CS([O-])(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 101710198445 Programmed cell death 6-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000000604 cryogenic transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000013554 lipid monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920002851 polycationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5023—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures with a sample being transported to, and subsequently stored in an absorbent for analysis
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D37/00—Processes of filtration
- B01D37/03—Processes of filtration using flocculating agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
- B01D21/01—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation using flocculating agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/16—Feed pretreatment
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/04—Specific process operations in the feed stream; Feed pretreatment
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/12—Addition of chemical agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
- B01D2311/2642—Aggregation, sedimentation, flocculation, precipitation or coagulation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D29/00—Filters with filtering elements stationary during filtration, e.g. pressure or suction filters, not covered by groups B01D24/00 - B01D27/00; Filtering elements therefor
- B01D29/01—Filters with filtering elements stationary during filtration, e.g. pressure or suction filters, not covered by groups B01D24/00 - B01D27/00; Filtering elements therefor with flat filtering elements
- B01D29/05—Filters with filtering elements stationary during filtration, e.g. pressure or suction filters, not covered by groups B01D24/00 - B01D27/00; Filtering elements therefor with flat filtering elements supported
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
- B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0681—Filter
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/12—Specific details about materials
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
본 발명은 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법에 관한 것으로, 상기 생물학적 샘플에 다가 양이온 물질이 첨가되어 상기 미세 소포체와 상기 다가 양이온 물질이 전기적 힘에 의해 응집한 응집체가 형성되는 단계와; 상기 응집체를 포함하는 상기 생물학적 샘플이 포획 필터를 통과하면서 상기 응집체가 상기 포획 필터에 포획되는 단계와; 상기 응집체가 포획된 상기 포획 필터에 용리 용액을 통과시켜 상기 응집체로부터 상기 미세 소포체를 분리하여 상기 미세 소포체를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 다가 양이온 물질을 이용하여 원심 분리 과정없이 미세 소포체를 추출할 수 있다.
Description
본 발명은 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 다가 양이온 물질을 이용하여 원심 분리 과정없이 미세 소포체를 추출할 수 있는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법에 관한 것이다.
생체 내의 미세 소포체(Micro vesicle)는 여러 종류의 세포들에 존재하거나 세포로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포이다. 세포 외로 분비되는 미세 소포체로는 엑소좀(Exosome), 쉐딩 미세 소포체(Shedding mior vesicle : SMVs), 세포자살성 수포(Apoptotic blebs) 등이 있다. 여기서, 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100nm의 막성 소포체이고, 쉐딩 미세 소포체는 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1000nm의 큰 막성 소포체이고, 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5000㎚의 소포체이다.
삭제
이와 같은 생체 내의 미세 소포체, 예를 들어 엑소좀은 세포에서 분비되는 수십 나노미터 크기의 소포체로서, 지질 이중층(Lipid bilayer) 또는 지질 단층(Lipid monolayer) 내부에 세포질 또는 세포에서 생성되는 단백질과 RNA가 포함되어 있는 구조이다.
엑소좀의 경우, 단백질 및 RNA의 교환을 통한 세포 간 의사소통의 수단으로, 세포 내 불필요한 물질의 배출 기능도 담당하고 있으며, 마이크로RNA(microRNA, miRNA)를 포함하고 있어 암 등의 질병 조기진단과 같은 분자 진단에 있어서 유용한 마커로 그 활용이 기대되고 있다.
그러나, 상기와 같이 생체 내 미세 소포체의 중요성 및 가치가 밝혀지고 있지만, 상술한 바와 같이, 미세 소포체는 나노미터 단위의 매우 작은 크기를 갖기 때문에 이를 추출하는데 많은 어려움이 있다.
기존의 미세 소포체를 분리하는 기술로는 초고속 원심분리(Ultracentrifugation isolation), 크기별 제외법(Size exclusion), 면역친화성 분리(Immunoaffinity isolation), 미세유체 기술(Microfluidics chip) 및 폴리머를 이용한 방법(Polymeric method) 등이 있다.
상기와 같은 기존의 방법 중 초고속 원심분리 방법은 미세 소포체를 분리하는 가장 널리 사용되고 있는 방법으로, 원리 자체가 간단할 뿐만 아니라 가장 신뢰성이 높은 방법으로 인식되고 있다.
하지만, 초고속 원심분리 방법을 이용해서 미세 소포체를 분리하는 경우, 미세 소포체의 수율이 낮을 뿐만 아니라, 미세 소포체를 분리하는데 많은 시간, 예컨대 8시간 이상의 많은 시간이 소요되는 단점이 있다.
또한, 초고속 원심분리기의 경우 10만~20만 RPM으로 회전 가능한 원심분리기를 사용하여야 하는데, 일반적인 실험실에서 사용되는 원심분리기가 5천~1만 RPM임을 가만할 때, 고가의 원심분리기를 사용하여야 하는 문제점이 있다.
크기별 제외법의 경우, 주로 초고속 원심분리 방법과 함께 사용되며, 미세 소포체의 순도를 높일 수 있는 장점이 있으나, 미세 소포체가 필터에 달라붙는 현상으로 인해 수율이 낮아질 뿐만 아니라, 초고속 원심분리 방법을 사용하여야 하므로 이에 따른 단점을 그대로 안게 된다.
면역친화성 분리 방법은 항체를 미세 소포체에 붙여서 분리하는 방법으로, 특정 미세 소포체를 매우 높은 선별성(Specificity)으로 분리 가능하지만, 일반적인 미세 소포체에 대해 범용적으로 활용 가능한 항체가 없기 때문에 추출 효율이 낮은 한계가 있다. 또한, 항체를 만드는 과정이 오래 걸리며 많은 비용이 들기 때문에 실용적인 진단에 적용하는 것은 적합하지 않다.
한편, 폴리머를 이용한 방법은 PEG(polyethylene glycol)을 샘플에 추가하여 용해도를 낮춰 줌으로써 미세 소포체를 가라앉게 만들어 주는 방법이다. 이 방법의 경우, 원심 분리기를 활용한 침전법으로 침전 효율을 높일 수 있으나, 원심 분리기를 그대로 사용하고 있다는 점에서 검사 비용이 비싸질 뿐만 아니라, EV와 같은 불순물도 함께 가라앉기에 침전물의 순도가 좋지 않아 진단을 위한 활용에 적합하지 않다.
이에, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로서, 다가 양이온 물질을 이용하여 원심 분리 과정없이 미세 소포체를 추출할 수 있는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적은 본 발명에 따라, 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법에 있어서, 상기 생물학적 샘플에 다가 양이온 물질이 첨가되어 상기 미세 소포체와 상기 다가 양이온 물질이 전기적 힘에 의해 응집한 응집체가 형성되는 단계와; 상기 응집체를 포함하는 상기 생물학적 샘플이 포획 필터를 통과하면서 상기 응집체가 상기 포획 필터에 포획되는 단계와; 상기 응집체가 포획된 상기 포획 필터에 용리 용액을 통과시켜 상기 응집체로부터 상기 미세 소포체를 분리하여 상기 미세 소포체를 추출하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수, 양수, 정액, 유(milk), 세포 배지, 조직 추출물 또는 암 조직 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 미세 소포체가 엑소좀, 아그로좀, 덱소좀, 엑토좀, 엑소베지클, 온코좀, 프로미노좀, 프로스타좀, 톨레로좀, 미세입자, 나노소포, 수포성 소포, 출아성 소포, 엑소좀-유사 소포, 매트릭스 소포, 막 소포, 탈피성 소포, 막 입자, 탈피성 미세소포, 막 수포, 에피디디모좀, 프로미니노좀, 텍소좀 또는 아키오좀 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법에 의해서 달성된다.
한편, 상기 목적은 본 발명의 다른 실시 형태에 따라, 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법에 있어서, 상기 생물학적 샘플에 다가 양이온 물질이 첨가되어 상기 미세 소포체와 상기 다가 양이온 물질이 전기적 힘에 의해 응집한 응집체가 형성되는 단계와; 상기 응집체를 포함하는 상기 생물학적 샘플이 포획 필터를 통과하면서 상기 응집체가 상기 포획 필터에 포획되는 단계와; 상기 응집체가 포획된 상기 포획 필터에 음 전하를 갖는 버퍼 용액을 통과시켜 상기 포획 필터로부터 상기 응집체를 이탈시키는 단계와; 상기 포획 필터로부터 이탈된 상기 응집체에 용리 용액을 투입하여 상기 응집체로부터 상기 미세 소포체를 분리하여 상기 미세 소포체를 추출하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수, 양수, 정액, 유(milk), 세포 배지, 조직 추출물 또는 암 조직 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 미세 소포체가 엑소좀, 아그로좀, 덱소좀, 엑토좀, 엑소베지클, 온코좀, 프로미노좀, 프로스타좀, 톨레로좀, 미세입자, 나노소포, 수포성 소포, 출아성 소포, 엑소좀-유사 소포, 매트릭스 소포, 막 소포, 탈피성 소포, 막 입자, 탈피성 미세소포, 막 수포, 에피디디모좀, 프로미니노좀, 텍소좀 또는 아키오좀 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법에 의해서 달성된다.
여기서, 상기 다가 양이온 물질은 , 폴리아르기닌, 폴리 히스티딘, 프로타민, 양이온성 덱스트란, 양이온성 덴드리머, 양이온성 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민, 폴리쿼터늄, 또는 이들의 조합일 수 있다.
또한, 상기 용리 용액은 카오트로픽 물질 또는 프로테아제(Protease)를 포함할 수 있다.
삭제
상기 카오트로픽 물질은 구아니디니움(Guanidinium) 이온을 포함하는 염, n-부탄올, 에탄올, 과염소산 리튬, 아세트산 리튬, 염화마그네슘, 페놀, 2-프로판올, 소듐 도데실 설페이트, 티오우레아, 우레아, 또는 이들의 조합일 수 있다.
또한, 상기 프로테아제(Protease)는 프로테나제 K(Proteinase K), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin) 또는 키모트립신(Chymotrypsin)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 포획 필터는 상기 응집체가 포획 가능한 사이즈의 공극이 형성될 수 있다.
여기서, 상기 포획 필터는 상기 공극이 형성된 멤브레인과, 상기 공극이 형성되도록 복수의 마이크로 비드가 3차원적으로 밀착된 비드 패킹 필터 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 포획 필터는 친수성 물질 또는 양이온 교환 수지로 마련될 수 있다.
그리고, 상기 포획 필터는 친수성 물질 또는 양이온 교환 수지로 마련되어 상기 응집체가 전기적인 힘에 의해 상기 포획 필터에 포획되며; 상기 버퍼 용액은 Ca2 +, Mg2 +, Na+, K+, NH4+ 이온 중 적어도 하나, 또는 2 이상의 조합을 포함할 수 있다.
상기와 같은 구성에 따라, 본 발명에 따르면, 다가 양이온 물질을 이용하여 원심 분리 과정없이 미세 소포체를 추출할 수 있는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법이 제공된다.
도 1은 본 발명에 따른 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법을 설명하기 위한 도면이고,
도 2 내지 도 4는 본 발명에 따른 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법의 구현 예들을 설명하기 위한 도면이고,
도 5는 본 발명에 따른 미세 소포체 추출 방법에 따라 생성된 미세 소포체 응집체 및 분리된 미세 소포체의 크기 및 형태를 나타내고;
도 6은 본 발명의 실시예 및 비교예를 통해 추출된 미세 소포체의 크기 및 형태를 나타내고;
도 7은 실시예 및 비교예에 따라 추출된 미세 소포체 내 단백질 마커 및 RNA를 측정한 결과를 나타내고;
도 8은 생물학적 샘플 내 성분에 대한 제타 포텐셜 측정 결과를 나타내고;
도 9는 다가성 양이온 물질 농도에 따른 미세 소포체 응집체 형성 결과를 나타내고;
도 10은 인큐베이션 시간 및 온도에 따른 미세 소포체 응집체 형성 결과를 나타내고;
도 11은 용리 용액 내 카오트로픽 물질 농도에 따른 미세 소포체 크기 및 수율을 나타내고;
도 12는 세척 용액 내 카오트로픽 물질 농도에 따른 단백질 불순물 및 미세 소포체 양을 나타내고;
도 13은 용리 용액 내 프로테아제 양에 따른 미세 소포체 응집체 분리 정도를 나타낸다.
도 2 내지 도 4는 본 발명에 따른 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법의 구현 예들을 설명하기 위한 도면이고,
도 5는 본 발명에 따른 미세 소포체 추출 방법에 따라 생성된 미세 소포체 응집체 및 분리된 미세 소포체의 크기 및 형태를 나타내고;
도 6은 본 발명의 실시예 및 비교예를 통해 추출된 미세 소포체의 크기 및 형태를 나타내고;
도 7은 실시예 및 비교예에 따라 추출된 미세 소포체 내 단백질 마커 및 RNA를 측정한 결과를 나타내고;
도 8은 생물학적 샘플 내 성분에 대한 제타 포텐셜 측정 결과를 나타내고;
도 9는 다가성 양이온 물질 농도에 따른 미세 소포체 응집체 형성 결과를 나타내고;
도 10은 인큐베이션 시간 및 온도에 따른 미세 소포체 응집체 형성 결과를 나타내고;
도 11은 용리 용액 내 카오트로픽 물질 농도에 따른 미세 소포체 크기 및 수율을 나타내고;
도 12는 세척 용액 내 카오트로픽 물질 농도에 따른 단백질 불순물 및 미세 소포체 양을 나타내고;
도 13은 용리 용액 내 프로테아제 양에 따른 미세 소포체 응집체 분리 정도를 나타낸다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시예들을 상세히 설명한다.
본 발명에서, 용어 “미세 소포체(microvesicle)”는 고세균(Archaea), 원핵생물(Prokarya) 또는 진핵생물(Eukarya)의 세포막으로부터 방출되는 세포외 소포체(extracellular vesicle)와 동일한 의미로 사용된다. 상기 미세 소포체는 본 발명에서 엑소좀(exosome), 아그로좀(argosomes), 덱소좀(dexosomes), 엑토좀(ectosomes), 엑소베지클(exovesicle), 온코좀(oncosome), 프로미노좀(prominosome), 프로스타좀(prostasome), 톨레로좀(tolerosome), 미세입자(microparticle), 나노소포(nanovesicle), 수포성 소포(blebbing vesicle), 출아성 소포(budding vesicle), 엑소좀-유사 소포(exosome-like vesicle), 매트릭스 소포(matrix vesicle), 막 소포(membrane vesicle), 탈피성 소포(shedding vesicle), 막 입자(membrane particle), 탈피성 미세소포(shedding microvesicle), 막 수포(membrane bleb), 에피디디모좀(epididimosome), 프로미니노좀(promininosome), 텍소좀(texosome) 또는 아키오좀(archeosome)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명에 따른 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법을 설명하기 위한 도면이고, 도 2는 본 발명에 따른 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법의 구현 예를 나타낸 도면이다.
도 1 및 도 2를 참조하여 설명하면, 본 발명에 다른 미세 소포체를 추출하는 방법은 먼저 미세 소포체(11)를 포함하는 생물학적 샘플에 다가 양이온 물질(12)을 첨가한다(S10). 본 발명에서 생물학적 샘플은 미세소포체를 포함하는 생체 시료 또는 세포 배양액, 조직 시료 등을 포함할 수 있으며, 구체적으로 동물, 식물 또는 미생물 유래 세포 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
미세 소포체(11)는 전기적으로(-) 특성을 가지므로, 다가 양이온 물질(12)이 생물학적 샘플에 첨가되는 경우, 다가 양이온 물질(12)과 미세 소포체(11)가 전기적인 힘에 의해 응집하여, 도 2의(a)에 도시된 바와 같이, 응집체(10)를 형성하게 된다(S11).
본 발명에서 다가 양이온 물질은 양이온성 폴리머(cationic polymer)를 포함한다. 구체적으로, 상기 다가 양이온 물질은 폴리 라이신(폴리-L-라이신 하이드로브로마이드 또는 폴리-L-라이신 하이드로클로라이드 등 염의 형태로 제공 가능), 폴리아르기닌, 폴리 히스티딘, 프로타민(프로타민 클로라이드 또는 프로타민 설페이트와 같은 염의 형태로 제공 가능), 양이온성 덱스트란, 양이온성 덴드리머, 양이온성 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민, 폴리쿼터늄, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 다가 양이온 물질은 폴리 라이신 염일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 다가 양이온 물질로서 분자량 150-300 kDa의 폴리-L-라이신(poly-L-lysine; PLL)을 0.02 내지 2.00 mg/mL의 농도로 사용하였다(실시예 1).
상술한 바와 같이, 미세 소포체(11)의 크기는 나노미터 단위로 미세하여 그 자체 만으로 추출하기 어려운 문제점이 있는 바, 본 발명에서는 (-) 특성의 미세 소포체(11)를 다가 양이온 물질(12)과 전기적인 힘에 의해 응집시켜 그 크기를 크게 함으로써, 포획을 용이하게 한다.
여기서, 다가 양이온 물질(12)과 미세 소포체(11)의 응집을 위한 인큐베이션 과정은 일정 시간과 일정 온도 조건 하에서 이루어진다.
일 실시양태에서, 상기 인큐베이션 과정은 0.1 내지 40℃의 온도 조건 하에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 25℃ 미만에서 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 인큐베이션 과정은 20℃ 미만, 또는 15℃ 미만, 또는 12℃ 미만, 또는 10℃ 미만에서 수행될 수 있으며, 예컨대 1 내지 8 ℃의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 인큐베이션 과정은 0.5 내지 100분 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 30분 미만 동안 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 인큐베이션 과정은 25 분 미만, 또는 20 분 미만, 또는 15 분 미만에서 수행될 수 있으며, 예컨대 5 내지 15 분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는, 상기 인큐베이션을 4℃에서 10 분 동안 수행할 경우 미세소포체 응집체가 효과적으로 형성된다는 점을 확인하였다(도 10).
여기서, 응집을 위한 인큐베이션 시간은 실험적으로 결정될 수 있으나, 종래의 면역친화성 분리(Immunoaffinity isolation) 방법에서 소요되는 시간에 대비할 때, 전기적인 힘에 의한 응집으로 그 소요 시간은 현저히 줄일 수 있다.
본 발명에서는 다가 양이온 물질(12)로 폴리 라이신 염(Poly lysine salt), 폴리 아르기닌(Poly lysine salt), 폴리 히스티딘 염(Poly histidine salt), 프로타민 클로라이드(Protamine chloride), 프로타민 설페이트(Protamine sulfate), 양전하 덱스트란(Cationic dextran), 양전하 덴드리머(Cationic dendrimer), 양전하 폴리 사카라이드(Cationic polysaccharide), 폴리 아미도아민(Poly amidoamine), 폴리 에틸렌이민(Polyethylenimine) 또는 폴리 쿼터늄(Polyquaternium) 중 어느 하나, 또는 둘 이상의 조합이 적용되는 것을 예로 한다.
상기와 같이, 생물학적 샘플 내에서 다가 양이온 물질(12)과 미세 소포체(11)가 응집하여 응집체(10)가 형성되면, 생물학적 샘플을 포획 필터(120)에 통과시키는데, 생물학적 샘플이 포획 필터(120)를 통과하면서 내부의 응집체(10)는 포획 필터(120)에 의해 포획된다(S12).
본 발명에서는 도 2의(b)에 도시된 바와 같이, 포획 필터(120)가 추출 튜브(110) 내부에 설치된 상태로 생물학적 샘플이 중력 또는 음압에 의해 포획 필터(120)를 통과하는 것을 예로 한다.
또한, 도 2에 도시된 실시예에서는 포획 필터(120)가 응집체(10)의 포획이 가능한 사이즈의 공극이 형성되는 것을 예로 한다. 이와 같은 포획 필터(120)는 공극이 형성된 멤브레인이나, 공극이 형성되도록 복수의 마이크로 비드가 3차원적으로 밀착된 비드 패킹 필터 형태로 마련되는 것을 예로 한다.
상기 포획 필터는 미세소포체 응집체가 포획 가능한 크기의 공극을 그 안에 형성할 수 있다. 상기 포획 필터 내에 형성되는 공극의 크기는 미세소포체 응집체가 빠져나가지 못하는 크기를 고려하고, 후속하는 용리 단계에서 용리액에 의하여 응집체가 풀렸을 때 흘러갈 수 있는 크기를 고려하여 결정될 수 있다. 일 실시양태에서 상기 포획 필터 내 공극의 크기는 50 nm 내지 1,000 nm의 범위일 수 있고, 구체적으로 100 nm 내지 500 nm일 수 있으며, 보다 구체적으로 150 nm 내지 300 nm일 수 있다.
상기 포획 필터는 미세소포체 응집체와 접촉하는 표면이 멤브레인, 비드, 컬럼, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 실시양태에서 상기 포획 필터는 공극이 형성된 멤브레인이나, 공극이 형성되도록 복수의 마이크로 비드가 3차원적으로 밀착된 비드 패킹 필터 형태로 마련될 수 있다.
여기서, 포획 필터(120)는 전기적 특성이(+) 특성을 갖는 응집체(10)가 보다 쉽게 포획되도록 친수성 물질이나 양이온 교환 수지로 마련될 수 있다.
상기 포획 필터가 친수성 물질로 마련될 경우, 미세소포체 응집체가 공극에 쉽게 걸려 물리적으로 포획될 수 있다. 상기 친수성 물질은 실버 메탈(silver metal), 폴리에테르설폰(polyethersulfone), 유리 파이버(glass fiber), 폴리카보네이트 트렉 에치(polycarbonate track etch; PCTE), 폴리에스터(polyester), 혼합 셀룰로오스 에스터(mixed cellulose esters; MCE), 나일론(nylon), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate) 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 포획 필터가 양이온 교환 수지로 마련될 경우, 미세소포체 응집체가 음전하로 하전된 포획 필터에 의해 전기적인 힘으로 필터 표면에 흡착된다. 상기 양이온 교환 수지는 카복시메틸(carboxymethyl), 메틸 설포네이트(methyl sulfonate), 설포닐 기(sulphonyl group), 또는 이들의 조합일 수 있다.
도 3의(b)에 도시된 실시예에서는 음전하를 갖는 양이온 교환 수지에 응집체(10)가 전기적인 힘에 의해 포획되도록 형성된 포획 필터(120a)의 예를 나타내고 있다.
즉, 본 발명에서는 응집체(10)가 공극이 형성된 포획 필터(120)에 의해 포획되는 방식 및/또는 음전하를 갖는 양이온 교환 수지에 의한 전기적인 힘에 의해 포획되는 방식이 적용된다. 이를 통해, 나노미터 단위의 미세 소포체(11)가 다가 양이온 물질(12)과 응집하여 응집체(10)를 형성하여 공극에 쉽게 걸려 포집되거나 전기적인 힘에 의해 쉽게 포집 가능하게 된다.
본 발명의 실시예에서는 약 220 nm의 공극 크기를 갖는 시린지 필터를 사용하여 미세소포체 응집체를 여과하였다(실시예 1).
상기와 같이 응집체(10)가 포획 필터(120)에 포획된 상태에서 용리 용액을 통한 미세 소포체(11)의 추출 과정이 진행된다(S13 및 S14). 여기서, 본 발명에서는 용리 용액을 통한 미세 소포체(11)의 추출 과정의 진행 전에, 세척 용액을 포획 필터(120)에 통과시켜 포획 필터(120)를 세척하는 과정을 거칠 수 있다. 이를 통해, 응집체(10) 외에 미세 소포체(11)에 포집된 EV와 같은 잔존물을 제거함으로써, 최종적으로 추출되는 미세 소포체(11)의 순도를 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 세척 용액에는 후술할 카오트로픽 물질이 포함될 수 있다. 이 경우, 세척 용액에 포함되는 카오트로픽 물질은 용리 용액에 포함되는 카오트로픽 물질보다 낮은 농도로 포함되는 것이 바람직하다. 예컨대, 용리 용액이 구아니디니움 이온을 포함하는 염을 카오트로픽 물질로 포함할 경우, 세척 용액 역시 구아니디니움 이온을 포함하는 염을 카오트로픽 물질로 포함할 수 있다. 이 경우, 세척 용액에 포함되는 카오트로픽 물질의 농도는 용리 용액에 포함되는 카오트로픽 물질의 농도보다 낮으며, 예컨대 0.1 내지 4.5 M, 0.5 내지 4 M, 1 내지 3 M의 범위일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 구아니디이움 티오시아네이트를 0 내지 2 M 농도로 포함한 세척 용액을 사용하여 포획된 미세소포체 응집체를 세척하였다(도 12).
상기 세척 용액은 불순물을 효과적으로 세척할 수 있는 적절한 염을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 염은 NH4 +, Na+, K+와 같은 1가 양이온, Ca2 +, Mg2 +와 같은 2가 양이온, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 세척 용액 내 염은 (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl, KCl, CH3COONH4, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 염은 세척 용액 내에 일정 농도 미만, 예컨대 10 mM 미만의 농도로 포함될 수 있다.
세척 과정이 완료되면, 용리 용액을 응집체(10)가 포획된 포획 필터(120)에 통과시켜(S13) 응집체(10)로부터 미세 소포체(11)를 분리하여 미세 소포체(11)를 추출한다(S14).
본 발명에서 용리 용액은 카오트로픽 물질(Chaotropic agent) 또는 프로테아제(Protease)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 카오트로픽 물질이란 수용액내 물분자의 바구니구조(cargo structure)를 불안전하게 하거나 파괴하는 물질 또는 이온을 의미한다. 수용액 내에 카오트로픽 물질의 첨가로 인해, 물의 엔트로피가 증가되고 단백질 간, 수소결합 간, 반데르발스(Van der Waals force)힘 또는 소수결합 등에 영향을 미치게 함으로서 그의 분자구조를 불안정하게 한다.
상기 카오트로픽 물질은 구아니디니움(Guanidinium) 이온을 포함하는 염, 예컨대 구아니디니움 이소티오시아네이트, 구아니디니움 티오시아네이트, 또는 구아니디니움 클로라이드, 또는 구아니딘 하이드로클로라이드; n-부탄올, 에탄올, 과염소산 리튬, 아세트산 리튬, 염화마그네슘, 페놀, 2-프로판올, 소듐 도데실 설페이트, 티오우레아, 우레아 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 본 발명의 카오트로픽 물질은 구아니디니움 티오시아네이트(GuTc)를 포함하며, 1 내지 9 M, 구체적으로 2 내지 8 M, 보다 구체적으로 3 내지 7 M, 또는 4 내지 6 M의 농도로 용리 용액에 포함될 수 있다.
상기 프로테아제는 프로테나제 K(Proteinase K), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin) 또는 키모트립신(Chymotrypsin)를 포함할 수 있다.
상기와 같은 용리 용액은 응집체(10)를 구성하는 미세 소포체(11)와 다가 양이온 간의 전기적 결합을 해제시켜 응집체(10)로부터 미세 소포체(11)를 분리함으로써, 미세 소포체(11)의 추출이 가능하게 된다. 즉, 용리 용액을 통해 응집체(10)로부터 미세 소포체(11)를 분리시킴으로써, 미세 소포체(11)를 추출하기 위한 원심리 공정을 제거함으로써, 기존의 원심 분리기를 사용하던 방법에 비해, 적은 비용과 시간으로 미세 소포체(11)의 추출이 가능하게 된다.
한편, 도 4는 본 발명에 따른 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법의 다른 구현 예를 나타낸 도면이다. 도 4에 도시된 실시예에서는, 도 4의(b)에 도시된 바와 같이, 포획 필터(120a)가 친수성 물질 또는 양이온 교환 수지로 마련되어 응집체(10)가 전기적인 힘에 의해 포획 필터(120a)에 포획되는 것을 예로 한다.
그리고, 상술한 실시예에서와 같이 포획 단계 및 세척 단계가 완료되면, 도 4의(c)에 도시된 바와 같이, 응집체(10)가 포획된 포획 필터(120a)에 음 전하를 갖는 버퍼 용액을 통과시켜 포획 필터(120a)로부터 응집체(10)를 이탈시킨다. 그리고, 포획 필터(120a)로부터 이탈된 응집체(10)에 전술한 실시예에서와 같이 용리 용액을 투입하여 응집체(10)로부터 미세 소포체(11)를 분리하여 미세 소포체(11)를 추출하게 된다. 본 발명에서는 버퍼 용액으로 Ca2 +, Mg2 +, Na+, K+, NH4+ 이온 중 적어도 하나, 또는 2 이상의 조합을 포함하는 용액이 적용되는 것을 예로 한다.
도 5 내지 도 13은 본 발명에 따른 생물학적 샘플로부터 미세 소포체(11)를 추출하는 방법의 실험 예를 설명하기 위한 도면이다. 이는, 생물학적 샘플로 혈장을 사용하고, 다가 양이온 물질(12)로 폴리-L-라이신 용액을 첨가하여 미세 소포체(11)와 다가 양이온 물질(12)이 응집하여 응집체(10)를 형성한 실험 예를 나타내며, 상세한 내용은 후술한다.
도 5는 실시예에 따라 형성된 미세 소포체(11)에 비해 응집체(10)의 크기가 상당히 증가하였음을 나타낸다.
도 6은 종래 기술로 사용되는 비교예 방법에 비해 실시예의 방법의 미세 소포체(11) 추출 수율 및 순도가 향상되었음을 나타낸다.
도 7은 실시예에 따라 추출된 미세 소포체(11)에 세포외 소포체(EV)의 바이오 마커가 잘 발현되어, 후속하는 분자진단 등의 분석에 유용하게 활용될 수 있음을 나타낸다.
도 9는 다가 양이온 물질(12)을 0, 0.10 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.50 mg/mL, 1.0 mg/mL, 5.0 mg/mL를 각각 첨가한 실험 결과, 하단에 응집체(10)가 형성되는 것을 확인할 수 있다.
도 10은 미세 소포체(11)의 응집체(10) 형성에 필요한 최적 온도 및 시간을 나타낸다.
도 13은 혈장에 폴리-L-라이신 용액이 첨가되어 응집체(10)를 형성시킨 후, 용리 용액으로 프로테나제 K(Proteinase K)를 첨가한 후 응집체(10)가 분해되어 재부유하는지 여부를 실험한 결과이다. 실험에는 폴리-L-라이신 용액이 0.25 mg/mL가 첨가되었고, 프로테나제 K(Proteinase K)가 각각 100㎕, 200㎕ 및 300㎕가 첨가된 것을 예로 실험되었으며, 도 13에 도시된 바와 같이, 응집체(10)가 분해되어 재부유되는 것을 확인하였다.
도 11의 (a)는 혈장에 폴리-L-라이신 용액이 첨가되어 응집체(10)를 형성시킨 후, 용리 용액으로 구아니디니움 티오시아나아트(Guanidinium thiocyanate) 용액을 첨가한 후 응집체(10)가 분해되어 재부유하는지 여부를 실험한 결과이다. 도 11 (a)의 좌측에서부터, 증류수, 1M, 2M, 3M, 4M의 구아니디니움 티오시아나아트(Guanidinium thiocyanate) 용액을 첨가하였는데, 농도가 높아질수록 응집체의 재부유가 향상됨을 확인할 수 있다.
도 11의 (b)는 도 11의 (a)의 재부유된 용액 내의 입자의 크기를 나노 입자 추적 분석 장비를 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 11의 (b)에 도시된 바와 같이, 농도의 증가에 따라 응집체(10)가 재부유하여 입자의 크기가 농도가 증가함에 따라 감소하는 것을 확인할 수 있다. 도 11의 (c)는 도 11의 (a)의 재부유된 용액의 농도가 구아니디니움 티오시아나아트(Guanidinium thiocyanate) 용액가 증가함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있다.
도 12는 세척 용액 내 카오트로픽 물질(GuTc) 농도에 따른 단백질 불순물 및 미세 소포체 양을 측정한 것으로, 2M 농도의 GuTc로 세척할 경우 세척 과정이 효율적으로 진행됨을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
생물학적 샘플의 준비
본 연구는 고려대학교 안암 병원의 기관생명윤리연구위원회 승인(IRB 프로젝트 No.: 2016AN0090) 및 혈액 샘플에 대한 모든 지원자의 동의서를 받은 후 진행하였다. 각 지원자의 주정중피정맥(median cubital vein)으로부터 혈액 샘플을 취하여 3 mL K2-EDTA 진공 채혈기(vacutainer)(Becton Dickinson, USA)에 수집하였다. 전혈을 1,900 g에서 10 분 동안 원심분리한 후 12,000g에서 15 분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 그 다음, 혈장을 800 nm 공극 크기의 메쉬로 여과하여 크기가 큰 잔해물을 제거하였다. 각 혈장 샘플을 1 mL씩 준비하였다.
실시예
1.
양이온성
폴리머에
의한 응집 및
카오트로픽
물질에 의한
용리를
통한
세포외
소포체 분리
준비된 혈장 샘플에 양이온성 폴리머를 첨가하여, 전하간 상호작용에 의한 세포외 소포체 및 폴리머간 응집을 유발하고, 수백 나노미터 크기의 응집체를 형성하였다. 양이온성 폴리머로는 분자량 150-300 kDa의 폴리-L-라이신(PLL, Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였다. 10 mg/mL 농도의 PLL 스톡 용액을 제조한 후, 스톡 용액을 추가로 첨가함으로써 각 혈장 샘플 내 최종 PLL 농도(0.02-2.00 mg/mL)를 조절하였다. 분리된 세포외 소포체의 수율 및 순도를 신중히 고려하여, 최종 PLL 농도를 0.5 mg/mL로 맞추었다. 혈장 및 PLL 용액의 혼합물을 4℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후, 혼합물을 220 nm의 공극 크기를 갖는 시린지 필터를 사용하여 여과하였다. 여과 이후 커다란 응집된 입자가 필터에 남겨졌다.
PLL과의 응집체로부터 세포외 소포체를 수득하기 위해, 2mL의 세척 버퍼(GuTc, 2M) 및 200 μL의 용리 버퍼(GuTc, 5M)를 동일한 메쉬에 사용하였다. 응집된 단백질에 세척 버퍼를 흐르게 하여 세척하였다. 그 다음, GuTc 용액을 사용하여 세포외 소포체를 분리하고, PLL 폴리머 및 혈장 단백질을 제거하였다.
수득된 세포외 소포체를 확인하기 위해 SEM 이미지(Quanta 250 FEG; FEI, USA)를 촬영하고 분석하였다.
비교예
1.
초원심분리에
의한
세포외
소포체 분리
초원심분리(Ultracentrifugation; UC) 방법은 세포외 소포체의 분리를 위해 전통적으로 널리 사용되어온 표준 방법이다. UC의 분리 프로토콜은 간단하지만 시간이 소모되며(6 시간 이상), 노동집약적이라는 단점이 있다. 혈장 및 PBS를 1:1 비율로 혼합하고, 혼합물을 원심분리하여 잔여 세포 성분들을 제거하였다(4℃, 12,000 g, 30 min). 상청액을 옮기고 원심분리를 동일 조건 하에서 1회 반복하였다. 상청액을 200 μm 공극 크기를 갖는 시린지 필터(Merck Millipore, USA)를 이용하여 여과한 후, 120,000 g 및 4℃에서 2 시간 동안 초원심분리하였다(CP100WX; Hitachi, Japan). 상청액을 흡입해낸 후, 바닥의 펠렛을 120,000 g 및 4℃에서 1 시간 동안 PBS로 조심스럽게 세척한 다음, 50 μL의 PBS로 재현탁하였다.
비교예
2.
세포외
소포체 침전을 유도하는 시판되는 PEG 용액에 의한
세포외
소포체 분리
세포외 소포체 분리를 위해 시판되는 대표적인 제품인 ExoQuickTM 엑소좀 침전 용액(EXOQ5A-1;System Biosciences, USA)을 사용하였다. 표준 프로토콜로서 ExoQuick 사용자 매뉴얼을 참고할 수 있다.
간략히 설명하면, 혈장 샘플을 PEG-기반 용액인 ExoQuick 용액으로 혼합한 다음, 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후, 혼합물을 1,500 g에서 30 분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 흡입해내어 펠렛을 바닥에 남겨두었다. 1,500 g에서 5 분 동안 추가로 원심분리한 후, 미량의 ExoQuick 용액을 모두 제거하였다. 그 다음, 남겨진 펠렛을 200 μL의 PBS로 재현탁하였다.
비교예
3. 시판되는 스핀
컬럼을
통한
세포외
소포체 분리 방법
또다른 세포외 소포체 분리 방법으로, 시판되는 세포외 소포체와 멤브레인 간의 전기적 상호작용을 활용한 스핀 컬럼 유형의 세포외 소포체 분리 키트인 exoEasyTM 방법을 사용하였다.
실험예
1. 미세소포체 응집체의 입자 크기 측정
실시예 1에 따른 입자 지름을 동적 광 산란법(DLS)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 세포외 소포체 응집체(600 nm)는 세포외 소포체(200 nm)보다 현저히 큰 크기를 가짐을 확인하였다. 상기 결과는 세포외 소포체가 PLL과 응집되었음을 나타낸다. 분리된 세포외 소포체 및 PLL과 응집된 세포외 소포체는 SEM을 통해서도 시각화된다. 응집된 세포외 소포체에서, 세포외 소포체는 폴리머에 완전히 둘러싸였고, 세포외 소포체 및 세포외 소포체 응집체 크기는 각각 171 nm 및 815 nm로 확인되었다(도 5).
실험예
2. 미세소포체 추출 방법에 따른 미세소포체 크기 비교
실시예 1의 방법을 적용하여 혈장으로부터 분리한 세포외 소포체의 수율, 크기 및 순도를 비교예 1, 2, 3에 따른 방법과 비교하였다. 비교예 2는 세포외 소포체에 대한 폴리머(PEG) 기반의 침전 및 분리 방법이고, 비교예 3은 세포외 소포체와 멤브레인 간의 전기적 상호작용을 활용한 스핀 컬럼 유형의 세포외 소포체 분리 키트를 이용한 방법이다. 세포외 소포체의 크기 분포를 나노입자 트래킹 분석법(nanoparticle tracking analysis; NTA)으로 측정하였고(Malvern Panalytical, USA), 형태 및 크기를 cryo-TEM(TecnaiG2-F20,FEI,USA)으로 확인하였다.
비교예 1에 의해 분리된 세포외 소포체의 경우, SEM 측정 결과 ~20-130 nm의 크기 분포를 나타낸 반면, ExoCAS에 의해 분리된 세포외 소포체의 경우, ~30-100 nm의 크기 분포를 나타내었다(도 6의 d 및 e).
또한, 실시예 1에 따라 분리된 세포외 소포체의 TEM 이미지 형태를 비교예 1로부터 분리된 세포외 소포체와 비교하였다. 그 결과, 양 방법 모두에서, 지름 100-200 nm 소포에 대한 명확한 형태가 관찰되었다(도 6의 d 및 e). 더욱이, 비교예 1과 실시예 1 방법의 TEM 이미지간의 뚜렷한 차이가 발견되지 않았다.
세포외 소포체 회복 분석에서, 비교예 2 및 실시예 1 양 방법 모두 고 수율(각각 41 × 1010/mL 및 61 × 1010/mL)을 가지는 반면, 비교예 1 및 비교예 3 방법은 비교적 낮은 수율(각각 3.8 × 1010/mL 및 9 × 1010/mL)을 가짐을 확인하였다 비교예 1 및 3과 비교하면, 실시예 1 방식은 6-17배 높은 세포외 소포체 수율을 가짐을 확인하였다(도 6의 b).
세포외 소포체 분리 성능을 가늠하는 파라미터 중에서, 후속 분석의 질을 결정하는 단백질 오염 역시 중요하다. 즉, 용리 버퍼 내에 단백질은 최소화되어야 하는 반면, 세포외 소포체는 고농도로 농축되어야 한다. BCA 단백질 어세이 방법(#23225; Thermo Scientific, USA)에 따라, 상이한 세포외 소포체 분리 방법에 따른 단백질 오염의 정도를 측정하였다. 테스트된 샘플은 각 방법에서 수득한 최종 용리액(eluent)이었다. 비교예 1, 비교예 3 및 실시예 1 방법에서 잔여 단백질의 양은 각각 232 μg/mL, 301 μg/mL, 및,041 μg/mL인 반면, 비교예 2는 상당히 높았다(33,730 μg/mL)(도 6의 a).
단백질 농도에 대한 분리된 입자의 수를 나타내는 순도 비율(purity ratio)을 UC 방법을 기준으로 살펴보면, 비교예 1이 1.0, 비교예 2가 0.1, 비교예 3이 1.8의 순도 비율을 나타낸 반면, 실시예 1은 이보다 현저히 높은 3.5의 순도비를 나타낸다(도 6의 c).
실험예
3. 단백질
마커
및 마이크로 RNA에 의한
세포외
소포체 분리 성능 비교
웨스턴 블롯팅으로 세 가지 상이한 방법(실시예 1, 비교예 1, 비교예 3)으로부터 분리된 세포외 소포체의 단백질 마커를 측정하였다. 엑소좀은 Alix (ALG-2-interacting protein X), TSG101 (tumor susceptibility gene 101 protein), HSP70 (heat shock protein), and the tetraspanins CD63, CD81, 및 CD9와 같은 단백질 마커를 함유한다는 것이 알려져있다. 본 발명자들은, 4 가지 기준 단백질 마커(ALIX, TSG101: inner protein markers; CD9, and CD81: surface protein markers)를 사용하여 분리된 세포외 소포체의 특성을 분석하였다(도 7의 a).
웨스턴 블롯팅 과정을 간략히 설명하면, 먼저 단백질 샘플을 SDS-PAGE Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gel (456-1035; Bio-rad, USA)를 이용한 겔 전기영동으로 분리하고, 토끼 폴리클론 항체(1:2,000 희석) 항-CD9 (ab92726), 항-CD81 (ab109201), 항-ALIX (ab186429), 항-TSG101 (ab125011), 및 염소 항-토끼 IgG H&L (HRP) (ab205718) (Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 면역블롯팅하였다. 단백질 밴드를 강화 화학발광(enhanced chemiluminescence; ECL) 용액 및 ChemiDoc™ XRS + System (Bio-Rad, USA)을 이용하여 단백질 밴드를 분석하였다.
상기 마커에 대한 웨스턴 블롯팅 결과, 단백질 밴드의 세기로부터 단백질 마커의 전체 수준을 측정할 수 있다(도 7의 b 및 c). 엑소좀 단백질 마커의 수준과 관련하여, 실시예 1 > 비교예 3 > 비교예 1 순으로 엑소좀 단백질 마커의 수준이 높게 나타났다.
RNA 추출 및 정량 과정을 간략히 설명하면, seraMir Exosome RNA 정제 키트(RA806A-1, SBI, USA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 모든 분리 과정은 제조자 프로토콜에 의거하여 수행하였다. EV miRNA 마커를 정량하기 위해, TaqMan MicroRNA RT 키트 (4366596, Life Technologies, USA) 및 TaqMan Micro RNA 어세이 (4427975, Life Technologies, USA)를 사용하여 RNA 용출물에 대한 역전사를 수행하였다. 이 과정에 TaqMan Universal Master Mix Ⅱ, no UNG (4440040, Life Technologies, USA)와 miRNA assays hsa-let-7a-5p, ID 000377, 및 hsa-miR-142-3p, ID 000464를 사용하였다. RNA 용출물에 대해 Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, USA) 상에서 Agilent Eukaryote Total RNA Pico chip를 이용하여 추가 실험을 수행하였다.
총 RNA를 추출하여 그 양을 비교한 결과, 실시예 1 > 비교예 3 > 비교예 1 > 비교예 2 순으로 RNA 양이 높게 나타났다(도 7의 d).
상기 결과는 PLL 응집화 방법이 다른 세포외 소포체 분리 방법에 비해 보다 풍부한 RNA를 함유한다는 것을 나타낸다. 또한, 공지된 세포외 소포체의 miRNA 마커인 hsa-let-7a-5p and hsa-miR-142-3p를 사용한 RT-qPCR 실험 결과, PLL 응집 방법은 UC와 비교하여 유사한 Ct 수치를 나타냈다(도 7의 e).
실험예
4.
양이온성
폴리머로부터
유도된
세포외
소포체 응집체 형성
세포외 소포체 및 폴리양이온성 폴리머의 제타 포텐셜의 분석법을 간략히 설명하면, 비교예 1에 따라 분리된 세포외 소포체, PLL 용액(10 mg/mL), 및 PLL과 소포외 소포체 응집체에 대한 제타 포센셜을 제타 포텐셜 분석기(Zetasizer Pro; Malvern Panalytical; UK)를 이용하여 측정하였다. 응집체는 탈이온수로 재현탁하기 어렵기 때문에 1 mL의 혈장으로부터 응집된 펠렛(PLL 0.5 mg/mL)을 먼저 10 μL의 GuTc 용액(10 M)에 재현탁한 다음, 990μL의 탈이온수를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 볼텍스 믹서를 이용하여 5 분 동안 조심스럽게 분산시켰다.
그 결과를 도 8의 a에 나타나내었다.
세포외 소포체는 -19.7 mV의 음 전하를 나타내는 반면, PLL 용액 (10 mg/mL)은 42.4 mV의 강한 양전하 제타 포텐셜을 나타낸다. 세포외 소포체를 PLL 폴리머와 결합할 경우, 세포외 소포체-PLL 응집체의 제타 포텐셜은 -5.6 mV로 중화되었다. 상기 결과는 세포외 소포체의 음 전하와 PLL 폴리머의 양전하 간의 강한 정전기적 상호작용을 나타낸다. 알부민은 약한 음 전하를 나타내는 반면, η-글로불린은 약학 양 전하를 나타냈다. 한편, 피브리노겐은 세포외 소포체와 유사한 -18.7 mV의 음 전하를 나타내어, 양이온성 PLL과 강하게 상호작용할 수 있음을 보여준다(도 8의 a, b 및 도 9).
혈장 단백질 및 PLL의 제타 포텐셜을 이해한 후, 본 발명자들은 PLL 용액을 첨가함으로써 세포외 소포체-결핍된 혈장의 응집체 형성 가능성을 조사하였다(도 8의 d). 세포외 소포체가 없음에도 불구하고, 대조군 혈장과 비교하여 비교적 약한 응집체 형성이 발견되었다. 따라서, 본 발명자들은 혈청(피브리노겐이 배제됨) 및 PLL에 의해 세포외 소포체-결핍된 혈청에 대한 응집체 형성을 추가로 조사하였다(도 8의 e 및 f). 놀랍게도, 뚜렷한 응집체 형성이 나타나지 않았다. 상기 결과는 혈장 단백질 및 PLL이 전기적 상호작용에 의해 응집되고, 피브리노겐이 PLL과 응집하는 주요 단백질임을 보여준다.
그 다음, 세포외 소포체-PLL 응집체 형성에 대한 인큐베이션 온도의 영향을 조사하였다. 혈장-PLL 폴리머 혼합물을 4℃ 및 25℃에서 10 분 동안 각각 인큐베이션 한 다음 원심분리하였다. 세포외 소포체 응집은 25℃보다 4℃에서 훨씬 더 효율적이었다(도 10)
PLL 농도가 증가할수록, 펠렛 크기 및 형태 역시 증가하였고, 펠렛은 보다 선명해졌다(도 8의 b 및 도 9).
실험예
5. 응집체로부터
세포외
소포체의
재현탁
세포외 소포체 응집체를 혈장에 PLL 용액을 단순히 첨가함으로써 성공적으로 획득하였다. 후속 적용을 위한 세포외 소포체의 분리를 위해, 적절한 버퍼 내 세포외 소포체 응집체의 재현탁이 필요하였다. 그러나, 강력히 응집된 폴리머와 세포외 소포체는 탈이온수 또는 PBS 용액에 현탁될 수 없었다(도 11의 a). 따라서, PLL 및 세포외 소포체 침전물의 용해를 위해 카오트로픽 물질(GuTc)을 사용하였다. 다양한 농도의 GuTc 용액(0-4 M)에 따른 세포외 소포체-PLL 응집체의 용해 능력을 측정하였다(도 11의 a).
GuTc 농도별로 분리된 세포외 소포체의 크기 및 입자 농도를 NTA를 이용하여 분석하였다(도 11의 b 및 c). GuTc 용액의 농도가 증가할수록, 세포외 소포체의 크기는 점진적으로 감소하였다. 저농도의 GuTc(1M, 2M)에서, 보다 큰 입자가 관측되었다(~300 nm). 1M GuTc에서 세포외 소포체 농도는 0.03×1010로 매우 낮았다. 반면, 고농도의 GuTc(4M)에서, 입자 크기는 피크 값이 102 nm으로 상당히 감소하여, 응집체로부터 완전히 용해되었다고 생각된다. 혈장 내 고정된 PLL 농도(0.2 mg/mL)에서, 4 M의 GuTc 용액은 응집체를 용해하는 농도들 중 최고의 효과를 나타냈다. 최적화된 GuTc 버퍼는 1 분 내에 세포외 소포체 응집체 펠렛을 성공적으로 용해시켰다.
세척 용액 내 카오트로픽 물질(GuTc) 농도에 따른 단백질 불순물 및 미세 소포체 양을 측정한 결과, 2M의 GuTc로 세척할 경우 세척 과정의 순도(입자/단백질 농도)가 가장 높음을 확인하였다(도 12).
상기 세포외 소포체 응집체 펠렛의 용해는 용리 용액으로 프로테아제 K를 사용하였을 경우에도 관찰되었다(도 13).
비록 본 발명의 몇몇 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그 균등물에 의해 정해질 것이다.
10 : 응집체 11 : 미세 소포체
12 : 다가 양이온 물질 110 : 추출 튜브
120, 120a : 포획 필터
12 : 다가 양이온 물질 110 : 추출 튜브
120, 120a : 포획 필터
Claims (11)
- 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법에 있어서,
상기 생물학적 샘플에 다가 양이온 물질이 첨가되어 상기 미세 소포체와 상기 다가 양이온 물질이 전기적 힘에 의해 응집한 응집체가 형성되는 단계와;
상기 응집체를 포함하는 상기 생물학적 샘플이 포획 필터를 통과하면서 상기 응집체가 상기 포획 필터에 포획되는 단계와;
상기 응집체가 포획된 상기 포획 필터에 용리 용액을 통과시켜 상기 응집체로부터 상기 미세 소포체를 분리하여 상기 미세 소포체를 추출하는 단계를 포함하고,
상기 생물학적 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수, 양수, 정액, 유(milk), 세포 배지, 조직 추출물 또는 암 조직 중 어느 하나 이상을 포함하고,
상기 미세 소포체가 엑소좀, 아그로좀, 덱소좀, 엑토좀, 엑소베지클, 온코좀, 프로미노좀, 프로스타좀, 톨레로좀, 미세입자, 나노소포, 수포성 소포, 출아성 소포, 엑소좀-유사 소포, 매트릭스 소포, 막 소포, 탈피성 소포, 막 입자, 탈피성 미세소포, 막 수포, 에피디디모좀, 프로미니노좀, 텍소좀 또는 아키오좀 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법. - 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법에 있어서,
상기 생물학적 샘플에 다가 양이온 물질이 첨가되어 상기 미세 소포체와 상기 다가 양이온 물질이 전기적 힘에 의해 응집한 응집체가 형성되는 단계와;
상기 응집체를 포함하는 상기 생물학적 샘플이 포획 필터를 통과하면서 상기 응집체가 상기 포획 필터에 포획되는 단계와;
상기 응집체가 포획된 상기 포획 필터에 음 전하를 갖는 버퍼 용액을 통과시켜 상기 포획 필터로부터 상기 응집체를 이탈시키는 단계와;
상기 포획 필터로부터 이탈된 상기 응집체에 용리 용액을 투입하여 상기 응집체로부터 상기 미세 소포체를 분리하여 상기 미세 소포체를 추출하는 단계를 포함하고,
상기 생물학적 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수, 양수, 정액, 유(milk), 세포 배지, 조직 추출물 또는 암 조직 중 어느 하나 이상을 포함하고,
상기 미세 소포체가 엑소좀, 아그로좀, 덱소좀, 엑토좀, 엑소베지클, 온코좀, 프로미노좀, 프로스타좀, 톨레로좀, 미세입자, 나노소포, 수포성 소포, 출아성 소포, 엑소좀-유사 소포, 매트릭스 소포, 막 소포, 탈피성 소포, 막 입자, 탈피성 미세소포, 막 수포, 에피디디모좀, 프로미니노좀, 텍소좀 또는 아키오좀 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
다가 양이온 물질이 폴리 라이신, 폴리아르기닌, 폴리 히스티딘, 프로타민, 양이온성 덱스트란, 양이온성 덴드리머, 양이온성 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민, 폴리쿼터늄, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 용리 용액은 카오트로픽 물질 또는 프로테아제(Protease)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법. - 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 카오트로픽 물질은 구아니디니움(Guanidinium) 이온을 포함하는 염, n-부탄올, 에탄올, 과염소산 리튬, 아세트산 리튬, 염화마그네슘, 페놀, 2-프로판올, 소듐 도데실 설페이트, 티오우레아, 우레아, 또는 이들의 조합인 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 프로테아제(Protease)는 프로테나제 K(Proteinase K), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin) 또는 키모트립신(Chymotrypsin)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 포획 필터는 상기 응집체가 포획 가능한 사이즈의 공극이 형성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 포획 필터는
상기 공극이 형성된 멤브레인과,
상기 공극이 형성되도록 복수의 마이크로 비드가 3차원적으로 밀착된 비드 패킹 필터 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 포획 필터는 친수성 물질 또는 양이온 교환 수지로 마련되는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법. - 제2항에 있어서,
상기 포획 필터는 친수성 물질 또는 양이온 교환 수지로 마련되어 상기 응집체가 전기적인 힘에 의해 상기 포획 필터에 포획되며;
상기 버퍼 용액은 Ca2 +, Mg2 +, Na+, K+, NH4+ 이온 중 적어도 하나, 또는 2 이상의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17/430,429 US20220111318A1 (en) | 2019-02-14 | 2020-02-12 | Method for extracting microvesicles from biological sample |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20190017053 | 2019-02-14 | ||
| KR1020190017053 | 2019-02-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200099489A KR20200099489A (ko) | 2020-08-24 |
| KR102403334B1 true KR102403334B1 (ko) | 2022-06-02 |
Family
ID=72045018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200017213A KR102403334B1 (ko) | 2019-02-14 | 2020-02-12 | 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220111318A1 (ko) |
| EP (1) | EP3925703A4 (ko) |
| KR (1) | KR102403334B1 (ko) |
| CN (1) | CN113631240B (ko) |
| WO (1) | WO2020166978A2 (ko) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022145980A1 (ko) * | 2020-12-29 | 2022-07-07 | 주식회사 한국유니온 생명과학 | 고효율 및 고순도의 엑소좀 분리방법 |
| CN113462520A (zh) * | 2021-07-26 | 2021-10-01 | 百奥芯(苏州)生物科技有限公司 | 一种循环肿瘤外泌体富集芯片及其应用 |
| JP7160294B1 (ja) * | 2022-03-31 | 2022-10-25 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | 脂質二重膜に覆われた微粒子又は細胞外小胞の回収方法および脂質二重膜に覆われた微粒子又は細胞外小胞を回収するための回収キット |
| CN115074301A (zh) * | 2022-08-22 | 2022-09-20 | 博奥生物集团有限公司 | 利用ε-聚赖氨酸富集细菌细胞外囊泡的方法 |
| CN116773500B (zh) * | 2023-06-26 | 2024-02-23 | 四川大学 | 一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005531304A (ja) * | 2002-05-31 | 2005-10-20 | ディーエヌエー・リサーチ・イノヴェイションズ・リミテッド | 細胞分離のための方法、組成物およびキット |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2645739A1 (en) * | 2006-03-20 | 2007-09-27 | Medarex, Inc. | Protein purification |
| KR101233636B1 (ko) * | 2010-10-20 | 2013-02-15 | 아주대학교산학협력단 | 혈색소 측정용 혈액 성분 분리 장치 및 분리 방법 |
| CN106434871B (zh) * | 2011-05-17 | 2020-08-18 | 德克斯特里蒂诊断公司 | 用于检测目标核酸的方法与组合物 |
| US10968443B2 (en) * | 2014-12-31 | 2021-04-06 | The Rockefeller University | Method of RNA isolation from clinical samples |
| KR101761680B1 (ko) * | 2015-03-31 | 2017-08-23 | 포항공과대학교 산학협력단 | 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 분리방법 |
| KR101726286B1 (ko) * | 2015-08-11 | 2017-04-12 | 한국과학기술연구원 | 세포외 소포체 포집 장치 및 그 사용 방법 |
| JP2019518428A (ja) * | 2016-04-12 | 2019-07-04 | ユニシテ エーファウ アクチェンゲゼルシャフト | 体液試料からの細胞外小胞（ｅｖ）の単離 |
| KR101951549B1 (ko) * | 2017-04-21 | 2019-02-22 | 고려대학교 산학협력단 | 미세 소포체의 분리 장치 및 방법 |
| KR102107844B1 (ko) * | 2017-07-26 | 2020-05-07 | ㈜로제타엑소좀 | 양이온을 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법 |
-
2020
- 2020-02-12 CN CN202080024409.0A patent/CN113631240B/zh active Active
- 2020-02-12 WO PCT/KR2020/001987 patent/WO2020166978A2/ko unknown
- 2020-02-12 US US17/430,429 patent/US20220111318A1/en active Pending
- 2020-02-12 EP EP20754903.1A patent/EP3925703A4/en active Pending
- 2020-02-12 KR KR1020200017213A patent/KR102403334B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005531304A (ja) * | 2002-05-31 | 2005-10-20 | ディーエヌエー・リサーチ・イノヴェイションズ・リミテッド | 細胞分離のための方法、組成物およびキット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020166978A9 (ko) | 2021-05-27 |
| WO2020166978A2 (ko) | 2020-08-20 |
| KR20200099489A (ko) | 2020-08-24 |
| EP3925703A4 (en) | 2022-11-30 |
| WO2020166978A3 (ko) | 2021-04-22 |
| CN113631240B (zh) | 2023-08-08 |
| US20220111318A1 (en) | 2022-04-14 |
| CN113631240A (zh) | 2021-11-09 |
| EP3925703A2 (en) | 2021-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102403334B1 (ko) | 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 추출하는 방법 | |
| Cai et al. | Immuno-modified superparamagnetic nanoparticles via host–guest interactions for high-purity capture and mild release of exosomes | |
| Konoshenko et al. | Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends | |
| EP3443112B1 (en) | Isolation of extracellular vesicles (evs) from biological fluid samples | |
| KR101761680B1 (ko) | 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 분리방법 | |
| Hou et al. | Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples | |
| US11479765B2 (en) | Method of isolating exosomes using encapsulation and aqueous micellar system | |
| US10669535B2 (en) | Methods for the isolation of extracellular vesicles and other bioparticles from urine and other biofluids | |
| CN111670067B (zh) | 用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法 | |
| US20190040093A1 (en) | Bioparticle isolation and therapeutic application thereof | |
| Ströhle et al. | Affinity-based isolation of extracellular vesicles and the effects on downstream molecular analysis | |
| KR20210131905A (ko) | 미세소포체 분리방법 및 미세소포체 분리장치 | |
| Wani et al. | Exosomes harnessed as nanocarriers for cancer therapy-current status and potential for future clinical applications | |
| EP4141107A1 (en) | Microvesicle isolation method and microvesicle isolation device | |
| WO2011063324A2 (en) | Microfluidic systems for isolating microvesicles | |
| Wang et al. | Isolation and usage of exosomes in central nervous system diseases | |
| Maggio et al. | Current methods for the isolation of urinary extracellular vesicles | |
| EP4273229A1 (en) | Method for isolating exosomes with high efficiency and high purity | |
| Jang et al. | Engineering of Cell Derived-Nanovesicle as an Alternative to Exosome Therapy | |
| CN116948947A (zh) | 一种外泌体的分离纯化方法 | |
| Ciftci-Dede et al. | Comparative analysis of magnetically activated cell sorting and ultracentrifugation for exosome isolation from human mesenchymal stem cell culture supernatant | |
| CA3097782A1 (en) | Isolation of extracellular vesicles by precipitation or immobilization using polyethylenimine and polyethylenimine-coated solid supports | |
| EA045221B1 (ru) | Неподвижная фаза для выделения внеклеточных везикул, способ и набор для ее получения и ее применение |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |