KR102385674B1 - 타공된 유기 중합체 필름을 포함하는 기형 혈관의 감쇄 유도용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 내 혈관 감쇄용 조성물, 이를 이용한 기형 혈관 관련 질환의 치료용 조성물 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래 혈관 폐색용으로 이미 생체 내 삽입되어 오던 유기 중합체 필름을 그대로 적용하여 안전성이 담보될 뿐 아니라, 저비용의 간단한 타공 작업을 통해 폐색 효과를 현저히 개선시킴으로써, 효율적인 기형 혈관의 혈류 차단 수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

타공된 유기 중합체 필름을 포함하는 기형 혈관의 감쇄 유도용 조성물{A Composition for Inducing Anomalous Vessel Attenuation Comprising Punched Organic Polymer Films}

본 발명은 타공된 유기 중합체 필름, 구체적으로는 타공된 셀로판 밴드 필름을 이용한 기형 혈관의 감쇄 및 혈류 저하용 조성물에 관한 것이다.

문맥전신성 단락(Portosystemic shunt, PSS)은 문맥혈이 간계(hepatic system)로 우회하여 전신 순환계로 바로 유입되도록 하는 혈관 기형 질환으로(Hunt et al., 2000), 선천성 간외 PSS는 고양이와 개 등의 반려동물에서 가장 흔하게 진단되는 혈관 기형 질환이다(Faulkner et al., 2004). 몇몇 의료적 조치에 의해 PSS의 증상이 경감될 수는 있으나, 완전한 회복은 단락 혈관의 감쇄에 의해서만 달성될 수 있다(Van Vechten et al., 1994; Greenhalgh et al., 2010; Wallace et al., 2016). 선천성 간외 PSS를 치료하기 위해 다양한 수술이 시도되어 왔으며, 봉합 결찰 기술보다는 점진적인 단락 혈관의 감쇄가 보다 효과적임이 보고되었다(Hunt et al., 2004; Wallace et al., 2018). 완전한 단락의 결찰이 필요하긴 하지만, 단락 혈관의 갑작스런 폐색은 치명적인 문맥 고혈압으로 이어질 수 있다(Smith et al., 2013). 점진적인 단락의 감쇄는 문맥계가 혈류 방향의 전환에 서서히 적응할 수 있도록 하며, 이는 셀로판 밴드, 아메로이드 수축기, 수압 폐색기 및 혈전 유발성 혈관내 코일을 이용하여 달성할 수 있다(Winkleret al., 2003; Seredaet al., 2005). 특히, 셀로판 밴드는 쉽게 구할수 있고 경제적이며 경량일 뿐 아니라 꼬임을 방지하고 문맥 고혈합 발생의 위험이 낮기 때문에 광범위하게 이용되고 있다(Youmans et al., 1998).

한편, 합병증을 최소화하고 더 나은 임상적 결과를 얻기 위해서 셀로판 밴드의 적절한 형태를 탐색하는 것이 필요하지만, 셀로판 밴드가 혈관 폐색에 최초로 적용된 후 수십년동안 종래의 효과를 현저히 향상시킬 수 있는 최적의 개량 형태는 제안되지 못하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 미국 특허공개공보 제2001-0044629호

본 발명자들은 다양한 기형 혈관에서의 비정상적인 혈류를 효율적으로 차단하기 위한 안전하면서도 경제적인 혈관 감쇄용 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 종래에 이미 혈관 폐색을 위해 생체 내에 삽입되어 온 유기 중합체 필름, 구체적으로는 셀로판 밴드에 타공(punching)을 통해 일정 직경의 소공(pore)을 일정 간격으로 형성시키는 간단한 공정을 통해 표면 거칠기(surface roughness)와 이물 반응(foreign-body reaction)을 크게 증가시킴으로써 혈관 감쇄 또는 폐색 효과가 현저히 개선된다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 생체 내 혈관 감쇄용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 기형 혈관 관련 질환의 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 0.5 - 1.5 mm 직경의 소공(pore)을 가지는 다공성(porous) 유기 중합체 필름을 포함하는 생체 내 혈관 감쇄용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 다양한 기형 혈관에서의 비정상적인 혈류를 효율적으로 차단하기 위한 안전하면서도 경제적인 혈관 감쇄용 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 종래에 이미 혈관 폐색을 위해 생체 내에 삽입되어 온 유기 중합체 필름, 구체적으로는 셀로판 밴드에 타공(punching)을 함으로써 일정 직경의 소공(pore)을 일정 간격으로 형성시키는 간단한 공정을 통해 표면 거칠기(surface roughness)와 이물 반응(foreign-body reaction)을 크게 증가시킴으로써 혈관 감쇄 또는 폐색 효과가 현저히 개선된다는 사실을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“혈관 감쇄(attenuation)”란 기형 또는 비정상 혈관의 직경을 감소시킴으로써 혈액의 통로를 차단, 비정상적인 혈류를 감경하거나 제거하는 것을 의미한다. 이에, 본 발명의 혈관 감쇄는 바람직하게는 “혈관 폐색”이다. 본 명세서에서 용어“혈관 폐색(occlusion)”은 혈액의 흐름이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, 비정상적인 혈류에 의한 생체 내 부작용 및 손상이 유의하게 저하될 수 있을 정도로 혈액의 흐름이 저하되는 것을 의미한다. 이에, 혈관 폐색은 혈류의 100% 완전 차단이 아닐 수도 있으며, 대조군 대비 70% 이상 차단, 구체적으로는 80% 이상 차단, 보다 구체적으로는 90% 이상 차단된 경우일 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 유기 중합체 필름은 생체 내에 이식되어 감쇄 또는 폐색시키고자 하는 혈관을 감쌈으로써(wrapping) 이물반응을 일으켜 혈관의 직경과 혈류량이 현저히 감소시킨다.

본 명세서에서 용어 "이식"은 수용자의 세포 또는 조직의 기능적 완전성을 달성하려는 목적 하에 수용자의 생체 내에 인공 지지체 또는 삽입물을 전달하는 과정을 의미한다.

본 명세서에서 용어“유기 중합체”는 동일하거나 상이한 종류의 유기물 단량체가 연속적으로 결합된 합성 또는 천연 고분자 화합물을 지칭한다. 따라서, 중합체에는 단독 중합체(한 종류의 단량체가 중합화된 중합체)와 적어도 2종의 상이한 단량체의 중합에 의해 제조된 혼성중합체를 포함되며, 혼성중합체에는 공중합체(2종의 상이한 단량체로부터 제조된 중합체)와 2종 초과의 상이한 단량체로부터 제조된 중합체를 모두 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 유기 중합체 필름은 셀룰로오스 필름, 폴리에틸렌 필름, 폴리프로필렌 필름 및 에틸렌비닐아세테이트(EVA) 필름으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로는 셀룰로오스 필름 또는 폴리프로필렌이고, 가장 구체적으로는 셀룰로오스 필름이다. 셀룰로오스 필름은 통상적으로 셀로판 필름으로도 불리운다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 소공은 상기 다공성(porous) 유기 중합체 필름 내에 4개 내지 12개가 형성된다. 보다 구체적으로는 4개 내지 10개가 형성되며, 보다 더 구체적으로는 5개 내지 8개가 형성되며, 가장 구체적으로는 6개가 형성된다. 본 발명의 소공은 원형일수도 있고 원형 이외의 형태 또는 비정형일 수도 있다. 본 발명의 소공이 원형일 경우 완전한 원형(circle)이 아닐 수도 있다.

본 발명의 소공은 0.5 - 1.5 mm 직경의 가지며, 보다 구체적으로는 0.7 - 1.3mm 직경의 가지고, 가장 구체적으로는 0.9 - 1.1mm의 직경을 가진다.

보다 구체적으로는, 상기 소공 간의 간격은 1 - 3 mm이다. 보다 구체적으로는 1.5 - 2.5 mm이며, 가장 구체적으로는 1.8 - 2.2 mm이다.

본 발명의 소공은 하나의 직선 상에 일렬로 나열될 수도 있고 다수의 직선 상에 일렬로 나열될 수도 있다. 다수의 직선 상에 일렬로 나열될 경우에도 각 소공 간의 간격은 상술한 범위와 동일하다. 구체적으로는, 본 발명의 소공은 하나의 직선 상에 일렬로 나열된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 유기 중합체 필름은 4 - 8 mm의 너비를 가진다. 보다 구체적으로는 4 - 7 mm의 너비를 가지며, 보다 더 구체적으로는 4.5 - 6.5 mm의 너비를 가지고, 가장 구체적으로는 4.5 - 5.5 mm의 너비를 가진다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 유기 중합체 필름은 2중층(double layer) 또는 3중층(triple layer)이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 상술한 조성물을 포함하는 기형 혈관 관련 질환의 치료용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어“기형 혈관 관련 질환(vascular anomaly-related disorder)”은 비정상적인 혈관의 형태에 기인한 이상 혈류에 의해 발생하는 모든 질환을 포괄하는 의미이다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 기형 혈관 관련 질환은 예를 들어 동맥류(aneurysm), 척수 혈관기형(spinal arteriovenous malformation), 뇌동정맥 기형(Cerebral arteriovenous malformation), 폐동정맥기형(Pulmonary Arteriovenous Malformation) 및 문맥전신단락(Portosystemic Shunt)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 기형 혈관 관련 질환은 문맥전신단락이다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체의 기형 혈관에 적용하면 효율적으로 혈관을 감쇄 또는 폐색시킴으로써 비정상적인 혈류로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료용 조성물”은“치료 보조”또는“치료 보조용 조성물”의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 래빗, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간, 래빗 또는 개이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 상술한 조성물을 대상체의 혈관에 접촉시키는 단계를 포함하는 생체 내 혈관의 감쇄 방법을 제공한다. 본 발명의 혈관 감쇄용 조성물에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 유기 중합체 필름의 표면에 타공기를 이용하여 소공을 형성시키는 단계를 포함하는 생체 내 혈관 감쇄용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어“타공(punching)”은 필름의 표면에 타공 장비를 관통시킴으로서 후발적으로 소공을 형성하는 과정을 의미한다. 본 발명에 따르면, 필름의 제작 시 몰딩 기법 등을 통해 이미 소공을 가지는 필름의 형태로 제작되는 것이 아니라 필름 시트의 제작 완료 후 후발적으로 타공 작업을 수행함으로써 타공기가 관통한 주변 경계부에 장골(crest)을 형성시켜 표면 거칠기와 이물감을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 생체 내 혈관 감쇄용 조성물, 이를 이용한 기형 혈관 관련 질환의 치료용 조성물 및 이들의 제조 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 종래 혈관 폐색용으로 이미 생체 내 삽입되어 오던 유기 중합체 필름을 그대로 적용하여 안전성이 담보될 뿐 아니라, 저비용의 간단한 타공 작업을 통해 폐색 효과를 현저히 개선시킴으로써, 효율적인 기형 혈관의 혈류 차단 수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 셀로판 밴드의 외형을 보여주는 사진으로, 왼쪽부터 4mm, 5mm 및 6mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드(패널 A)와 구멍이 뚫린 셀로판 밴드(패널 B)를 보여준다. 구멍이 뚫린 셀로판 밴드는 중앙에 1 mm 직경의 구멍이 형성되었다.
도 2는 주사 전자 현미경으로 셀로판 밴드의 형태 및 두께에 대한 사진을 찍는 과정을 보여준다. 도 2a는 고해상도 전계 방사주사 전자 현미경 사진이다. 12 mm 양면 전도성 접착 테잎으로 표본 고정기에 셀로판 밴드를 마운팅하였다(흰색 화살표)(도 2b).
도 3은 수술 도중의 사진으로, 외부 장골정맥(흰색 화살표)이 노출되었으며 그 직경을 측정하였다. 구멍이 뚫린 셀로판 밴드(패널 A) 및 구멍 없는 셀로판 밴드(패널 B)를 외부 장골정맥 주변에 적용하였다. 수술 중 혈관이 감쇄되지 않도록 하면서 혈관 2개의 헤모클립으로 셀로판 밴드를 고정하였다.
도 4는 셀로판에 대한 주사전자현미경 이미지를 보여준다. 셀로판 밴드의 표면은 부드러웠으나(x 60)(패널 A), 셀로판 밴드의 구멍 주변은 거친 경계가 형성되었다(x 60)(패널 B). 구멍이 없는 샐로판 밴드의 두께는 65 μm로 측정되었다(x 100)(패널 C). 고배율(x 300, 패널 D)에서는 불규칙한 경계(흰색 원, 패널 B)가 관찰되었다. 측면 사진을 통해 구멍이 뚫린 셀로판 밴드의 3겹 구조가 확인되었으며 두께는 102μm로 측정되었다(x 700, 패널 E). 구멍 주변에 장골(crest)이 관찰되었다(x 2020)(패널 F).
도 5는 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드그룹에서 B-mode 초음파를 이용하여 혈관을 조사한 결과를 보여준다. 셀로판 밴드 수술 1주일 뒤, 혈관 직경의 변화는 3.1 mm로 측정되었으며(흰색 이중 화살표), 혈관벽의 비투과성이 관찰되었다(화살표 머리)(패널 A). 3주 째에, 혈관 내강의 비투과성이 증가되었으며, 이로 인해 혈관의 직경이 감소하였다(패널 B). 직경은 1.9 mm로 측정되었다(흰색 이중 화살표, 패널 B). 6 주째에, 조직의 부투명한 부분의 두께가 내강 쪽으로 증가하였고(화살표), 혈관 직경이 현저히 감소하였다(패널 C). 직경은 0.8 mm로 측정되었다(흰색 이중 화살표, 패널 C). 8주 째에, 혈관벽 주변 조직 뿐 아니라 내강의 비투과성도 전반적으로 증가하였으며, 내강이 잘 식별되지 않았다(패널 D).
도 6은 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드그룹에 대해 수술 8주 후 컬러 도플러 초음파 검사를 수행한 결과를 보여준다. 혈관 직경은 0.3 mm로 나타났으며(패널 A) 혈류는 검출되지 않았다(패널 B). 혈관 주위의 섬유화 반응은 관찰되지 않았다(흰색 화살표).
도 7은 4mm, 5mm, 6 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹에서의 혈관 직경 변화를 보여주는 그래프이다. 모든 래빗은 시간의 경과에 따라 혈관 직경이 감소하였다. 4 mm, 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍없는 셀로판 밴드그룹에서 가장 큰 직경 감소는 각각 2 내지 3 주, 1 내지 3 주 및 첫째주에 관찰되었다. 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 14주에 4 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹과 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹 간에 혈관 직경의 유의한 차이가 있었다(p<0.05). *4 mm와 5 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹 간의 혈관 직경의 유의한 차이(p= 0.031) 및 4 mm와 6 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹 간의 혈관 직경의 유의한 차이(p= 0.003). p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. Pre, 수술 전
도 8은 4mm, 5mm, 6mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서의 혈관 직경을 보여주는 그래프이다. 모든 래빗은 혈관 직경이 점차 감소하였다. 가장 큰 직경 감소는 4 mm, 5 mm, 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 수술 1주 및 2주 경과 시점에 관찰되었다. 4 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 및 5 mm와 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 간에 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 주차에 혈관 직경의 유의한 차이가 있었다(p < 0.05). *4 mm 및 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 간(p= 0.009) 및 4 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 간(p= 0.000)의 유의한 차이. p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. Pre, 수술 전
도 9는 4mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서의 직경 변화를 보여주는 그래프이다. 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 주에서 5 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹 간 혈관 직경의 유의한 차이가 관찰되었다(p< 0.05). p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. Pre, 수술 전
도 10은 5mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서의 직경 변화를 보여주는 그래프이다. 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 주에서 5 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹 간 혈관 직경의 유의한 차이가 관찰되었다(p< 0.05). p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. Pre, 수술 전
도 11은 6mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서의 직경 변화를 보여주는 그래프이다. 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 주에서 6 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹 간 혈관 직경의 유의한 차이가 관찰되었다(p<0.05). p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. Pre, 수술 전
도 12는 수술 후 4주 및 8주 뒤의 C-arm 형광투시 이미지를 보여주는 그림이다. 수술 전 형광투시에서, 외부 장골정맥(화살표머리, 패널 A 및 B) 및 내부 장골정맥(검은 화살표)의 혈류가 확인되었다. 조영제를 이용하여 수술 4주 후 혈류를 조사한 결과, 5 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹 모두 혈류가 현저히 감소하였다(검은 화살표, 패널 C 및 D). 수술 8주 후에, 셀로판 밴드가 위치한 혈관 주변에는 조영제 유동이 없었으며, 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 완전한 폐색이 나타났다(검음 화살표, 패널 E). 수술 8주 후에 5mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹에서, 4주차에 비하여 조영제 유동이 유의하게 낮아짐을 관찰하였다(검은 화살표, 패널 F). R, 오른쪽
도 13은 5 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드를 적용한 외부 장골정맥을 적출한 사진이다. 헤모클립으로 셀로판 밴드를 고정한 정맥을 적출하였으며(패널 A), 혈전(별표)가 혈관 벽으로부터 용이하게 분리되었다(패널 B). 구멍 없는 셀로판 밴드는 혈관에서 쉽게 분리되었고, 섬유질 조직(화살표)이 셀로판 밴드 외부에 형성되었다(패널 C).
도 14는 구멍 없는 셀로판 밴드(패널 C) 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드(패널 A, B, D)의 육안 관찰 결과를 보여주는 사진이다. 혈관 절제 후, 셀로판 밴드 주변에 형성된 과립화 조직(화살표 머리)을 확인하였으며(패널 A), 얇은 과립화 조직(화살표)이 헤모클립 및 셀로판 밴드를 덮었다(패널 B). 헤모클립 제거 후, 포집된 과립화 조직(화살표)을 관찰하였다(패널 B). 외부 과립화 조직 제거 후 구멍 없는 셀로판 밴드는 혈관벽으로부터 쉽게 제거되었다. 과립화 조직은 구멍이 뚫린 셀로판 밴드의 구멍 경계부 뿐 아니라 외부에도 형성되었다(화살표 머리).
도 15는 셀로판 밴드 수술 후의 조직학적 형태를 보여주는 그림이다(헤마톡실린 & 에오신 염색). 4mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드로 결찰한 혈관에서, 내강(별표) 및 혈관 층을 확인하였으며, 경미한 염증과 몇몇 혈관생성(화살표)이 관찰되었다(패널 A). 구멍이 뚫린 셀로판 밴드가 적용된 혈관은 내강이 더 좁은 내강을 가지며, 염증이 더 경미하고 혈관화 부위가 더 넓음이 확인되었다(화살표)(패널 B). 5 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드로 결찰된 혈관은 많은 혈관화 부위 및 충혈 부위가 나타났다(패널 C). 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드로 결찰된 혈관은 내강 직경이 감소하였으며, 주변 섬유질 조직이 증식하였다(패널 D). 6 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드로 결찰된 혈관의 내강은 작았으며, 섬유질 조직 증식이 관찰되었다(패널 E). 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드로 결찰된 혈관은 내강이 매우 좁아 식별이 어려웠으며, 많은 말초혈관 반응이 관찰되었다(패널 F).(배율 x 40, 스케일바: 500μm).
도 16은 200×배율에서의 조직학적 형태를 보여주는 그림이다(헤마톡실린 & 에오신 염색). 고배율에서 혈관 층이 명확히 구분되었으며(이중 화살표, 도 16a), 외막층에서 형성된 림프구와 비만세포를 포함하는 염증성 세포(동그라미)가 관찰되었다(도 16a). 섬유아세포 및 섬유세포로 구성된 섬유질 조직 증식(이중 화살표, 도 16b, 16c)은 대부분 조직 슬라이드의에서 발견되었다(도 16b, 16c)(배율 x 200, 스케일바: 100μm).
도 17은 콜라겐 침착을 측정하기 위해 Masson 트리크롬으로 혈관을 염색한 결과를 보여주는 그림이다. Masson 트리크롬 염색 단면의 붉은색 부분은 중간막층의 적혈구 및 근육을 나타낸다(흰색 별표, 패널 A, C, D, F). 섬유질 조직을 나타내는 파란색 염색 부분(검은 화살표)은 주로 외부 물질과의 반응으로 생성된 두꺼워진 외막층에서 발견되었다. 혈관 주위의 섬유화 및 혈관 비대가 관찰되었으며(이중 화살표, 패널 B), 내막층에서 흡착된 만성 혈전 형성이 관찰되었다(흰색 화살표, 패널 B, F).(배율 x 125, 스케일바: 200μm)
도 18은 Masson 트리크롬 염색을 통해 콜라겐 침착 점수를 측정한 결과를 보여준다. 셀로판 밴드의 너비가 증가할수록, 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹 및 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹에서 형성된 섬유질 조직이 증가하였다. 4 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드와 6mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 간(p = 0.024), 그리고 4 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 간(p= 0.016) 콜라겐 침착에 유의한 차이가 나타났다. p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. *p< 0.05
도 19는 문맥전신성 단락에 대한 CT(Computed tomography) 이미지를 보여주는 그림이다. 진단 확인을 위해 수술전 CT 스캔을 수행하였다. CT 이미지에서, 단락 직경은 시작 부위에서 3.7 mm이고(흰색 화살표, 패널 A), 가장 넓은 부위에서 6.2 mm였으며(검은 화살표, 패널 A), 합류 부분에서는 1.8 mm였다(흰색 화살표 머리, 패널 B). 문맥 직경(화살표 머리, 패널 C)는 0.7 mm이고, 단락(흰색 화살표, 패널 C)은 비장 정맥에서 갈라져 나왔다. 단락은 비장 정맥에서 시작되어 횡경막 정맥으로 연결되었으며, 후대정맥으로 진입했다; 이는 단일 간외 비장횡경막 단락(흰색 화살표, 패널 D)으로 분류되었다. Cr, 두개골; Cd, 꼬리
도 20은 셀로판 밴드를 이용하여 단락 혈관을 처리하는 수술 중 사진을 보여주는 그림이다. 검은 화살표는 비장횡경막 단락을 나타낸다(패널 A). 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드를 단락 혈관에 감쌌다. 셀로판 밴드는 혈관 경계를 따라 가늘어지지 않으면서 단락 부근을 단단히 감쌌으며(검은 화살표), 두 개의 중간 크기의 헤모클립을 이용하여 셀로판 밴드를 고정하였다(패널 B).
도 21은 방사선 이미지를 이용하여 간 크기를 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 선천적 간외 문맥전신성 단락을 가지는 3년생의 난소 제거된 암컷 말티즈 개에서 좌외측(패널 A) 및 복배측(패널 B) 횡와에 대해 수술 전 방사선 이미지를 촬영하였다. 좌외측 방사선 촬영 이미지를 통해 소간증(Microhepatica)을 확인하였다. 간 길이(검은색 이중 화살표)는 2.95 cm이고 2번 요추 길이(흰색 이중 화살표)는 1.24 cm이고, 간 비율은 2.38이다(패널 A). R, 오른쪽
도 22는 셀로판 밴드 수술 후의 단락 직경 변화를 보여주는 그림이다. 수술 2주 뒤에 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 가장 큰 직경 감소가 관찰되었다. 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드그룹에 비해 더 빨리 직경이 감소하였다(p = 0.00). *p 값이 0.05 미만인 경우 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 사이에 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
도 23은 셀로판 밴드 수술 이후의 문맥 직경의 변화를 보여주는 그림이다. 문맥 직경은 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 12주간 꾸준히 증가하였다. 수술 전과 수술 후 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 및 12 주 후의 두 그룹 간의 문맥 직경의 유의한 차이는 없었다(p= 0.08). p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
도 24는 비장대정맥 단락의 수술 전 초음파 이미지를 보여주는 그림이다. 단락 혈류는 이간성(hepatofugal)인 것으로 나타났다(패널 A, B). 문맥, 후대 정맥, 단락 및 비장 정맥을 동정하였다(패널 C, D). SPV, 비장 정맥; CVC, 후대정맥; PV, 문맥, SV, 비장 정맥
도 25는 셀로판 밴드 수술 후의 담즙산 농도의 식전 및 식후 변화를 보여주는 그림이다. 식전 및 식후 담즙산 농도는 수술 전 모든 그룹에서 높았다. 담즙산 농도는 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 수술 후 4주 및 8주까지 서서히 감소하는 경향을 보였다. 구멍 뚫린 셀로판 밴드 중 5 mm 및 6 mm 너비 그룹 간에 수술 전, 수술 후 4주 및 8주 뒤에 식전 및 식후 담즙산 농도에서의 유의한 차이는 없었다(p >0.05). p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. Preop, 수술전; pre, 식전; post, 식후
도 26은 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 군에서 셀로판 밴드 수술 1주일 후 간 크기의 변화를 보여주는 그림이다. 수술 전 방사선 촬영에서, 2번 요추 길이(파란색 이중 화살표) 및 간 길이(검은색 이중 화살표)는 각각 1.21mm 및 3.48mm 였다. 간 비율(hepatic ratio)은 2.88이었다(패널 A). 수술 1주 후 방사선 촬영 이미지를 통해 측정한 결과, 증가된 간 길이 및 간 비율은 각각 5.40 mm 및 4.46이다(패널 B).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 셀로판 밴드의 래빗 모델에서의 혈관 감쇄 효과

실험방법

실험 동물

3.5-4.0kg의 뉴질랜드 화이트(NZW) 래빗 24마리를 DBL(Chungbuk, Korea)에서 구입하고 1주일간 환경, 먹이, 식수에 적응하도록 하였다. 래빗은 다음의 조건 하에서 한 마리씩 우리에서 사육하였다: 온도, 20 ± 2 ℃; 상대 습도, 50 ± 5; 명/암 주기, 12 시간; 먹이와 식수에 대한 접근을 제한하지 않음. 동물 실험은 건국대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 수행하였다(승인 번호 KU17061-1).

실험군

24마리의 NZW 래빗을 6개 그룹으로 나누었다. 양 다리에 존재하는 각각의 외부 장골정맥(장골 vein)에 대해 셀로판 밴드 수술을 수행하였다; 총 48개의 외부 장골정맥에 대해 6개의 각기 다른 셀로판 밴드를 사용하였다. 실험은 세션당 8마리 래빗으로 3개의 독립적인 세션으로 수행하였다. 8개 외부 장골정맥의 3개 세트에 대해 4mm, 5mm 및 6 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드를 사용하였고, 나머지 8개 외부 장골정맥의 3개 세트에 대해서는 4mm, 5mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드를 사용하였다.

셀로판 밴드의 제작

상용화된 셀로판(HomoBiaxially Oriented Polypropylene film, Indopoly, Indonesia)을 12, 15 및 18mm 너비의 밴드로 자르고 세로로 두 번 접어서 3중층 셀로판 밴드를 만들었다(도 1-1). 3중층 셀로판 밴드를 60℃에서 가열하여 층이 분리되지 않도록 하였다. 최종적인 셀로판 밴드는 각각 4mm, 5mm 및 6 mm 폭에 10 cm길이가 되었다.

구멍이 뚫린 셀로판 밴드를 제작하기 위해, 셀로판 밴드 중앙에 1 mm 바이옵시 펀치를 이용하여 6개의 둥근 구멍을 만들되 2 mm 간격으로 구멍을 형성하여 찢어지지 않도록 하였다. 이식 전 에틸렌 옥사이드를 이용하여 살균하였다.

주사 전자 현미경

전계방사형 주사전자현미경(FESEM, HitachiSU8010, Tokyo, Japan)(도 1-2)을 이용하여 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 및 구멍 없는 셀로판 밴드의 표면 거칠기를 평가하였다. 12 mm 양면 전도성 접착 테이프를 이용하여 셀로판 밴드를 표본 고정기 상에 마운팅하였다(도 1-2). 셀로판 밴드가 비 전도성 물질로 만들어졌기 때문에, 미세구조의 시각화를 위해서는 온도 변화 및 기질 조성에 영향을 덜 받는 백금 코팅이 필요하다. 백금 코팅된 셀로판 밴드를 적절한 높이로 마운팅하고 표본 교환 로드에 접착시킨 뒤, 적절한 배율과 초점을 조정하여 이미지를 수득하였다. 가속 전압은 3000 V이고 진공 전압은 3 kV이다.

구멍 없는 셀로판 밴드 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 간의 표면-거칠기의 차이, 구멍이 뚫린 셀로판 밴드의 경계 주변의 형태 및 각 셀로판 밴드의 옆면 두께를 관찰하였다.

수술 과정

래빗에 30 mg/kg 세파졸린(cefozol inj.®, Koruspharm. Co., Ltd., Seoul, Korea) 및 0.1 mg/kg 부토파놀(Butophan Inj.®, Myungmoon Pharm. Co., Ltd., Seoul, Korea)을 먼저 정맥주사하고 35 mg/kg 케타민(케타민 50®, YUHAN Ltd., Seoul, Korea) 및 5 mg/kg 자일라진(Rompun® inj., BAYER Ltd., Seoul, Korea)을 근육주사하여 마취시킨 다음 3% 이소플루란(I-Fran liquid®,Hana Pharm. Co., Ltd., Seoul, Korea)을 기관 튜브로 주입하여 수술 진행 동안 유지하였다.

수술을 위해 복부를 제모하고 무균상태를 만들었다. 래빗을 중앙 개복을 위해 배횡와 자세로 두었다. 배꼽에서 골반 방향으로 6 cm 배쪽정중 개복 절개를 하였다. 젖은 거즈를 이용하여 소장을 꺼내고 수술 부위를 노출시키기 위해 방광천공법(cystocentesis)을 수행하였다. 외부 장골정맥을 확인하여 주변에 우각(right-angled) 해부겸자(dissecting forceps)를 이용하여 셀로판 밴드를 부착하였다. 셀로판 밴드가 가늘어지지 않으면서 혈관 주위로 지나가도록 중간 크기의 헤모클립(hemoclip)(Weck Tantalum Hemoclip®, Teleflex Incorporated., NC, U.S.A.)으로 고정하였다. 구멍 없는 셀로판 밴드를 좌측 외부 장골정맥 주변에 부착시키고 구멍이 뚫린셀로판 밴드를 우측 외부 장골정맥에 부착시켰다. 셀로판 밴드를 외부 장골정맥에 감싼 뒤(도 1-3), 복강을 따뜻한 식염수로 세척하고 폐복하였다.

초음파 측정

셀로판 밴드가 부착된 혈관에 혈류 존재를 측정하기 위해 컬러 도플러 초음파를 이용하였다. B-mode 초음파를 이용하여 직경을 측정하고 혈관의 구조적 변화를 관찰하였다. 이후 모든 과정에서 혈관 직경 측정은 동일한 초음파 기계(ProSound F75®, Hitachi Aloka Medical, Ltd., OH, U.S.A.)를 사용하여 수행하였다. 셀로판 밴드의 위치는 고정된 헤모클립을 통해 확인하였고, 혈관의 직경은 루멘의 시상 단면을 이용하여 측정하였다. 혈관 비투과성의 증가가 확인되면 컬러 도플러로 혈류를 확인하고, 루멘으로 여겨지는 부분만을 대상으로 직격을 측정하였다. 혈관 직경은 초음파 이미지를 이용하여 수술 전 및 수술 후 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 및 14 주 뒤에 측정하였다.

형광투시경 측정

혈류 확인을 위해, 셀로판 밴드로 감싼 외부 장골정맥에서의 이오헥솔(2 ml/kg IV; Omnipaque 300, GE Healthcare, Shanghai, China) 흐름을 C-arm 형광투시기(형광투시, KMC-650®, Gemss co., Ltd., Seongnam, Korea)를 이용하여 관찰하였다. 조영제인 이오헥솔을 래빗의 복재정맥(saphenous vein)에 삽입된 정맥 카테터를 통해 주입하였다. 형광투시는 조영제 주사와 동시에 개시하였으며, 완전한 폐색은 조영제 유동이 차단되는 것을 관찰함으로써 확인하였다.

육안 및 조직학적 검사

셀로판 밴드 수술 후 14주 경과된 래빗에서 혈관의 육안 및 조직학적 검사를 수행하였다. 모든 래빗을 마취상태에서 염화 칼륨을 주입함으로써 안락사시켰다. 폐색 여부의 육안 관찰을 위해 외부 장골정맥을 전부 제거하였다. 육안 관찰에서, 혈관, 셀로판 밴드 및 헤모클립 주변의 과립 조직을 확인하였다.

조직학적 검사를 위해, 헤모클립을 제거하고 조직을 10% 포르말린 용액에 12시간 동안 고정하였다. 표본에 자일렌을 첨가하고 파라핀에 포매한 다음 블록을 수득하였다. 자동 회전 마이크로톰을 이용하여, 조직을 4 μm 두께의 절편으로 잘랐다. 헤마톡실린 & 에오신(H&E) 염색을 수행하여 혈관 주변 부위와 혈관 내강을 관찰하였다. 각 혈관 층의 섬유화 정도, 염증의 존재 및 혈전 형성 여부를 조사하였다.

Masson 트리크롬 염색을 수행하여 혈관의 평활근 섬유와 세포외 기질을 포함하는 구조적 요소들을 정량하였다. Masson 트리크롬 염색에서, 근육(붉은색), 콜라겐 섬유(파란색) 및 섬유질 조직(blue)을 구분하기 위해 세가지 염료를 사용하였다. 모든 이미지를 디지털 슬라이드 스캐너를 이용하여 캡쳐하였다. Masson 트리크롬으로 염색된 슬라이드를 이용하여 이미징 소프트웨어(Image J, National institute of health, v1.52)로 섬유질 조직에 대한 조직학적 정량분석을 수행하였다. 파란색 염색 부위(섬유질 조직)를 측정하여 염색 정도에 따라1 내지 5까지의 점수를 매겼다. 높은 점수는 다량의 섬유질 조직이 생성되었음을 의미한다.

통계적 분석

모든 데이터는 통계 소프트웨어(SPSS statistics 25.0 for Windows, IBM, NY, U.S.A.)를 이용하여 분석하였으며, p<0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 초음파로 측정된 직경은 평균 및 표준편차(SD)로 나타내었으며, 반복적으로 수행된 ANOVA 검정을 통해 분석하였다. 독립적 시료에 대해 맨-휘트니 U-검정을 이용하여 상응하는 집단에 유의한 차이가 있는지 여부를 결정하였다. 크루스칼-왈리스 검정을 통해 6개 그룹의 변수들을 비교하였다.

실험 결과

주사 전자 현미경

60 x 배율의 주사 전자 현미경 관찰 결과 구멍 없는 셀로판 밴드의 앞면은 부드럽지만 구멍이 뚫린 셀로판 밴드의 구멍 주변은 거칠다는 것을 확인하였다(도 4a 및 4b). 구멍 없는 셀로판 밴드의 두께는 65 μm 였으며 구멍이 뚫린 셀로판 밴드의 두께는 102 μm 였다(도 4c 및 4e). 300 x 배율에서, 구멍이 뚫린 셀로판 밴드의 거친 경계부가 명확히 관찰되었고(도 4d), 구멍 주변에 장골(crest)이 형성되었으며 높이는 14 μm로 측정되었다(도 4f).

초음파를 이용한 혈관 직경 변화 관찰

구멍 없는 셀로판 밴드 그룹 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹의 혈관 직경 변화를 초음파로 측정한 뒤 결과를 표 1-1에 평균±표준편차로 나타내었다.

모든 그룹의 혈관 직경이 점차적으로 감소하였다. 혈관 및 혈관 내강의 비투과성(혼탁성)이 모든 그룹에서 실험 전에 비하여 높아졌다(도 5). 컬러 도플러 초음파로 나타낸 바와 같이, 혈류의 소멸을 통해 완전한 폐색을 확인하였다(도 6). 혈관 직경의 주간(weekly) 변화에서 보는 바와 같이, 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹(도 7)에서는 4 mm 너비의 셀로판 밴드의 25%, 5 mm 너비의 셀로판 밴드의 50%, 6 mm 너비의 셀로판 밴드의 62.5%에서 수술 후 14±0.0주, 13±1.2주 및 11.2±2.3주 뒤에 각각 완전한 폐색이 달성되었다(p=0.025). 완전한 폐색을 위해 소요되는 시간에는 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹의 경우 4 mm, 5 mm 및 6 mm 너비의 그룹에서 유의한 차이가 없었다(p> 0.05). 5mm 및 6 mm 너비의 셀로판 밴드가 4 mm 너비의 셀로판 밴드에 비해 완전한 폐색을 더 잘 달성하였다.

구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서, 4 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드의 50%, 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드의 87.5%, 그리고 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드의 100%에서 수술 후 10±2.8주, 7.5 ±2.3주 및 6.4±2.5주 뒤에 각각 완전한 폐색이 관찰되었다(p=0.025)(도 8). 완전한 폐색은 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드에서 4 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드에 비하여 더 빨리 달성되었으며(p= 0.039), 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 간 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p= 0.072).

동일한 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드와 구멍이 뚫린 셀로판 밴드를 비교하면, 통계적으로 유의한 차이가 발견되었다. 4 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드에서 구멍없는 밴드에 비하여 2배 더 많은 완전 폐색이 관찰되었고(도 9), 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 주에 두 그룹간 유의한 차이가 확인되었다(p<0.05). 5 mm 너비의 셀로판 밴드 그룹에서, 구멍이 뚫린 셀로판 밴드는 구멍 없는 셀로판 밴드에 비해 1.5배 높은 완전 폐색율을 나타냈고(도 10), 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 주에 두 그룹간 유의한 차이가 확인되었다(p<0.05). 6 mm 너비의 셀로판 밴드 그룹에서, 구멍이 뚫린 셀로판 밴드는 구멍 없는 셀로판 밴드에 비해 1.6배 높은 완전 폐색율을 나타냈고(도 11), 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 주에 두 그룹간 유의한 차이가 확인되었다(p<0.05).

형광투시 검사

조영제를 이용하여 외부 장골정맥 및 내부 장골정맥에서의 수술전 혈류를 확인하였다(도 12a 및 12b). 수술 후 4주 뒤, 구멍 없는 셀로판 밴드 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드가 적용된 외부 장골정맥에서 조영제 유동이 감소하였다(도 12c 및 12d). 5mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드를 적용한 혈관에서, 수술 8주 후 헤모클립 위치에서 조영제 유동이 중단되었음을 확인하였다(도 12e). 5 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드가 적용된 혈관에서, 수술 4주 후에 비하여 수술 8주 후에 조영제 유동이 현저히 감소하였다(도 12f).

육안 관찰

대부분의 표본에서, 셀로판 밴드가 적용된 혈관의 내강에서 혈전을 확인하였으며, 이는 쉽게 분리되었다(도 13). 셀로판 밴드를 제거하자, 셀로판 밴드와 혈관벽 사이에 과립화 조직이 나타났다(도 13c). 혈관을 적출하자 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹의 45% (11/24)와 구멍이 뚫린 셀로판 밴드의 66% (16/24)에서 혈관 내강의 혈전이 관찰되었다. 모든 그룹의 표본에서, 구멍 없는 셀로판 밴드 및 구멍이 뚫린 셀로판 밴드는 두껍고 조밀한 연조직으로 포집되어 있었다. 구멍이 뚫린 셀로판 밴드가 구멍 없는 셀로판 밴드에 비하여 혈관 분리가 더 어려웠다(도 14).

조직학 검사

셀로판 밴드로 결찰된 혈관에서 경미하거나 중간 정도의 혈관 주위 섬유화와 육아종성 염증이 관찰되었다. 구멍이 뚫린 셀로판 밴드로 결찰된 혈관은 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹에 비해 좁은 내강을 가지고, 더 경미한 염증세포 침윤을 보였으며, 육아종 부위가 더 넓었다(도 15). 침윤 염증 세포에는 호중구, 대식세포, 섬유세포, 섬유아세포, 림프구 및 다핵거대세포가 포함되었다(도 16).

콜라겐 침착 정량화를 위해 Masson 트리크롬 염색을 수행하였다(도 17). 4 mm, 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드 그룹의 조직학적 점수의 평균 ± 표준편차는 각각 1.7 ± 0.47, 2.0± 0.82 및 2.3± 0.47였으며, 4 mm, 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹의 경우 각각 3.7± 0.47, 3.3± 0.47 및 4.7± 0.47 였다(도 18). 침착된 콜라겐 양은 4mm 및 6mm 너비의 구멍 없는 셀로판 밴드(p = 0.024)와 4mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드(p= 0.016) 간 유의한 차이를 보였다.

실시예 2: 문맥전신성 단락 개 모델에서의 임상적 적용

실험방법

실험 동물

2016년부터 2019년까지 선천적 단일 간외성 전신문맥단락(Extrahepatic single PSS)을 가진 6마리 개를 모집하여 동의서 수령 후 실험을 진행하였다. 셀로판 밴드 수술을 위해, 6마리 개를 무작위로 2개 그룹으로 나누어 3마리는 5 mm 구멍이 뚫린 셀로판 밴드를, 나머지 3마리는 6 mm 구멍이 뚫린 셀로판 밴드를 적용하였다.

셀로판 밴드의 제작

상용화된 셀로판(HomoBiaxially Oriented Polypropylene film, Indopoly, Indonesia)을 15 및 18mm 너비의 밴드로 자르고 세로로 두 번 접어서 3중층 셀로판 밴드를 만들었다. 3중층 셀로판 밴드를 60℃에서 가열하여 층이 분리되지 않도록 하였다. 최종적인 셀로판 밴드는 각각 5mm 및 6 mm 폭에 10 cm길이가 되었다. 셀로판 밴드 중앙에 1 mm 바이옵시 펀치를 이용하여 6개의 둥근 구멍을 만들되 2 mm 간격으로 구멍을 형성하여 찢어지지 않도록 하였다. 이식 전 에틸렌 옥사이드를 이용하여 살균하였다.

수술 전 조사

연령, 성별, 체중, 품종 및 임상적 증상에 대한 수술 전 데이터를 수집하였다. 모든 개는 수술 전 전혈구 검사, 혈청 검사 및 담즙산 농도 측정을 포함하는 혈액검사를 받았다. 단락의 위치, 크기 및 형태를 결정하기 위해 CT를 수행하였고(도 19), 방사선 촬영으로 간 크기를 확인하였다. 초음파 검사를 통해 혈류의 방향, 단락 혈관의 직경 및 문맥의 직경을 확인하였다.

수술 과정

모든 개를 배횡와 자세로 두고, 중앙 개복을 수행하였다. 개복은 배꼽에서 골반까지 영역에 대해 이루어졌다. 단일 간외성 PSS를 확인하고, 제작된 5 mm 또는 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드를 단락 혈관 경계선을 따라 단락 주위에 우각 해부겸자로 단단히 부착시킨 뒤 2개의 중간 크기 헤모클립으로 고정하였다(도 20). 세 마리 개는 개 5mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드로 결찰하고 나머지 세 마리는 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드로 결찰하였다. 구멍이 뚫린 셀로판 밴드를 단락 혈관 주변에 위치시킨 뒤, 심박수, 동맥압, 장 운동성 및 색상 및 췌장 색상을 포함하는 문맥고혈압의 신호를 확인하였다. 복강을 따뜻한 식염수로 세척하고 폐복하였다.

모든 개는 마취에서 회복된 후 1주일 간 신경후 증후군 및 문맥고혈압의 임상적 증상을 모니터링하였다. 항생제(메트로니다졸 10 mg/kg IV(Intravenous)), 세파졸린 30 mg/kg IV, 아목실린-카불라나텔 2.5 mg/kg IV), 락툴로스(Duphalac syrup®; JW pharm. Co., Ltd., Seoul, Korea), 안타시드(famotidine 0.5 mg/kg IV) 및 항경련제(Levetiracetam 20 mg/kg, KBr 40 mg/kg PO)를 투여하였다. 수술 후 개들에게 저단백질 식이를 먹였다.

차후 조사

셀로판 밴드 수술 후, 각각의 개의 임상적 증상 및 수술 후 합병증을 모니터링하고 혈액 검사를 수행하였다. 셀로판 밴드 수술 효용성 확인을 위해 단락과 문맥 혈관의 직경, 혈청 담즙산 농도 및 간 크기를 측정하였다. The changes in the 단락 및 문맥 직경의 변화는 셀로판 밴드 수술 전 및 수술 후 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 및 12주 후에 측정하였다. 단락 크기, 혈류 방향 및 문맥 직경을 측정하기 위해 초음파 검사를 수행하였으며, 혈청 담즙산 농도를 수술 전 및 수술 후 4주와 8주째에 측정하였다. 식전 및 식후 시료에서 혈청을 수집하였다. 셀로판 밴드 수술 전 및 수술 후 1, 4, 8 및 12주 후에 수행한 방사선 촬영을 통해 수득한 간 비율(hepatic ratio)에 기반하여 간 크기 변화를 측정하였다. 간 크기 측정을 위해 길이 횡경막 두 개부에서 우중엽 및 좌외측엽 정점까지 길이를 측정하고 2번 요추 길이로 나누었다(Cockett, 1986)(도 21). 간 크기의 증가 정도는 수술 전 간 크기에 대해 상대적으로 측정하였다.

통계적 분석

통계적 분석은 IBM SPSS Statistics 버전 25(IBM, Armonk, NY)를 이용하여 수행하였다. 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 간의 차이를 연령, 체중 및 단락 직경을 고려하여 독립시료 t-검정 또는 맨-휘트니 U 검정을 통해 분석하였다. 단락 직경, 문맥, 담즙산 농도 및 간 크기의 변화는 각 순위(크루스칼-왈리스 H 검정)의 일원분산분석을 이용하여 비교하였으며 p<0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 간의 관계는 맨-휘트니 U-검정으로 분석하였으며, p<0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과

실험동물 특성

실험 대상인 6마리 개의 특성은 표 2에 요약하였다. 개의 품종은 말티즈, 푸들, 포메리안, 슈나우저, 혼혈종 및 비숑 프리체이다. 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에는 난소제거된 암컷 개 1 마리, 암컷 개 한 마리 및 거세된 수컷 개 1 마리가 포함되었고, 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에는 난소제거된 암컷 개 1마리, 암컷 개 1 마리 및 거세된 수컷 개 1 마리가 포함되었다. 실험 당시 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹의 평균(±표준편차) 연령은 각각 2.8 ±2.9년 및 1.8 ±1.6년으로, 두 그룹당 연령의 유의한 차이는 없었다(p = 0.70). 평균(±표준편차) 체중은 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 각각 3.8 ±2.6 kg 및 4.9 ±2.3 kg으로서, 체중 역시 두 그룹간 유의한 차이를 보이지 않았다(p= 0.70). 실험동물의 단락 형태는 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹의 3마리 개는 비장대정맥 단락이고, 6mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹은 비장횡경막, 비장대정맥 및 우측 위대정맥단락이다. 평균(±표준편차) 단락 직경은 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 각각 7.8±1.2mm 및 6.1±0.9mm 였다. 수술전 단락 직경은 5 mm 및 6 mm 너비 구멍의 셀로판 밴드 그룹에서 유의한 차이가 없었다(p= 0.40).

선천성 간외 문맥전신성 단락을 가진 6마리 개의 특성

번호	품종	연령	성별	체중(kg)	단락 형태	너비
1	슈나우저	6년	난소제거 암컷	6.7	비장대정맥	5 mm
2	포메리안	6월	암컷	1.7	비장대정맥	5 mm
3	푸들	1년7월	거세수컷	3.1	비장대정맥	5 mm
4	말티즈	3년7월	난소제거 암컷	2.8	비장횡경막	6 mm
5	혼혈종	1년2월	암컷	4.6	비장대정맥	6 mm
6	비숑 프리체	6월	거세수컷	7.3	우측 위대정맥	6 mm

임상 평가

5mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내의 2마리 개 및 6mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내의 2마리 개에서 운동장애, 우울증, 발작 또는 선회증(circling)과 같은 신경학적 증상이 관찰되었다(표 2-2). 5mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내 1 마리 개에서 구토와 설사를 포함하는 위장관 신호가 관찰되었고, 나머지 개들에서는 위장관 신호가 관찰되지 않았다. 5마리 개는 수술 후 3개월 동안 생존하였고, 관찰 종료 시점에 신경학적 증상 또는 위장관 신호가 관찰되었다.

5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내 한 마리 개에서 수술후 위장관 신호가 개선되었다. 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내에서 4주차에 한 마리, 6주차에 한 마리, 그리고 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내에서 6주차에 한 마리에서 수술후 신경학적 증상의 개선이 관찰되었다. 수술 전 신경학적 증상을 보였던 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내 한미리 개는 셀로판 밴드 수술 후 5일 뒤에 신경학적 증상으로 인해 사망하였다. 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내에서 증상이 없던 한 마리 개는 수술 후에도 여전히 증상이 없었다(표 3).

6마리 개에서의 수술 전후의 임상적 신호

번호	수술전 임상증상의 지속 기간	위장관 신호	신경학적 신호	수술후 임상증상의 지속기간
1	2달	무증상	운동장애, 머리기울임, 선회증	4주
2	1주	구토, 설사	무증상	4주
3	1달	무증상	혼수상태, 머리누름, 협박반사 부재	6주
4	무증상	무증상	무증상	무증상
5	2주	무증상	신근 경직, 대부전마비	6주
6	1달	무증상	선회증, 감각 감소	사망

단락 혈관 및 문맥 직경의 변화

5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 수술 전후의 단락 직경, 혈류 방향 및 문맥 직경을 비교하였다. 수술 전 초음파에서, 두 그룹 모두 후대정맥(꼬리 대정맥)의 단락에서 요란한 혈류가 명백히 감지되었다. 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 및 6 mm 구멍이 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내의 선천적 간외성 PSS의 수술전 단락 직경은 각각 7.8 ± 1.2mm 및 6.1 ± 0.9 mm였다(표 2-3). 모든 그룹에서 단락 혈관 직경은 점차 감소하였으며 문맥 직경은 점차 증가하였다(도 2-4). 수술 수 2, 3, 4 및 6주 째에 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 간 단락 직경 변화에 있어 유의한 차이가 관찰되었다(p= 0.00).

5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 수술전 평균 문맥 직경은 각각 2.4 ± 1.8mm 및 2.7 ± 0.3mm였다(표 4). 모든 그룹에서 문맥 직경의 증가가 확인되었다(도 23). 두 그룹 간 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 및 12주 째에 문맥 직경 변화에 있어 유의한 차이는 없었다(p= 0.08). 컬러 도플러 초음파로 이간성 혈류(Hepatofugal flow)를 관찰한 결과 시간이 경과하자 간향성 혈류(hepatopetal flow)로 전환되었다.

5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서, 완전한 폐색이 수술 후 8주째에 3마리 개에서 달성되었다. 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 4주 차에 두 마리 개에서, 6주 차에 한 마리 개에서 완전한 폐색이 달성되었다.

6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내 2마리 및 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내 3마리 개에 대해 12시간 금식 후 수술전 식전 혈청 담즙산 수준을 측정하였다. 수술전 식전 담즙산 농도는 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹의 경우 168.8 ± 42.5μmol/L이고 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서는 170.5±19.6 μmol/L로 나타났다(기준 범위, 0-10 μmol/L); 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹간 유의한 차이는 없었다(p= 1.00). 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내 한 마리는 정상적인 식전 혈청 담즙산 수준(9.8μmol/L)을 보였다. 수술전 식후 담즙산 농도는 먹이를 준 후 2시간 뒤에 측정하였다; 식전 혈청 담즙산 수준이 정상이었던 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내 한 마리 개는 정상의 식후 혈청 담즙산 수준을 보였다(22.4 μmol/L)(기준 범위, 0-25 μmol/L). 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹과 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹의 수술전 식후 담즙산 농도는 각각 431.5±153.7 μmol/L 및 341.5±63.6 μmol/L로서, 두 그룹 간 담즙산 농도의 유의한 차이는 없었다(p= 0.564)(표 5).

수술 4주 후, 식전 담즙산 농도는 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내의 한 마리에서 7.1 μmol/L로서 정상 범위 내임을 확인하였다. 동일 그룹으 나머지 2마리는 98 μmol/L 및 71.6 μmol/L 였고 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내의 구마리 개에서는 43 μmol/L 및 94.5 μmol/L였다. 5 mm 및 6 mm너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 수술후 식전 담즙산 농도에 대한 유의한 차이는 없었다(p= 1.00). 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내의 2마리 개에서 식후 담즙산 농도는 156μmol/L 및 341μmol/L 였고 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내의 두 마리 개에서는 98μmol/L 및 197.6 μmol/L였다. 두 그룹 간 수술후 식후 담즙산 농도에 유의한 차이는 없었다(p= 1.00).

수술 8주 후, 식전 담즙산 농도는 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내의 2 마리 개(9.6 μmol/L 및 8.9 μmol/L)와 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내의 2마리 개(8.2 μmol/L and 7.9 μmol/L)에서 모두 정상 범위 내임을 확인하였다. 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내 1마리 개는 증가된 담즙산 농도(43 μmol/L)를 보였다. 식후 담즙산 농도는 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 11.8 μmol/L 및 24.6 μmol/L이고 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 22.7 μmol/L 및 22.5μmol/L였다. 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹 내 1 마리 개는 증가된 식전 담즙산 농도(103.6 μmol/L)를 나타냈다. 수술후 두 그룹 사이에 식전(p= 0.083) 및 식후 (p= 0.564) 담즙산 농도의 유의한 차이는 없었다(도 25).

간 크기

방사선 촬영 결과 PSS를 가진 모든 개에서 소간증이 확인되었다. 셀로판 밴드 수술 후, 간 크기가 1주일만에 극적으로 증가하였다. 수술전 간 비율은 5 mm 및 6 mm 그룹에서 각각 2.46±0.39 및 2.33±0.27였다. 첫째주에 간 비율은 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 각각 4.22 ±0.25 및 3.83 ±0.41였다. 수술 1주 후 간 비율은 5 mm 및 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서 각각 1.7 및 1.6 배 증가하였고(도 26), 이후 기간 동안에는 꾸준히 증가하였다(도 27). 5 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹에서, 2마리 개는 4주째에, 한마리 개는 8주째에 간 비율이 정상 범위까지 증가하였다(기준 범위, 4.8±0.34). 6 mm 너비의 구멍 뚫린 셀로판 밴드 그룹의 간 비율은 4주 째에 한 마리, 또 다른 한 마리는 12주 째에 정상 범위까지 증가하였다(표 2-5). 수술 전 및 수술 후 1주, 4주, 8주 및 12주 시점에 두 그룹 간 간 비율의 유의한 차이는 없었다(p>0.05).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

1. 0.5 - 1.5 mm 직경의 소공(pore)을 가지는 다공성(porous) 유기 중합체 필름을 포함하고,
   상기 소공(pore)은 상기 유기 중합체 필름을 타공(punching)하여 형성된 것으로 상기 소공 주변에 장골(crest)이 형성된 것을 특징으로 하는 생체 내 혈관 감쇄용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 소공은 상기 다공성(porous) 유기 중합체 필름 내에 4개 내지 12개가 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 소공 간의 간격은 1 - 3 mm 인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 유기 중합체 필름은 셀룰로오스 필름 또는 폴리프로필렌 필름인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 유기 중합체 필름은 4 - 8 mm의 너비를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 유기 중합체 필름은 2중층(double layer) 또는 3중층(triple layer)인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관 감쇄는 혈관 폐색(occlusion)인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 기형 혈관 관련 질환의 치료용 조성물.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 기형 혈관 관련 질환은 동맥류(aneurysm), 척수 혈관기형(spinal arteriovenous malformation), 뇌동정맥 기형(Cerebral arteriovenous malformation), 폐동정맥기형(Pulmonary Arteriovenous Malformation) 및 문맥전신단락(Portosystemic Shunt)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 삭제
11. 유기 중합체 필름의 표면에 타공기를 이용하여 소공을 형성시키는 단계를 포함하는 생체 내 혈관 감쇄용 조성물의 제조 방법.
    

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