KR102363111B1 - 항염 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 균주 및 이의 용도 - Google Patents
항염 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항염 및 항산화 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) BCC-LF-02 및 이의 유효성분을 함유하는 의약품 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로서, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) BCC-LF-02는 항염 활성과 관련하여 IL-12을 억제하고 IL-10울 증가시키며 우수한 Arginine deiminase 활성을 갖는다. 또한 항산화 활성과 관련하여 DPPH 라디칼 소거 활성이 우수하다.
Description
본 발명은 항염증 및 항산화 활성을 가지는 락토바실러스 퍼멘텀 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
염증반응은 조직의 손상을 비롯하여 외부의 물리적, 화학적 자극 및 다양한 감염원에 대한 방어 반응으로써 손상된 조직을 수복하고 재생하려는 기전이다. 정상적인 경우에 생체는 염증반응을 통하여 발병요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 지속적으로 또는 과도하게 발생된 만성 염증반응은 조직의 손상을 유발한다. 이러한 염증반응은 위, 대장, 방광 그리고 전립선암으로의 진행으로 유도하며, 류마티스 관절염, 만성 감염 등 다양한 질환의 원인이 된다.
염증반응이 일어나면 대식세포와 단핵구 등 면역세포들은 하위 신호전달체계의 활성화를 유도하며 궁극적으로 전사인자인 nuclear factor-κB(NF-κB)를 활성화한다. 핵으로 이동한 NF-κB는 염증성 cytokine (TNF-α, IL-β, IL-6, IL-8, IL-12 등)을 생성하고 inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2)의 유전자 발현을 유도한다. iNOS에 의하여 발생된 산화질소(nitric oxide; NO)는 염증 발생을 심화시킨다. 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 산화질소(NO)는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입힘으로써 염증과 암을 포함한 다양한 병리적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.
염증 반응이 지속되면 염증유발인자뿐만 아니라 다양한 자유 라디칼이 생성된다. 자유 라디칼은 생체 내에서 에너지 공급을 위해서 생화학적 반응이 끊임없이 발생하면서 생성된다. 자유 라디칼에는 생체 내 정상적인 세포대사과정에서 생성되거나 여러 환경오염 및 화학물질의 노출 등에 의해 생성되는 과산화 라디칼(superoxide radical, O2·), 수산화 라디칼(hydroxyl radical, OH·), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 단일체 산소(singlet oxygen, 1O2) 등과 같은 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)이 포함된다. 이러한 활성 산소는 반응성이 매우 커서 생체 분자들과 빠르게 반응하여 생체막의 지질 산화, 단백질 변성, DNA 손상 등을 초래하며, 암, 동맥경화증, 당뇨병, 자가면역질환, 노화, 뇌졸중, 파킨슨병 등 각종 질환의 발병 위험성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
정상적인경우, 자유 라디칼은 자기방어 기구인 생체 내 기작에 의해 대부분 소멸되지만 조직의 방어능을 넘어선 지속적인 활성산소 및 자유 라디칼의 생성은 성인병 및 순환기 장애뿐만 아니라 암 등과 같은 여러가지 질환의 원인이 될 수 있다.
현재 항염증제로서 널리 사용되고 있는 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)는 장기간 복용하게 되면 위장관 장애, 간 장애, 신 장애 등의 심각한 부작용을 야기한다고 알려져 있다.
인체의 산화적 스트레스에 의한 손상을 보호하기위해 사용되고 있는 항산화제로는 butylated hydroxytoluene(BHT), butylated hydroxyanisol(BHA)과 같은 합성 항산화제, α-tocopherol, vitamin C, carotenoids, flavonoids와 같은 일부 천연항산화제 및 SOD와 같은 항산화효소가 있다. 그러나 이들 항산화제는 독성, 저활성 및 용도의 한계성 등으로 인하여 사용에 제한을 받고 있다.
한편, 유산균은 활성산소로부터 자신을 보호하기 위한 항산화 메커니즘을 가지고 있으며 효소적, 비효소적 메커니즘을 통해 활성산소에 대해 방어 및 소거작용을 한다고 보고되고 있어 최근에는 미생물 대사산물로부터 얻고자 하는 연구가 진행되고 있다. 이에, 본 발명자들은 항염효과가 뛰어나면서도 항산화능이 우수한 균주에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 하기와 같은 신규 미생물 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 속의 균주로 항염증 및 항산화 활성이 우수한 신규한 균주 및 이의 제제를 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC 14551BP로 기탁된 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 (Lactobacillus fermentum BCC-LF-02) 균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 산화 스트레스의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 하나의 다른 목적은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 염증 또는 산화 스트레스의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.
본 발명의 일측면은 항염 또는 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) BCC-LF-02 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02는 염증유발인자인 IL-12 생성을 억제하고 항염증인자인 IL-10 생성을 증가시킴으로써 항염증 효능을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02는 아르기닌 데이미나아제(Arginine deiminase) 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 DPPH 자유라디칼 소거능을 나타내는 것을 특징으로 하는, 항산화 효능을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC 14551BP 인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 항염 활성을 갖으며, 염증 질환의 예방과 치료에 사용되는 것임을 특징으로 하는, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 항산화 활성을 갖으며, 활성산소로 인해 발생하는 질환을 예방 또는 치료에 사용되는 것임을 특징으로 하는 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다. 본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 또는 의약품 조성물인, 항염증 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 또는 의약품 조성물인, 항산화 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 항염 효과가 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 IL-12의 생성을 감소시키며, IL-10의 생성을 증가시키는 항염 효과가 우수하다
본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 아르기닌 데이미나아제를 생성하는 항염 효과가 우수하다
본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 항산화 효과가 우수하다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 신규 Lactobacillus fermentum BCC-LF-02 균주(KCTC 14551BP)의 당 이용성 확인 결과이다.
도 2은 신규 Lactobacillus fermentum BCC-LF-02 균주(KCTC 14551BP)의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3a는 분리된 32균주 중 항염 효과를 가지는 11균주를 도식화한 그래프이고 도 3b는 균주의 IL-12 생성량을, 도 3c는 균주의 IL-10 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 분리된 균주의 아르기닌 데이미나아제 활성을 정량화한 그래프이다.
도 5는 분리된 균주의 DPPH radical 소거활성을 나타낸 그래프이다.
도 2은 신규 Lactobacillus fermentum BCC-LF-02 균주(KCTC 14551BP)의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3a는 분리된 32균주 중 항염 효과를 가지는 11균주를 도식화한 그래프이고 도 3b는 균주의 IL-12 생성량을, 도 3c는 균주의 IL-10 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 분리된 균주의 아르기닌 데이미나아제 활성을 정량화한 그래프이다.
도 5는 분리된 균주의 DPPH radical 소거활성을 나타낸 그래프이다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02(Lactobacillus fermentum BCC-LF-02)균주는 항염 효과 및 항산화 효과를 제공한다.
이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.
본 발명의 일측면은 항염 또는 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) BCC-LF-02 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02는 염증유발인자인 IL-12 생성을 억제하고 항염증인자인 IL-10 생성을 증가시킴으로써 항염증 효능을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02는 아르기닌 데이미나아제(Arginine deiminase) 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 DPPH 자유라디칼 소거능을 나타내는 것을 특징으로 하는, 항산화 효능을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC 14551BP 인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 항염 활성을 갖으며, 염증 질환의 예방과 치료에 사용되는 것임을 특징으로 하는, 균주를 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 염증 질환은 심한 근무력증, 전신성 홍반성 루푸스 및 갑상선, 급성 및/또는 만성 염증 과정을 특징으로 하는 질병, 기관지 천식, 장내 염증 질병, 위염, 십이지장염, 위궤양, 십이지장 궤양, 폐렴 및 흉막염, 아데노바이러스, 배큘로바이러스와 바이러스성 매개체로부터의 감염, 급성 및/또는 만성 염증,중심 및/또는 주위 신경계의 퇴행성 질환, 췌장염, 내심근염과 허혈성 손상(심근, 망막, 대뇌 및 신장), 요결석증, 신석회증, 과수산뇨증, 과인산뇨증, 문맥 고혈압과 같은 전신 및/또는 부분 동맥압 및/또는 정맥압에서의 신장개질, 질 및 질염, 직장 치질 염증, 전립선, 정맥동염과 이염, 결막염, 치은염, 치주염, 과민증 그리고 면역결핍을 포함하는 다른 자가면역 질환일 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 항산화 활성을 갖으며, 활성산소로 인해 발생하는 질환을 예방 또는 치료에 사용되는 것임을 특징으로 하는 균주를 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 활성산소로 인해 발생하는 질환은 동맥경화증, 루게릭병, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축색경화증 및 헌팅톤병을 포함하는 퇴행성 신경질환, 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 허혈성 심장질환을 포함하는 심혈관 질환, 뇌졸중을 포함하는 허혈성 뇌질환, 당뇨병, 위염 및 위암을 포함하는 소화기계 질환, 암, 백혈병, 노화, 류마티스 관절염, 간염 또는 아토피성 피부염일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다. 본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 또는 의약품 조성물인, 항염증 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 또는 의약품 조성물인, 항산화 조성물을 제공한다.
예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/ 또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 개선적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다. 상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다. 상기 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다. 본 명세서에 개시된 유효성분 외에 함유할 수 있는 액체 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올 등이 있다. 상기의 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성향미제(예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 명세서에 개시된 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 일 측면에서 약 5 내지 12 g일 수 있다. 상기 식품 조성물은 일 측면에서 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그 염, 알긴산 및 그 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 치약 또는 가글액의 형태로 제공될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 인간을 대상으로 사용될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 인간 이외의 동물을 대상으로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주의 분리
한국인에게 맞는 신규 균주를 선발하기 위해 건강한 한국인 아기 및 성인의 분변, 모유 등을 시료로 사용하였다. 시료 1g을 멸균 식염수에 10배 연속 희석한 후 희석액 0.1mL를 MRS 고체배지에 도말하여 혐기조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 단일 콜로니를 MRS 액체배지에 37℃, 18시간 동안 순수 배양하였다.
실시예 2. 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주의 당 이용성
선별된 균주의 당 이용성을 분석하기 위해 API 50 CH kit(BioMerieux, Lyon, France)를 사용하여 49개의 탄소원에 대한 이용성을 확인하였다. MRS 고체배지에서 배양된 균주의 콜로니를 2 MacFarland의 탁도로 조절하여 현탁액을 제조하였다. 탁도를 맞춘 API 50 CHL medium을 API 50CH 스트립 튜브에 120 ㎕씩 분주하고 큐플에 미네랄 오일(mineral oil)을 2 방울씩 첨가하여 37℃에서 24 시간 및 48 시간 동안 배양하여 당 이용 패턴을 확인하였다. 동정 결과는 API web 프로그램(https://apiweb.biomerieux.com) 을 사용하여 확인하였다. 동정결과, 도 1에 표시된 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀과 96.4% 로 동일함을 나타내었다.
실시예 3. 퍼멘텀 균주의 동정
16S rRNA 서열 분석
균주의 동정을 위해 Bionics (Seoul, Korea)에 16S rRNA 서열분석을 의뢰하였다. 균주의 순수배양액 1mL에서 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA를 주형으로 16S rRNA 영역을 27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG), 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT), 518F(CCAGCAGCCGCGGTAATACG), 800R(TACCAGGGTATCTAATCC) primer로 PCR을 수행하여 DNA sequencing (Bionics)을 진행하였다. 염기서열 분석 결과를 토대로 NCBI의 BLAST 상의 Genebank 데이터베이스에 등록된 다른 표준균주와 상동성을 비교하였다.
염기서열 분석 결과 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 신규 균주는 Lactobacillus fermentum CIP 102980과 99.87%의 상동성을 나타내었다. Mega 7 program을 이용하여 상동성을 분석하고 계통도를 얻었다 (도 2).
이에 본 발명자는 상기 균주를 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 균주로 동정하였고, Lactobacillus fermentum BCC-LF-02로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2021년 4월 27일자로 기탁하였다 (기탁번호 KCTC 14551BP).
실험예 1. 항염 효과 확인
1)
사이토카인 측정
염증의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 균주의 항염 효과를 세포 내 IL-12 및 IL-10 조절 능력을 평가하여 선발하였다.
분리된 균의 항염 효과를 측정하기 위해 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit를 이용하여 실험을 수행하였다. Raw 264.7세포는 10% 우태아형청(FBS), penicillin(100 IU/mL), streptomycin(100 mg/mL)이 첨가된 DMEM 배지에 배양하였다. 24 well plate에 5 x 105 cells/mL 농도로 Raw264.7 세포를 분주하였으며, 분주하고 4시간 후 non-serum 및 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지 0.5 mL로 교체해 주었다.
각 균주를 1 x 108 CFU/mL 의 농도가 되도록 Raw 264.7 세포 위에 다시 접종하고 lipopolysaccharide(LPS) (1 mg/mL) 1ul 처리한 뒤, 5% CO2 존재 하에 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 well에서 조심스럽게 배지를 수거, 원심분리 한 후 상등액을 취한 다음 상등액에 포함된 IL-12 및 IL-10양을 ELISA Kit (Cusabio, USA)를 사용하여 측정하였다.
음성 대조군으로는 균주 미처리군, 양성 대조군으로는 LPS (Lipopolysaccharide, Sigma)를 각각 1 mg /mL의 농도로 처리한 샘플을 사용하였다. 분리균주와 비교분석을 위해 한국생명공학연구원에서 분양받은 Lactobacillus rhamnosus GG KCTC 5033 (LGG로 표기)을 대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 3회 반복하였고 평균값을 표준편차(SD)와 함께 도 3에 나타냈다.
항염능을 보이는 32개의 균주 중에서 IL-12를 유의하게 감소시키며, 동시에 IL-10을 유의하게 증가시키는 11개 균주를 선별하였다. 결과는 도 3a에 방사형 그래프로 나타내었다.
염증 반응 시 초기 Th1면역계의 cytokine stimulator인 IL-12 사이토카인은 상기 도 3b에서 확인되듯이, 선발된 11개의 균주 처리 시 LPS를 처리하여 대식세포에서 IL-12 분비를 유도한 군과 비교하였을 때, 최소 75% 내지 100% 정도의 매우 유의한 수준으로 IL-12 분비를 억제시키는 결과가 확인되었다.
이 중 10균주 (BCC-LF-01, BCC-LF-02, BCC-LCL-02, BCC-STT-02, BCC-LR-08, BCC-LR-12, BCC-LG-12, BCC-LG-18, BCC-LG-19, BCC-LPG-14)는 항염 분야에서 효과가 공지된 LGG (LPS 처리군 대비 80% 감소)보다 더 우수한 수준이었다.
또한, IL-10(Interleukin-10)은 대표적인 항염증성 사이토카인으로 Th2 세포에서 분비된다.
상기 도 3c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 11균주 (BCC-LF-01, BCC-LF-02, BCC-LCL-02, BCC-STT-02, BCC-LR-08, BCC-LR-12, BCC-LG-01, BCC-LG-12, BCC-LG-18, BCC-LG-19, BCC-LPG-14)는 LPS를 처리하여 대식세포에서 IL-10 분비를 유도한 군보다도 20% 내지 높게는 300% 수준으로 IL-10의 분비를 증가시켰다. 이는 대조군으로 사용된 LGG와 비교하였을 때, 매우 유의한 (p<0.001) 수준이었다.
이러한 사실을 종합하여 볼 때, 본 발명에서 항염능으로 선발된 11균주는 대식세포내에서 염증반응에 영향을 미치는 IL-12및 IL-10을 유의미하게 조절할 수 있는 결과를 보였고, 이는 항염능에 있어 LGG보다 훨씬 우수한 유산균 재료임을 분명하게 입증한다.
2)
아르기닌 데이미나아제 활성 정성 평가
아르기닌 데이미나아제(Arginine deiminase)는 아르기닌을 시트룰린과 암모니아로 분해시키는 효소이다.
외부 상처에 대한 반응 및 염증 같은 면역방어기전의 다양한 과정을 매개하는 cytokine (IL-1, TNF 등)에 의해 유도된 iNOS는 아르기닌으로부터 산화질소(NO) 합성에 관여한다. iNOS에 의해 생성된 산화질소(NO)는 prostaglandin E2(PGE2), TNF-α, IL-6와 같은 cytokine의 생성을 증가시켜 염증세포와 면역세포를 활성화시켜 염증을 일으킬 수 있다.
아르기닌 데이미나아제 활성이 있는 균주는 NO의 전구체인 아르기닌을 감소시켜 염증을 예방 또는 개선시킬 수 있다고 볼 수 있다.
아르기닌 데이미나아제(arginine deiminase, ADI) 활성이 있는 균주를 선별하기 위해 아르기닌을 기질로, phenol red를 지시약으로 사용하여 배지 (yeast extract 2g/L, peptone 2g/L, L-arginine 10g/L, ammonium chloride 1.5g/L, K2HPO4 1g/L, NaCl 0.02 g/L, MgSO4·7H2O 0.5g/L, MnSO4 0.1g/L, FeSO4 0.005g/L, glucose 10g/L, agar 20g/L, phenol red dye 0.12g/L, pH6.6)를 제조하였다. IL-12와 IL-10 실험을 통해 1차적으로 선별된 11개 항염 균주를 아르기닌이 첨가된 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 혐기 배양하였다. ADI는 아르기닌을 시트룰린과 암모니아로 분해시키는 효소로, ADI를 생성하는 균주의 콜로니는 암모니아에 의해 배지의 pH가 증가하여 분홍색으로 변한다. 따라서 아르기닌이 첨가된 배지에서 분홍색 콜로니를 나타내는 균주를 선별하였다. 양성대조군으로 ADI 활성이 있다고 알려진 Lactobacillus brevis (LB)를 제품으로부터 분리하여 사용하였다.
11개의 선별 균주 중 아르기닌 데이미나아제 활성을 지닌 균주는 BCC-LF-01, BCC-LF-02, BCC-LCL-02 총 3균주로 확인되었다 (표1).
| Strains | Arginine deiminase |
| LB | ++ |
| BCC-LF-01 | +++ |
| BCC-LF-02 | +++ |
| BCC-LCL-02 | + |
| BCC-STT-02 | - |
| BCC-LR-08 | - |
| BCC-LR-12 | - |
| BCC-LG-01 | - |
| BCC-LG-12 | - |
| BCC-LG-18 | - |
| BCC-LG-19 | - |
| BCC-LPG-14 | - |
| -: 활성 없음 +: 활성 있음 ++: 활성 우수 +++: 활성 매우 우수 | |
3)
아르기닌 데이미나아제 활성 정량 평가
상기 아르기닌 데이미나아제 활성이 확인된 3개 균주에 대해 아르기닌 데이미나아제(arginine deiminase, ADI) 활성을 정량적으로 측정하였다. 양성대조군으로 ADI 활성이 있다고 알려진 Lactobacillus brevis (LB)를 제품으로부터 분리하여 사용하였고, 한국생명공학연구원에서 분양받은 Lactobacillus fermentum KCTC 3112를 사용하였다.
균주를 MRS 액체배지에 2차 계대 배양한 후 배양액을 10 mL ADI 활성 최적 배지 (yeast extract 2g/L, peptone 2g/L, L-arginine 10g/L, ammonium chloride 1.5g/L, K2HPO4 1g/L, NaCl 0.02 g/L, MgSO4·7H2O 0.5g/L, MnSO4 0.1g/L, FeSO4 0.005g/L, glucose 10g/L pH6.0)에 2% 접종하여 37℃에서 48시간 혐기 배양하였다. 배양액을 원심분리(3600rpm, 15분)하여 얻은 상등액을 여과(0.22um pore size)하여 조효소로 사용하였다. 200μl의 상등액과 400μl의 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0), 400μl의 50mM arginine을 넣고 37℃에서 15분 동안 반응하였다. 1.5 M Trichloroacetic acid(TCA) 용액 200 μl를 첨가하여 효소 반응을 종결하고, 12,000 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하였다. 0.5mL의 상등액에 0.7mL의 H3PO4-H2SO4(3:1 v/v)와 0.25mL의 3% diacetyl monoxime (in 10% methanol)을 넣고 잘 섞은 후 95℃에서 15분간 가열하였다. 실온에서 10분 동안 식힌 후, Versamax microplate reader(Molecular Devices, California, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 시트룰린(0, 1, 3, 6, 9, 12 μmol/mL)을 희석하여 사용하였다. 단백질 총량은 BSA 표준곡선을 통해 측정하였다. 아르기닌 데이미나아제 1 unit은 37℃ 분석 조건 하에서 1 분당 1 μmol의 시트룰린을 생성한 효소의 양으로 결정되었다.
균주의 아르기닌 데이미나아제 활성을 측정한 결과는 도4에 나타냈다. BCC-LF-02는 3균주 중에서 0.111 ± 0.012 IU/mg으로 가장 높은 아르기닌 데이미나아제 활성을 보였으며 양성대조군으로 사용한 LB균주의 아르기닌 데이미나아제 활성 (0.130 IU/mg)과 비슷한 수준을 나타내었다.
실험예 2. 항산화 효과 확인
DPPH radical 소거 활성 측정
DPPH (2,2-diphenyl-2-picryl hydrazyl) radical 소거 활성은 (Chen, P. et al., 2014)의 방법을 변형하여 측정하였다.
균주를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 18시간 간격으로 2차 계대하였다. 배양액을 원심분리(3600rpm, 15분)하여 cell 을 회수하였다. 회수된 cell은 1X PBS로 2회 세척 후 다시 PBS로 현탁하여 intact cell 1x 109 CFU/mL로 맞추어 시료로 사용하였다.
intact cell (1x 109 CFU/mL) 1mL와 0.2 mM DPPH (in methanol solution) 1mL 를 혼합하여 30분간 상온의 암실에서 반응시킨 후 원심분리(13,000rpm, 5분)하여 상등액 200ul를 취해 96 well plate에 분주하여 Versamax microplate reader(Molecular Devices, California, USA)를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank로 시료 대신 동량의 PBS를 취하였으며, 양성 대조군으로 L-ascorbic acid(0.1mg/mL)와 Lactobacillus rhamnosus GG KCTC 5033를 사용하였다. DPPH radical 소거 활성은 아래의 식으로 계산하였다.
DPPH radical scavenging activity (%)= [1-{(ASample - ABlank)/ ABlank}] x 100
ASample : Absorbance of Sample
ABlank : Absorbance of Blank
DPPH radical 소거활성 결과는 도 5에 나타내었다. 분리된 균주 중에서, LF02 (60.78%)는 양성대조군인 L-ascorbic acid(0.1mg/mL)보다는 낮은 소거 활성을 보였으나 항산화 효과가 있다고 알려진 L. rhamnosus KCTC 5033균주(40.45%)보다 우수한 항산화능이 확인되었다.
IL-12 및 IL-10 분비능, 아르기닌 데이미나아제 활성, DPPH radical 소거활성 결과를 바탕으로 Lactobacillus fermentum BCC-LF-02 균주를 항염 및 항산화능이 우수한 균주로 선별하였다.
<110> Bioeleven co., Ltd.
<120> Lacobacillus fermentum having effects of anti-inflammation and
anti-oxidation and use of the same
<130> DP-2021-0151
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1519
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 16S rRNA of BCC-LF-02
<400> 1
ggctcaggat gaacgccggc ggtgtgccta atacatgcaa gtcgaacgcg ttggcccaat 60
tgattgatgg tgcttgcacc tgattgattt tggtcgccaa cgagtggcgg acgggtgagt 120
aacacgtagg taacctgccc agaagcgggg gacaacattt ggaaacagat gctaataccg 180
cataacagcg ttgttcgcat gaacaacgct taaaagatgg cttctcgcta tcacttctgg 240
atggacctgc ggtgcattag cttgttggtg gggtaacggc ctaccaaggc gatgatgcat 300
agccgagttg agagactgat cggccacaat gggactgaga cacggcccat actcctacgg 360
gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg gcgcaagcct gatggagcaa caccgcgtga 420
gtgaagaagg gtttcggctc gtaaagctct gttgttaaag aagaacacgt atgagagtaa 480
ctgttcatac gttgacggta tttaaccaga aagtcacggc taactacgtg ccagcagccg 540
cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gatttattgg gcgtaaagag agtgcaggcg 600
gttttctaag tctgatgtga aagccttcgg cttaaccgga gaagtgcatc ggaaactgga 660
taacttgagt gcagaagagg gtagtggaac tccatgtgta gcggtggaat gcgtagatat 720
atggaagaac accagtggcg aaggcggcta cctggtctgc aactgacgct gagactcgaa 780
agcatgggta gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gatgagtgct 840
aggtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc cggagctaac gcattaagca ctccgcctgg 900
ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 960
gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcttgcgcca 1020
accctagaga tagggcgttt ccttcgggaa cgcaatgaca ggtggtgcat ggtcgtcgtc 1080
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gttactagtt 1140
gccagcatta agttgggcac tctagtgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1200
acgacgtcag atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacggt 1260
acaacgagtc gcgaactcgc gagggcaagc aaatctctta aaaccgttct cagttcggac 1320
tgcaggctgc aactcgcctg cacgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1380
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac 1440
acccaaagtc ggtggggtaa ccttttagga gccagccgcc taaggtggga cagatgatta 1500
gggtgaagtc gtacaaggg 1519
Claims (12)
- 항염 또는 항산화 활성을 갖고, 기탁번호가 KCTC 14551BP 인, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) BCC-LF-02 균주.
- 제 1항에 있어서,
상기 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02는 염증유발인자인 IL-12 생성을 억제하고 항염증인자인 IL-10 생성을 증가시킴으로써 항염증 효능을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주. - 제 1항에 있어서,
상기 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02는 아르기닌 데이미나아제(Arginine deiminase) 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02균주. - 제 1항에 있어서,
상기 균주는 DPPH 자유라디칼 소거능을 나타내는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 퍼멘텀 BCC-LF-02 균주. - 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 균주는 항염 활성을 갖으며, 염증 질환의 예방과 치료에 사용되는 것임을 특징으로 하는, 균주 - 제 1항에 있어서,
상기 균주는 항산화 활성을 갖으며, 활성산소로 인해 발생하는 질환을 예방 또는 치료에 사용되는 것임을 특징으로 하는 균주 - 삭제
- 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 항염증 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품 또는 의약품 조성물인, 항염증 조성물. - 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 건강기능식품용 항산화 조성물.
- 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 활성산소로 인해 발생하는 질환을 예방, 경감 또는 치료하기 위한 약학 조성물로,
상기 활성산소로 인해 발생하는 질환은 동맥경화증, 루게릭병, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축색경화증 및 헌팅톤병을 포함하는 퇴행성 신경질환, 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 허혈성 심장질환을 포함하는 심혈관 질환, 뇌졸중을 포함하는 허혈성 뇌질환, 당뇨병, 위염 및 위암을 포함하는 소화기계 질환, 암, 백혈병, 노화, 류마티스 관절염, 간염 또는 아토피성 피부염인, 약학 조성물.
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| KR1020210084547A KR102363111B1 (ko) | 2021-06-29 | 2021-06-29 | 항염 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 균주 및 이의 용도 |
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| CN115992076A (zh) * | 2022-11-21 | 2023-04-21 | 河南工业大学 | 一株降血糖功能发酵乳杆菌及其应用 |
| KR20230134888A (ko) | 2022-03-15 | 2023-09-22 | 강원대학교산학협력단 | 엑소폴리사카라이드 생산량 및 알코올 분해활성 및 항산화 활성이 증진된 돌연변이 균주 락토바실러스 퍼멘텀 jy563 |
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| KR101681810B1 (ko) | 2014-06-05 | 2016-12-01 | 동국대학교 경주캠퍼스 산학협력단 | 백강균을 이용한 진세노사이드 함량이 증가된 인삼 제제 및 이의 제조방법 |
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- 2021-06-29 KR KR1020210084547A patent/KR102363111B1/ko active IP Right Grant
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