KR102379499B1 - Molecular marker for specifically detecting Chikungunya virus and uses thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 분자마커를 이용하면 단시간 내 특이적이고 효율적인 치쿤구니야 바이러스의 검출이 가능할 수 있으므로 감염병 진단 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a molecular marker capable of specifically detecting Chikungunya virus and its use, and by using the molecular marker according to the present invention, specific and efficient detection of Chikungunya virus is possible Therefore, it may be usefully used in the field of infectious disease diagnosis.

Description

치쿤구니야 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for specifically detecting Chikungunya virus and uses thereof}Molecular marker for specifically detecting Chikungunya virus and uses thereof

본 발명은 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to molecular markers capable of specifically detecting Chikungunya virus and uses thereof.

최근 급격한 기후변화로 인해 전 세계적으로 모기 매개 감염병 발생이 증가하고 있으며, 우리나라도 해외여행 및 국제교류 증가로 인해 이러한 모기 매개 감염병의 국내 유입 가능성이 증대되고 있다. 국외유입 감염병은 지속적으로 증가하여 2010년 이후 매해 300-400여 명이 보고되었고 2014년과 2015년에도 각각 400명과 491명이 발생하여 증가 추세에 있다. 2015년에 신고된 주요 국외유입 감염병은 뎅기열(52%), 말라리아(14%), 세균성이질·A형간염(각 5%), 장티푸스(4%) 등이다. 유입 국가는 필리핀, 인도네시아, 태국, 인도, 중국, 베트남, 미얀마, 말레이시아 등 아시아 지역(약 84%)에 주로 분포하고 적도기니, 남수단 등 아프리카 지역(약 13%)에 일부 분포한다. 일반적으로 모기 매개 바이러스에 의한 인체 감염은 암컷 모기가 사람을 물때 발생한다. 대표적인 모기 매개 바이러스에 의한 질병은 말라리아, 뎅기 감염증(뎅기열), 웨스트나일열, 치쿤구니야열, 황열, 일본뇌염 등이 있으며, 연간 700만명 이상이 감염이 되고 전세계적으로 발생하며 감염으로 인한 사망자가 많은 편이다.Recently, the occurrence of mosquito-borne infectious diseases is increasing worldwide due to rapid climate change, and the possibility of introducing such mosquito-borne infectious diseases into Korea is increasing due to the increase in overseas travel and international exchange in Korea. The number of imported infectious diseases has continued to increase, with 300-400 cases reported every year since 2010. The major imported infectious diseases reported in 2015 were dengue fever (52%), malaria (14%), bacterial shigella and hepatitis A (5% each), and typhoid (4%). The imported countries are mainly distributed in Asia (about 84%) such as the Philippines, Indonesia, Thailand, India, China, Vietnam, Myanmar, and Malaysia, and partly in Africa (about 13%) such as Equatorial Guinea and South Sudan. In general, human infection by mosquito-borne viruses occurs when a female mosquito bites a human. Representative diseases caused by mosquito-borne viruses include malaria, dengue infection (dengue fever), West Nile fever, chikungunya fever, yellow fever, and Japanese encephalitis. there are many

치쿤구니야열은 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)에 감염된 매개 모기로부터 사람에게 전염되는 바이러스성 질환으로, 사람과 사람간의 전파는 일어나지 않아 격리는 필요없으며 별도의 접촉자 관리도 요하지 않는다. 치쿤구니야열은 고열과 심한 관절 통증을 유발하며 근육통, 두통, 메스꺼움, 피로, 발진 등 다른 증상을 수반하기도 한다. 치쿤구니야열에 의한 관절 통증은 때때로 신체를 쇠약하게 하고, 고통의 지속 기간은 다양하다. 현재까지 치쿤구니야열에 특화된 치료제는 개발되어 있지 않은 상황이다.Chikungunya fever is a viral disease transmitted to humans from mosquito-borne mosquitoes infected with Chikungunya virus. Chikungunya fever causes high fever and severe joint pain, and may be accompanied by other symptoms such as muscle aches, headaches, nausea, fatigue, and rashes. Joint pain caused by chikungunya fever is sometimes debilitating, and the duration of the pain varies. To date, no specific treatment for chikungunya fever has been developed.

치쿤구니야 바이러스는 열대 아프리카 및 아시아에 자생하고, 토가바이러스과(Togaviridae)의 알파-바이러스(alpha-virus)에 속하며, 절족동물에 의하여 매개되어 척추동물에 전파되는 바이러스(Arthropod-born vertebrate viruses)인 "아르보바이러스(Arbovirus)"이다. 주로 아프리카, 중남미 등지에서 발병하고 있으며, 브라질의 경우 전년 대비 감소세이나 지속적이 유행이 지속되고 있으며, 국내의 경우도 18년도에 총 12명 발생한 것으로 보고되었다.Chikungunya virus is native to tropical Africa and Asia, belongs to the alpha-virus of the Togaviridae family, and is a virus mediated by arthropods and transmitted to vertebrates (Arthropod-born vertebrate viruses) is an "Arbovirus". It mainly occurs in Africa, Central and South America, etc. In Brazil, although it is decreasing compared to the previous year, the epidemic continues. In Korea, a total of 12 cases were reported in 2018.

한편, 한국등록특허 제2030245호에는 TF(transframe fusion protein) 유전자를 표적으로 한 '치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0118176호에는 '치쿤군야의 검출을 위한 프로브 및 프라이머'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '치쿤구니야 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.On the other hand, Korean Patent No. 2030245 discloses an 'oligonucleotide set for detecting chikungunya virus and its use' targeting a TF (transframe fusion protein) gene, and Korean Patent Publication No. 2011-0118176 discloses 'chikungunya virus' 'Probes and primers for the detection of

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 치쿤구니야 바이러스의 염기서열 정렬을 통하여 치쿤구니야 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 염기서열 부위를 선별하였고, 선별된 부위의 서열을 기반으로 프라이머 세트를 제작하였다. 제작된 프라이머 세트들과 합성된 RNA 주형을 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 및 RT real time PCR을 수행한 결과, 비특이적 증폭 반응이 나타나지 않으면서, 합성된 RNA 주형의 100 fg 농도까지 검출이 가능하고, 지카 바이러스, 일본뇌염 바이러스 및 뎅기 바이러스 RNA 시료에 대해서는 교차 반응이 없는, 치쿤구니야 바이러스 특이적 프라이머 세트를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above requirements, and the present inventors selected a nucleotide sequence site capable of specifically detecting chikunguniya virus through nucleotide sequence alignment of the chikunguniya virus, and the sequence of the selected site Based on the primer set was prepared. As a result of performing RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) and RT real time PCR using the prepared primer sets and the synthesized RNA template, the non-specific amplification reaction did not appear, and up to 100 fg concentration of the synthesized RNA template was performed. The present invention was accomplished by identifying a chikunguniya virus-specific primer set that is detectable and does not cross-react with Zika virus, Japanese encephalitis virus and dengue virus RNA samples.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a primer set for detecting Chikungunya virus comprising an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 치쿤구니야 바이러스 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention is the primer set; And it provides a kit for detecting chikunguniya virus, including a reagent for performing an amplification reaction.

또한, 본 발명은 치쿤구니야열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료, 또는 야생에서 수집된 모기 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 치쿤구니야 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a method comprising: isolating total RNA from a biological sample isolated from a patient suspected of having chikungunya fever, or a mosquito sample collected in the wild; using the isolated total RNA as a template and performing RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) using the primer set of the present invention to amplify a target sequence; and detecting the product of the amplification step; it provides a method for detecting a chikunguniya virus, including.

본 발명에 따른 치쿤구니야 바이러스 검출용 분자마커를 이용하면 단시간 내 특이적이고 효율적인 치쿤구니야 바이러스의 검출이 가능할 수 있으므로, 신종감염병 발생에 대비하고, 군과 같은 특수 목적의 집단생활을 하는 곳에서 감염병 발생 시 조기 진단을 통하여 감염병 확산의 차단이 가능할 것으로 사료된다.The use of the molecular marker for chikungunya virus detection according to the present invention enables specific and efficient detection of chikungunya virus within a short period of time. It is thought that it is possible to block the spread of an infectious disease through early diagnosis when an infectious disease occurs.

도 1은 5개의 프라이머 세트(CHIKV1, CHIKV2, CHIKV3, CHIKV4, CHIKV5; 표 3 및 표 4 참고)를 이용한 converntional RT-PCR의 결과이다.
도 2는 4개의 프라이머/프로브 세트(CHIKV1, CHIKV2, CHIKV3, CHIKV4; 표 3 및 표 4 참고)의 검출한계를 확인하기 위해 단계 희석한 주형 RNA를 이용한 RT real time PCR의 standard curve 및 Ct 값이다.
도 3은 2개의 프라이머/프로브 세트(CHIKV1, CHIKV4)의 교차 반응 실험 결과이다.
도 4는 2개의 프라이머/프로브 세트(CHIKV1, CHIKV4)와 시판용 치쿤구니야 바이러스 진단용 키트와 비교 실험 결과이다.
1 shows the results of converntional RT-PCR using five primer sets (CHIKV1, CHIKV2, CHIKV3, CHIKV4, CHIKV5; see Tables 3 and 4).
2 is a standard curve and Ct value of RT real time PCR using template RNA diluted stepwise to confirm the detection limit of four primer / probe sets (CHIKV1, CHIKV2, CHIKV3, CHIKV4; see Table 3 and Table 4) .
3 is a cross-reaction test result of two primer/probe sets (CHIKV1, CHIKV4).
4 is a comparison experiment result with two primer/probe sets (CHIKV1, CHIKV4) and a commercially available chikunguniya virus diagnostic kit.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a primer set for detecting Chikungunya virus comprising an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.

치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)는 (+)가닥 RNA 바이러스로, 게놈의 크기는 약 12kb 이고, 5'-end에 비구조 단백질(non-structural protein; nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4)을 3'-end에 구조 단백질[capsid protein C, envelope protein E(E3-E2-6K-E1)]을 코딩하고 있다.Chikungunya virus is a (+)-stranded RNA virus with a genome size of about 12 kb and 3' non-structural proteins (nsP1, nsP2, nsP3 and nsP4) at the 5'-end. At -end, structural proteins [capsid protein C, envelope protein E (E3-E2-6K-E1)] are encoded.

본 발명에 따른 상기 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 치쿤구니야 바이러스의 구조 단백질 코딩 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다.The oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 according to the present invention are primer sets capable of specifically amplifying the structural protein coding gene of chikunguniya virus.

또한, 본 발명의 상기 프라이머 세트는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the primer set of the present invention may further include an oligonucleotide probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and can serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should allow synthesis of the extension product to begin. The specific length and sequence of the primer will depend on the conditions of use of the primer, such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the DNA or RNA target required.

본 명세서에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다.As used herein, the term "probe" refers to a natural or modified monomer comprising deoxyribonucleotides and ribonucleotides that hybridize with a complementary single-stranded target sequence to form a double-stranded molecule (hybrid) or a linear oligomer having a bond. it means.

본 발명의 일 구현예에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 프로브는 형광물질을 부착하여 제조하였다. 상기 형광물질은 HEX, FAM, JOE, ROX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 또는 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등의 염료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the primer set according to an embodiment of the present invention, the probe was prepared by attaching a fluorescent material. The fluorescent material is HEX, FAM, JOE, ROX, Texas Red, TET, TRITC, TAMRA, fluorescein, fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green. , rhodamine red, tetramethylrhodamine, FITC, Oregon green, Alexa Fluor, cyanine-based dyes or thiadicarbocyanine It may be a dye, but is not limited thereto.

상기 프라이머 또는 프로브는 각 프라이머 또는 프로브의 서열 길이에 따라, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 10의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 10의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.The primers or probes may contain 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more contiguous nucleotides in the sequences of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, depending on the sequence length of each primer or probe. It may include an oligonucleotide consisting of a fragment of For example, the primer (20 oligonucleotides) of SEQ ID NO: 10 is an oligonucleotide consisting of fragments of 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 10. may include In addition, the primer may also include an addition, deletion or substitution of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.

본 명세서에 있어서, 프라이머 또는 프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.In the present specification, the oligonucleotide used as a primer or probe may also include a nucleotide analogue, for example, phosphorothioate, alkylphosphorothioate or peptide nucleic acid. or may include an intercalating agent. In addition, the primer may incorporate additional features that do not change the basic properties of the primer to serve as the starting point of DNA synthesis. The suitable length of the primer is determined by the characteristics of the primer to be used, but is usually used in a length of 15 to 30 bp. The primer need not be exactly complementary to the sequence of the template, but must be complementary enough to form a hybrid-complex with the template.

본 발명은 또한, 상기 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a primer set for detecting the Chikungunya virus; And it provides a kit for detecting Chikungunya virus, including a reagent for performing an amplification reaction.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 치쿤구니야 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 전술한 바와 같으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the primer set for detecting the chikunguniya virus is as described above, and the reagent for performing the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, and a buffer, and ribo It may further include a nuclease (ribonuclease) inhibitor, a thermostable polymerase, and the like, but is not limited thereto. The DNA polymerase may be a reverse transcriptase such as an RNA dependent DNA polymerase, a reverse transcriptase from a variety of sources, for example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase. derived virus reverse transcriptase (AMV RTase), murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase (MuLV RTase) and Rous-associated virus 2 reverse transcriptase (RAV-2 RTase) ), but is not limited thereto. In addition, the buffer may include both a reverse transcription buffer and a PCR buffer, and the heat-resistant polymerase may be EF Taq polymerase.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In one embodiment of the present invention, the kit may further include a user guide describing optimal conditions for performing the reaction. The handbook is a printout explaining how to use the kit, eg, how to prepare reverse transcription buffer and PCR buffer, and suggested reaction conditions. Instructions include a brochure in the form of a pamphlet or leaflet, a label affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. In addition, the guide includes information published or provided through electronic media such as the Internet.

본 발명은 또한,The present invention also

치킨구니야열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료, 또는 야생에서 수집된 모기 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;isolating total RNA from a biological sample isolated from a patient suspected of having chicken gonad fever or a mosquito sample collected in the wild;

상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및using the isolated total RNA as a template and performing RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) using the primer set of the present invention to amplify a target sequence; and

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)를 검출하는 방법을 제공한다.It provides a method for detecting Chikungunya virus, including; detecting the product of the amplification step.

본 발명의 방법은 치쿤구니야열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료, 또는 야생에서 수집된 모기 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 생물학적 시료는 개개인으로부터 얻어지는 폭넓은 범위의 모든 생물학적 체액을 포함하고, 바람직하게는 치쿤구니야열 의심 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 포유동물로부터 체액 및 조직, 생검 등을 획득하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.The method of the present invention comprises isolating total RNA from a biological sample isolated from a patient suspected of having chikungunya fever or a mosquito sample collected in the wild. The biological sample includes a wide range of all biological fluids obtained from an individual, and preferably includes cells, tissues, biopsies, paraffin tissues, blood, serum, plasma, urine, and combinations thereof derived from a subject suspected of chikungunya fever. It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto. A method for obtaining a body fluid, tissue, biopsy, etc. from a mammal may use a conventional method known in the art.

상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.A method for isolating total RNA from the sample may use any method known in the art, for example, a phenol extraction method may be used. A target sequence may be amplified by performing RT-PCR using the isolated total RNA as a template and using one or more oligonucleotide primer sets according to an embodiment of the present invention as primers. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.

또한, 본 발명에 따른 상기 증폭 산물의 확인 즉, 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.In addition, the identification, ie, detection, of the amplification product according to the present invention may be performed through gel electrophoresis, capillary electrophoresis, DNA chip, radiometric measurement, fluorescence measurement, or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one of the methods for detecting the amplification product, gel electrophoresis may be performed, and agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis may be used depending on the size of the amplification product. In addition, capillary electrophoresis can be performed. Capillary electrophoresis may use, for example, an ABi Sequencer. In addition, in the fluorescence measurement method, when PCR is performed by labeling the 5'-end of the primer with Cy-5 or Cy-3, the target sequence is labeled with a detectable fluorescent labeling material, and the labeled fluorescence is measured using a fluorescence meter. can do. In addition, the radioactive measurement method is a radioactive isotope such as 32 P or 35 S added to the PCR reaction solution during PCR to label the amplification product, and then a radioactive measuring instrument, for example, a Geiger counter (Geiger counter) or liquid scintillation Radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples. However, the following examples only illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1. 진단 유전자 합성 및 진단 프라이머/프로브 디자인 및 합성Example 1. Diagnostic gene synthesis and diagnostic primer/probe design and synthesis

치쿤구니야 바이러스 strain의 유전자 서열을 기반으로 상동성 분석을 통하여 검출부위를 선정하였다. 상동성 분석은 MEGA(http://www.megasoftware.net/) 5.1 프로그램을 이용하였으며, 프라이머 및 프로브는 다른 모기 매개 바이러스와는 상동성이 떨어지고, 치쿤구니야 바이러스 strain간에는 상동성이 높은 염기서열 부위를 선정한 후, 정방향 및 역방향 프라이머 세트의 조합에 의해 증폭되는 산물의 크기가 약 150~300 bp가 되도록 제작하였다.Based on the gene sequence of the Chikunguniya virus strain, the detection site was selected through homology analysis. For homology analysis, MEGA (http://www.megasoftware.net/) 5.1 program was used. Primers and probes have low homology with other mosquito-borne viruses, and nucleotide sequences with high homology between chikunguniya virus strains. After the site was selected, the size of the product to be amplified by the combination of the forward and reverse primer sets was about 150 to 300 bp.

염기서열 분석을 위한 참고 서열Reference sequence for sequencing analysis GenBank accession no.GenBank accession no. NC_004162NC_004162 Chikungunya virus, complete genomeChikungunya virus, complete genome MH229986MH229986 Chikungunya virus strain 06113879Chikungunya virus strain 06113879 KX702402KX702402 Chikungunya virus strain Chikungunya virus Homo sapiens/Haiti-2/2014Chikungunya virus strain Chikungunya virus Homo sapiens/Haiti-2/2014 KX702401KX702401 Chikungunya virus strain Chikungunya virus Homo sapiens/Haiti-1/2014Chikungunya virus strain Chikungunya virus Homo sapiens/Haiti-1/2014

보고된 각 strain에서 상동성이 떨어지는 염기서열은 하기 표 2의 base code를 이용하여 디자인하였다. 치쿤구니야 바이러스 검출을 위해 디자인된 프라이머 및 프로브의 정보는 표 3 및 표 4와 같다.Base sequences with poor homology in each reported strain were designed using the base codes in Table 2 below. Information on primers and probes designed for detection of chikungunya virus is shown in Tables 3 and 4.

염기 코드(Degenerate Base, C, Wobble bases, IUB code)Degenerate Base, C, Wobble bases, IUB code IUB 기호IUB symbol RR YY MM KK SS Mixed baseMixed base A, G (Y)A, G (Y) C, T (R)C, T (R) A, C (K)A, C (K) G, T (M)G, T (M) C, GC, G commentcomment puRinespuRines pYrimidinepYrimidine aMineaMine KetoKeto Strong
(3H-bonds)
Strong
(3H-bonds)
IUB 기호IUB symbol WW HH BB VV DD Mixed baseMixed base A, TA, T A, T, C (D)A, T, C (D) G, T, C (V)G, T, C (V) G, A, C (B)G, A, C (B) G, A, T (H)G, A, T (H) commentcomment Weak
(2H-bonds)
Weak
(2H-bonds)
Not GNot G Not ANot A Not TNot T Not CNot C

Figure 112020073491987-pat00001
Figure 112020073491987-pat00001

Figure 112020073491987-pat00002
Figure 112020073491987-pat00002

실시예 2. 최적 프라이머 세트 선별 테스트Example 2. Optimal Primer Set Selection Test

본 발명에서 사용한 치쿤구니야 바이러스의 주형 RNA(GenBank accession no. NC_004162 염기서열)는 PCR 반응으로 증폭한 후 정제하고, in vitro transcription 방법으로 RNA를 합성한 후 사용하였다.Chikunguniya virus template RNA (GenBank accession no. NC_004162 nucleotide sequence) used in the present invention was amplified by PCR reaction, purified, and used after synthesizing RNA by an in vitro transcription method.

디자인된 프라이머 세트(표 3 및 표 4)의 치쿤구니야 바이러스 특이도를 확인하기 위하여 conventional RT-PCR을 수행하였으며, 반응액은 표 5의 조성으로 구성하였으며, 프로토콜은 하기 표 6과 같다. conventional RT-PCR의 결과는 전기영동으로 확인하였으며, 겔의 농도는 아가로스 1.5%와 low melting 아가로스 1%를 사용하였다.Conventional RT-PCR was performed to confirm the specificity of the chikunguniya virus of the designed primer sets (Tables 3 and 4), and the reaction solution was composed of the composition of Table 5, and the protocol is shown in Table 6 below. The results of conventional RT-PCR were confirmed by electrophoresis, and the concentration of the gel was 1.5% agarose and 1% low melting agarose.

conventional RT-PCR 반응액 조성Composition of conventional RT-PCR reaction solution Componentcomponent volumevolume Template (1 ng/㎕)Template (1 ng/μl) 1~2 ㎕1-2 μl Forward primer (10 pmol/㎕)Forward primer (10 pmol/μl) 1 ㎕1 μl Reverse primer (10 pmol/㎕)Reverse primer (10 pmol/μl) 1 ㎕1 μl 2× PCR pre-mixture*2× PCR pre-mixture* 10 ㎕10 μl D.W.D.W. up to ~20 ㎕up to ~20 μl TotalTotal 20 ㎕20 μl * 2× PCR pre-mixture는 ㈜바이오니아의 2× PlusDual Star qPCR Mix 사용* 2× PCR pre-mixture uses Bioneer’s 2× PlusDual Star qPCR Mix

conventional RT-PCR 조건conventional RT-PCR conditions Reactionreaction StepStep Temp. (℃)Temp. (℃) TimeTime CycleCycle Reverse TranscriptionReverse Transcription 5050 30 min30 min Taq-polymerase activationTaq-polymerase activation 9595 5 min5 min
Reaction

reaction
denaturationdenaturation 9595 20 sec20 sec
40

40
annealingannealing 6060 20 sec20 sec extensionextension 7272 30 sec30 sec Final-extensionfinal-extension 7272 10 min10 min

5개의 프라이머 세트(CHIKV1 (189 bp), CHIKV2 (195 bp), CHIKV3 (224 bp), CHIKV4 (100 bp) 및 CHIKV5 (108 bp))를 사용한 conventional RT-PCR 결과, CHIKV5 프라이머 세트의 경우 비특이적 반응 산물이 함께 확인되어 해당 프라이머 세트를 제외시켰다(도 1).Conventional RT-PCR results using 5 primer sets (CHIKV1 (189 bp), CHIKV2 (195 bp), CHIKV3 (224 bp), CHIKV4 (100 bp) and CHIKV5 (108 bp)), non-specific reaction in the case of CHIKV5 primer set Products were identified together and the corresponding primer set was excluded (FIG. 1).

비특이적 반응이 확인되지 않은 4개의 프라이머 세트(CHIKV1 내지 CHIKV4)에 대해서 디자인된 프로브를 함께 적용하여 RT real time PCR을 수행하였다. 치쿤구니야 바이러스의 주형 RNA는 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg 및 100 fg/rxn으로 단계 희석하여 사용하였으며, 농도별 Ct값을 비교하였다. 각 실험은 3반복 수행하였다.RT real time PCR was performed by applying the probes designed for the four primer sets (CHIKV1 to CHIKV4) in which the non-specific reaction was not confirmed. Chikunguniya virus template RNA was used in serial dilutions of 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg and 100 fg/rxn, and Ct values for each concentration were compared. Each experiment was performed in triplicate.

RT real time PCR 반응액 조성Composition of RT real time PCR reaction solution Componentcomponent volumevolume Template (1 ng/㎕)Template (1 ng/μl) 1~2 ㎕1-2 μl Forward primer (10 pmol/㎕)Forward primer (10 pmol/μl) 1 ㎕1 μl Reverse primer (10 pmol/㎕)Reverse primer (10 pmol/μl) 1 ㎕1 μl Probe (10 pmol/㎕)Probe (10 pmol/μl) 1 ㎕1 μl 2× PCR pre-mixture*2× PCR pre-mixture* 10 ㎕10 μl D.W.D.W. up to ~20 ㎕up to ~20 μl TotalTotal 20 ㎕20 μl * 2× PCR pre-mixture는 ㈜진시스템의 2× Rapi:Spec Probe Master Mix with RTase for Model UF-150 및 ㈜바이오니아의 2× PlusDual Star RT-qPCR Master Mix 사용* 2× PCR pre-mixture uses 2× Rapi:Spec Probe Master Mix with RTase for Model UF-150 from Gene Systems Co., Ltd. and 2× PlusDual Star RT-qPCR Master Mix from Bioneer Co., Ltd.

RT real time PCR 조건RT real time PCR conditions Reactionreaction StepStep Temp. (℃)Temp. (℃) TimeTime CycleCycle Reverse TranscriptionReverse Transcription 5050 30 min30 min Taq-polymerase activationTaq-polymerase activation 9595 10 min10 min Reactionreaction denaturationdenaturation 9595 20 sec20 sec 4040 annealingannealing 6060 1 min1 min

그 결과, 도 2에서와 같이 2개의 프라이머 세트(CHIKV1, CHIKV4)가 주형 RNA의 농도별 Ct값의 변화(△Ct)가 일정하게 확인되어, 형광의 증폭양 및 농도별 증폭 곡선 등의 결과를 토대로 선별되었다. As a result, as in FIG. 2, the change (ΔCt) of the Ct value for each concentration of the template RNA was uniformly confirmed for the two primer sets (CHIKV1, CHIKV4), and the results of the amplification amount of fluorescence and the amplification curve for each concentration were obtained. was selected based on

실시예 3. 교차반응성 확인Example 3. Confirmation of cross-reactivity

실시예 2를 통해 선별된 2개의 프라이머 세트(CHIKV1, CHIKV4)가 치쿤구니야 바이러스에 특이적인 분자마커인지 확인하기 위해, 다른 모기 매개 바이러스와의 교차 반응성을 RT real time PCR을 통해 분석하였다. 사용된 바이러스 시료는 지카 바이러스(ZIKA), 일본뇌염 바이러스(JEV) 및 뎅기 바이러스(DENV) 혈청형 1, 2, 3 및 4를 사용하였다.In order to confirm that the two primer sets (CHIKV1, CHIKV4) selected in Example 2 are molecular markers specific to chikunguniya virus, cross-reactivity with other mosquito-borne viruses was analyzed by RT real-time PCR. As the virus samples used, Zika virus (ZIKA), Japanese encephalitis virus (JEV) and Dengue virus (DENV) serotypes 1, 2, 3 and 4 were used.

그 결과, 도 3에 개시된 것과 같이 2개의 프라이머/프로브 세트(CHIKV1, CHIKV4)는 다른 바이러스 시료에 대하여 증폭 반응이 확인되지 않았다. 또한, 상기 2개의 프라이머/프로브 세트(CHIKV1, CHIKV4)의 치쿤구니야 바이러스 진단 성능을 테스트하기 위하여 시판되는 치쿤구니야 바이러스 진단용 키트((주)코젠바이오텍, PowerCheck Zika/DENV/CHIKV Real-time PCR kit Catalog # R5008)를 이용하여 동일한 RNA 주형 농도에서 RT real time PCR을 수행하여 Ct값을 비교한 결과, CHIKV4 프라이머/프로브 세트가 시판용 키트와 유사한 수준으로 진단가능함을 확인할 수 있었다(도 4). 이의 결과를 통해 본 발명의 CHIKV4 분자마커가 치쿤구니야 바이러스에 대한 효율적인 검출 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 3 , the amplification reaction of the two primer/probe sets (CHIKV1 and CHIKV4) was not confirmed with respect to other virus samples. In addition, a commercially available chikunguniya virus diagnostic kit (Kogen Biotech Co., Ltd., PowerCheck Zika/DENV/CHIKV Real-time PCR) to test the chikunguniya virus diagnostic performance of the two primer/probe sets (CHIKV1, CHIKV4) As a result of comparing Ct values by performing RT real time PCR at the same RNA template concentration using kit Catalog # R5008), it was confirmed that the CHIKV4 primer/probe set can be diagnosed at a level similar to that of a commercially available kit (FIG. 4). From these results, it was found that the CHIKV4 molecular marker of the present invention can be used as an efficient detection marker for chikunguniya virus.

<110> Republic of Korea(The Armed Forces Medical Command) <120> Molecular marker for specifically detecting Chikungunya virus and uses thereof <130> PN20075 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcgggtcacc acaaagtaca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcgggtcacc acaaagtaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 tgttgtacgt agacgaggcr 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggcgtactgg gtwgggttcg a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcgcacggtt ytagcttttt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 ctgacrgaag gtagacgagg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tcaactgaay gcagccttyg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atyactgttt ttgcggttcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 ggccggagtc ctttaaraay 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agtcccgtag crctagaacg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cytggctatc atccgtcyyt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 tcarcgtccc gtctgtcgct 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cggcgtcaca yaccaccctc g 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcartgcmgc aacagcgaca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 acgggaggtg tgggactggt 20 <110> Republic of Korea (The Armed Forces Medical Command) <120> Molecular marker for specifically detecting Chikungunya virus and uses it <130> PN20075 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcgggtcacc acaaagtaca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcgggtcacc acaaagtaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 tgttgtacgt agacgaggcr 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggcgtactgg gtwgggttcg a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcgcacggtt ytagcttttt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 ctgacrgaag gtagacgagg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tcaactgaay gcagccttyg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atyactgttt ttgcggttcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 ggccggagtc ctttaaraay 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agtcccgtag crctagaacg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cytggctatc atccgtcyyt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 tcarcgtccc gtctgtcgct 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cggcgtcaca yaccaccctc g 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcartgcmgc aacagcgaca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 acgggaggtg tgggactggt 20

Claims (6)

서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출용 프라이머 세트.A primer set for detecting Chikungunya virus comprising an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치쿤구니야 바이러스 검출용 프라이머 세트.The primer set for detecting chikunguniya virus according to claim 1, wherein the primer set further comprises an oligonucleotide probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12. 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출용 키트.A primer set according to claim 1 or 2; and a reagent for performing an amplification reaction, a kit for detecting Chikungunya virus. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.The kit according to claim 3, wherein the reagents for performing the amplification reaction include DNA polymerase, dNTPs and a buffer. 치쿤구니야열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료, 또는 야생에서 수집된 모기 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)를 검출하는 방법.
isolating total RNA from a biological sample isolated from a patient suspected of having chikungunya fever or a mosquito sample collected in the wild;
using the isolated total RNA as a template, and performing RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) using the primer set of claim 1 or 2 to amplify a target sequence; and
A method for detecting Chikungunya virus, including; detecting the product of the amplification step.
제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.The method according to claim 5, wherein the detection of the amplification product is performed through a DNA chip, gel electrophoresis, radiometric measurement, fluorescence measurement, or phosphorescence measurement.
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