KR102358345B1

KR102358345B1 - 개선된 골형성 단백질

Info

Publication number: KR102358345B1
Application number: KR1020177021645A
Authority: KR
Inventors: 존 마틴 우즈니; 하워드 시허먼; 크리스토퍼 토드 브라운
Original assignee: 와이어쓰 엘엘씨
Priority date: 2015-01-05
Filing date: 2015-04-06
Publication date: 2022-02-07
Also published as: AU2015376655B2; EP3242885B1; AU2015376655A1; CA2972970C; JP2018506992A; CN107636008B; CN107636008A; US10196433B2; CA2972970A1; IL253305B; US20180134762A1; EP3242885A1; US20160207973A1; KR20170098940A; US11008373B2; WO2016111713A1; BR112017014464A2; US20190241634A1; IL253305A0; US9688735B2

Abstract

본 발명은 동족 수용체에 대해 변경된 친화도를 가지는 신규한 디자이너 골형성 단백질, 그를 코딩하는 핵산, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 더욱 바람직하게, 신규한 디자이너 골형성 단백질은 디자이너 BMP이고, 동족 BMP 수용체에 대해 변경된 친화도를 가진다. 디자이너 BMP는 변경된 생물학적 특징을 나타내고, 잠재적인 유용한 신규한 치료제를 제공한다.

Description

개선된 골형성 단백질

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 현 미국 특허 8,952,131인, 2011년 8월 17일 출원된 미국 특허 출원 번호 13/211,755의 계속 출원인 것인, 베라시(Berasi) 등에 의해 2015년 1월 5일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/589,468의 일부 계속 출원이며, 35 U.S.C. §120하에 그의 우선권의 이익을 주장하며, 결과적으로는 35 U.S.C §119(e)하에 2010년 8월 20일 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/375,636의 우선권의 이익을 주장한다. 상기 출원은 각각 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 출원된 서열 목록을 포함하며, 이는 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 2015년 4월 3일 작성된 상기 ASCII 사본명은 7362174001이고, 크기는 17,395 바이트이다.

본 발명의 분야

본 출원은 골형성 단백질, 개선된 골형성 단백질의 제조 방법, 및 골형성 단백질을 사용하여 환자를 치료하는 방법의 분야에 관한 것이다.

시스틴 노트(knot) 시토카인 수퍼패밀리는 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 단백질, 당단백질 호르몬, 혈소판-유래 성장 인자-유사 (PDGF-유사) 단백질, 신경 성장 인자 (NGF), 및 신경모세포종에서 이상을 보이는 차별적 스크리닝-선별 유전자 (DAN) 패밀리 (예컨대, 케르베루스(cerberus))를 포함하는 서브패밀리로 나누어진다. 결과적으로, TGFβ 수퍼패밀리는 3개의 서브패밀리: TGFβ, 액티빈 및 골 형태형성/성장 분화 인자 단백질 (BMP/GDF)로 세분되는 대략 43개의 구성원을 포함한다.

TGF-β 수퍼패밀리 구성원은 정규 시스틴 노트 토폴로지를 포함한다. 즉, 시스틴 노트는 6개의 시스테인 잔기의 특이한 배열의 결과이다. 노트는 시스테인 1-4, 시스테인 2-5, 및 고리를 형성하는 개재 서열 사이의 결합으로 이루어지고, 이를 통해 시스테인 3-6 사이의 디술피드 결합이 통과한다. 이들 단백질의 활성 형태는 동종이량체 또는 이종이량체이다. 각각의 경우에, 단량체 토폴로지는 시스테인 노트에 의해 안정화되고, 추가의 시스테인은 추가의 쇄내 결합에 기여하고/거나, 또 다른 단백질 단위와의 이량체화를 매개한다. 문헌 [Kingsley, 1994, Genes Dev. 8:133-146]; [Lander et al., 2001, Nature 409:860-921]을 참조한다.

BMP/GDF는 TGF-β 단백질 수퍼패밀리 중 가장 많은 구성원이다. BMP/GDF 서브패밀리는 BMP2, BMP3 (오스테오게닌), BMP3b (GDF-10), BMP4 (BMP2b), BMP5, BMP6, BMP7 (골형성 단백질-1 또는 OP1), BMP8 (OP2), BMP8B (OP3), BMP9 (GDF2), BMP10, BMP11 (GDF11), BMP12 (GDF7), BMP13 (GDF6, CDMP2), BMP15 (GDF9), BMP16, GDF1, GDF3, GDF5 (CDMP1; MP52), 및 GDF8 (미오스타틴)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. BMP는 종종 골형성 단백질 (OP), 성장 분화 인자 (GDF), 또는 연골-유래 형태형성 단백질 (CDMP)로 지칭된다. 또한, BMP는 다른 동물 종에도 존재한다. 추가로, 인간 집단의 상이한 구성원 중에는 BMP 서열 내에 일부 대립유전자 변이가 존재한다.

BMP는 긴 프로도메인, 하나 이상의 절단 부위, 및 성숙 도메인을 포함하는 프로단백질로서 자연적으로 발현된다. 이어서, 상기 프로단백질은 세포 기구에 의해 프로세싱되어 이량체성의 성숙한 BMP 분자를 생성한다. 프로도메인은 BMP의 정확한 폴딩 및 프로세싱을 돕는 것으로 생각된다. 추가로, 모든 BMP는 아니지만, 일부 BMP에서, 프로도메인은 성숙 도메인에 비공유 결합할 수 있고, 샤페론 뿐만 아니라, 억제제로서 작용할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Thies et al., Growth Factors 18:251-9 (2001)]).

BMP 신호 전달은 BMP 이량체가 2개의 타입 I 및 2개의 타입 II 세린/트레오닌 키나제 수용체에 결합할 때 개시된다. 타입 I 수용체는 ALK-1 (액티빈 수용체-유사 키나제 1(Activin receptor-Like Kinase 1)), ALK-2 (ActRIa 또는 ActRI로도 불림), ALK-3 (BMPRIa로도 불림), 및 ALK-6 (BMPRIb로도 불림)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 타입 II 수용체는 ActRIIa (ActRII로도 불림), ActRIIb, 및 BMPRII를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인간 게놈은 7개의 타입 I 및 5개의 타입 II 수용체를 포함하는 수용체 세린/트레오닐 키나제 패밀리의 12개의 구성원을 함유하고, 이들은 모두 TGF-β 신호전달에 관여한다 (Manning et al., Science 298:1912-34 (2002) (상기 문헌의 개시 내용은 본원에서 참조로 포함된다)). 따라서, 12개의 수용체 및 43개의 수퍼패밀리 구성원이 존재하고, 이는 적어도 일부의 TGF-β 수퍼패밀리 구성원이 동일한 수용체(들)에 결합한다는 것을 시사한다. BMP 결합 후에, 타입 II 수용체는 타입 I 수용체를 인산화하고, 타입 I 수용체는 전사 인자의 Smad 패밀리의 구성원을 인산화하고, Smad는 핵으로 이동하고, 많은 유전자의 발현을 활성화시킨다.

BMP는 TGF-β 수퍼패밀리의 대부분의 많은 구성원 사이에 존재하고, 다양한 세트의 세포 및 발생 과정, 예컨대, 배아 패턴 형성 및 조직 분화 뿐만 아니라, 성체 조직에서 다른 위치들 중에서도 특히 신경계 및 골격계에서의 상처 치유 및 수복 과정의 촉진을 제어한다. 실제로, BMP는 초기에는 골 및 연골 형성을 유도할 수 있는 능력에 의해 단리되었고: BMP 신호전달은 골절 및 관련 조직 손상시 유도될 수 있으며, 이는 골 재생 및 수복을 유도한다. 발생 및 정상적인 상처 치유에서의 그의 역할을 고려해 볼 때, BMP는 골격계, 신경계, 및 BMP 수용체가 발현되는 다른 조직의 재생 및 수복에 대한 막대한 유망성을 가지고 있다. 이러한 유망성은 그의 수용체에 대하여 변경된 친화도 및/또는 개선된 생물학적 활성을 가지는 BMP가 천연 단백질에 비해 훨씬 더 클 것이다. 본 발명자들은 앞서 다양한 시험관내 및 생체내 검정법에서 BMP 수용체에 대한 결합이 변경되고, 활성이 증가된 디자이너 BMP를 기술한 바 있다. 그러나, 현재 공지된 디자이너 BMP 분야는 여전히 비교적 소규모 상태이며, 새롭고, 신규한 디자이너 BMP의 개발 분야에서 여전히 요구되고 있다.

본 발명의 요약

본 발명은 그의 다양한 측면에서 BMP 2, 4, 6 및 7에 기초한 신규한 디자이너 BMP, 상기 디자이너 BMP와 관련된 조성물 및 방법, 및 그를 제조 및 사용하는 방법을 제공함으로써 상기 요구를 처리한다. 한 측면에서, 본 발명은 다양한 실시양태에서, 서열식별번호: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP에 관한 것이다. 디자이너 BMP는 임의적으로 타입 I, 타입 II A, 또는 타입 II B 결합 도메인이 아닌 곳에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고; 다양하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상기 돌연변이가 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 디자이너 BMP는 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 하나, 수개, 또는 모두를 포함하는 것인, 야생형 BMP와 다른 수용체 결합 프로파일을 보인다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1과 비교하여 하기 돌연변이: V33I, P36E, H39A, H44E, P48A, A52N, D53S, H54Y, L55M, S57A, N68H, S69F, V70I, S72P, K73E, K73 다음에의 T 삽입, I74V, A77P, V80A, S85N, M89V, L92F, E94D, N95S, E96S, K97N, V99I를 포함하는 디자이너 BMP에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 임의적으로 타입 I, 타입 II A, 또는 타입 II B 결합 도메인이 아닌 곳에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고; 다양하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상기 돌연변이가 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 디자이너 BMP는 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 하나, 수개, 또는 모두를 포함하는 것인, 야생형 BMP와 다른 수용체 결합 프로파일을 보인다. 디자이너 BMP는 일부 경우에서는 서열식별번호: 8을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 반면 다른 경우에서, 디자이너 BMP는 서열식별번호: 8과 비교하여 하기 돌연변이: E84K, N86R, A87P, I88M, V90M, F93Y, S96G, S97Q, V99I, L101K, N103D, Y104I, D106N, V108I, G111E, R115S를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1과 비교하여 하기 돌연변이: V33I, P36E, H39A, H44E, P48A, A52N, D53S, H54Y, L55M, S57A, N68H, S69F, V70I, S72P, K73E, K73 다음에의 T 삽입, I74V, A77P, V80A, E83K, S85R, A86P, I87M, L92Y, E94D, N95G, E96Q, K97N, V98I, V99I, L100K, N102D, Y103I, D105N, V107I, G110E, R114S를 포함하는 디자이너 BMP에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 임의적으로 타입 I, 타입 II A, 또는 타입 II B 결합 도메인이 아닌 곳에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고; 다양하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상기 돌연변이가 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 디자이너 BMP는 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 하나, 수개, 또는 모두를 포함하는 것인, 야생형 BMP와 다른 수용체 결합 프로파일을 보인다. 디자이너 BMP는 일부 경우에서는 서열식별번호: 9를 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38K, Q41A, H46D, D48E, P50S, A54N, D55A, L57M, S59A, N70H, S71L, V72P, S74P, S75E, S75 다음에의 Y 삽입, I76V, A79P, V82A, S87N, M91V, L94F, E96D, Y97N, D98S, K99N, V101I를 포함하는 디자이너 BMP에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 임의적으로 타입 I, 타입 II A, 또는 타입 II B 결합 도메인이 아닌 곳에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고; 다양하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상기 돌연변이가 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 디자이너 BMP는 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 하나, 수개, 또는 모두를 포함하는 것인, 야생형 BMP와 다른 수용체 결합 프로파일을 보인다. 디자이너 BMP는 일부 경우에서는 서열식별번호: 10을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 경우에서, 디자이너 BMP는 서열식별번호: 10과 비교하여 K38R의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있고/거나, 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38K, Q41A, H46D, D48E, P50S, A54N, D55A, L57M, S59A, N70H, S71L, V71M, S74P, S75E, S75 다음에의 Y 삽입, I76V, A79P, V82A, E85K, S87R, A88P, I89M, L94Y, E96D, Y97G, D98Q, K99N, V100I, V1010I, L102K, N104D, Y105I, E107N, V109I, G112E, R116S를 포함하는 디자이너 BMP에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 임의적으로 타입 I, 타입 II A, 또는 타입 II B 결합 도메인이 아닌 곳에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고; 다양하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상기 돌연변이가 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 디자이너 BMP는 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 하나, 수개, 또는 모두를 포함하는 것인, 야생형 BMP와 다른 수용체 결합 프로파일을 보인다. 디자이너 BMP는 일부 경우에서는 서열식별번호: 11을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38R, Q41A, H46D, D48E, P50S, A54N, D55A, L57M, S59A, N70H, S71L, V72M, S74P, S75E, S75 다음에의 Y 삽입, I76V, A79P, V82A, E85K, S87R, A88P, I89M, L94Y, E96D, Y97G, D98Q, K99N, V100I, V101I, L102K, N104D, Y105I, E107N, V109I, G112E, R116S를 포함하는 디자이너 BMP에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 임의적으로 타입 I, 타입 II A, 또는 타입 II B 결합 도메인이 아닌 곳에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고; 다양하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상기 돌연변이가 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 디자이너 BMP는 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 하나, 수개, 또는 모두를 포함하는 것인, 야생형 BMP와 다른 수용체 결합 프로파일을 보인다. 디자이너 BMP는 임의적으로 서열식별번호: 13을 포함하는 아미노산 서열을 가진다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38E, Q41A, H46E, D48E, P50A, A54N, D55S, H56Y, L57M, S59A, N70H, S71F, V72I, N73 다음에의 P 삽입, S74E, S75T, I76V, A79P, V82A, S87N, M91V, L94F, E96D, Y97S, D98S, K99N, V101I를 포함하는 디자이너 BMP에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 임의적으로 타입 I, 타입 II A, 또는 타입 II B 결합 도메인이 아닌 곳에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고; 다양하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상기 돌연변이가 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 디자이너 BMP는 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 하나, 수개, 또는 모두를 포함하는 것인, 야생형 BMP와 다른 수용체 결합 프로파일을 보인다. 디자이너 BMP는 서열식별번호: 14를 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

또한 추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38E, Q41A, H46E, D48E, P50A, A54N, D55S, H56Y, L57M, S59A, N70H, S71F, V72I, N73 다음에의 P 삽입, S74E, S75T, I76V, A79P, V82A, E85K, S87R, A88P, I89M, L94Y, E96D, Y97G, D98Q, K99N, V100I, V101I, L102K, N104D, Y105I, E107N, V109I, G112E, R116S를 포함하는 디자이너 BMP에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 임의적으로 타입 I, 타입 II A, 또는 타입 II B 결합 도메인이 아닌 곳에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고; 다양하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상기 돌연변이가 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 디자이너 BMP는 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 하나, 수개, 또는 모두를 포함하는 것인, 야생형 BMP와 다른 수용체 결합 프로파일을 보인다. 디자이너 BMP는 서열식별번호: 15를 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 기술된 타입의 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법을 추가로 포함한다. 본 방법은 일반적으로 단백질을 코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 단백질이 제조되는 조건하에서 세포를 배양하는 단계, 및 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.

다양한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 8-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는, 또는 구체적으로 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 및/또는 서열식별번호: 15를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 핵산은 임의의 적합한 발현 벡터 내로 도입될 수 있고, 결과적으로는 하기 논의되는 바와 같이 발현 및 수거를 위해 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명은 또한 골 손실과 연관된 골 질환 치료를 필요로 하는 환자에서 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 한 측면에서, 본 방법은 치료학상 유효량의, 상기 기술된 바와 같은 디자이너 BMP 단백질을 투여하여 환자에서 골 질환을 치료하는 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 디자이너 BMP 단백질은 서열식별번호: 8-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 구체적으로, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 및/또는 서열식별번호: 15를 포함한다.

본 발명은 섬유증 치료를 필요로 하는 환자에서 섬유증을 치료하는 방법을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명은 치료학상 유효량의, 상기 기술된 바와 같은 디자이너 BMP 단백질을 투여하여 섬유증을 치료하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다양한 실시양태에서, 디자이너 BMP 단백질은 서열식별번호: 8-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 구체적으로, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 및/또는 서열식별번호: 15를 포함한다.

추가로, 본 발명은 조직에서 골 형성을 유도하는 방법을 포함한다. 본 측면에서, 본 방법은 조직을 상기 기술된 바와 같은 디자이너 BMP 단백질과 접촉시켜 상기 조직에서 골 형성을 유도하는 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 디자이너 BMP 단백질은 서열식별번호: 8-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 구체적으로, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 및/또는 서열식별번호: 15이다.

마지막으로, 본 발명의 한 측면은 상기 기술된 바와 같은 디자이너 BMP를 포함하는, 환자 치료용 키트에 관한 것이다. 다양한 실시양태에서, 디자이너 BMP 단백질은 서열식별번호: 8-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 구체적으로, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 및/또는 서열식별번호: 15를 포함한다. 본 발명의 키트는 임의적으로 또는 추가로, 디자이너 BMP를 희석시켜 디자이너 BMP 용액을 생성하기 위한 유체, 및/또는 디자이너 BMP 용액과 함께 사용하기 위한 의료 기구 또는 임플란트 물질을 포함한다.

본 발명을 예시하기 위해, 본 발명의 특정 실시양태가 도면에 도시된다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시양태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다.
도 1은 다양한 야생형 및 디자이너 BMP 아미노산 서열의 정렬을 보여주고, 타입 I 및 타입 II 수용체 상호작용에 잠재적으로 관여하는 이들 단백질의 영역 (박스 내)을 나타내는 다이어그램이다. 도 1은 야생형 BMP2 (서열식별번호: 1), BMP4 (서열식별번호: 2), BMP5 (서열식별번호: 3), BMP6 (서열식별번호: 4), BMP7 (서열식별번호: 5), BMP8 (서열식별번호: 6) 및 BMP9 (서열식별번호: 7)의 아미노산 서열 정렬을 보여주는 것이다.
도 2는 2개의 타입 I 및 2개의 타입 II BMP 수용체에의 야생형 BMP2 동종이량체 결합을 보여주는 구조적 모델의 예시도이다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 3은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) (도 3A) 및 E. 콜라이(E. coli) 세포 (도 3B)에서 생성된 인간 BMP2 내의 히스티딘 도어스톱 (도어스톱) (H54)의 위치를 보여주는 구조적 모델의 다이어그램이다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 4는 글리칸 테더 및 잠재적인 히스티딘 (His) 도어스톱의 위치를 도시한 다이어그램이다. 도 4A는 비-도어스톱 배향의 글리칸 테더 (N56에서 N-연결된 글리칸) 및 히스티딘 54 뿐만 아니라, 모두 CHO 생산된 BMP2에서 R16과 글리칸 테더의 상호작용을 보여준다. 도 4B는 BMP6 내의 H78에서 비-도어스톱 입체형태의 글리칸 테더 (N80에서 N-연결된 글리칸) 및 히스티딘 뿐만 아니라, BMP2 내의 R16에 상응하는 R39를 보여준다.
패널 A-D를 포함하는 도 5는 BMP 및 디자이너 BMP의 정제 공정의 다양한 단계를 보여준다. 도 5A는 셀루핀 술페이트 칼럼을 사용한 BMP의 구배 용리를 보여주는 크로마토그램을 보여주는 것이다. 도 5B는 셀루핀 술페이트 칼럼 단계로부터의 분획의 샘플을 함유하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE (좌측에 비-환원 및 우측에 환원) 겔의 영상이다. 도 5C는 분취 역상 정제 단계로부터의 프로파일을 보여주는 크로마토그램을 보여주는 것이다. 도 5D는 분취 역상 정제 단계에 의해 수득된 분획의 샘플을 함유하는 BMP의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE (좌측에 비-환원 및 우측에 환원) 겔의 영상이다.

본 발명은 본원에서 "디자이너 BMP," "디자이너 골형성 단백질" 및 "디자이너 단백질"로 지칭되는 "디자이너" 골 형태형성 단백질 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 디자이너 BMP는 야생형 비변형된 BMP, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, BMP2 (서열식별번호: 1), BMP4 (서열식별번호: 2), BMP5 (서열식별번호: 3), BMP6 (서열식별번호: 4), BMP7 (서열식별번호: 5), BMP8 (서열식별번호: 6), 및 BMP9 (서열식별번호: 7)의 아미노산 서열에 상응할 수 있다. 특정 실시양태에서, 디자이너 BMP는 그의 상응하는 야생형 BMP와 비교하였을 때, 타입 I 및/또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 보인다. 추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP는 그의 상응하는 야생형 BMP와 비교하였을 때, 변경된 반감기, 면역원성, 또는 임의의 약동학적/약력학적 (PK/PD) 파라미터를 가지도록 변형될 수 있다.

정의

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상 이해되는 의미를 가진다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하여야 하고, 복수 용어는 단수를 포함하여야 한다. 일반적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 본원에서 설명되는 하이브리드화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 보편적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서 전역에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반 참고문헌 및 더욱 구체적인 참고문헌에 기술된 방법에 따라 수행된다. 상기 참고문헌으로는 예컨대, 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)], [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002)], [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)을 포함한다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 설명에 따라, 관련 기술분야에서 통상 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 그의 실험 절차 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 일반적으로 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제제, 제제화, 및 전달, 및 환자의 치료를 위한 표준 기술이 사용된다.

본원에서 사용되는 바, 하기 용어는 각각 본 섹션에서 그와 연관된 의미를 가진다.

"하나"("a" 및 "an")라는 관사는 본원에서 관사의 문법적 대상이 하나 또는 1 초과 (즉, 적어도 하나)라는 것을 의미하는 데 사용된다. 예로서, "한 요소"라는 것은 하나의 요소 또는 1 초과의 요소를 의미한다.

본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한, "및/또는"을 의미한다.

본원에서는 폴리펩티드 서열을 나타내는 데 통상적인 표기법이 사용된다: 폴리펩티드 서열의 좌측 단부는 아미노-말단이고; 폴리펩티드 서열의 우측 단부는 카르복실-말단이다. 본원에서 사용되는 바, 20종의 통상적인 아미노산 및 그의 약어는 통상적인 용법을 따른다. 문헌 [Immunology--A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 아미노산은 그의 정식 명칭에 의해, 그에 상응하는 3 문자 코드에 의해, 또는 그에 상응하는 1 문자 코드에 의해 하기 제시되는 바와 같이 표시된다:

정식 명칭 3 문자 코드 1 문자 코드

아스파르트산 Asp D

글루탐산 Glu E

리신 Lys K

아르기닌 Arg R

히스티딘 His H

티로신 Tyr Y

시스테인 Cys C

아스파라긴 Asn N

글루타민 Gln Q

세린 Ser S

트레오닌 Thr T

글리신 Gly G

알라닌 Ala A

발린 Val V

류신 Leu L

이소류신 Ile I

메티오닌 Met M

프롤린 Pro P

페닐라닌 Phe F

트립토판 Trp W

"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 화학적 특성 (예컨대, 하전 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R 기를 가지는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 서로 보존적 치환에 의해 상이한 경우에, 서열 동일성(%) 또는 유사도는 치환의 보존적 성질을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 상기 조정을 위한 수단은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Pearson, Methods Mol . Biol. 243:307-31 (1994)]를 참조할 수 있다.

화학적 특성이 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 군의 예로는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다.

대안적으로, 보존적 대체는 문헌 [Gonnet et al., Science 256:1443-1445 (1992)] (본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 PAM250 log-우도 매트릭스에서 양의 값을 가지는 임의의 변화이다. "중간 수준의 보존적" 대체는 PAM250 log-우도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 가지는 임의의 변화이다.

바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위해 결합 친화도를 변경하고, (4) 상기 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변경하는 것이다. 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 유사체는 명시된 펩티드 서열 이외의 다른 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중의 아미노산 치환 (바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 명시된 서열에서 (바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의, 예컨대, CDR 또는 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 부위 외부의 폴리펩티드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모체 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다 (예컨대, 대체 아미노산은 모체 서열에 존재하는 나선을 파단하거나, 또는 모체 서열의 특징이 되는 다른 타입의 2차 구조를 파괴시키는 경향을 보이지 않아야 한다). 관련 기술분야에서 인정되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 [Thornton et al., Nature 354:105 (1991)] (상기 문헌은 각각 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.

"폴리뉴클레오티드," "뉴클레오티드 서열," "핵산," "핵산 분자," "핵산 서열," 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 DNA 및 RNA 내의 연속된 뉴클레오티드 염기 ("뉴클레오티드"로도 불림)를 지칭하고, 2개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 임의의 쇄를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥의, 키메라 혼합물 또는 그의 유도체 또는 변형된 버전일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 분자의 안정성, 그의 하이브리드화 파라미터 등을 개선시키기 위해 염기 모이어티, 당 모이어티, 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 단백질 및 효소를 제조하기 위해 세포 기구에 의해 사용되는 정보를 포함하는 유전 정보를 보유한다. 이들 용어는 이중 또는 단일 가닥 게놈 및 cDNA, RNA, 임의의 합성 및 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드, 및 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 둘 모두를 포함한다. 이는 또한 변형된 염기, 예를 들어, 티오-우라실, 티오-구아닌, 및 플루오로-우라실을 함유하는, 또는 탄수화물, 또는 지질을 함유하는 핵산을 포함한다.

뉴클레오티드 서열과 관련하여, 본원에서 사용되는 바, "실질적으로 동일한"이라는 용어는, 제1 핵산 서열이, 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열이 공통된 기능적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하거나, 또는 공통된 구조적 폴리펩티드 도메인 또는 공통된 기능적 폴리펩티드 활성을 코딩하도록 제2 핵산 서열 내의 정렬된 뉴클레오티드와 동일한 충분한 개수의 또는 최소 개수의 뉴클레오티드를 함유한다는 것을 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 참조 서열에 대해 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가진다.

본원에서 "디자이너 BMP 핵산," 및 문법상 등가물은 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산을 의미한다.

"단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 순차적인 쇄를 의미한다. 본 용어는 별개의 단위로서 작용하는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 단일 폴리펩티드가 별개의 작용 단위이고, 별개의 작용 단위를 형성하기 위해 다른 폴리펩티드와 영구적인 또는 일시적인 물리적 회합을 필요로 하지 않는다면, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 별개의 작용 단위가 서로 물리적으로 회합되는 다중의 폴리펩티드로 이루어진다면, 본원에서 사용되는 바, "단백질"이라는 용어는 물리적으로 커플링되고, 별개의 단위로서 함께 작용하는 다중 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명에 따라 발현시키고자 하는 단백질은 단백질 치료제일 수 있다. 단백질 치료제는 그가 작용하는 신체 내의 영역에 대해 또는 중간체를 통해 원격으로 작용하는 신체의 영역에 대해 생물학적 효과를 가지는 단백질이다. 단백질 치료제의 예는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.

본원에서 사용되는 바, "디자이너 BMP"라는 용어는 돌연변이가 없는 상응하는 야생형 BMP와 비교하였을 때, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 BMP 단백질에 관한 것이고, 여기서 디자이너 BMP는 타입 I 및/또는 타입 II 수용체에 대한 상응하는 야생형 BMP의 결합과 비교하였을 때, 적어도 타입 I 수용체 및/또는 적어도 하나의 타입 II 수용체에 대해 검출 가능하게 변경된 결합을 가진다.

"상응하는 야생형 단백질"이란, 임의의 돌연변이 도입 이전의 디자이너 BMP 의 야생형 버전을 의미한다. 예를 들어, 디자이너 BMP가 디자이너 BMP2일 경우, 상응하는 야생형 BMP는 야생형 BMP2이다. 따라서, 한 실시양태에서, 디자이너 BMP 의 디자인은, 그러할 필요는 없지만, 야생형 BMP 서열로 시작할 수 있고, 여기서 돌연변이 (예컨대, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)는 야생형 서열 내로 도입된다. 그러므로, 디자이너 BMP는 야생형 BMP에 상응할 수 있고, 돌연변이의 위치는 예를 들어, 야생형의 상응 또는 "참조" BMP 서열의 아미노산 서열에 상응하고/거나, 그에 관련되고/거나, 그에 따른다고 말할 수 있다.

본 발명의 단백질은 본원에서 기술된 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체, 또는 변이체, 및 그의 임의 조합을 포함한다. 본 발명의 단백질을 언급할 때 "단편," "변이체," "유도체" 및 "유사체"라는 용어는 그의 유래 기점이 된 단백질의 기능적 특성 중 적어도 일부를 보유하는 임의의 단백질을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "단편"이라는 용어는 폴리펩티드를 지칭하고, 상기 폴리펩티드에 독특하거나, 특징적인 주어진 폴리펩티드의 임의의 별개의 부분으로서 정의된다. 또한, 본원에서 사용되는 상기 용어는 전장의 폴리펩티드의 활성 중 적어도 일부를 보유하는 주어진 폴리펩티드의 임의의 별개의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 활성 보유 분율은 전장의 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%이다. 특정 실시양태에서, 활성 보유 분율은 전장의 폴리펩티드의 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다. 특정 실시양태에서, 활성 보유 분율은 전장의 폴리펩티드의 활성의 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 특정 실시양태에서, 활성 보유 분율은 전장의 폴리펩티드의 활성의 100% 이상이다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에서 사용되는 상기 용어는 또한 적어도, 전장의 폴리펩티드에서 발견되는 확립된 서열 요소를 포함하는 주어진 폴리펩티드의 임의의 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 서열 요소는 전장의 폴리펩티드의 적어도 약 4-5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 아미노산에 걸친다. 본 발명의 단백질의 단편은 단백질 분해 단편 뿐만 아니라, 결실 단편을 포함한다.

본 발명의 단백질의 변이체는 상기 기술한 바와 같은 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 자연적으로 발생하거나 또는 비-자연적으로 발생할 수 있다. 비-자연적으로 발생된 변이체는 관련 기술분야에 공지된 돌연변이유발 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 변이체 단백질은 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.

본 발명의 단백질은 측쇄 작용기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 가지는 단백질을 포함한다. 또한, 20종의 표준 아미노산의 하나 이상의 자연적으로 발생된 아미노산 유도체를 함유하는 폴리펩티드가 본 발명의 단백질로서 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린 대신으로 치환될 수 있고; 5-히드록시리신이 리신 대신으로 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘이 히스티딘 대신으로 치환될 수 있고; 호모세린이 세린 대신으로 치환될 수 있고; 오르니틴이 리신 대신으로 치환될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "재조합적으로 발현된 폴리펩티드" 및 "재조합 폴리펩티드"란, 상기 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 숙주 세포로부터 발현된 폴리펩티드를 의미한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 특정 실시양태에서, 상기 조작은 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 발현시키고자 하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자의 도입에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 재조합적으로 발현된 이종성 폴리펩티드는 숙주 세포에서 보통 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나 유사할 수 있다. 재조합적으로 발현된 이종성 폴리펩티드는 또한 숙주 세포에 외래성, 예컨대, 숙주 세포에서 보통 발현되는 폴리펩티드에 이종성일 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합적으로 발현된 이종성 폴리펩티드는 키메라이다. 예를 들어, 폴리펩티드의 일부는 숙주 세포에서 보통 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나, 유사한 아미노산 서열을 함유할 수 있지만, 다른 부분은 숙주 세포에 외래성인 아미노산 서열을 함유한다. 추가로 또는 대안적으로, 폴리펩티드는 둘 모두가 숙주 세포에서 보통 발현되는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 폴리펩티드는 둘 모두가 숙주 세포에 외래성인 2개 이상의 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 하나 이상의 내인성 유전자의 활성화 또는 상향조절에 의해 유전적으로 변형된다.

서열들 사이의 상동성 또는 서열 동일성 (상기 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 두 아미노산 서열, 또는 두 핵산 서열의 동일성(%)을 측정하기 위하여, 서열을 최적의 비교 목적으로 정렬한다 (예컨대, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입할 수 있고, 비-상동성 서열은 비교를 위해 무시할 수 있다). 전형적인 실시양태에서, 비교 목적으로 정렬되는 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 60%, 또는 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 점유되었을 때, 그 분자는 상기 위치에서 동일한 것이다 (본원에서 사용되는 바, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 등가인 것이다).

두 아미노산 서열, 또는 두 핵산의 동일성(%)을 측정하기 위하여, 서열을 최적의 비교 목적으로 정렬한다 (예컨대, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭을 도입할 수 있다). 두 서열 사이의 동일성(%)은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 개수의 함수이다 (즉, 상동성(%) = (동일한 위치의 개수/위치의 총 개수) X 100). 두 서열 사이의 상동성(%)의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 사용되는 바람직한 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 문헌 [Karlin et al., Proc Natl Acad Sci U S A 90:5873-7 (1993)]에서 변형된 문헌 [Karlin et al., Proc Natl Acad Sci U S A 87:2264-8 (1990)]의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., J Mol Biol 215:403-10 (1990)]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내에 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드 길이=12를 이용하여 수행될 수 있다.

BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드 길이=3을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적의 갭 도입 정렬을 얻기 위해, 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res 25:3389-402 (1997)]에 기술된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다.

두 서열 사이의 동일성(%)은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 개수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 개수의 함수이다.

서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성(%) 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다. 한 실시양태에서, 두 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6를 사용하여 (gcg.com에서 이용가능한) GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 내로 포함된 니들만-운쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘을 사용하여 측정된다 (Needleman et al., J Mol Biol 48:443-53 (1970)). 추가의 또 다른 실시양태에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(%)은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여 (인터넷 상의 gcg.com에서 이용가능한) GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 사용하여 측정된다. 한 전형적인 파라미터 세트 (및 달리 명시되지 않는 한, 사용되어야 하는 것)는 갭 패널티 12, 갭 연장 패널티 4, 및 프레임쉬프트 갭 패널티 5를 사용한 블로섬 62 스코어링 매트릭스이다.

두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(%)은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 포함된 E. 마이어스 (E. Myers) 및 W. 밀러 (W. Miller) (Myers et al., Comput Appl Biosci 4:11-7 (1988))의 알고리즘을 사용하여 측정할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "사용 설명서"는 본원에서 언급된 각종 질환 또는 장애에 영향을 주거나, 그를 완화시키거나, 또는 치료하기 위한 키트 내의 본 발명의 화합물, 조합물, 및/또는 조성물의 유용성을 알리기 위해 사용될 수 있는 출판물, 기록, 다이어그램, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 임의로, 또는 대안적으로, 사용 설명서는 본원 다른 곳에 개시된 것을 비롯한, 세포, 조직, 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 완화시키는 하나 이상의 방법을 기술할 수 있다.

키트의 사용 설명서는 예를 들어, 본 발명의 화합물 및/또는 조성물이 담긴 용기에 부착되거나, 또는 화합물 및/또는 조성물이 담긴 용기와 함께 수송될 수 있다. 대안적으로, 사용 설명서는 수여자가 사용 설명서와 화합물을 함께 사용하도록 하는 의도로 용기와 별개로 수송될 수 있다.

언급된 경우를 제외하고, "환자" 또는 "대상체"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 포유동물, 예컨대, 인간 환자 및 비-인간 영장류, 및 수의학적 대상체, 예컨대, 토끼, 래트, 및 마우스 및 다른 동물을 의미한다. 바람직하게는, 환자는 인간을 지칭한다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 "유효량" 또는 "치료학상 유효량"이라는 용어는 조직 또는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여되었을 때, 화합물의 부재하에서 검출된 반응과 비교하여 검출가능한 치료학적 반응을 매개하는 양이다. 치료학적 반응, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 섬유증의 억제 및/또는 감소, 골 질량 또는 골 밀도의 증가 등은 예컨대, 본원에 개시된 방법을 비롯한, 관련 기술분야에서 인정되는 다양한 방법에 의해 쉽게 사정될 수 있다.

통상의 기술자는 본원에서 투여되는 화합물 또는 조성물의 유효량이 상이하고, 많은 인자, 예컨대, 치료되는 질환 또는 병태, 질환의 병기, 치료받는 포유동물의 연령 및 건강 및 신체 상태, 질환의 중증도, 투여되는 특정 화합물 등에 기초하여 쉽게 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 사용되는 바, "치료하다"라는 것은 질환의 증상 (예컨대, 골 밀도 감소, 골절, 섬유증 등)을 환자가 경험하는 빈도를 감소시키는 것을 의미한다. 상기 용어는 질환의 증상, 합병증, 또는 생화학적 징후의 발병을 방지하거나, 또는 지연시키거나, 증상을 완화시키거나, 또는 질환, 병태, 또는 장애의 추가 발생을 정지 또는 억제시키기 위해 본 발명의 화합물 또는 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 치료는 (질환의 발병을 방지하거나 지연시키기 위한, 또는 그의 임상 또는 준임상적 증상의 징후를 방지하기 위한) 예방적 또는 질환의 징후 이후의 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "특이적으로 결합하다"라는 어구는 화합물, 예컨대, 단백질, 핵산, 항체 등이 특이 분자를 인식하고, 결합하지만, 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나, 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, BMP 단백질, 항체 또는 펩티드 억제제는 샘플 중 동족 수용체 (예컨대, BMP 타입 I 또는 타입 II 수용체, 그의 동족 항원에 결합하는 항체 등)를 인식하고 결합하지만, 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나, 결합하지 않는다. 따라서, 지정된 검정 조건하에서, 명시된 결합 모이어티 (예컨대, BMP 또는 그의 수용체 결합 단편)는 특정 표적 분자에 우선적으로 결합하고, 시험 샘플 중에 존재하는 다른 성분에는 유의적인 양으로 결합하지는 않는다. 관심 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하는 데 다양한 검정 포맷이 사용될 수 있다. BMP 수용체와 특이적으로 반응하는 BMP를 확인하는 데 사용될 수 있는 많은 검정법들 중에 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정법, 면역침전, BIA코어(BIAcore), FACS, 옥텟(Octet), 및 웨스턴 블롯 분석이 있다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 잡음의 적어도 2배, 더욱 바람직하게는, 배경 신호 또는 잡음의 적어도 5배 더 크고, 더욱 전형적으로는 배경의 10배 초과일 것이며, 더욱더 구체적으로는, 평형 해리 상수 (K_D)가 ≤ 100 μM, 더욱 바람직하게 ≤ 10 μM, 더욱더 바람직하게 ≤ 1 μM, 더욱더 바람직하게 ≤ 100 nM 및 가장 바람직하게는 ≤ 10 nM일 때, BMP가 BMP 수용체에 "특이적으로 결합한다"고 말할 수 있다.

"K_D"라는 용어는 특정 리간드-수용체 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.

"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 결합 부위 (예컨대, BMP 리간드)와 그의 결합 파트너 (예컨대, BMP 타입 I 또는 타입 II 수용체) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예컨대, BMP 및 그의 동족 수용체) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다.

친화도는 본원에 기술된 것을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 일반 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화도가 낮은 BMP는 일반적으로 수용체에 느리게 결합하고, 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면에, 친화도가 높은 BMP는 일반적으로 수용체에 더욱 빠르게 결합하고, 더욱 오랜 기간 동안 결합된 상태로 유지되는 경향을 보인다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 그 중 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적인 실시양태가 본원 다른 곳에 기술되어 있다.

본원에서 사용되는 바, "k _온 "이라는 용어는 M^-1 sec^-1 단위로 측정된 회합 또는 온 속도 상수, 또는 정방향 또는 복합체-형성 반응의 특이적인 반응 속도를 지칭하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바, "k _오프 "라는 용어는 sec^-1 단위로 측정된 해리 또는 오프 속도 상수, 또는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리에 대한 특이적인 반응 속도를 지칭하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바, "K_d"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 하기 공식에 의해 계산된다:

k _오프 _/ k _온 = K_d.

본원에서 사용되는 바, "변경된 결합"이라는 용어는 디자이너 BMP가 동일한 타입 I 및/또는 타입 II 수용체에의 상응하는 야생형 BMP의 결합과 비교하였을 때, 적어도 타입 I 수용체 및/또는 타입 II 수용체에 대하여 상이한 결합 특이성을 포함한다는 것을 의미한다. 디자이너 BMP는 수용체에의 야생형 BMP의 결합과 비교하였을 때, 수용체에 대해 더 크거나 더 작은 친화도로 결합할 수 있다. 예를 들어, 야생형 BMP가 특정 타입 I 수용체에 특정 결합 친화도로 결합한다면, 상응하는 디자이너 BMP는 그 수용체에 대해 야생형 BMP에 비해 더 크거나 더 작은 친화도로 결합한다. 심지어는 디자이너 BMP는 야생형 BMP가 검출가능하게 결합하지 않은 수용체에 특이적으로 결합하고, 반대로, 디자이너 BMP는 야생형 BMP가 결합하는 수용체에 더 이상 검출가능하게 결합하지 않을 수도 있다. 따라서, 변경된 결합은 상응하는 야생형 BMP에 의한 수용체의 결합과 비교하였을 때, 타입 I 또는 타입 II 수용체에의 디자이너 BMP 결합의 임의의 검출가능한 변화를 포함한다. 디자이너 BMP의 Kd가 동일한 BMP 수용체에 대한 상응하는 야생형 BMP의 Kd보다 더 크거나 더 작도록, 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP에 대한 k _온 값과 비교하여 더 크거나 더 작은 k _온 값을 가지고/거나, 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP의 k _오프 값과 비교하여 더 크거나 더 작은 k _오프 값을 가질 수 있다. 따라서, 디자이너 BMP와 상응하는 야생형 BMP 사이의 결합 특징 및/또는 친화도 값의 임의의 차이는 본원에서 사용되는 "변경된 결합"이라는 용어에 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "표면 플라스몬 공명"이라는 용어는 예를 들어, BIA코어 시스템 (파마시아 바이오센서 아베(Pharmacia Biosensor AB: 스웨덴 웁살라, 및 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변경의 검출에 의해 실시간의 생체특이적 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상을 의미한다. 추가의 설명에 대해서는, 예컨대, 문헌 [Johnsson, et al., Ann. Biol. Clin . 51: 19-26 (1993)]; [Johnsson, et al., Biotechniques 11: 620-627 (1991)]; [Johnsson, et al., J. Mol . Recognit . 8: 125-131 (1995)]; 및 [Johnnson, et al., Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991)]을 참조할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한"이란, 목적하는 종이 우세하게 존재하는 종이라는 것 (즉, 몰 기준으로 조성물 중에 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부하다는 것)을 의미하고, 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은 목적하는 종 (예컨대, 디자이너 BMP)이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50% (몰 기준으로)를 구성하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80% 초과, 더욱 바람직하게는, 약 85%, 90%, 95%, 및 99% 초과를 구성할 것이다. 가장 바람직하게는, 목적하는 종은 조성물이 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진 것인 본질적으로 균일한 상태로 정제된다 (오염 종은 종래 검출 방법에 의해 조성물 중에서 검출될 수 없다).

설명

골 형태형성 단백질 (BMP)

상기 언급한 바와 같이, BMP는 그 모두가 6개의 보존된 시스테인 잔기를 특징으로 하는 TGF-β 단백질 수퍼패밀리의 구성원이다 (Lander et al., (2001) Nature, 409:860-921). BMP/GDF 서브패밀리는 BMP2, BMP3 (오스테오게닌) (see, 예컨대, 미국 특허 번호 6,177,406), BMP3b (GDF-10) (예컨대, 미국 특허 번호 6,204,047 참조), BMP4 (BMP2b) (예컨대, 미국 특허 번호 6,245,889 참조), BMP5 (예컨대, 미국 특허 번호 5,543,394 참조), BMP6 (예컨대, 미국 특허 번호 6,613,744 참조), BMP7 (골형성 단백질-1 또는 OP1) (예컨대, 미국 특허 번호 5,141,905 참조), BMP8 (OP2) (예컨대, 미국 특허 번호 5,688,678 참조), BMP8B (OP3) (예컨대, 미국 특허 번호 5,854,071 참조), BMP9 (GDF2) (예컨대, 미국 특허 번호 6,287,816 참조), BMP10 (예컨대, 미국 특허 번호 5,703,043 참조), BMP11 (GDF11) (예컨대, 미국 특허 번호 6,437,111 참조), BMP12 (GDF7) (예컨대, 미국 특허 번호 6,027,919 참조), BMP13 (GDF6, CDMP2) (예컨대, 미국 특허 번호 6,027,919 참조), BMP15 (GDF9) (예컨대, 미국 특허 번호 6,034,229 참조), BMP16 (예컨대, 미국 특허 번호 6,331,612 참조), GDF1 (예컨대, 미국 출원 번호 2004/0039162 참조), GDF3 (예컨대, 미국 특허 번호 6,025,475 참조), GDF5 (CDMP1; MP52) (예컨대, 미국 특허 번호 5,994,094 참조), 및 GDF8 (미오스타틴) (예컨대, 미국 특허 번호 5,827,733 참조)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

BMP는 타입 I 수용체: ALK-I, ALK-2 (ActRla 또는 ActRI로도 불림), ALK-3 (BMPRIa로도 불림), 및 ALK-6 (BMPRIb로도 불림); 및 타입 II 수용체: ActRIIa (ActRII로도 불림), ActRIIb, 및 BMPRII를 포함하는, 그의 동족 수용체에 특이적으로 결합한다. BMP-수용체 결합 상호작용은 광범하게 연구되었고, 각각의 타입 I 및/또는 타입 II 수용체에 대한 각각의 야생형 BMP의 결합 특이성은 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있고, 하기 표 1에 제시되어 있다. 예컨대, 문헌 [Nickel et al., Cytokine Growth Factor Rev 20:367-77 (2009)]; [Heinecke et al., BMC Biol 7:59 (2009)]를 참조할 수 있다.

<표 1>

골형성 활성이 개선된 디자이너 골 형태형성 단백질

본 발명은 부분적으로는 각각의 BMP 이량체가 4개의 BMP 수용체: 2개의 타입 I 수용체 및 2개의 타입 II 수용체에 결합한다는 이해에 기초한다. 각각의 수용체에 대한 각각의 BMP의 특이성은 상기 표 1에 제시된 바와 같이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 각각의 수용체에 대한 BMP의 결합을 매개하는 다양한 BMP의 수용체 결합 영역이 매핑되었고, 이는 하기 표 2에 제시되어 있다. 예를 들어, 야생형 BMP2 및 BMP4가 타입 I BMP 수용체 Alk-3 및 ALK-6에 고친화도로 결합하고, 타입 II BMP 수용체에는 보다 낮은 친화도로 결합한다는 것이 잘 확립되어 있다. 다른 한편으로, 야생형 BMP6 및 BMP7은 타입 II 수용체 ActrIIA, ActrIIB, 및 BMPRII에 고친화도로 결합하지만, 타입 I 수용체에는 타입 II에 결합하는 것보다 더 낮은 친화도로 결합한다는 것이 알려져 있다. 대략 12개의 수용체와의 상호작용을 통해 신호를 전달하는 대략 43개의 TGFβ 수퍼패밀리 구성원과 상이한 세포성 반응은 상이한 친화도로 결합하는 특정 수용체 레퍼토리를 이용하는 각각의 리간드에 의한 것으로 생각된다. 타입 I 및 II 결합 도메인이 하기 표 2에 기술되어 있다.

<표 2>

디자이너 BMP의 수용체 결합을 변경하기 위한 합리적인 아미노산 치환

야생형 BMP2는 타입 I 수용체에 대해 비교적 높은 친화도를 보이는 반면, 야생형 BMP6은 타입 II 수용체에 대해 높은 친화도를 보인다는 것인 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 야생형 BMP2 및 BMP6의 이종이량체는 타입 I 및 타입 II 수용체 둘 모두에 비교적 높은 친화도로 결합하고, 각 BMP는 분명히 각 수용체에 대해 더욱 높은 친화도 결합 부위를 제공한다는 것이 관련 기술분야에 추가로 공지되어 있다. 하기 표 3을 참조할 수 있다. BMP2/6 이종이량체는 시험관내 및 생체내 골 형성 검정법, 둘 모두에서 BMP2 또는 BMP6 단독 또는 동종이량체로서보다 더 큰 활성을 띠는 것으로 알려져 있다. 표 3은 타입 I 및 II 수용체에 대한 BMP2 및 BMP6 결합 친화도의 예를 보여주는 것이다.

<표 3>

따라서, (제한없이) BMP 이종이량체의 결합을 모방하고, 바람직하게는 하기 결합을 능가하는 결합을 비롯한, 타입 I 및/또는 타입 II 수용체에 대하여 개선된 결합을 가지는 디자이너 BMP를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 도 1 및 표 2에 제시된 바와 같이, 각각의 BMP는 수용체 결합에 기여하는 3개의 결합 부위를 포함한다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 BMP는 타입 II 수용체 결합 부위 A, 타입 I 수용체 결합 부위, 및 제2 타입 II 수용체 결합 부위 B를 포함한다. 야생형 BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, 및 BMP9의 예시적인 정렬이 도 1에 도시되어 있지만, 통상의 기술자는 TGFβ 수퍼패밀리의 구성원 중의 다양한 아미노산의 상대적인 위치를 제공하는 널리 공지된 정렬이 존재함을 이해할 것이다. 상기 정렬은 그 중에서도 특히 국제 공개 번호 WO 2009/086131 (예컨대, 도 15-17, 도 31A), WO 2008/051526 (도 9-12), WO 2005/118636 (도 6), WO 2005/118635, WO 2005/113585 (도 3), WO 2001/92298 (도 6a-6c), [Kirsch et al., EMBO J. 19 :3314-3324 (2000)] (도 1), 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0293425 (도 6), [Groppe et al., Nature 420 :636-642 (2002)], [Nickel et al., J. Bone Joint Surg. Am. 83:7-14 (2001)], 및 [Weber et al., BMC Structural Biol . 7:6 (2007)]에 제공되어 있다. 따라서, 다양한 TGFβ 수퍼패밀리 구성원의 아미노산 서열의 정렬 뿐만 아니라, 본원에 제공된 개시내용을 비롯한, 관련 기술분야에 널리 공지된 단백질 서열 정렬 알고리즘 및 도구를 사용하여, 하나의 BMP/GDF 단백질 내의 상응하는 아미노산을 또 다른 BMP/GDF 단백질 내의 임의 위치의 아미노산과 비교하여 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 및 BMP-9 내의 상응하는 아미노산 잔기가 제시되어 있다 (예컨대, 도 1 참조).

본 발명에 따른 디자이너 BMP는 일반적으로 타입 I 결합 도메인 및/또는 타입 II 결합 도메인에 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대한 변경된 결합을 부여한다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 I 결합 도메인 및 제1 (결합 도메인 A) 및/또는 제2 (결합 도메인 B) 타입 II 결합 도메인 둘 모두에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 두 타입 II 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 제1 타입 II 결합 도메인, 제2 타입 II 결합 도메인, 및 타입 I 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 I 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 기술된 돌연변이는 상이한 TGFβ 수퍼패밀리 구성원의 상응하는 도메인 사이의 하나 이상의 "스왑"에 의해 발생되고, 이로써, 키메라 디자이너 BMP가 생성된다. 예를 들어, 문헌 [Berasi et al.]에서, BMP-2와 BMP-6 사이의 스왑은 다양한 디자이너 BMP를 생성하는 데 사용된다. 통상의 기술자는 상기 및 다른 TGFβ 수퍼패밀리 구성원 사이의 다른 스왑도 가능하다는 것을 이해하겠지만, 본 개시내용에서 베라시 등의 교시내용은 BMP-2, 4, 6 및 7 사이의 스왑을 포함하는 것으로 확장된다.

비제한적인 예로서, BMP-GE27 (서열식별번호: 8)은 BMP-2/7 키메라를 생성하는, BMP-7의 타입 I 및 타입 II A 및 B 도메인의 BMP-2로의 스왑을 포함한다. 유사하게, BMP-GE46 (서열식별번호: 10) 및 BMP-GE47 (서열식별번호: 14)은 (각각) BMP 6 및 7의 타입 I 및 타입 II A 및 B 도메인의 BMP-4로의 스왑을 포함한다.

상기 돌연변이 전략법 이외에도, 액티빈-A의 C-말단 영역의 디자이너 BMP로의 별도의 스왑이 ActRIIB 수용체에 대하여 극도로 높은 친화도를 가지는 디자이너 BMP를 생성하고, 이로써, 생성된 분자는, 심지어 고농도의 노긴(Noggin)의 존재하에서도 BMP 수용체에 결합하면서, 기능상 노긴에는 무관심하다는 것을 본 발명자들은 발견하게 되었다 (그리고, 이는 문헌 [Berasi et al.]에 개시되었다). 따라서, 본 발명은 특정 실시양태에서, 하나 이상의 C-말단 돌연변이 점 돌연변이 및/또는 "스왑", 예컨대, BMP-GE27-NR (서열식별번호: 9), BMP-GE46-NR (서열식별번호: 11), BMP-GER46-NR (서열식별번호: 13) 또는 BMP-GE47-NR (서열식별번호: 15)을 도입하는 dBMP를 포함한다.

일부 실시양태에서, 돌연변이는 타입 I 수용체에 대한 결합을 개선시킨다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 타입 II 수용체에 대한 결합을 개선시킨다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 하기에 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 글리칸 테더를 생성하거나, 파괴한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 하기에 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, His 도어스톱을 생성하거나, 파괴한다.

BMP는 이와 같이 관련 기술분야에 특징이 잘 규명되어 있고, 이해되고 있기 때문에, 일단 본원에서 제공되는 개시내용이 제공되고 나면, 디자이너 BMP의 활성에 추가로 영향을 주지 않고 이루어질 수 있는 가능한 돌연변이의 위치를 알 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 따라서, 본 발명의 디자이너 BMP는 변이체 BMP의 수용체 결합 친화도에 영향을 주지 않는 추가의 삽입, 결실, 또는 치환을 함유한다는 점에서 상응하는 야생형 또는 디자이너 BMP와 상이한 변이체 BMP를 포함한다. 일부 비제한적인 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 시스테인 노트 형성에 관여하는 시스테인 및 수용체 상호작용에 관여하는 아미노산은 돌연변이화되지 않아야 하거나, 또는 보존적 치환으로 변이되어야 하는 반면, 다른 아미노산은 디자이너 BMP의 생물학적 활성에 유해한 영향을 주지 않으면서 더욱 자유롭게 치환, 삽입, 또는 결실될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

달리 언급되지 않는 한, 디자인된 또는 변형된 BMP의 모든 위치에 따른 넘버링은 성숙 천연 BMP의 서열에 기초한다는 것에 유의하여야 한다. 디자이너 BMP는 그를 BMP 서열의 자연적으로 발생된 대립유전자 또는 종간 변이와 구분시키는 특징인 미리 결정된 변이 성질을 특징으로 한다. 디자이너 BMP의 변이체는 하기 기술되는 적절한 검정법을 이용하여 측정되는 바와 같이, 하나 이상의 세포 타입에서 상응하는 야생형의 활성 또는 디자이너 BMP 활성의 적어도 50%를 보유하여야 한다. 야생형 활성의 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%를 보유하는 변이체가 더욱 바람직하고, 야생형보다 더 큰 활성을 가지는 변이체가 특히 바람직하다. 디자이너 BMP는 N-말단, C-말단, 또는 내부에 삽입, 결실, 및/또는 치환을 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 디자인된 또는 변형된 BMP는 가장 유사한 인간 BMP 서열과 상이한 적어도 1개의 잔기를 가지고, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상이한 잔기가 더욱 바람직하다.

본 발명의 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP 단백질 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 유지한다.

본 발명의 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP 단백질 서열의 C-말단 영역의 보존된 시스테인 도메인과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 유지할 수 있다.

디자이너 BMP는 추가의 단백질 특성, 예컨대, 안정성 또는 면역원성을 변경하거나, 또는 번역 후 변형, 예컨대, PEG화 또는 글리코실화를 가능하게 하거나, 방지하는 추가의 변형, 예를 들어, 돌연변이를 포함할 수 있다. 디자이너 BMP는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글리코실화, PEG화, 환상 순열, 고리화, 단백질 또는 단백질 도메인에의 융합, 및 펩티드 태그 또는 표지의 부가를 포함하나, 이에 제한되지 않는 공동-번역 또는 번역 후 변형에 적용될 수 있다.

유전자 코드의 축퇴성에 기인하여, 디자이너 BMP의 아미노산 서열을 변이시키지 않는 방식으로 간단히 하나 이상의 코돈의 서열을 변형시킴으로써 그 모두가 본 발명의 디자이너 BMP를 코딩하는 것이 극도로 많은 개수의 핵산이 제조될 수 있다. 본 발명의 디자이너 BMP는 WO2008/051526 또는 WO2009/086131에 기술된 상기 서열은 포함하지 않는다.

상기 기술한 바와 같이, BMP는 긴 프로도메인, 하나 이상의 절단 부위, 및 성숙 도메인을 포함하는 프로단백질로서 자연적으로 발현된다. 이어서, 상기 프로단백질은 세포 기구에 의해 프로세싱되어 이량체성의 성숙한 BMP 분자를 생성한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 유사한 방식으로 제조된다. 프로도메인은 BMP의 정확한 폴딩 및 프로세싱을 돕는 것으로 생각된다. 추가로, 모든 BMP는 아니지만, 일부 BMP에서, 프로도메인은 성숙 도메인에 비공유 결합할 수 있고, 샤페론 뿐만 아니라, 억제제로서 작용할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Thies et al. (2001) Growth Factors, 18:251-259]). 바람직하게는, 본 발명의 변형된 BMP는 상기 형태로 제조되고/거나, 치료학적으로 투여된다. 대안적으로, BMP는 성숙 도메인이 직접 제조되거나, 또는 봉입체로부터 리폴딩되거나, 또는 전장의 무손상 프로단백질을 포함하는 형태를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 디자이너 BMP는 상기 및 다른 형태로 유용할 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 백본 BMP, 즉, 디자이너 BMP가 그에 상응하는 야생형 BMP를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 백본 BMP는 야생형 BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, 또는 BMP9 백본일 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 I 결합 도메인 및/또는 타입 II 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 상응하는 야생형 BMP의 결합과 비교하였을 때, 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대한 변경된 결합을 부여한다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 두 타입 I 결합 도메인 모두에 적어도 하나의 돌연변이 및 타입 II 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 II 결합 도메인 A 및 타입 II 결합 도메인 B에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 II 결합 도메인 A, 타입 II 결합 도메인 B, 및 타입 I 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

특정 실시양태에서, 돌연변이는 아미노산 또는 핵산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 아미노산 치환을 포함한다.

일부 실시양태에서, 백본 BMP는 야생형 BMP이고, 돌연변이는 하기 표 4 내지 6에 열거된 돌연변이 중 하나 이상의 것이다. 디자이너 BMP는 이들 표에 열거된 돌연변이의 임의의 조합 및 임의 개수의 돌연변이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 백본 BMP는 야생형 BMP이고, 돌연변이는 하기 표 4 내지 6에 열거된 돌연변이 중 하나 이상의 것이다. 디자이너 BMP는 이들 표 또는 본원의 다른 곳에 개시된 돌연변이의 순열 및 임의의 모든 돌연변이를 포함할 수 있다.

<표 4>

<표 5>

<표 6>

일부 실시양태에서, 돌연변이는 타입 I 수용체에 대한 결합을 개선시킨다. 다른 실시양태에서, 타입 II 수용체에 대한 결합을 개선시킨다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합을 감소시킨다.

상기 표 4-6은 돌연변이의 위치가 상응하는 야생형 BMP 아미노산 서열 기준으로 제공되는 것인, 본 발명의 예시적인 돌연변이의 비-제한적인 편집을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 하기의 돌연변이의 바람직한 조합을 포함한다:

디자이너 BMP의 예시적인 아미노산 서열은 하기 표 7에 기재되어 있다. 표 7은 디자인된 분자의 명칭 및 서열을 보여주는 것이다.

<표 7>

상기 열거된 디자이너 BMP가 본 발명의 실시양태를 구성하지만, 본 발명은 어느 방식으로도 임의의 구체적인 분자로 제한되지 않는다. 대신, 본 발명은 변경된 수용체 결합을 포함하는 임의의 디자이너 BMP를 포함하고, 여기서 디자이너 BMP는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 더욱더 바람직하게는, 디자이너 BMP는 타입 I 수용체 결합 도메인 내에 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 포함하고, 가장 바람직하게는, 디자이너 BMP는 타입 II 수용체 결합 도메인 B 내에 추가로 또 다른 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 상기 기술된 서열 중 하나와 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열식별번호: 8-15의 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

추가의 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열식별번호: 8-15 중 어느 하나에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8-15의 서열 중 하나로 이루어진다.

추가로, 한 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열식별번호: 8-15의 서열 중 하나와 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 디자이너 BMP는 상기 기술된 서열 중 어느 하나의 단편을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 디자이너 BMP 단편은 서열식별번호: 8-15의 서열 중 어느 하나의 서열로부터의 적어도 연속된 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 47, 50, 53, 54, 56, 58, 60, 62, 66, 68, 70, 71, 74, 77, 80, 83, 85, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 100, 102, 105, 108, 110, 112, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 또는 125개의 아미노산 서열로 이루어진 단편을 포함할 수 있다.

BMP가 단백질의 아미노 및/또는 카르복실 말단과 관련하여 종종 불균일하다는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 즉, 본 발명은 디자이너 BMP의 C 및/또는 N 말단으로부터 적어도 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는, 9개의 아미노산 잔기, 더욱더 바람직하게는, 8개의 아미노산 잔기, 더욱더 바람직하게는, 7개의 아미노산 잔기, 바람직하게는, 6개의 아미노산 잔기, 더욱더 바람직하게는, 5개의 아미노산 잔기, 바람직하게는, 4개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는, 3개의 아미노산 잔기, 더욱더 바람직하게는, 2개의 아미노산 잔기, 및 가장 바람직하게는 1개의 아미노산 잔기의 결실을 포함하는, 아미노 및/또는 카르복실 말단에 아미노산 결실/말단절단을 포함하는 디자이너 BMP를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8-15의 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 단백질의 아미노 및/또는 카르복실 말단으로부터 결실/말단절단을 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8-15의 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 BMP 단백질로부터 유래된 디자이너 BMP 단백질을 포함하고, 여기서 단백질은 디자이너 BMP 단백질 아미노산 서열의 C 및/또는 N 말단으로부터 적어도 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는, 9개의 아미노산 잔기, 더욱더 바람직하게는, 8개의 아미노산 잔기, 더욱더 바람직하게는, 7개의 아미노산 잔기, 바람직하게는, 6개의 아미노산 잔기, 더욱더 바람직하게는, 5개의 아미노산 잔기, 바람직하게는, 4개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는, 3개의 아미노산 잔기, 더욱더 바람직하게는, 2개의 아미노산 잔기, 및 가장 바람직하게는, 1개의 아미노산 잔기의 결실을 포함하는, 아미노 및/또는 카르복실 말단에 아미노산 결실/말단절단을 포함한다.

글리코실화에 의해 매개된 수용체 친화도가 변경된 BMP의 구조 디자인

베라시 등에 의해 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 앞서, 글리코실화되지 않은, E. 콜라이에서 제조된 BMP2 동종이량체 (본원에서 "E. 콜라이 BMP2"로 지칭된다)가 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포에서 제조된 글리코실화된 BMP2 (본원에서 "CHO BMP2"로 지칭된다)보다 활성이 작다는 것을 발견하게 되었다. 본 발명자들은 또한 E. 콜라이에서 제조된 BMP6 동종이량체가 포유동물 세포 배양물에서 제조된 BMP6 동종이량체와 비교하였을 때, 본질적으로 비작용성이라는 것도 발견하게 되었다. 상기 관찰 결과는 타입 I 수용체 결합 영역에서 E. 콜라이 BMP2와 CHO BMP2의 결정 구조 사이에는 유의적인 차이가 존재한다는 것을 시사한다.

본 발명자들은 앞서 포유동물 (예컨대, CHO) 세포에서 제조된 야생형 BMP2 에서 D53은 수용체 계면을 향하는 반면, H54는 수용체로부터 멀어진다는 것 또한 발견하게 되었다 (그리고, 베라시 등도 개시한 바 있다). 이는 D53 잔기가 수용체 계면으로부터 멀어지고, H54 잔기가 수용체를 향해 배열되고, 도 3에 도시된 바와 같이 프롤린 잔기에 대해 적층되어 분명히 "도어스톱"으로서 작용하는, E. 콜라이에서 제조된 BMP2와 대조를 이룬다. 베라시 등은 추가로 완전히 글리코실화되고, 활성을 띠는 CHO 제조된 BMP6 또한 유입 수용체로 향하는 히스티딘 잔기, 즉, 히스티딘 "도어스톱"을 포함한다는 것을 최초로 입증하였다.

임의의 특정 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 문헌 [Berasi et al.]에 기술된 바와 같이, 본 발명자들의 관찰 결과는 수용체 계면으로부터 "도어스톱" 잔기를 멀리 이동시키는 것이 BMP 리간드와 그의 수용체 사이의 결합 증가를 매개할 수 있다는 것을 최초로 제안하였다. 본 데이터는 추가로 도어스톱 잔기 자체가 도어스톱을 제거하기 위해 돌연변이화될 수 있거나, 또는 도어스톱 잔기의 위치를 옮기기 위해서 다른 잔기가 돌연변이화될 수 있다는 것을 입증하였다. 문헌 [Berasi et al.]에 개시된 데이터는 다른 잔기가 돌연변이화되어 "글리칸 테더"를 제공할 수 있고, 이는 이어서, 글리칸의 테더링이 도어스톱 잔기를 재배향시키도록 글리칸을 배향시킬 수 있다는 것을 추가로 입증하였다.

문헌 [Berasi et al.]의 결과를 기반으로 한 본 발명은 일부 실시양태에서, 글리칸 테더에 영향을 주고/거나, 히스티딘 도어스톱 구조를 제거하여 수용체 결합이 변경된 디자이너 BMP를 제공하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 도입함으로써 제조된 디자이너 BMP를 포함한다.

요약하면, 일부 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 변경된 타입 I 및/또는 타입 II 수용체 결합을 부여하는 BMP의 타입 I 및/또는 타입 II 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, BMP 서열은 조작된 또는 "디자이너" BMP의 수용체 결합 및/또는 골형성 활성을 변경하고, 개선시키기 위해 BMP의 수용체 친화도를 변경하도록 조작된다. 한 실시양태에서, 상기 조작은 타입 I 및 타입 II 수용체 결합에 관여하는 잔기를 확인하고, 그 중에서도 특히 타입 I 및 타입 II 수용체에 대하여 디자이너의 유래 기점이 되는 모체 BMP보다 더 높은 친화도를 보이는 디자이너 BMP 분자를 생성하도록 상기 잔기를 대체하는 것을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 새로운 아르기닌 "글리칸 테더"를 생성하거나, 또는 타입 I 수용체 결합 도메인을 재성형하기 위해 존재하는 것을 파괴하는 돌연변이를 포함한다. 즉, BMP2의 R16에 등가인, 제1 시스테인으로부터 C-말단으로 2개 잔기만큼의 위치에서 아르기닌으로의 돌연변이는 글리칸 쇄가 BMP 표면 상에 "테더링되도록" 하고, 이로써, 돌연변이가 결여된 야생형 BMP와 비교하였을 때, 예비-나선 루프 영역의 입체형태를 변경시키는 것으로 보인다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 BMP와의 추가의 체결로부터 타입 I 수용체를 차단하는 "도어스톱" 잔기를 변경하거나, 생성하거나, 파괴하는 (폐기하는) 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 즉, 디자이너 BMP 내의 H54, 또는 그의 상응하는 등가인 잔기의 돌연변이는 타입 I 수용체와 디자이너 BMP의 상호작용을 방해하거나 증가시키는 방식으로 배향된다.

일부 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는, 상기 돌연변이는 다르게는 상응하는 야생형 BMP에 존재하는 돌연변이가 아르기닌 "글리칸 테더"의 생성 및/또는 폐기를 매개하도록 디자이너 BMP의 입체형태에 영향을 준다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 디자이너 BMP 내의 히스티딘 도어스톱 입체형태를 생성하거나 제거/폐기하는 변경된 입체형태를 매개하고, 여기서 상기 도어스톱 입체형태는 각각 상응하는 야생형 BMP에서 존재하지 않거나, 또는 활성을 띤다.

그러므로, 일단 본원에서 및 문헌 [Berasi et al.]에 제공된 교시 내용을 갖추고 나면, 통상의 기술자는 TGFβ 수퍼패밀리 구성원 내의 아르기닌 "글리칸 테더" 및/또는 히스티딘 "도어스톱"의 존재 또는 부재는 본원에서 예시되는 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 단백질 구조 분석 방법을 이용하여 사정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일단 "도어스톱" 잔기가 존재하는 것으로 확인되고 나면, 히스티딘이 수용체 결합 계면으로부터 멀리 재배향되도록 적어도 하나의 돌연변이를 분자 내로 도입할 수 있다. 대안적으로, 존재할 경우, 히스티딘 "도어스톱"의 억제 효과가 감소되거나, 더욱 바람직하게는 제거되도록 "글리칸 테더"를 생성하거나, 증진시키는 돌연변이를 도입시킬 수 있다.

한 실시양태에서, TGFβ 수퍼패밀리 구성원이 BMP2일 경우, 히스티딘 도어스톱을 제거하는 돌연변이는 H54를 대신하는 또 다른 아미노산으로의 치환이다. 일부 실시양태에서, H54는 알라닌, 글리신, 세린, 또는 트레오닌으로 교체된다.

비록 본 발명이 BMP2에 대한 상기 "도어스톱"-제거 돌연변이를 개시하지만, 통상의 기술자는 관련 기술분야의 지식에 기초하여 다른 TGFβ 수퍼패밀리 구성원에 대한 상응하는 돌연변이를 확인하고, "도어스톱" 결여 돌연변이체를 쉽게 제조하는 방법, 즉, 다르게는 결합 계면에 대면하거나, 그로 돌출됨으로써 수용체 결합을 방해하는 잔기를 제거하거나, 재배향시키는 방법을 이해할 것이다. 돌연변이가 단백질 입체형태에 미치는 효과는 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 본원에 개시된 것과 같은, 관련 기술분야에서 인정되는 임의의 단백질 구조 분석 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 대안적으로, 도어스톱을 제거하고, 타입 I 수용체에 대한 리간드 결합을 증가시킬 수 있는 돌연변이는 관련 기술분야에서 이용가능한 컴퓨터 모델링 방법을 이용하여 인 실리코로 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다르게는 수용체 계면에 존재하는 히스티딘 "도어스톱" 잔기가 결여되어 있다는 점에서 타입 I 수용체와의 결합이 개선된 TGFβ 수퍼패밀리 구성원의 디자인을 포함한다.

본 발명은 추가로 통상의 기술자에게 아르기닌 글리칸 테더를 생성하거나, 파괴시키는 다른 TGFβ 패밀리 구성원에 대한 돌연변이를 확인하는 방법에 관한 이해를 추가로 제공한다. 테더가 결여된 단백질에 아르기닌 글리칸 테더를 부가하는 돌연변이가 본 발명에 의해 고려된다. 따라서, 본 발명은 타입 I 수용체 결합 도메인의 입체형태를 변경하는 아르기닌 글리칸 테더를 보유한다는 점에서 타입 I 수용체와의 결합이 개선된 TGFβ 수퍼패밀리 구성원의 디자인을 포함한다.

일부 실시양태에서, 히스티딘 도어스톱을 제거하여 글리칸 테더의 필요성을 제거하면, 생물학적 활성을 유지하면서, 글리코실화 없이 제조될 수 있는 디자이너 BMP가 제공된다. 예를 들어, 디자이너 BMP는 글리코실화 활성이 포유동물 세포와 상이하거나 존재하지 않는 세포, 예컨대, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 점균류 세포 내에서 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 디자이너 BMP는 E. 콜라이에서 제조되고, 생물학적 활성을 유지할 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 글리코실화가 결여되거나, 또는 포유동물 세포에 의해 제조된 것과 상이한 변경된 글리칸이 제조되도록 변경된 글리코실화를 포함하는 세포에서 제조될 수 있는 BMP를 디자인하고, 제조하는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 다르게는 수용체 결합을 손상시키거나, 또는 억제할 수 있는 도어스톱 잔기를 제거하는 돌연변이를 도입하는 방법을 포함한다. 통상의 기술자는 일단 본 발명의 교시내용을 갖추고 나면, 수용체-리간드 계면에 대해 악영향을 주는 도어스톱 잔기가 완전히 제거되도록 상기 잔기를 돌연변이화시킬 수 있거나, 또는 상기 잔기가 계면으로부터 멀리 배향되도록 다른 돌연변이를 도입할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 다른 돌연변이는 글리칸의 입체형태를 변경하고, 이로써, 도어스톱 잔기가 결합 계면으로부터 멀리 배향되도록 리간드의 입체형태를 변경하는 글리칸 테더를 제공하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

디자이너 BMP를 코딩하는 핵산

본 발명은 또한 본원에 기술된 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산을 포함한다. 본원에 기술된 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 범위 내에 있는 임의의 하나 이상의 적합한 수단에 따라 제조될 수 있다.

한 경우에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 전체 유전자 합성에 의해, 또는 야생형 또는 변형된 BMP를 코딩하는 핵산의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조된다. 주형-유도 라이게이션, 반복 PCR, 카세트 돌연변이유발, 부위-지정 돌연변이유발 또는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 다른 기술을 비롯한 방법이 이용될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Strizhov et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:15012-15017 (1996)]; [Prodromou and Perl, Prot . Eng . 5: 827-829 (1992)]; [Jayaraman and Puccini, Biotechniques 12: 392-398 (1992)]; 및 [Chalmers et al., Biotechniques 30: 249-252 (2001)] 참조).

따라서, 본 발명의 실시양태는 본 발명의 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8 내지 15의 아미노산 서열 중 하나를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 8-15의 아미노산 서열 중 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 코딩한다.

디자이너 BMP를 제조하는 방법

BMP는 긴 프로도메인, 하나 이상의 절단 부위, 및 성숙 도메인을 포함하는 프로단백질로서 자연적으로 발현된다. 이어서, 상기 프로단백질은 세포 기구에 의해 프로세싱되어 전형적으로 이량체성의 성숙한 BMP 분자를 생성한다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 유사한 방식으로 제조된다. 프로도메인은 BMP의 폴딩 및 프로세싱에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 추가로, 일부 BMP에서, 프로도메인은 성숙 단백질에 비공유 결합할 수 있고, 용해도 증진제, 샤페론, 억제제로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, BMP는 봉입체로부터 직접 제조되거나, 그로부터 재폴딩된 성숙 도메인으로서 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, BMP는 화학적 합성 또는 단백질 제조를 위한 임의의 다른 공지 방법을 통해 제조된다.

예를 들어, 일부 경우에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 전체 유전자 합성에 의해, 또는 야생형, 디자이너, 또는 변이체 BMP를 코딩하는 핵산의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 제조된다. 방법은 주형 유도 라이게이션, PCR, 카세트 돌연변이유발, 부위-지정 돌연변이유발, 제한 효소 분해 및 라이게이션, 또는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 다른 기술을 포함한다 (예컨대, 문헌 [Prodromou et al., Protein Eng 5:827-9 (1992)]; [Jayaraman et al., Biotechniques 12:392-8 (1992)]; [Chalmers et al., Biotechniques 30:249-52 (2001)]; 및 [Sambrook and Russell, In: Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)] 참조).

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조한다. 다양한 숙주 세포에 대한 수많은 타입의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터는 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는 전사 및 번역 조절 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터 및 전사 출발 및 정지 서열을 포함한다. 추가로, 발현 벡터는 추가 요소, 예컨대, 그를 두 유기체에서 유지될 수 있도록 허용하는 2개의 복제 시스템과 같은 추가 요소를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 염색체외 벡터 또는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 게놈 내로의 통합을 촉진하기 위해 숙주 세포의 게놈에 상동성인 적어도 하나의 서열을 함유한다. 벡터 통합을 위한 구축물은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 안정하게 형질전환된 숙주 세포가 선별될 수 있도록 허용하는 선별가능한 마커 유전자를 포함한다. 선별 마커 유전자는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 사용되는 숙주 세포에 따라 달라진다.

발현 벡터는 숙주 세포로부터 디자이너 BMP의 분비를 제공하는 분비 리더 서열 또는 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 적합한 분비 리더 서열 및 신호 펩티드는 관련 기술분야에 공지되어 있다.

디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 디자이너 BMP가 핵산으로부터 발현되도록 숙주 세포 내로 단독으로 또는 발현 벡터와 조합되어 도입될 수 있다. 도입 방법은 주로 숙주 세포 타입에 의해 좌우된다. 형질감염/형질전환의 예시적인 방법은 CaPO₄ 침전, 리포솜 융합, 전기천공, 바이러스 감염, 덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 직접 미세주사, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 방법을 포함한다. 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있거나, 또는 세포질 내에 일시적으로 또는 안정적으로 존재할 수 있다.

디자이너 BMP를 발현시키는 데 적절한 숙주 세포로는 효모, 박테리아, 고세균, 진균, 곤충, 및 동물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 야생형 또는 천연 BMP를 발현하는 데 적합한 임의의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 에스케리키아 콜라이이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대, 293 (예컨대, 293-T 및 293-EBNA), BHK, CHO (예컨대, CHOK1 및 DG44), COS, 주르카트(Jurkat), NIH3T3, 또는 C2C12 세포이다. 다른 적합한 세포는 ATCC 카탈로그에서 살펴볼 수 있다. 디자이너 BMP는 식물 및 동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 더욱 복잡한 유기체에서 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는, 즉, 디자이너 BMP 핵산을 포함하는 발현 벡터 이외의 다른 외인성 핵산을 함유하도록 추가로 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 디자이너 BMP의 발현을 유도하거나, 또는 그를 발현시키는 데 적절한 조건하에 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다. 디자이너 BMP 발현에 적절한 조건은 천연 또는 야생형 BMP를 발현시키는 데 적절한 것으로 공지된 것과 동일한 조건이다. 이들 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라 상이할 것이며, 통상적인 실험을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 발현 후에 정제 또는 단리될 수 있다. 표준 정제 방법으로는 전기영동, 분자, 면역학적, 및 크로마토그래피 기술, 예컨대, 이온 교환, 소수성, 친화도, 및 역상 HPLC 크로마토그래피, 및 크로마토포커싱을 포함한다. 적합한 정제 기술에 대한 일반적인 가이던스는 문헌 [Scopes, In: Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 3^rd Ed. (1994)]에서 살펴볼 수 있다. 필요한 정제 정도는 원하는 용도에 따라 상이할 것이며, 일부 경우에서는 정제가 불필요할 것이다.

박테리아 세포로부터의 정제는 봉입체 내의 BMP의 발현 및 CHAPS/고염 시스템에서의 후속된 리폴딩 단계를 일으킬 수 있다. 포유동물 세포로부터의 정제는 셀루핀-술페이트 및 역상 크로마토그래피 칼럼을 통한 2 단계 정제를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 공유 또는 비-공유적으로 변형될 수 있다. 공유 변형은 단백질의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 단백질에 도입될 수 있다. 최적의 변형 부위는 육안 검사, 구조 분석, 서열 분석, 및 분자 모의실험을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 기준을 사용하여 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 적어도 하나의 요소, 동위원소, 또는 화학적 화합물로 표지될 수 있다. 표지는 동위원소 표지, 예컨대, 방사성 또는 중금속 동위원소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 면역 표지, 예컨대, 항체 또는 항원일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 착색된 또는 형광 표지, 예컨대, 플루오레세인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 비오틴, 태그 (예컨대, FLAG, Myc, His)일 수 있다.

디자이너 BMP는 단백질에 결합하는 항체 또는 단백질을 정제할 때 사용하기 위해 또는 스크리닝 검정에서 결합을 검출하기 위해 디자이너 BMP를 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교결합시키는 이작용성 작용제로 유도체화될 수 있다. 통상적으로 사용되는 가교결합제로는 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 동종이작용성 이미도에스테르, 예를 들어, 디숙신이미딜 에스테르, 예컨대, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 이작용성 말레이미드, 예컨대, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프랄린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 아미노 기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다. 상기 유도체화는 용해도, 흡수, 혈액 뇌 장벽을 통한 수송, 혈청 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 대안적으로, 디자이너 BMP의 변형은 단백질의 임의의 가능한 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시킬 수 있다. 상기 효과를 매개할 수 있는 모이어티는 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)]에 개시되어 있다.

디자이너 BMP의 또 다른 타입의 공유 변형은 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로 단백질을 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결하는 것을 포함한다. 다양한 커플링 화학이 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 PEG 부착을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 단백질을 CovX-바디 링커를 통해 CovX-바디 항체, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 미국 특허 번호 5,733,757, 및 미국 특허 공개 번호 US 2009/0098130에 기술된 CovX-바디에 연결하는 것을 포함한다. 그러한 CovX-바디는 개선된 안정성 및 연장된 혈청 반감기를 포함하나, 이에 제한되지 않는 개선된 특성을 보일 수 있다.

디자이너 BMP의 수용체 결합 활성을 검정하는 방법

디자이너 BMP의 수용체 결합 활성은 야생형 BMP의 활성을 사정하기 위해 사용된 임의의 방법을 이용하여 사정할 수 있다.

하나 이상의 BMP 수용체에 대한 디자이너 BMP의 친화도는 수용체 결합 검정법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, ALK-2, ALK-3, ALK-6, ActRII, ActRIIb, 또는 BMPRII에 대한 친화도를 측정할 수 있다. 적합한 결합 검정법으로는 ELISA, 형광 이방성 및 강도, 섬광 근접 검정법 (SPA), 비아코어 (Pearce et al., Biochemistry 38:81-89 (1999)), DELFIA 검정법, 및 알파스크린(AlphaScreen)™ (퍼킨엘머(PerkinElmer)로부터 상업적으로 입수가능; 문헌 [Bosse R., Illy C, and Chelsky D (2002)])을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 비아코어 또는 표면 플라스몬 공명 검정법이 이용된다. 예를 들어, 문헌 [McDonnell, Curr . Opin . Chem . Biol . 5:572-577 (2001)]을 참조할 수 있다. 비아코어 실험은 그의 수용체에 대한 TGF-β 이소폼의 결합을 특징화하기 위해 이전에 사용되었다 ([De Crescenzo et al., J. Biol. Chem., 276: 29632-29643 (2001)]; [De Crescenzo et al., J. Mol. Biol. 328: 1173-1183) (2003)]).

다른 실시양태에서, 플레이트-기반 직접 결합 검정법이 하나 이상의 BMP 수용체에 대한 하나 이상의 변형된 BMP의 친화도를 측정하는 데 사용된다. 상기 방법은 BMP를 항-BMP 모노클로날 항체를 사용하여 포획한 후, BMP 수용체-Fc 융합 단백질을 사용하여 검출하는 변형된 샌드위치 ELISA이다.

다른 실시양태에서, 수용체 및 억제제 결합을 특징화하기 위해 알파스크린™ 검정법 (Bosse R. et al., Principles of AlphaScreen™, PerkinElmer Literature Application Note Ref #4069, http://lifesciences.perkinelmer.com/ Notes/S4069-0802.pdf (2002))이 이용될 수 있다. 또한, 수용체 및 억제제 결합을 특징화하기 위해 형광 검정법이 사용될 수 있다. 예를 들어, BMP2 또는 BMP2 수용체 또는 억제제는 형광 염료로 표지될 수 있다 (적합한 염료의 예에 대해서는 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes) 카탈로그를 참조한다). 추가로, 수용체 결합 친화도를 측정하는 데 섬광 근접 검정법 (SPA)이 사용될 수 있다. 예를 들어, BMP 수용체-Fc 융합체는 단백질 A 코팅된 SPA 비드 또는 플래시-플레이트에 결합하고, S35-표지된 BMP로 처리될 수 있고; 결합 이벤트를 통해 빛이 발생하게 된다.

특정 실시양태에서, 특이 BMP 돌연변이체의 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 KD는 인간 IgG-Fc에 대한 수용체 세포외 도메인 융합을 사용함으로써 측정될 수 있다. 수용체는 항-인간-IgG-Fc 센서를 사용하여 옥텟 센서에 결합될 수 있고, BMP는 용액 중의 수용체 세포외 도메인에 결합함으로써 K온 및 K오프 속도가 측정될 수 있다. 옥텟 시스템은, 생체분자 상호작용의 실시간 무표지 분석을 가능하게 하고, 친화도, 동적 성질 및 농도에 대한 정보를 제공하기 위해 독점권이 있는 바이오레이어 간섭계법(BioLayer Interferometry; BLI)을 이용한다. 단백질이 옥텟 센서에 결합할 때, 센서를 통과하는 빛은 파장 변화를 보이고, 이는 분광광도계로 측정될 수 있다. 변화율은 분석물이 센서에 결합하고, 결합을 상실함에 따라 측정된다.

디자이너 BMP의 골형성 활성을 검정하는 방법

디자이너 BMP의 골형성 활성은 야생형 BMP의 활성을 사정하기 위해 사용된 임의의 방법을 이용하여 사정될 수 있다.

BMP는 많은 타입의 세포의 성장 및 분화를 촉진시킨다. 분화는 예를 들어, 알칼리성 포스파타제에 대한 발광 리포터 또는 비색 시약, 예컨대, 알시안 블루 (Alcian Blue) 또는 PNPP를 사용하여 모니터링될 수 있다 ([Asahina et al. (1996) Exp. Cell Res, 222:38-47]; [Inada et al. (1996) Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 222:317-322]; [Jortikka et al. (1998) Life ScL 62:2359-2368]; [Cheng et al. (2003) J. Bone Joint Surgery 95A:1544-1552]).

또한, 래트 지아(limb bud) 연골 분화 검정법을 사용하여 1차 세포에서 활성을 모니터링할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 리포터 유전자 또는 키나제 검정법이 사용될 수 있다. BMP는 JAK-STAT 신호 전달 경로를 활성화하기 때문에, STAT-반응성 리포터, 예컨대, GFP 또는 루시퍼라제를 함유하는 BMP 반응성 세포주가 사용될 수 있다 (Kusanagi et al. (2000) MoI Biol. Cell., 11:555-565). 예를 들어, 신장 세포에서 BMP 활성은 세포-기반 검정법을 사용하여 측정될 수 있고; 예를 들어, 문헌 [Wang and Hirschberg (2004) J. Biol. Chem., 279:23200-23206]을 참조할 수 있다.

골형성 활성은 세포 기반 검정법, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, BRE-루시퍼라제, 또는 알리자린 레드(Alizarin red) 무기질화로 측정될 수 있고, 이 모두는 문헌 [Isaacs et al., Mol. Endocrinol. 24:1469-1477 (2010)]에 기술되어 있다.

골형성 활성은 또한 생체내에서, 래트 이소성 골 검정법 또는 포유동물 골 성장 모델을 통해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골형성 활성은 비-인간 영장류 모델에서 측정된다. 이들 모델은 문헌 [Isaacs et al., Mol . Endocrinol . 24:1469-1477 (2010)]에 기술되어 있다.

골 질량 및 정질을 평가하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, X-선 회절; DXA; DEQCT; pQCT, 화학적 분석, 밀도 분별화, 조직광도측정, 조직형태계측, 및 예를 들어, 문헌 [Lane et al., J. Bone Min. Res. 18:2105-2115 (2003)]에 기재된 조직화학적 분석을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 피질 골 밀도를 측정하기 위한 한 검정법은 마이크로CT (MicroCT) 검정법이다. pQCT 측정 후에, 예를 들어, 대퇴골에 대해 스캔코(Scanco) mCT40 (스캔코 메디컬 아게(Scanco Medical AG))을 사용하여 마이크로CT 평가를 수행할 수 있다.

골 성장/밀도/강도를 사정하기 위한 임의의 공지된 또는 추후 개발될 시험관내 또는 생체내 방법을 사용하여 본 발명의 디자이너 BMP의 골형성 활성을 사정할 수 있다.

제약 조성물

본 발명의 디자이너 BMP는 제약 조성물의 일부로서 그를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대, 비경구적으로, 경구적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 디자인된 BMP가 원하는 조직 부위에 국소적으로, 예컨대, 주사에 의해, 또는 전신으로, 예컨대, 정맥내, 피하, 근육내, 안와내, 눈, 심실내, 두개내, 관절낭내, 척수내, 수조내, 복강내, 협측, 직장, 질내, 비내 또는 에어로졸 투여에 의해 투여되는 경우에, 조성물은 바람직하게는 수용액을 포함한다. 용액은 바람직하게는 포유동물에의 그의 투여가 포유동물의 정상적인 전해질 및 유체 부피 균형에 대해 유해한 영향을 주지 않도록 생리학상 허용되는 것이다. 따라서, 수용액은 예컨대, 일반 생리식염수 (0.9% NaCl, 0.15 M) (pH 7-7.4)를 포함할 수 있다.

경구 또는 비경구적 전신 투여에 유용한 용액은 예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" (Gennaro, A., ed., Mack Pub., 1990)] (상기 문헌의 개시내용은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 제약 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 제제는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화 나프탈렌 등을 포함할 수 있다. 직접 투여를 위한 제제는 특히 글리세롤 및 고점도의 다른 조성물을 포함할 수 있다.

예를 들어, 히알루론산, 콜라겐, 제3인산칼슘, 폴리부티레이트, 폴리락티드, 폴리글리콜리드 및 락티드/글리콜리드 공중합체를 비롯한, 생체적합성, 바람직하게는 생체재흡수성 중합체는 생체내에서 디자이너 BMP의 방출을 제어하는 유용한 부형제일 수 있다. 본 디자이너 BMP에 대한 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 및 리포솜을 포함할 수 있다. 흡입 투여를 위한 제제는 부형제로서, 예를 들어, 락토스를 함유할 수 있거나, 또는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 또는 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액, 또는 점비제의 형태로 또는 비내 적용되는 겔로서 투여하기 위한 오일성 용액일 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 디자이너 BMP는 경구적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 디자이너 BMP의 액체 제제는 표준 실무, 예컨대, 문헌, ["Remington's Pharmaceutical Sciences" (상기 문헌 동일)]에 기술되어 있는 것에 따라 제조될 수 있다. 이어서, 상기 액체 제제를 투여를 위해 음료 또는 또 다른 식품 보충제에 첨가할 수 있다. 경구 투여는 이들 액체 제제의 에어로졸을 사용하여 달성될 수 있다. 대안적으로, 관련 기술분야에서 인정되는 유화제를 사용하여 제조된 고체 제제는 경구 투여에 적합한 정제, 캡슐제 또는 로젠지로 제조될 수 있다.

임의적으로, 디자이너 BMP는 원하는 조직에 의한 단백질의 흡수를 증진시키기 위한 수단을 포함하는 조성물 내에 제제화될 수 있다. 예를 들어, 테트라시클린 및 디포스포네이트 (비스포스포네이트)는 포유동물에서 전신 제공될 때 특히 골 재형성 구역에서 골 무기질에 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 성분은 본의 디자이너 BMP를 골 조직으로 전달하는 것을 증진시키는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 원하는 표적 조직, 예컨대, 세포 표면 항원에 특이적으로 회합하는 접근가능한 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 일부도 사용될 수 있다. 원하는 경우, 상기 특이적 표적화 분자는 예컨대, 산 불안정성 결합, 예컨대, Asp-Pro 연결을 생성하기 위해 화학적 가교결합에 의해 또는 표준 유전 공학 기술을 사용하여 본 디자이너 BMP에 공유 결합될 수 있다. 유용한 표적화 분자는 예를 들어, 미국 특허 번호 5,091,513의 교시내용에 따라 디자인될 수 있다.

또한, 일부 디자이너 BMP는 제한 없이, 중합체 매트릭스를 비롯한 담체 매트릭스와 조합될 때 생체 내에서 최고 수준의 활성을 보일 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,266,683 (상기 특허의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다)를 참조할 수 있다. 현재 바람직한 담체 매트릭스는 성질상 이종성, 동종성 또는 자가성이인 것이다. 그러나, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리부티르산, 그의 유도체 및 공중합체를 포함하는 합성 물질도 적합한 담체 매트릭스를 생성하는 데 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 바람직한 합성 및 자연적으로 유래된 매트릭스 물질, 그의 제조, 이를 본 발명의 디자이너 BMP와 함께 제제화하는 방법, 및 투여 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이에, 본원에서는 상세하게 논의되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,266,683을 참조할 수 있다.

특정 실시양태에서, 디자이너 BMP는 단독으로 또는 조직 형태형성에 유익한 효과를 미치는 것으로 알려져 있는 또 다른 물질과 함께 조합되어 그를 필요로 하는 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 물질 (본원에서 보조인자)의 예로는 조직 수복 및 재생을 촉진하고/거나, 염증 또는 섬유증을 억제시키는 물질을 포함한다. 골다공증 개체에서 골 조직 성장을 자극하는 데 유용한 보조인자의 예로는 예를 들어, 비타민 D3, 칼시토닌, 프로스타글란딘, 부갑상선 호르몬, 덱사메타손, 에스트로겐 및 IGF-I 또는 IGF-II를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 신경 조직 수복 및 재생에 유용한 보조인자로는 신경 성장 인자를 포함할 수 있다. 다른 유용한 보조인자로는 방부제, 항생제, 항바이러스제 및 항진균제, 진통제 및 마취제를 비롯한 증상-완화 보조인자를 포함한다.

디자이너 BMP는 바람직하게는 제약상 허용되는 비독성 부형제 및 담체와 함께 혼합되어 제약 조성물로 제제화된다. 상기 언급한 바와 같이, 상기 조성물은 전신, 예를 들어, 비경구 투여용으로 특히 액상 액제 또는 현탁제의 형태로; 경구 투여용으로 특히 정제 또는 캡슐제 형태로; 또는 비내용으로 특히 분제, 점비제 또는 에어로졸의 형태로 제조될 수 있다. 조직 표면에 대한 부착되어야 하는 경우, 조성물은 피브리노겐-트롬빈 분산제 또는 예를 들어, PCT US91/09275 (상기 문헌의 개시 내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 다른 생체접착제를 포함할 수 있다. 이어서, 조성물을 원하는 조직 표면에 도포하거나, 분무하거나 또는 다른 방식으로 적용시킬 수 있다.

투여될 때, 본 발명의 제약 조성물은 전형적으로 발열원을 함유하지 않는 생리학상 허용되는 형태로 전달된다. 추가로, 조성물은 바람직하게는 골 연골 또는 조직 손상 부위로 전달하기 위해 캡슐화되거나, 점성 형태로 주사될 수 있다. 상처 치유 및 조직 수복을 위해 국소 투여가 적합할 수 있다. 바람직하게는, 골 및/또는 연골 형성을 위해, 조성물은 발생하는 골 및 연골을 위한 구조를 제공하고, 최적으로 체내로 재흡수될 수 있는, BMP 단백질을 골 및/또는 연골 손상의 부위에 전달할 수 있는 매트릭스를 포함한다. 상기 매트릭스는 다른 이식되는 의료 용도로 현재 사용되는 물질로 형성될 수 있다.

매트릭스 물질의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용상 외관 및 계면 특성을 기초로 한다. 디자이너 BMP 조성물의 특정 용도가 적절한 제제를 정의할 것이다. 조성물에 대한 잠재적인 매트릭스는 생분해성이고, 화학적으로 규정된 황산칼슘, 제3인산칼슘, 히드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리안히드라이드일 수 있다. 다른 잠재적인 물질은 생분해성이고, 생물학상 잘 정의된, 예컨대, 골 또는 피부 콜라겐이다. 추가의 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진다. 다른 잠재적인 매트릭스는 비생분해성이고, 화학적으로 정의된, 예컨대, 소결 히드록시아파타이트, 생체유리, 알루미네이트, 또는 다른 세라믹이다. 매트릭스는 상기 언급된 타입의 물질, 예컨대, 폴리락트산 및 히드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 제3인산칼슘 중 임의의 것의 조합으로 이루어질 수 있다. 바이오세라믹은 공극 크기, 입자 크기, 입자 형상 및 생분해성을 변경하기 위해서 조성, 예컨대, 칼슘-알루미네이트-포스페이트 및 프로세싱에서 변경될 수 있다.

투여 요법은 디자이너 BMP 단백질의 작용을 변경시키는 다양한 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 이들 인자는 제한없이, 형성되는 것이 요구되는 골 중량, 골 손상 부위, 손상된 골의 상태, 상처의 크기, 손상된 조직의 타입, 환자의 연령, 성별, 및 식이, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상 인자를 포함한다. 투여량은 재구성에 사용되는 매트릭스의 타입에 따라 달라질 수 있다. 최종 조성물에 다른 공지의 성장 인자, 예컨대, IGF I (인슐린 유사 성장 인자 I)를 추가하는 것 또한 투여량에 영향을 줄 수 있다. 경과는 골 성장 및/또는 수복을 주기적으로 사정함으로써 모니터링할 수 있다. 골 성장 또는 수복을 사정하는 한 방법은 관련 기술분야에서 인정되는 많은 방법 중에서 x-선 영상화 및/또는 CT 스캐닝에 의해 이루어진다.

조성물은 치료 유효량, 예컨대, 원하는 효과를 유도하는 데 충분한 시간 동안 표적 조직에 디자이너 BMP의 적절한 농도를 제공하는 양으로 인간 또는 다른 포유동물에게 비경구적 또는 경구적으로 투여하기 위한 것으로 제제화될 수 있다. 바람직하게, 본 조성물은 모르포겐-연관 생물학적 반응, 예컨대, 노화 조직 (예컨대, 골감소성 골 조직)에 대한 조직-특이적 기능의 유지 또는 조직-특이적 표현형의 회복 또는 조직에서 섬유증 반응의 억제 또는 역전에 대한 포유동물의 요구를 완화시키거나, 경감시킨다.

관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 치료 조성물에서 기술되는 화합물의 농도는 투여하고자 하는 약물의 투여량, 사용되는 화합물의 화학적 특징 (예컨대, 소수성), 및 투여 경로를 비롯한, 많은 인자에 따라 달라질 수 있다. 투여하고자 하는 약물의 바람직한 투여량은 또한 가능하게는 질환의 타입 및 정도, 조직 손실 또는 결함, 특정 환자의 전반적인 건강 상태, 선택된 화합물의 상대적인 생물학적 효능, 화합물의 제제, 제제 내의 부형제의 존재 및 타입, 및 투여 경로와 같은 변수에 의존할 수 있다.

일반적인 측면에서, 본 발명의 화합물은 비경구 투여를 위해 약 0.1 내지 10% w/v 화합물을 함유하는 수성 생리학적 완충제 용액 내에 제공될 수 있다. 전형적인 용량 범위는 약 10 ng/kg (체중)/일 내지 약 1 g/kg (체중)/일이고; 바람직한 용량 범위는 약 0.1 mg/kg (체중) 내지 100 mg/kg (체중)이다.

치료 용도

디자이너 BMP는 야생형 BMP가 유용한 임의의 적응증에 대해 또는 TGFβ 수퍼패밀리 구성원이 사용될 수 있는 임의의 방법에 사용될 수 있다. 디자이너 BMP는 골 및 연골 형태형성의 발생 캐스케이드를 유도하고, Smad 신호전달 경로를 유도하거나, 매개할 수 있다. 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP보다 더 큰 골 질량, 골 강직도 및 골 밀도 생산을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 더 큰 골 증대 및 수복을 유도한다. 따라서, 디자이너 BMP는 조직에서 골 형성을 유도하는 데 사용될 수 있다. 또한, 디자이너 BMP는 신체의 다양한 위치에서 골 및 연골의 증식을 유도하는 데에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 디자이너 BMP는 예컨대, 무릎, 팔꿈치, 발목, 및 손가락과 같은 관절을 수복시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 디자이너 BMP는 관절염 또는 다른 연골 변성 질환을 앓는 환자에서 연골을 재생시키는 데 유용할 수 있다. 추가로, 디자이너 BMP는 손상에 의한 연골 파열을 치료하는 데 권고된다. 추가로, 디자이너 BMP는 환자에서 골 성장의 유도에 유용하다. 예를 들어, 디자이너 BMP는 골절 또는 절골, 골다공증을 앓는 환자, 또는 척추 고정이 필요한 환자의 치료 또는 척추, 척추골 등의 수복에 사용하기 위해 권고된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 골 증대 및/또는 수복의 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 치료학상 유효량의 디자이너 BMP를 검출가능한 골 증대 또는 수복을 매개하는 부위에 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Smad 발현을 유도하거나, 또는 그를 증가시키는 방법을 포함한다. 본 방법은 Smad 매개 발현 경로를 포함하는 세포를 본 발명의 디자이너 BMP와 접촉시키는 것을 포함한다.

디자이너 BMP는 골 또는 연골과는 상이한 포유동물 내의 다양한 조직에 대해 골 형태형성 및 조직 형태형성의 발생 캐스케이드를 유도할 수 있다. 상기 형태형성 활성은 전구 세포의 증식 및 분화를 유도할 수 있는 능력, 및 골, 연골, 비-무기질화된 골격 또는 결합 조직, 및 다른 성체 조직의 형성을 유도하는 이벤트의 진행을 통해 분화 표현형을 지지하고 유지할 수 있는 능력을 포함한다.

예를 들어, 디자이너 BMP는 대사적 골 질환에서 골 질량의 손실을 방지하고/거나, 골 질량을 증가시키는 치료를 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용하여 대사적 골 질환에서 골 질량의 손실을 방지하고/거나, 골 질량을 증가시키는 일반 치료 방법은 미국 특허 번호 5,674,844 (상기 특허의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 또한, 디자이너 BMP는 손상 부위, 예컨대, 절골, 골절, 및 연골 파열의 골 또는 연골을 교체하거나, 수복시키기 위해 투여될 수 있다. 본 발명의 디자이너 BMP는 치주 조직 재생을 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 일반 치주 조직 재생 방법은 미국 특허 번호 5,733,878 (상기 특허의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

디자이너 BMP는 간 재생을 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 일반 간 재생 방법은 미국 특허 번호 5,849,686 (상기 특허의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 디자이너 BMP는 만성 신부전의 치료를 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 일반 만성 신부전 치료 방법은 미국 특허 번호 6,861,404 (상기 특허의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 디자이너 BMP는 중추신경계 허혈증 또는 외상 후의 기능 회복을 증진시키는 데 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 중추신경계 허혈증 또는 외상 후의 기능 회복을 증진시키는 일반적인 방법은 미국 특허 번호 6,407,060 (상기 특허의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

디자이너 BMP는 수지상 성장을 유도하는 데 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 수지상 성장을 유도하는 일반적인 방법은 미국 특허 번호 6,949,505 (상기 특허의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

디자이너 BMP는 신경 세포 부착을 유도하는 데 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 신경 세포 부착을 유도하는 일반적인 방법은 미국 특허 번호 6,800,603 (상기 특허의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

디자이너 BMP는 파킨슨 질환의 치료 및 예방을 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 일반 파킨슨 질환 치료 및 예방 방법은 미국 특허 번호 6,506,729 (상기 특허의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

상기 기술된 다양한 치료 용도를 위해 본 발명의 변형된 BMP를 사용하는 일반적인 방법을 변형시키는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 범위 내에 포함된다. 본 발명의 변형된 BMP의 치료 용도의 예시적인 실시양태를 하기에 추가로 기술한다.

디자이너 BMP는 이환된 또는 손상된 포유동물 조직을 수복시키는 데 사용될 수 있다. 수복시키고자 하는 조직은 바람직하게는 사정되고, 과도한 괴사 또는 방해하는 상처 조직은 수술, 화학적, 제거 또는 의학 분야에 공지된 다른 방법에 의해 필요에 따라 제거된다. 이어서, 디자이너 BMP는 수술에 의한 이식 또는 주사에 의해 멸균 생체적합성 조성물의 일부로서 조직 자리에 직접 제공될 수 있다. 대안적으로, 변형된 BMP-자극된 전구 세포를 함유하는 멸균 생체적합성 조성물이 조직 자리에 제공될 수 있다. 이환되거나, 손상된 자리에 존재하는 조직은 전구 세포의 증식 및 조직-특이적 분화를 허용하는 데 적절한 매트릭스를 제공한다. 추가로, 손상된 또는 이환된 조직 자리, 특히 수술 수단에 의해 추가로 침습된 것은 형태형성적으로 허용되는 환경을 제공한다. 일부 조직에 대해, 변형된 BMP의 전신 제공이 충분할 것으로 생각된다.

디자이너 BMP는 손상 후에 상처 조직 형성을 방지하거나, 실질적으로 억제하기 위해 사용될 수 있다. 디자이너 BMP가 새로 손상된 조직 자리에 제공되면, 이는 그 자리에서 조직 형태형성을 유도하고, 비-분화된 결합 조직 내로 이동하는 섬유모세포의 응집을 방지할 수 있다. 디자이너 BMP는 바람직하게는 손상 5시간 이내에 조직 자리 내로 주사되는 멸균 제약 제제로서 제공된다.

예를 들어, 디자이너 BMP는 부분적인 간절제술 후에 실질적으로 손상된 간 조직의 단백질-유도된 형태형성을 위해 사용될 수 있다. 상기 일반 프로토콜에 대한 변형법이 다른 조직을 위해 사용될 수 있다. 일반 방법은 조직의 본질적으로 비재생되는 부분을 절제하고, 변형된 BMP를, 바람직하게는 가용성 제약 제제로서 절제된 조직 자리에 제공하고, 상처를 봉합하고, 추후에 부위를 조사하는 것을 포함한다. 골과 마찬가지로, 간은 태아기 이후의 기간 동안 손상시에 재생 가능성을 가진다.

또 다른 예로서, 디자이너 BMP는 또한 상아질 발생을 유도하는 데 사용될 수 있다. 현재까지, 손상에 대한 치아 속질 조직의 예측불가능한 반응이 치의학에서 기본적인 임상 문제이다. 표준 치과 수술 절차를 이용하여, 샘플 치아의 속질 바로 위의 사기질 및 상아질을 (드릴에 의한 천공에 의해) 제거하고, 치아머리 속질 조직의 부분적 절단을 수행함으로써 치아 속질의 작은 영역 (예컨대, 2 mm)을 수술에 의해 노출시키고, 지혈을 유도하고, 치아 속질 치료를 수행하고, 및 표준 절차에 의해 구멍을 밀봉 및 충전을 수행할 수 있다.

본 발명의 디자이너 BMP는 섬유증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 섬유증은 다양한 신체 부위에 위치할 수 있고, 특정 타입일 수 있고, 예를 들어, 섬유증은 신장 (예를 들어, 사구체신염, 당뇨병성 신병증, 동종이식 거부, 및 HIV 신병증에서 관찰되는 섬유증); 간 (예를 들어, 경변증, 및 정맥-폐쇄성 질환); 폐 (예를 들어, 특발성 섬유증 (및 자가면역 섬유증)); 피부 (예를 들어, 전신 경화증, 켈로이드, 반흔, 및 호산구증가증-근육통 증후군); 중추신경계 (예를 들어, 안내 섬유증); 심혈관계 (예를 들어, 혈관 재협착); 코 (예를 들어, 비강 폴립증); 골 또는 골수; 내분비 기관; 및 위장관계에 위치할 수 있다.

한 실시양태에서, BMP7의 결합 특징, 또는 그의 유용한 변형 (연장된 반감기, 야생형 BMP7과 비교하였을 때, 동일하거나, 상이한 수용체에 대한 결합 친화도 증가, BMP7 길항제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 노긴 등에 의한 억제에 대한 내성)을 가지는 디자이너 BMP는 섬유증을 치료하거나, 호전시키거나, 또는 역전시키는 데 유용할 수 있다. 즉, 최근에 문헌 [Weiskirchen et al., 2009, Frontiers in Biosci. 14:4992-5012]에서 리뷰된 바와 같이, TGFβ₁은 상피-중간엽 이행을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 증가된 섬유증을 유도하는 캐스케이드를 매개한다. TGFβ₁의 섬유증-유도 효과는 BMP7에 의해 억제 또는 역전될 수 있다. 또한, 문헌 [Loureiro et al., 2010, Nephrol. Dial. Transplant. 25:1098-1108]을 참조할 수 있다. 추가로, 특정 섬유증 병태는 또한 BMP4의 투여에 의해 치료 또는 호전될 수 있다 (문헌 [Pegorier et al., 2010, Resp. Res. 11:85] 참조). 그러므로, 본 발명은 수용체 결합을 변경하고, 섬유증 치료를 필요로 하는 환자에서 섬유증의 치료를 위한 잠재적인 유용한 치료제를 제공하기 위해 BMP7 프레임워크를 기초로 하고/거나, 본원 다른 곳에도 개시된 타입 I 및 타입 II 돌연변이를 도입한 디자이너 BMP를 포함한다.

섬유증 장애는 화학요법, 예를 들어, 블레오마이신, 클로람부실, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 무스틴, 또는 프로카르바진 치료로 유발된 폐 섬유증; 우발적이든 또는 고의적이든 간에, 방사선 요법에서와 같은 방사선 노출, 예를 들어, 방사선으로부터 유발된 간질성 폐 질환 (ILD); 환경 또는 산업 인자 또는 오염물질, 예컨대, 화학물질, 연기, 금속, 증기, 가스 등, 예를 들어, 석면증 또는 석탄 가루에 의한 ILD; ILD를 유발할 수 있는 약물 또는 약물의 조합, 예를 들어, 항생제 (예컨대, 페니실린, 술폰아미드 등), 심혈관 약물 (예컨대, 히드랄라진, 베타 차단제 등), CNS 약물 (페니토인, 클로르프로마진 등), 항염증성 약물 (예컨대, 금 염, 페닐부타존 등) 등; 면역 반응 장애, 예를 들어, 피부 섬유증을 동반한 만성 이식편-대-숙주 질환; 질환 상태, 예컨대, ILD의 공지된 원인인 흡인성 폐렴, 및 기생충 유발 섬유증; 및 상처, 예를 들어, 둔상, 수술에 의한 절개, CNS의 관통상과 같은 전장 상처 등을 비롯한 많은 원인에 의해 유도될 수 있다:

특정 실시양태에서, 타입 I 수용체 ALK2에 대한 결합이 개선된 디자이너 BMP, 예컨대, BMPE는 ALK2와 관련된 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

키트

본 발명은 애플리케이터 및 본 발명의 방법을 수행하기 위해 디자이너 BMP의 사용을 설명하는 사용 설명서와 함께 치료학상 유효량의, 본 발명의 디자이너 BMP를 포함하는 다양한 키트를 포함한다. 예시적인 키트를 하기에 기술하지만, 본 개시내용에 비추어 다른 유용한 키트의 내용물도 통상의 기술자에게는 자명할 것이다. 각각의 상기 키트는 본 발명에 포함된다.

본 발명은 골 질량의 손실을 방지하고/거나, 골 질량을 증가시키는 치료를 필요로 하는 환자의 대사적 골 질환에서 골 질량의 손실을 방지하고/거나 골 질량을 증가시키는 치료를 위한 키트를 포함한다. 본 키트는 본 발명의 디자이너 BMP를 포함한다. 본 키트는 환자에게 키트 성분을 투여하기 위한 시린지, 골 시멘트 혼합 장치 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 애플리케이터를 추가로 포함한다. 추가로, 본 키트는 환자에서 골 손실을 치료 또는 예방하고/거나, 골 질량을 증가시키기 위한 키트의 사용을 위한 관련 정보를 제시하는 사용 설명서를 포함한다.

더욱 바람직하게, 본 키트는 서열식별번호: 8-15로 이루어진 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 항체로부터 선택되는 적어도 하나의 디자이너 BMP를 포함하고, 즉, 디자이너 BMP는 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 및/또는 서열식별번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.

본 키트는 골 손실을 예방하고/거나, 골 질량을 증가시키기 위한 치료를 위해 임의 개수의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 상기 작용제는 앞에 기재되어 있고, 다른 많은 것들 중에서도 특히 치료 화합물, 시토카인, 비타민, TGFβ 수퍼패밀리의 다른 구성원을 포함한다.

본 발명은 또한 디자이너 BMP를 골 손실을 예방하고/거나, 골 질량을 증가시키는 데 효과적인 양 (예컨대, 10 mg/kg 초과, 적어도 15 mg/kg, 또는 15 mg/kg)으로 포함하는 제조물품 (예컨대, i.v. 또는 경구 투여용으로 적합화된 투여 형태)에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제조물품은 디자이너 BMP를 포함하는 용기 또는 용기들 및 골 손실을 치료 또는 예방하고/거나, 골 질량을 증가시키는 데 사용하기 위한 라벨 및/또는 사용 지침서를 포함한다.

본 발명은 또한 섬유증 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 조직 또는 기관에서 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 본 발명의 디자이너 BMP를 포함한다. 본 키트는 환자에게 키트의 성분을 투여하기 위한 단백질 전달용 시린지 또는 장치, 혼합 장치 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 애플리케이터를 추가로 포함한다. 추가로, 본 키트는 환자에서 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 키트의 사용에 관한 관련 정보를 기재한 사용 설명서를 포함한다.

더욱 바람직하게, 본 키트는 서열식별번호: 8-15로 이루어진 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질로부터 선택되는 적어도 하나의 디자이너 BMP를 포함하고, 즉, 디자이너 BMP는 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 및/또는 서열식별번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.

본 키트는 골 손실을 예방하고/거나, 골 질량을 증가시키거나, 또는 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 치료를 위해 임의 개수의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 상기 작용제는 앞에 기재되어 있고, 다른 많은 것들 중에서도 특히 치료 화합물, 시토카인, 비타민, TGFβ 수퍼패밀리의 다른 구성원을 포함한다.

본 발명은 또한 디자이너 BMP를 골 손실을 예방하고/거나, 골 질량을 증가시키거나, 또는 섬유증을 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양 (예컨대, 1 mg/kg 초과, 적어도 10 mg/kg, 적어도 15 mg/kg, 또는 15 mg/kg)으로 포함하는 제조물품 (예컨대, i.v. 또는 경구 투여용으로 적합화된 투여 형태)에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제조물품은 디자이너 BMP를 포함하는 용기 또는 용기들 및 골 손실을 치료 또는 예방하고/거나, 골 질량을 증가시키거나, 또는 섬유증을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 라벨 및/또는 사용 지침서를 포함한다.

예시적인 실시양태의 목록:

하기의 비제한적인 실시양태는 본 발명의 다양한 실시양태를 예시하는 것이다:

1. 서열식별번호: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

2. 실시양태 1에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 타입 I, 타입 IIA, 또는 타입 IIB 결합 도메인 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

3. 실시양태 2에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 10개 이하의 돌연변이인 디자이너 BMP 단백질.

4. 실시양태 1에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.

5. 실시양태 4에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.

6. 실시양태 1의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.

7. 실시양태 6의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.

8. 환자를 실시양태 1에 따른 디자이너 BMP 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.

9. 실시양태 8에 있어서, 환자를 치료하는 것이 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 골 질환을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

10. 실시양태 8에 있어서, 환자를 치료하는 것이 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 섬유증을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

11. 서열식별번호: 1과 비교하여 하기 돌연변이: V33I, P36E, H39A, H44E, P48A, A52N, D53S, H54Y, L55M, S57A, N68H, S69F, V70I, S72P, K73E, K73 다음에의 T 삽입, I74V, A77P, V80A, S85N, M89V, L92F, E94D, N95S, E96S, K97N, V99I를 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

12. 실시양태 11에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 타입 I, 타입 IIA, 또는 타입 IIB 결합 도메인 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

13. 실시양태 11에 있어서, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

14. 실시양태 11에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.

15. 실시양태 14에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.

16. 실시양태 11의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.

17. 실시양태 16의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.

18. 환자를 실시양태 11에 따른 디자이너 BMP 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.

19. 실시양태 18에 있어서, 환자를 치료하는 것이 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 골 질환을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

20. 실시양태 18에 있어서, 환자를 치료하는 것이 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 섬유증을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

21. 서열식별번호: 1과 비교하여 하기 돌연변이: V33I, P36E, H39A, H44E, P48A, A52N, D53S, H54Y, L55M, S57A, N68H, S69F, V70I, S72P, K73E, K73 다음에의 T 삽입, I74V, A77P, V80A, E83K, S85R, A86P, I87M, L92Y, E94D, N95G, E96Q, K97N, V98I, V99I, L100K, N102D, Y103I, D105N, V107I, G110E, R114S를 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

22. 실시양태 21에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 타입 I, 타입 IIA, 또는 타입 IIB 결합 도메인 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

23. 실시양태 21에 있어서, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

24. 실시양태 21에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.

25. 실시양태 24에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.

26. 실시양태 21의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.

27. 실시양태 26의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.

28. 환자를 실시양태 21에 따른 디자이너 BMP 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.

29. 실시양태 28에 있어서, 환자를 치료하는 것이 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 골 질환을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

30. 실시양태 28에 있어서, 환자를 치료하는 것이 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 섬유증을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

31. 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38K, Q41A, H46D, D48E, P50S, A54N, D55A, L57M, S59A, N70H, S71L, V72P, S74P, S75E, S75 다음에의 Y 삽입, I76V, A79P, V82A, S87N, M91V, L94F, E96D, Y97N, D98S, K99N, V101I를 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

32. 실시양태 31에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 타입 I, 타입 IIA, 또는 타입 IIB 결합 도메인 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

33. 실시양태 31에 있어서, 서열식별번호: 10 또는 12 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

34. 실시양태 31에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.

35. 실시양태 34에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.

36. 실시양태 31의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.

37. 실시양태 36의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.

38. 환자를 실시양태 31에 따른 디자이너 BMP 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.

39. 실시양태 38에 있어서, 환자를 치료하는 것이 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 골 질환을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

40. 실시양태 38에 있어서, 환자를 치료하는 것이 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 섬유증을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

41. 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38K, Q41A, H46D, D48E, P50S, A54N, D55A, L57M, S59A, N70H, S71L, V71M, S74P, S75E, S75 다음에의 Y 삽입, I76V, A79P, V82A, E85K, S87R, A88P, I89M, L94Y, E96D, Y97G, D98Q, K99N, V100I, V1010I, L102K, N104D, Y105I, E107N, V109I, G112E, R116S를 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

42. 실시양태 41에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 타입 I, 타입 IIA, 또는 타입 IIB 결합 도메인 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

43. 실시양태 41에 있어서, 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

44. 실시양태 41에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.

45. 실시양태 44에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.

46. 실시양태 41의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.

47. 실시양태 46의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.

48. 환자를 실시양태 41에 따른 디자이너 BMP 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.

49. 실시양태 48에 있어서, 환자를 치료하는 것이 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 골 질환을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

50. 실시양태 48에 있어서, 환자를 치료하는 것이 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 섬유증을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

51. 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38R, Q41A, H46D, D48E, P50S, A54N, D55A, L57M, S59A, N70H, S71L, V72M, S74P, S75E, S75 다음에의 Y 삽입, I76V, A79P, V82A, E85K, S87R, A88P, I89M, L94Y, E96D, Y97G, D98Q, K99N, V100I, V101I, L102K, N104D, Y105I, E107N, V109I, G112E, R116S를 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

52. 실시양태 51에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 타입 I, 타입 IIA, 또는 타입 IIB 결합 도메인 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

53. 실시양태 51에 있어서, 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

54. 실시양태 51에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.

55. 실시양태 54에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.

56. 실시양태 51의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.

57. 실시양태 56의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.

58. 환자를 실시양태 51에 따른 디자이너 BMP 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.

59. 실시양태 58에 있어서, 환자를 치료하는 것이 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 골 질환을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

60. 실시양태 58에 있어서, 환자를 치료하는 것이 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 섬유증을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

61. 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38R, Q41A, H46D, D48E, P50S, A54N, D55A, L57M, S59A, N70H, S71L, V72M, S74P, S75E, S75 다음에의 Y 삽입, I76V, A79P, V82A, E85K, S87R, A88P, I89M, L94Y, E96D, Y97G, D98Q, K99N, V100I, V101I, L102K, N104D, Y105I, E107N, V109I, G112E, R116S를 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

62. 실시양태 61에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 타입 I, 타입 IIA, 또는 타입 IIB 결합 도메인 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

63. 실시양태 61에 있어서, 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

64. 실시양태 61에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.

65. 실시양태 64에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.

66. 실시양태 61의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.

67. 실시양태 66의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.

68. 환자를 실시양태 61에 따른 디자이너 BMP 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.

69. 실시양태 68에 있어서, 환자를 치료하는 것이 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 골 질환을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

70. 실시양태 68에 있어서, 환자를 치료하는 것이 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 섬유증을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

71. 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38R, Q41A, H46D, D48E, P50S, A54N, D55A, L57M, S59A, N70H, S71L, V72M, S74P, S75E, S75 다음에의 Y 삽입, I76V, A79P, V82A, E85K, S87R, A88P, I89M, L94Y, E96D, Y97G, D98Q, K99N, V100I, V101I, L102K, N104D, Y105I, E107N, V109I, G112E, R116S를 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

72. 실시양태 71에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 타입 I, 타입 IIA, 또는 타입 IIB 결합 도메인 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

73. 실시양태 71에 있어서, 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

74. 실시양태 71에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.

75. 실시양태 74에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.

76. 실시양태 71의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.

77. 실시양태 76의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.

78. 환자를 실시양태 71에 따른 디자이너 BMP 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.

79. 실시양태 78에 있어서, 환자를 치료하는 것이 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 골 질환을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

80. 실시양태 78에 있어서, 환자를 치료하는 것이 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 섬유증을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

81. 서열식별번호: 2와 비교하여 하기 돌연변이: V35I, P38E, Q41A, H46E, D48E, P50A, A54N, D55S, H56Y, L57M, S59A, N70H, S71F, V72I, N73 다음에의 P 삽입, S74E, S75T, I76V, A79P, V82A, E85K, S87R, A88P, I89M, L94Y, E96D, Y97G, D98Q, K99N, V100I, V101I, L102K, N104D, Y105I, E107N, V109I, G112E, R116S를 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

82. 실시양태 81에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 타입 I, 타입 IIA, 또는 타입 IIB 결합 도메인 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

83. 실시양태 81에 있어서, 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.

84. 실시양태 81에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.

85. 실시양태 84에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.

86. 실시양태 81의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.

87. 실시양태 86의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.

88. 환자를 실시양태 81에 따른 디자이너 BMP 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.

89. 실시양태 88에 있어서, 환자를 치료하는 것이 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 골 질환을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

90. 실시양태 88에 있어서, 환자를 치료하는 것이 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 환자를 디자이너 BMP와 접촉시키는 단계는 환자에게 섬유증을 치료하는 데 효과적인 용량으로 디자이너 BMP를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

결론

본원에서 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 공개문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 구체적인 실시양태를 참조로 개시되었지만, 본 발명의 진정한 정신 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 본 발명의 다른 실시양태 및 변형이 고안될 수 있다는 것은 자명하다. 첨부된 특허청구범위는 그러한 모든 실시양태 및 등가인 변형을 포함하도록 해석되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Bioventus LLC Wozny, John M. Brown, Christopher T. 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Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr Cys His Gly Asp 35 40 45 Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu 85 90 95 Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu Gly 100 105 110 Cys Gly Cys Arg 115 <210> 3 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ala Asn Lys Arg Lys Asn Gln Asn Arg Asn Lys Ser Ser Ser His 1 5 10 15 Gln Asp Ser Ser Arg Met Ser Ser Val Gly Asp Tyr Asn Thr Ser Glu 20 25 30 Gln Lys Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp 35 40 45 Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe 50 55 60 Tyr Cys Asp Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala 65 70 75 80 Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Phe Pro Asp 85 90 95 His Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser 100 105 110 Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg 115 120 125 Asn Met Val Val Arg Ser Cys Gly Cys His 130 135 <210> 4 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Ala Ser Ser Arg Arg Arg Gln Gln Ser Arg Asn Arg Ser Thr Gln 1 5 10 15 Ser Gln Asp Val Ala Arg Val Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser 20 25 30 Glu Leu Lys Thr Ala Cys Arg Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro 85 90 95 Glu Tyr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 5 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys 1 5 10 15 Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro 85 90 95 Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 6 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Val Arg Pro Leu Arg Arg Arg Gln Pro Lys Lys Ser Asn Glu Leu 1 5 10 15 Pro Gln Ala Asn Arg Leu Pro Gly Ile Phe Asp Asp Val His Gly Ser 20 25 30 His Gly Arg Gln Val Cys Arg Arg His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Leu Asp Trp Val Ile Ala Pro Gln Gly Tyr Ser Ala 50 55 60 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asp Ser Cys Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Leu Gln Ser Leu Val His Leu Met Met Pro 85 90 95 Asp Ala Val Pro Lys Ala Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Ser Ala Thr 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Tyr Asp Ser Ser Asn Asn Val Ile Leu Arg Lys His 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Lys Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ser Ala Gly Ala Gly Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val Asn 1 5 10 15 Phe Glu Asp Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr 20 25 30 Glu Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp 35 40 45 Val Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Lys 50 55 60 Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser 65 70 75 80 Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp Met Gly Val Pro Thr Leu Lys 85 90 95 Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala Glu Cys Gly Cys Arg 100 105 110 <210> 8 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 8 Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg 1 5 10 15 His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala 35 40 45 Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln 50 55 60 Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys 65 70 75 80 Ala Pro Thr Glu Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser 85 90 95 Ser Asn Val Ile Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys 100 105 110 Gly Cys Arg 115 <210> 9 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg 1 5 10 15 His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala 35 40 45 Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln 50 55 60 Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys 65 70 75 80 Ala Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ser 115 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 Trp Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Asp Gly Glu 35 40 45 Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro 65 70 75 80 Cys Cys Ala Pro Thr Glu Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp 85 90 95 Asp Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu 100 105 110 Gly Cys Gly Cys Arg 115 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 11 Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 Trp Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Asp Gly Glu 35 40 45 Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro 65 70 75 80 Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp 85 90 95 Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu 100 105 110 Glu Cys Gly Cys Ser 115 <210> 12 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 12 Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 Trp Ile Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Asp Gly Glu 35 40 45 Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro 65 70 75 80 Cys Cys Ala Pro Thr Glu Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp 85 90 95 Asp Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu 100 105 110 Gly Cys Gly Cys Arg 115 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 13 Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 Trp Ile Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Asp Gly Glu 35 40 45 Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro 65 70 75 80 Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp 85 90 95 Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu 100 105 110 Glu Cys Gly Cys Ser 115 <210> 14 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 14 Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Glu Gly Glu 35 40 45 Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro 65 70 75 80 Cys Cys Ala Pro Thr Glu Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp 85 90 95 Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu 100 105 110 Gly Cys Gly Cys Arg 115 <210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 15 Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Glu Gly Glu 35 40 45 Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro 65 70 75 80 Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp 85 90 95 Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu 100 105 110 Glu Cys Gly Cys Ser 115

Claims

서열식별번호(SEQ ID NO): 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질.
제1항에 있어서, 상응하는 야생형 BMP의 결합 프로파일과 상이한 결합 프로파일을 가지는 디자이너 BMP 단백질.
제2항에 있어서, 디자이너 BMP 단백질의 결합 프로파일이 하기: 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합; 및 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합인 것 중 적어도 하나를 포함하는 것인 디자이너 BMP 단백질.
제1항의 디자이너 BMP 단백질을 코딩하는 핵산.
제4항의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 디자이너 BMP 단백질을 제조하는 방법.
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