KR102398990B1

KR102398990B1 - Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킨 비뇨생식기질환 동물모델 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102398990B1
Application number: KR1020200026711A
Authority: KR
Inventors: 박재학; 이지민
Original assignee: 서울대학교 산학협력단
Priority date: 2020-03-03
Filing date: 2020-03-03
Publication date: 2022-05-16
Also published as: KR20210111589A

Abstract

본 발명은 Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킨 비뇨생식기질환 동물모델 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 비특이적 돌연변이 효율이 낮은 TALEN을 사용하고 랫트 수정란 조작을 통해 Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킴으로써 원하는 표현형을 가진 비뇨생식기질환 형질전환 동물모델의 안정적인 생산이 가능함을 확인하였다. 상기 형질전환 동물모델은 전립선암, 유방암을 비롯한 비뇨생식기질환의 진단, 예후 및 전이에 대한 정보제공, 비뇨생식기질환 후보 약물의 스크리닝 등 다양한 비뇨생식기질환 연구에 응용이 가능하여 산업적으로 높은 활용 가치를 가질 것으로 기대된다.

Description

Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킨 비뇨생식기질환 동물모델 및 이의 용도{Nkx3.1 gene knock-out genitourinary disease animal model and use thereof}

본 발명은 Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킨 비뇨생식기질환 동물모델 및 이의 용도에 관한 것이다.

전립선질환 중 가장 많이 발생하는 것은 전립선비대증, 전립선암 및 전립선염이다. 노령화사회로 진행되어감에 따라 전립선비대증 질환은 점차 증가하는 추세이며, 전립선염은 다양한 형태를 가진 복합적인 전립선 질환을 통칭하고 50세 이하 남성에서 가장 빈번하게 발생하는 전립선질환으로 우리나라에서는 비뇨기과를 이용하는 환자의 15~20% 정도가 전립선염 때문인 것으로 알려져 있다. 전립선암(Prostate cancer, PC)의 경우, 2011년 미국 국립암연구소(National Cancer Institute)에서 발표한 국제적 통계에 따르면 남성 암들 중 두번째 호발하는 암이며, 생존기간 동안 15.3%의 남성들이 전립선암에 걸린다고 보고하였다. 한국의 경우도, 2012년 국립암센터 통계(National Cancer Center, NCC)에 따르면 전립선암은 한국인의 10대 주요암 중 7번째를 차지하고 있으며 남성 암들 중에는 5번째로 흔하게 발생하는 암으로 보고하였다. 또한 매년 약 9천명정도의 한국남성들이 새롭게 전립선암으로 진단받고 약 1400명이 전립선암으로 사망한다.

유방암은 서구적인 식생활과 생활습관의 확산으로 한국에서 심각한 여성건강 이슈로 부상하고 있으며, 우리나라 여성암중 발병율 1위를 차지하고 있고, 우리나라의 경우 전체 유방암 환자 중 50세 이하 여성이 63.6%를 차지하고, 호발연령도 서구사회에 비해 10-15년 정도 낮은 젊은 연령층에서 발생한다.

형질전환 동물(transgenic animals)은 인위적으로 외부의 유전자를 삽입하거나 또는 유전자를 제거하여 의도하는 유전형질을 발현시킨 동물을 말하며, 생명체에서의 특정 유전자의 역할을 파악하는 기초연구에 유용하게 쓰일 수 있다. 특히, 형질전환 랫트는 생쥐(mouse)보다 10배 가량 크기가 크기 때문에 유전적 특성은 물론 샘플 크기 등의 생리적 특성이 사람과 유사하다는 장점이 있다. 이와 같은 형질전환 랫트는 비뇨생식기질환 관련 타겟 유전자를 결실시켜 상기 유전자가 매개하는 생리적 기능을 유추하고, 질병의 진단이나 진행과정 등을 파악하거나, 후보약물의 효과나 부작용 연구에 대한 좋은 모델동물로 사용될 수 있어 비뇨생식기질환 모델로서의 개발이 필요하다.

한편, ZFN(Zinc Finger Nuclease, 징크핑거), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease, 탈렌), CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9, 크리스퍼)을 포함하는 유전자가위 기술(gene scissors 또는 genome editing)은 높은 효율과 낮은 가격으로 형질전환 동물의 생산을 가능하게 하여, 다양한 동물에 광범위하게 적용되고 있다.

이에, 본 발명자들은 타겟 유전자로 Nkx3.1을 선정하고, 비특이적 돌연변이 효율이 낮은 TALEN을 이용하여 랫트 수정란 조작을 통해 Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킴으로써, Nkx3.1 -/-의 비뇨생식기질환 형질전환 랫트를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 Nkx3.1 유전자 넉아웃(knock-out)용 TALEN mRNA를 수정란에 도입하는 단계; 상기 수정란을 대리모의 난관에 이식하는 단계; 를 포함하는 비뇨생식기질환 동물모델의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 제조방법으로 제조된 Nkx3.1 유전자가 넉아웃(knock-out)된 비뇨생식기질환 동물모델을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 비뇨생식기질환 동물모델에 후보약물을 처리하는 단계; 및 상기 후보약물이 처리된 동물모델을 무처리된 대조군과 비교하여 증상 완화여부를 판단하는 단계;를 포함하는 비뇨생식기질환 관련 약물 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Nkx3.1 유전자 넉아웃(knock-out)용 TALEN mRNA를 수정란에 도입하는 단계; 상기 수정란을 대리모의 난관에 이식하는 단계; 를 포함하는 비뇨생식기질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 Nkx3.1 유전자가 넉아웃(knock-out)된 비뇨생식기질환 동물모델을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 비뇨생식기질환 동물모델에 후보약물을 처리하는 단계; 및 상기 후보약물이 처리된 동물모델을 무처리된 대조군과 비교하여 증상 완화여부를 판단하는 단계;를 포함하는 비뇨생식기질환 관련 약물 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서는 비특이적 돌연변이 효율이 낮은 TALEN을 사용하고 랫트 수정란 조작을 통해 Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킴으로써 원하는 표현형을 가진 비뇨생식기질환 형질전환 동물모델의 안정적인 생산이 가능함을 확인하였다. 상기 형질전환 동물모델은 전립선암, 유방암을 비롯한 비뇨생식기질환의 진단, 예후 및 전이에 대한 정보제공, 비뇨생식기질환 후보 약물의 스크리닝 등 다양한 비뇨생식기질환 연구에 응용이 가능하여 산업적으로 높은 활용 가치를 가질 것으로 기대된다.

도 1은 Nkx3.1 염기서열 내 TALEN의 인식부위를 나타낸 도이다.
도 2는 순서대로 TALEN 플라스미드, 선형화된 TALEN 플라스미드 및 TALEN mRNA의 PCR 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 랫트에서의 수정란 이식 과정을 나타낸 도이다. 순서대로 난관 노출, 이식용 미세유리관(microcapillary) 삽입, 수정란 주입 및 수술 후 회복 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 F0의 Nkx3.1 유전자에 대한 T7E1 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 F0의 Nkx3.1 유전자 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 F0의 Nkx3.1 단백질 아미노산 서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 F1의 Nkx3.1 유전자형 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 F2의 유전자형 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 F0의 Nkx3.1-/+(회색) 또는 Nkx3.1-/-(검은색) 개체를 12개월에 각각 부검하여 전립선 조직의 표현형 확인 및 무게 측정을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 대조군으로는 야생형(흰색)의 전립선 조직을 관찰하였다.
도 10은 F2의 Nkx3.1-/+(회색) 또는 Nkx3.1-/-(검은색) 개체를 15주(D), 20주(C), 5주(B), 30주(A)에 각각 부검하여 전립선 조직의 표현형 확인 및 무게 측정을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 대조군으로는 야생형(흰색)의 전립선 조직을 관찰하였다.
도 11은 10주, 15주, 20주령 F2 Nkx3.1-/- 개체의 정액량 측정 결과(A), 임신율을 태어난 산자수로 환산(B) 및 질에서 탈락된 질전(vaginal plug) 확인 결과(C)를 나타낸 도이다.
도 12는 F2의 kx3.1-/+ 또는 Nkx3.1-/- 개체를 15주(A), 20주(B), 25주(C), 30주(D)에 각각 부검하여 전립선상피세포층 비율을 확인한 결과이다.
도 13 내지 도 18은 F2의 kx3.1-/+ 또는 Nkx3.1-/- 개체에서 분리한 전립선 조직에서 종양원성 유전자인 AR(Androgen receptor)(도 13), P53(도 14), PTEN(도 15), Akt(도 16), PI3K(도 17) 및 E-cadherin(도 18)의 발현 분석 결과를 각각 나타낸 도이다.
도 19은 Nkx3.1 -/- 12개월령 암컷 랫트(A) 및 F2 Nkx3.1 -/+ 20주령 암컷 랫트(B)의 유선을 육안으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 20는 F2 Nkx3.1 -/+ 20주령 암컷 랫트 유선의 조직병리학적 분석 결과(H&E 염색 결과)를 나타낸 도이다.
도 21은 Nkx3.1-/- 30주령 랫트 유선 조직에서 종양원성 유전자 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Nkx3.1 유전자 넉아웃(knock-out)용 TALEN mRNA를 수정란에 도입하는 단계; 상기 수정란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는 비뇨생식기질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, “Nkx3.1 유전자(Homeobox protein Nkx-3.1, 서열번호 23)”는 NKX3-1, NKX3, BAPX2 또는 NKX3A로도 불리며, 염색체 8번에 위치하는 안드로겐에 의해 조절되고, 전립선 특이적인 호메오박스(homeobox) 유전자이다. 본 발명자들은 기존 전립선암 진단에 사용되는 PSA(prostate specific antigen)와 비교하여 비전이성 암에서는 유사한 민감도, 전이성 암에서는 더 뛰어난 민감도를 보이고 전립선암 지표 유전자들 중에서 전립선 특이적 발현이 뛰어난 Nkx3.1을 타겟 유전자로 선정하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 본 발명의 타겟 유전자인 Nkx3.1은 전립선, 유선 특이적 발현 양상을 보이므로, 돌연변이에 의한 표현형이 비뇨생식기질환 특이적인 돌연변이를 유도할 수 있어 비뇨생식기질환 동물모델 생산에 있어서 타겟 유전자로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 TALEN은 Nkx3.1 유전자의 특정 서열에 결합하여 절단하는 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 용어, "TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)"은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인을 서로 융합하여 제조한 인공의 제한효소를 의미한다. 본 발명에서 상기 TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인이 링커를 통하여 연결된 형태도 포함한다. 여기서, TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 어떠한 원하는 DNA 서열에도 빠르게 결합하도록 엔지니어링된 것으로, 이를 DNA 절단 도메인과 결합시키는 경우 원하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하여 원하는 DNA 부위를 절단하는 효과를 가져온다. 본 발명에 사용되는 TALEN은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들어 Addgene, 툴젠 등과 같은 TALEN 공급업체에 의해 제작될 수 있다.

본 발명자들은 TALEN은 CRISPR 보다는 원하지 않는 부분에 교정이 일어나는 오프-타겟 효과(off-target effect)가 낮아, 특이적인 돌연변이를 보다 효율적으로 유도할 수 있으며 원하는 표현형을 나타내는 형질전환 동물의 안정적인 생산이 가능할 것으로 보고, 형질전환 동물모델 생산에 TALEN 방법을 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 TALEN은 Nkx3.1 유전자 내의 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 결합하는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 TALEN은 Nkx3.1 유전자 내의 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열에 결합하는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서는, (1) 서열번호 7의 염기서열을 갖는 TAL 이펙터 결합 도메인을 포함하는 제1 TALEN, 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하는 제2 TALEN으로 구성되는 TAL-A, (2) 서열번호 9의 염기서열을 갖는 TAL 이펙터 결합 도메인을 포함하는 제1 TALEN, 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하는 제2 TALEN으로 구성되는 TAL-B를 사용하여 실험을 수행하였다. 상기 TAL-A 및 TAL-B는 Nkx3.1 유전자를 타겟팅하며, 바람직하게는 Nkx3.1 유전자의 엑손 1을 특이적으로 절단하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 TALEN은 TAL 도메인이 Nkx3.1 유전자의 특정 염기서열을 특이적으로 인식하고, 상기 TAL 도메인과 펩티드 결합으로 연결된 뉴클레오티드 절단 도메인에 의해 Nkx3.1 유전자에 절단이 발생한다. 이 때, 상기 "서열"이란 그 길이와 관계없이 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 이는 직선형, 원형 또는 가지형의 DNA 또는 RNA가 될 수도 있고, 단일 나선형이거나 이중 나선형일 수 있다.

상기 Nkx3.1 유전자 넉아웃(knock-out)용 재조합 발현 벡터가 세포 내로 도입되어 이로부터 TALEN 융합단백질이 발현되면 Nkx3.1 유전자 상의 원하는 부분에 이중 가닥 손상을 유도할 수 있으며, Nkx3.1 유전자 상에 이중 가닥 손상이 발생하면 세포는 자체적으로 가지고 있는 수리 기작을 이용하여 손상된 부위를 고치게 된다. 이때, 세포는 비상동 말단 결합(non-homologous end joining, NHEJ) 방식으로 손상된 부위를 고치게 되고, 끊어진 DNA 가닥 말단에서 삽입(insertion)이나 결실(deletion)이 일어나는 오류가 발생하기 쉬운(error-prone) 방향으로 수리가 진행된다. 따라서 Nkx3.1 유전자에 돌연변이가 유발되고, 결과적으로 Nkx3.1 유전자를 넉아웃 시킬 수 있다. 구체적으로 상기 돌연변이는 치환, 결실, 삽입 및 이들의 조합에 의한 돌연변이일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 TALEN 융합단백질에 의해 삽입, 결실 등의 다양한 돌연변이가 유발되었으며, 이로 인해 Nkx3.1 유전자가 성공적으로 넉아웃되었다.

본 발명에 있어서, Nkx3.1 유전자 넉아웃용 TALEN mRNA를 수정란에 도입하는 방법은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 적합한 표준 기술, 예컨대 전기천공법(electroporation)을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 있어서, 수정란을 대리모의 난관에 이식하여 임신시키는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법, 예컨대 미세주입(microinjection)을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 제조된 동물모델을 야생형과 교배시켜 동형접합(homozygote) 형질전환체를 제조하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 동형접합 형질전환체는 이형접합(heterozygote) 형질전환체에 비해 비뇨생식기질환의 표현형이 더욱 강하게 나타남을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 비뇨생식기질환은 전립선암, 전립선비대증, 전립선염 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 전립선암 또는 유방암일 수 있으며, 가장 바람직하게는 전립선암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 비뇨생식기질환 동물모델에서 전립선 조직의 위축, 정액량 감소, 임신율 감소, 전립선상피층 면적 증가, 전립선 조직 내 종양원성 유전자 발현 증가, 유선조직 내 종양원성 유전자 발현 증가, 유선종양, 발생 등 비뇨생식기질환 특이적인 표현형을 나타냄을 확인하여, 상기 비뇨생식기질환 동물모델을 전립선암, 유방암을 비롯한 비뇨생식기질환의 진단, 예후 및 전이에 대한 정보제공, 전립선질환 후보 약물의 스크리닝 등 다양한 전립선질환 연구에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 동물은 랫트(rat)인 것을 특징으로 한다. 본 발명은 유전적 특성은 물론 샘플 크기 등의 생리적 특성이 사람과 유사한 랫트를 사용하고, 랫트 수정란을 안정적으로 조작하여 랫트에서 비뇨생식기질환 모델을 개발한 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 동물모델은 교배 시 F1 및 F2 산자에서도 Nkx3.1 넉아웃(knock-out)이 유지되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서는, F1 산자의 염기서열 분석을 통해 F1 산자들이 부모와 동일한 돌연변이를 유지하고 있으며, 나아가 동형접합체인 Nkx3.1 -/- 개체에서 전립선, 유선 관련 비뇨생식기질환 특이적 표현형이 나타남을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킨 비뇨생식기질환 동물모델은 비특이적 돌연변이 효율이 낮은 TALEN을 사용하고 랫트 수정란 조작을 통해 Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킴으로써 원하는 표현형을 가진 비뇨생식기질환 형질전환 동물모델의 안정적인 생산이 가능함을 확인하였다.

상기 비뇨생식기질환이 유도된 동물모델에 비뇨생식기질환 치료 후보약물을 투여한 후, 비뇨생식기질환 증상을 간접적으로 또는 직접적으로 경감시키는 약물은 비뇨생식기질환 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 비뇨생식기질환 치료 후보약물의 부재 하에 비뇨생식기질환 증상을 측정하고, 비뇨생식기질환 치료 후보약물 존재 하에서 비뇨생식기질환 증상을 측정하여 양자를 비교한 후, 비뇨생식기질환 치료 후보약물이 존재할 때의 비뇨생식기질환 증상이 비뇨생식기질환 치료 후보약물의 부재 시 증상보다 경감시키는 물질을 비뇨생식기질환 치료제로 예측할 수 있는 것이다. 상기 비뇨생식기질환은 바람직하게는 전립선암, 전립선비대증, 전립선염 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 "치료"는 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 후보약물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. TALEN 설계 및 mRNA 제작

1-1. 타겟 유전자의 선정

기존 전립선암 동물모델에 사용된 유전자, 임상 전립선암 환자의 유전자에 대한 연구를 기반으로 문헌 조사를 진행하고, 기존 전립선암 진단에 사용되는 PSA(prostate specific antigen)와 비교하여 비전이성 암에서는 유사한 민감도, 전이성 암에서는 더 뛰어난 민감도를 보이고 전립선암 지표 유전자들 중에서 전립선 특이적 발현이 뛰어난 Nkx3.1을 타겟 유전자로 선정하였다.

1-2. TALEN의 제작

Nkx3.1 유전자가 녹아웃된 랫트 형질전환 모델을 제조하기 위해 TALEN(transcription activator-like effector nuclease) 방법을 이용하였다. 본 발명의 방법에 사용되는 TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인을 포함하며, 상기 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 Nkx3.1(NM_001034144.1) 유전자 내의 엑손 1에 결합하는 것을 특징으로 한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 2쌍의 TALEN(TAL-A, TAL-B)은 Nkx3.1 엑손 1의 개시코돈을 포함 또는 비포함하며, 모두 엑손의 앞쪽을 인식하여 돌연변이에 의한 전사, 번역 과정의 변화가 크도록 유도하였다. TAL 이펙터 DNA 결합 도메인이 결합하는 엑손의 각 염기서열 부위를 하기 표 1에 나타내었고, 이를 바탕으로 TALEN A 및 B를 제작하였다.

	좌측 결합부위	스페이서	우측 결합부위
TAL-A	TGctt agggtagcgg agc(서열번호 1)	cccaaga ggcacggt (서열번호 2)	tg gaggcggtg gtcgca (서열번호 3)
TAL-B	tcc ctgggcagcg ccac(서열번호 4)	ccacgc agtccaagc (서열번호 5)	ggctcacgtcc ttcctca (서열번호 6)

구체적으로, (1) TAL-A는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 TAL 이펙터 결합 도메인을 포함하는 제1 TALEN, 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하는 제2 TALEN으로 구성되며, (2) TAL-B는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 TAL 이펙터 결합 도메인을 포함하는 제1 TALEN, 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하는 제2 TALEN으로 구성되었다. 구체적인 서열은 다음과 같다.

서열번호 7: TGctt agggtagcgg agc

서열번호 8: tg gaggcggtg gtcgca

서열번호 9: tcc ctgggcagcg ccac

서열번호 10: ggctcacgtcc ttcctca

1-3. TALEN mRNA의 제작

각각의 TALEN을 이용하여 컴피턴트 세포(JM109) 형질전환 및 MIDIPREP 키트(Life Technology)를 통해 TALEN-Nkx3.1 플라스미드를 확보하였다. TALEN mRNA는 플라스미드 내 제한효소 부위(Smal)를 이용하여 플라스미드를 직선화시킨 후, Mmessage Mmachine(T7) kit(Ambion) 및 Mega clear kit(Ambion)를 통해 주형으로 선형화된 TALEN 플라스미드의 프로모터(T7)를 이용하여 시험관내(in vitro) 전사되었다. 합성된 mRNA를 정제 후 RNA 전기영동을 통해 mRNA의 존재 여부를 확인하였다. 이 때 사용한 TALEN 프라이머의 구체적인 서열은 하기와 같다.

TAL_F1: 5'-ttggcgtcggcaaacagtgg-3' (서열번호 11)

TAL_R2: 5'-ggcgacgaggtggtcgttgg-3' (서열번호 12)

도 2에 나타낸 바와 같이, 컴피턴트 세포를 통해 증폭된 TALEN 플라스미드는 유전적 변형을 겪지 않고, TALEN 플라스미드의 특징적인 PCR 양상(사다리 패턴)을 나타냄을 확인하였다(A). 또한, 전기영동을 통해 직선화된 플라스미드는 직선화되지 않은 플라스미드보다 아래에 위치함을 확인하였고(B), TALEN mRNA의 존재를 확인하였다(C).

실시예 2. TALEN mRNA의 수정란 주입

2-1. 과배란(superovulation) 및 동기화(synchronization)

Sprague-Dawley(SD) 암컷 및 수컷 랫트는 오리엔트 바이오에서 구입하였고, 폴리카보네이트 케이지에서 12시간마다 바뀌는 명/암 사이클, 상대습도 40~70% 및 22~23℃ 조건으로 사육하였다. 식이와 식수는 자유식(ad libitum)으로 공급하였고, 모든 동물실험은 서울대학교 동물실험위원회가 승인한 프로토콜에 맞추어 수행되었다(승인번호 SNU-140313-3).

과배란 유도를 위해 6주령 암컷 SD 랫트(n=80)에 25 IU PMSG(Sigma)를 복강 내(i.p.) 주사하고, 배란을 위해 PMSG 주사 48시간 후 25 IU hCG를 주사하였다. hCG 주사 30분 후 9주령의 수컷과 암컷을 교미시켰다. 다음날 아침 질전(vaginal plug) 검사를 실시하여, 질전이 확인되면 임신 0일령으로 간주하여 배아 수집에 사용하였다. 한편, 동기화 실험에 사용된 암컷 SD 랫트(n=21)는 교미 3일 전 PMSG를 단독으로 투여하였다.

2-2. 수정란 분리 및 TALEN mRNA 삽입

6주령 수컷 SD 랫트를 Alfaxan(10 mg/kg, Careside, Seoul, Korea) 및 Xylazine(3 mg/kg, Bayer, Leverkusen, Germany)으로 마취 후, 하복부 절개를 통하여 정관(vas deferens)을 노출시키고 이를 조심스럽게 잡아당겨 5 mm 간격으로 2개의 매듭을 지었다. 두 매듭 사이의 지점을 가열된 포셉(forcep)으로 절단 후, 절단된 끝단을 복강 내부에 다시 넣고 같은 과정을 다른 쪽에도 수행한 뒤 봉합사를 이용하여 피부를 봉합하였다. 정관결찰 수술 후 수정능력이 없는 것으로 확인된 수컷 랫트와 대리모 랫트를 교배시킨 후, 다음날 아침 안락사시켰다. 복강을 연 후 난관을 분리하여 팽대부(ampulla) 절개를 통해 수정란을 수집하고, 1% 히알루로니다제(hyaluronidase)를 첨가한 M2 배양배지(Sigma)로 15분간 처리하여 수정란을 둘러싸고 있는 난구 세포(cumulus cells)를 제거한 뒤, IVF 멀티디쉬(IVF multidish, Nunc, Roskilde, Denmark)로 옮기고 mR1ECM 배지에서 배양하여 수정란을 확보하였다.

다음으로, 전기천공법(electroporation)을 이용하여 수정란에 TALEN mRNA를 삽입하였다. 구체적으로, 수정란 전용 전기천공기(BEX, GEB15)를 사용하여 배지에 0.4 ug/ul 농도로 TALEN을 희석하고 이를 수정란과 함께 용기에 배열한 뒤 용기에 부착된 전선을 따라 전기자극을 주었다. 그 후, 수정란을 mR1ECM 배지로 옮기고 37℃의, 5% CO₂ 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 다음날 2세포로 분화된 수정란만을 선별하여 이식에 사용하였다.

실시예 3. 수정란 이식

선별한 수정란을 정관결찰된 수컷과 교배하여 가임신된 대리모의 난관에 이식하였다. 구체적으로, 대리모 랫트를 Alfaxan(10 mg/kg, Careside, Seoul, Korea) 및 Xylazine(3 mg/kg, Bayer, Leverkusen, Germany)으로 마취 후 우측 옆구리 피부를 절개 및 개복하여 난관 및 난소지방을 복부 밖으로 노출시켰다. 팽대부에 3 μm의 절개창을 내고, 이식용 파이펫에 수정란 12~20개 정도를 흡입하여 상기 노출된 난관 내에 삽입하고 천천히 주입하였다. 이식 후 근육층과 피부를 원래대로 봉합하였으며, 수술이 끝난 랫트는 37℃의 온열 패드 위에서 회복시킨 뒤 개별 사육하였다.

실시예 4. 산자의 표적 유전자 적중 여부 확인

TALEN이 삽입된 수정란 총 80개의 이식 결과, 대리모 랫트로부터 19마리의 새끼를 얻었다. 태어난 개체(F0)에서의 돌연변이 여부를 T7E1, 염기서열 및 단백질 서열분석에 의해 확인하였다.

4-1. T7E1 분석(T7E1 assay)

형질전환 개체(F0)의 꼬리에서 DNA를 추출하고, Nkx3.1 유전자에 대한 PCR을 수행한 뒤, PCR 산물을 변성 이후 리어닐링하고 리어닐링한 산물을 37℃에서 20분 동안 T7E1 효소로 분해하여 변이 부위의 절단을 유도하였다. T7E1에 의해 분해된 산물은 1% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, F0의 Nkx3.1 유전자에 대한 돌연변이 여부를 확인한 결과, 총 19마리 중 4마리(11, 21, 25, 35번)에서 돌연변이가 관찰됨을 확인하였다.

4-2. 염기서열 분석(nucleic acid sequencing)

돌연변이가 일어난 개체에서 Nkx3.1의 염기서열을 분석하였다. 서열 분석을 위해, 상기 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터를 이용하여 서브-클로닝에 사용하였다. 상기 제조한 플라스미드를 정제하고 야생형(wild type, WT)과 비교하여 각 클론의 서열을 분석한 결과를 도 5 및 하기 표 2에 나타내었다.

	성별	결손염기 개수 및 특이사항
T11	수컷	- 18bp
T21	수컷	- 23bp- Biallelic mutation
T25	암컷	- 32bp(+1bp) / 89bp- Biallelic mutation
T35	암컷	- 89bp

도 5 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 돌연변이가 일어난 개체에서 Nkx3.1의 일부 염기서열이 넉아웃(knock-out)된 것을 확인하였다. 25번(T25-A)과 35번(T35)의 경우 TALEN 인식부위를 초과하여 Nkx3.1의 개시코돈을 포함하는 염기서열에서 넉아웃이 일어남을 확인하였다. 25번(T25-A)의 경우, 32개의 염기가 소실되었으나 1개의 새로운 염기가 추가되었다. 한편, 서열 분석 시 프라이머는 표적 서열을 포함하여 PCR이 일어나도록 디자인하였으며 사용한 프라이머의 구체적인 서열은 하기와 같다.

Nkx3.1 F1: GGGATAACCAGGAAAGGCTAAG (서열번호 13)

Nkx3.1 R2: GAAGCAGAATCCCTCTTAGGGT (서열번호 14)

4-3. 단백질 서열 분석(protein sequencing)

염기서열을 전사될 것으로 예상되는 단백질 서열로 변환해주는 프로그램인 ExPASy - Translate를 이용하여 예상 단백질 서열을 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 돌연변이에 의한 Nkx3.1의 단백질 서열을 분석한 결과, 11번(T11)은 일부 아미노산(6개) 손실, 21번(T21)과 25번(T25-A)은 종결코돈이 조기에 나타남을 확인하였다. 25번(T25-B) 및 35번(T35)는 개시코돈을 포함하여 돌연변이가 일어나, Nkx3.1 단백질을 형성할 수 없음을 확인하였다.

실시예 5. 생식선 전이 확인

실시예 4에서 확보한 4마리의 형질전환 랫트(F0)가 8주령이 되었을 때, F0 개체를 야생형(wild type)과 교배한 후, 생산된 산자(F1)의 유전형을 염기서열 분석에 의하여 확인하였다.

구체적으로, 11번(T11), 21번(T21-A, T21-B), 25번(T25-A, T25-B), 35번(T35) 랫트를 야생형(WT) 마우스와 합사 방법에 의해 교배하고, 임신되어 태어난 개체(F1)의 Nkx3.1 유전자에 대한 PCR을 수행한 뒤, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 PCR 산물의 염기서열 분석을 수행하였다. 이 때, 생식선전이를 확인하기 위해 염기서열분석결과를 바탕으로 돌연변이 유전자 확인용 PCR 프라이머를 디자인하였으며, 사용한 프라이머의 구체적인 서열은 하기 표 3과 같다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

	정방향	역방향
Wild type	GGGATAACCAGGAAAGGCTAAG (서열번호 15)	GACGTGAGCCGCTTGGACTG (서열번호 16)
T11		GAAGGACGTGAGCCGCGCTG (서열번호 17)
T21-A		GAAGGACGTGAGCCGCAGTC (서열번호 18)
T21-B		GGACGTGAGCCCAGGGAC (서열번호 19)
T25-A		GACGTGAGCCTGACTGCG (서열번호 20)
T25-B		GACGTGAGCCATGCTGAG (서열번호 21)
T35		GAAGGACGTGAGCCTCCAC (서열번호 22)

도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 돌연변이가 확인된 산자의 염기서열을 야생형(W) 마우스의 염기서열과 비교한 결과, 산자(F1)들은 부모(F0)와 동일한 돌연변이를 유지하고 있는 것으로 확인되었다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 돌연변이는 야생형 마우스와의 교배에도 불구하고 추가 변이없이 그대로 유지됨을 확인하였다.

실시예 6. Nkx3.1 -/- (25A type) 랫트 모델의 생산

실시예 5에서 얻어진 F1 산자(Nkx3.1 -/+)끼리 교배하여 F2 산자인 Nkx3.1 -/- 개체를 생산하였다. 생식선전이를 확인하기 위해 꼬리 유전자를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, F1 산자끼리 교배하여 얻은 3마리의 F2 산자 중 두 마리의 랫트가 동형접합체(homozygote, HO)인 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 TALEN mRNA를 이용한 수정란 조작을 통해 Nkx3.1 유전자가 넉아웃(knock-out)된 동형접합체를 갖는 형질전환 랫트를 생산할 수 있음을 확인하였다.

실시예 7. Nkx3.1 -/- 랫트 전립선의 표현형 분석

전립선암의 경우 노령층에서의 발병율이 높기 때문에, 성성숙이 완료되는 8주 이후부터 15주, 20주, 25주 및 노령화가 시작되는 30주에 F0 및 F2 산자의 Nkx3.1-/+ 또는 Nkx3.1-/- 개체를 각각 부검하여, 연령별 전립선암의 병변 형성 여부 및 전립선 표현형을 분석하였다.

7-1. 전립선 조직 무게 측정

F0의 Nkx3.1-/+ 및 Nkx3.1-/- 개체를 12개월에 부검하여 전립선 조직 무게를 측정하였다. 또한, F2 Nkx3.1-/+ 및 Nkx3.1-/- 개체를 15주, 20주, 25주, 30주에 부검하고 전립선 조직 내 각각의 엽의(anterior lobe, AL; ventral lobe, VL; dorsolateral lobes, DLL) 무게를 측정하였다. 그 결과를 각각 도 9 및 도 10에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, F0 Nkx3.1 -/+ 및 Nkx3.1 -/- 개체 모두에서 전립선 조직 모든 엽에서 위축 소견 및 무게 감소를 확인하였다. 또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 15주(D), 20주(C), 25주(B), 30주(A)에서 모든 F2 Nkx3.1-/+(회색) 및 Nkx3.1-/- 개체(검은색)의 전립선 조직의 위축 소견 및 무게 감소를 확인하였다. 특히, F2 Nkx3.1-/-의 경우 25주령에서부터 야생형(흰색)에 비해 전립선 조직이 현저히 위축됨을 확인하였다.

7-2. 전립선 기능 분석

전립선액은 정액의 30%를 구성하며, 정자에게 영양 공급, 정자 운동능 향상, 요로감염 예방 등의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 전립선 상피 형성 및 발달의 주요 유전자인 Nkx3.1의 돌연변이로 인한 전립선기능 변화를 살펴보기 위하여, 교미 후 정액이 응고되어 암컷의 질 등에 형성되는 질전(vaginal plug)의 양을 통해 정액량을 분석하고, 임신 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 야생형(흰색)에 비해 Nkx3.1-/- 개체(회색)의 정액량이 현저히 감소하였으며(A), 임신율도 현저히 감소한 것을 확인하였다(B). 도 11C는 질에서 탈락된 질전(vaginal plug) 확인 결과를 나타낸 것이다.

7-3. 전립선 조직의 병리학적 표현형 및 유전자 발현 분석

F2의 Nkx3.1-/+ 또는 Nkx3.1-/- 개체를 15주, 20주, 25주, 30주에 각각 부검하여 전립선 조직의 조직병리학적 병변을 확인하였다. 구체적으로, 전립선상피세포의 증식을 평가하기 위해서 표본의 전 영역과 분비선 영역의 현미경 사진을 이용하여 전립선 각 엽의 소관 단면에서 상피세포가 차지하는 면적의 비를 연령별로 분석하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, Nkx3.1-/-개체에서 야생형에 비해 전립선상피의 면적이 증가하였다. 이는 전립선암이 전립선상피세포의 증식에서부터 시작하므로, Nkx3.1 유전자의 결손으로 인한 전립선암으로의 진행가능성을 예측할 수 있는 결과이다.

또한, 15, 20, 25, 30주령의 수컷의 전립선 조직을 소엽별로, 즉 Anterior, Ventral, Dorsal, Lateral Lobe 각각에 대하여 종양원성 유전자의 발현 양상을 real time PCR을 통해 분석하였다. 그 결과를 도 13 내지 도 18에 나타내었다.

도 13 내지 도 18에 나타낸 바와 같이, 종양 억제 유전자인 P53, E-cadherin, Pten의 증가, 전립선암에서 활성화되는 것으로 알려진 Androgen receptor, PI3K, Akt 유전자의 증가가 관찰되었다.

실시예 8. 유선 조직의 병리학적 표현형 및 유전자 발현 분석

8-1. 유선 조직의 병리학적 표현형 분석

F0 Nkx3.1 -/- 암컷 랫트를 12개월 째에 부검 및 F2 Nkx3.1 -/+ 암컷 랫트를 20주에 부검하여 유선 조직을 육안으로 관찰하였다. 또한, H&E 염색을 통해 상기 유선종괴의 조직병리학적 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 19 및 도 20에 각각 나타내었다.

도 19에 나타낸 바와 같이, F0 Nkx3.1 -/- 12개월령 개체에서 다발성 유선종양이 관찰되며, 특히 우측 상부 유선에서 가장 큰 종괴가 발생한 것을 확인하였다(A). 또한, F2 Nkx3.1 -/+ 20주령 암컷 랫트의 우측 상부 유선에서도 유선종양이 발생한 것을 확인하였다. 또한, 도 20에 나타낸 바와 같이, 조직병리학적 분석 결과 발생한 유선종괴는 모두 악성종양으로 확인되었다.

8-2. 유선 조직의 유전자 발현 분석

상기 실시예 8-1과 동일한 동물모델의 유선 조직에서 유전자 발현을 분석하였다. 그 결과를 도 21에 나타내었다.

도 21에 나타낸 바와 같이, Nkx3.1-/-개체에서 유선 종양의 주요 경로로 알려져 있는 Pten, Akt, PI3K 유전자의 발현이 모두 증가하였으며, 유선암종(invasive ductal carcinoma)의 발현마커 중 하나인 E-cadherin의 발현 또한 증가한 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명의 Nkx3.1 유전자를 넉아웃시킨 비뇨생식기질환 동물모델은 전립선, 유선 등 비뇨생식기질환 특이적인 표현형을 나타내어, 전립선암, 유방암을 비롯한 비뇨생식기질환의 진단, 예후 및 전이에 대한 정보제공, 전립선질환 후보 약물의 스크리닝 등 다양한 전립선질환 연구에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 기술적 범위는 전술한 실시예에 한정되지 않고 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 이때, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 고려해야 할 것이다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Nkx3.1 gene knock-out genitourinary disease animal model and use thereof <130> 1-158 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL-A left <400> 1 tgcttagggt agcggagc 18 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer <400> 2 cccaagaggc acggt 15 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL-A right <400> 3 tggaggcggt ggtcgca 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL-B left <400> 4 tccctgggca gcgccac 17 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer <400> 5 ccacgcagtc caagc 15 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL-B right <400> 6 ggctcacgtc cttcctca 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL effector binding domain <400> 7 tgcttagggt agcggagc 18 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL effector DNA binding domain <400> 8 tggaggcggt ggtcgca 17 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL effector binding domain <400> 9 tccctgggca gcgccac 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL effector DNA binding domain <400> 10 ggctcacgtc cttcctca 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL_F1 <400> 11 ttggcgtcgg caaacagtgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAL_R2 <400> 12 ggcgacgagg tggtcgttgg 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nkx3.1 F1 <400> 13 gggataacca ggaaaggcta ag 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nkx3.1 R2 <400> 14 gaagcagaat ccctcttagg gt 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 gggataacca ggaaaggcta ag 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_Wild type <400> 16 gacgtgagcc gcttggactg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_T11 <400> 17 gaaggacgtg agccgcgctg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_T21-A <400> 18 gaaggacgtg agccgcagtc 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_T21-B <400> 19 ggacgtgagc ccagggac 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_T25-A <400> 20 gacgtgagcc tgactgcg 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_T25-B <400> 21 gacgtgagcc atgctgag 18 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_T35 <400> 22 gaaggacgtg agcctccac 19 <210> 23 <211> 1800 <212> RNA <213> Rattus norvegicus <400> 23 cgggatgctt agggtagcgg agccccaaga ggcacggttg gaggcgggtg gtcgcagtcc 60 ctgggcagcg ccacccacgc agtccaagcg gctcacgtcc ttcctcatcc aggacatcct 120 gcgggaccac gcagagcggc gtgggggaca gccgagcacc ccgcagcacc agtgccaacc 180 agaccctaag agggattctg cttcagagct cgacgaagca gagggtagca gtgtgactct 240 ggaggacccg ccaggtatcc ggtcgagccc cacagagaca cgggctgaaa ccgagtcaga 300 tgcacatttt gagacttatc tgttggactg tgaacatact ccagtcttat caagtgcccc 360 ccaggtcacc aagcagccac agaagcgttc ccgggctgct ttctctcaca ctcaggtgat 420 tgagttggag aggaagttca gccatcagaa gtacctgtcc gcccctgaaa gggctcacct 480 ggccaagaac ctcaaactca ccgaaaccca agtaaaaata tggttccaga acagacgcta 540 caagactaag cgaaggcagc tgtcagaaga cctgggagtc ttggagaaga actccacatt 600 gtctttgcca accctgaaag atgacagcct atccagggcc tccttggtct ccgtgtatgc 660 tagctacccc tactacccct acctatactg tctgggcagc tggcatccaa ctttctggta 720 acaacagttc agatgacaac tgcatagatc agaaactgcc ttccctgggg gtccctggga 780 aaaagccaga gtggctgatg tcaaggagtt gaaagcaaga agtgtacaga cacaaactgt 840 tgggtgttcc cagggaatac tccgattctt ctctggtggc caatgaaaga tctggggcag 900 tggacatttt attatgtagt cacagttcca agtgttctgt aggtcacggc tgtcagttcc 960 ctgtttagag agagctagac aagttcaagt cttatttcca gagcttagag tggctatggc 1020 tgcaatggct acatcgttcc taagaattct gttgctgcaa tttcatcctc tcccataact 1080 gggtatcatg aaagggccaa gcaaggggag ggatggcccc ttagatgagg atttcctctt 1140 gaattaaact tgtgtttaaa agtctcttgt tggccttgga ctctgaccag agtttccctc 1200 tgcccttgta aaagtgaggg taaacgggag atttgaagaa ggggagaaaa aaccttagtg 1260 attaagcagg ttggcatagg acatgaaggg gctggaaggt ggcattttca acttcttact 1320 ccttttgcag tgatgtgcca atccaaggat ttacagggca gcctgagtgc agcagggtac 1380 atatactgaa gggggttaag acaagctgtg taaacagttt gcctgcaggg gtgggcttca 1440 gaacagactt cctgtccaag acaagggcct atggggtttc caaactccag gtgagctgct 1500 tcggtcatga cattttatta ccagtgaagg gggaggggag atcttagact caggagatcc 1560 tgcagcttcc ctggtctgag aattcacacc tcattatgac agaggtgcca tcatttttaa 1620 acaaaggatc ttccttctat tcttttattt cttgttcttt cttacaggac tcctcagttc 1680 attgttttca tatatgcctg tcttatttag tgtaagattt gctcccacca cctcccaagt 1740 tttatctttc ccagtttaat aactaactag cttcagacag ataaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 1800

Claims

Nkx3.1 유전자 넉아웃(knock-out)용 TALEN mRNA를 수정란에 도입하는 단계;
상기 수정란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하고,
상기 TALEN은 (i) Nkx3.1 유전자 내의 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 결합하는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인; 또는 (ii) Nkx3.1 유전자 내의 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열에 결합하는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인;을 포함하는, 비뇨생식기질환 동물모델의 제조방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 Nkx3.1 유전자는 서열번호 23으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 비뇨생식기질환 동물모델의 제조방법.
제1항에 있어서, 제조된 동물모델을 야생형과 교배시켜 동형접합 형질전환체를 제조하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비뇨생식기질환 동물모델의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 비뇨생식기질환은 전립선암, 전립선비대증, 전립선염 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 비뇨생식기질환 동물모델의 제조방법.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 Nkx3.1 유전자가 넉아웃(knock-out)된 비뇨생식기질환 동물모델.
제7항에 있어서, 상기 동물은 랫트(rat)인 것을 특징으로 하는, 비뇨생식기질환 동물모델.
제7항에 따른 Nkx3.1 유전자가 넉아웃(knock-out)된 비뇨생식기질환 동물모델에 후보약물을 처리하는 단계; 및
상기 후보약물이 처리된 동물모델을 무처리된 대조군과 비교하여 증상 완화여부를 판단하는 단계;를 포함하는 비뇨생식기질환 관련 약물 스크리닝 방법.