CN107636008A

CN107636008A - 改进的成骨蛋白

Info

Publication number: CN107636008A
Application number: CN201580077338.XA
Authority: CN
Inventors: J·M·沃兹尼; H·泽赫曼; C·T·布朗
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2015-01-05
Filing date: 2015-04-06
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2035-04-06
Also published as: AU2015376655B2; EP3242885B1; AU2015376655A1; CA2972970C; JP2018506992A; CN107636008B; US10196433B2; CA2972970A1; IL253305B; KR102358345B1; US20180134762A1; EP3242885A1; US20160207973A1; KR20170098940A; US11008373B2; WO2016111713A1; BR112017014464A2; US20190241634A1; IL253305A0; US9688735B2

Abstract

本发明涉及对同源受体具有改变的亲和性的新的经设计的成骨蛋白、其编码核酸及其使用方法。更优选地，新的经设计的成骨蛋白是经设计的BMP并且对同源BMP受体具有改变的亲和性。经设计的BMP显示改变的生物学特性，并提供潜在的有用的新型治疗剂。

Description

改进的成骨蛋白

相关申请的交叉引用

本申请是由Berasi等人于2015年1月5日提交的第14/589,468号美国专利申请的部分继续申请，并且根据35 U.S.C.§120要求其优先权的权益，第14/589,468号美国专利申请是2011年8月17日提交的第13/211,755号美国专利申请、现为美国专利8,952,131的继续申请，第13/211,755号美国专利申请、现为美国专利8,952,131的继续申请又根据35 U.S.C§119(e)要求2010年8月20日提交的第61/375,636号美国临时专利申请的优先权的权益。每个上述申请通过引用以其全部并且出于所有目的并入本文。

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，在此通过引用以其全部并入。所述ASCII拷贝于2015年4月3日创建，被命名为7362174001，且大小为17,395字节。

发明领域

本申请涉及成骨蛋白领域、制备改进的成骨蛋白的方法，以及用成骨蛋白治疗患者的方法。

发明背景

胱氨酸结细胞因子超家族被分为亚家族，其包括转化生长因子β(TGFβ)蛋白、糖蛋白激素、血小板源生长因子样(PDGF样)蛋白、神经生长因子(NGF)和差异筛选选出的成神经细胞瘤家族中畸变的基因(DAN)(例如cerberus)。TGFβ超家族又包含大约43个成员，被进一步分为三个亚家族：TGFβ、活化素和骨形态发生蛋白/生长分化因子蛋白(BMP/GDF)。

TGF-β超家族成员含有典型的胱氨酸结拓扑结构。也就是说，胱氨酸结是六个半胱氨酸残基异常排列的结果。该结由半胱氨酸1-4、半胱氨酸2-5之间的键和形成环的间插序列(intervening sequence)组成，半胱氨酸3-6之间的二硫键穿过该环。这些蛋白的活性形式是同二聚体或异二聚体。在每种情况下，单体拓扑结构通过半胱氨酸结稳定，并且另外的半胱氨酸有助于另外的链内键和/或介导与另一蛋白单元的二聚化。参见Kingsley,1994,Genes Dev.8:133-146；Lander等人,2001,Nature 409:860-921。

BMP/GDF是TGF-β蛋白超家族中为数最多的成员。BMP/GDF亚家族包括但不限于BMP2、BMP3(成骨素)、BMP3b(GDF-10)、BMP4(BMP2b)、BMP5、BMP6、BMP7(成骨蛋白-1或OP1)、BMP8(OP2)、BMP8B(OP3)、BMP9(GDF2)、BMP10、BMP11(GDF11)、BMP12(GDF7)、BMP13(GDF6、CDMP2)、BMP15(GDF9)、BMP16、GDF1、GDF3、GDF5(CDMP1；MP52)和GDF8(肌生成抑制素)。BMP有时被称为成骨蛋白(OP)、生长分化因子(GDF)或软骨源形态发生蛋白(CDMP)。BMP也存在于其他动物物种中。此外，在人类种群的不同成员中，BMP序列中存在一些等位变异。

BMP天然表达为前蛋白(pro-protein)，其包含长的前结构域(pro-domain)、一个或多个切割位点和成熟结构域。然后通过细胞机制加工该前蛋白以产生二聚体成熟的BMP分子。前结构域被认为有助于BMP的正确折叠和加工。此外，在一些但非全部的BMP中，前结构域可以非共价结合成熟结构域并且可以充当分子伴侣以及抑制剂(例如，Thies等人，Growth Factors 18:251-9(2001))。

当BMP二聚体结合两个I型和两个II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体时，引发BMP信号转导。I型受体包括但不限于ALK-1((Activin receptor-Like Kinase 1，活化素受体样激酶1)、ALK-2(也称为ActRIa或ActRI)、ALK-3(也称为BMPRIa)和ALK-6(也称为BMPRIb)。II型受体包括但不限于ActRIIa(也称为ActRII)，ActRIIb和BMPRII。人类基因组包含12个受体丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员，包括7种I型和5种II型受体，所有这些都参与TGF-β信号传导(Manning等人，Science 298：1912-34(2002))，其公开内容通过引用在此并入)。因此，存在12种受体和43种超家族成员，表明至少一些TGF-β超家族成员结合相同的受体(多种受体)。在BMP结合后，II型受体使I型受体磷酸化，I型受体使转录因子的Smad家族的成员磷酸化，并且Smad易位到细胞核并激活多个基因的表达。

BMP是TGF-β超家族中为数最多的成员，并且控制不同组的细胞进程和发育进程，例如胚胎模式形成和组织特异化，以及在成人组织中，除了别的地方，在神经系统和骨骼系统中促进伤口愈合和修复过程。事实上，BMP最初是通过其诱导骨和软骨形成的能力而被分离的：BMP信号传导在骨折和相关组织损伤时是可诱导的，导致骨再生和修复。鉴于它们在发育和正常伤口愈合中的作用，对于骨骼系统、神经系统和其中表达BMP受体的其他组织的再生和修复，BMP具有极好的前景。对于具有对其受体改变的亲和性和/或相对于天然蛋白改进的生物活性的BMP，这一前景甚至更好。本发明人之前已经描述了具有与BMP受体改变的结合以及具有在各种体外和体内检测中增加的活性的经设计的BMP。然而目前已知的经设计的BMP的整体规模仍然相对小，并且在本领域中对开发新型和新颖的经设计的BMP存在持续的需求。

发明概述

本发明通过在其各个方面通过提供基于BMP2、4、6和7的、新颖的经设计的BMP，涉及这些经设计的BMP的组合物和方法，以及制备和使用它们的方法来满足该需求。在一方面，本发明涉及经设计的BMP，其在各种实施方案中包含选自SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13、14和15的氨基酸序列。经设计的BMP任选地包括一个或多个不在I型、IIA型或IIB型结合结构域中的突变；可以各不相同地有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这样的突变。可选地或另外地，经设计的BMP表现出与野生型BMP不同的受体结合谱，该结合谱包括以下的一个、几个或全部：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

在另一方面，本发明涉及经设计的BMP，其包含相对于SEQ ID NO:1的以下突变：V33I、P36E、H39A、H44E、P48A、A52N、D53S、H54Y、L55M、S57A、N68H、S69F、V70I、S72P、K73E、K73后插入T、I74V、A77P、V80A、S85N、M89V、L92F、E94D、N95S、E96S、K97N、V99I。在一些实施方案中，经设计的BMP任选地包括一个或多个不在I型、IIA型或IIB型结合结构域中的突变；可以各不相同地有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这样的突变。可选地或另外地，经设计的BMP表现出与野生型BMP不同的受体结合谱，该结合谱包括以下的一个、几个或全部：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。在一些情况下，经设计的BMP可以具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，而在其他情况下，经设计的BMP还包含相对于SEQID NO:8的以下突变：E84K、N86R、A87P、I88M、V90M、F93Y、S96G、S97Q、V99I、L101K、N103D、Y104I、D106N、V108I、G111E、R115S。

在另一方面，本发明涉及经设计的BMP，其包含相对于SEQ ID NO:1的以下突变：V33I、P36E、H39A、H44E、P48A、A52N、D53S、H54Y、L55M、S57A、N68H、S69F、V70I、S72P、K73E、K73后插入T、I74V、A77P、V80A、E83K、S85R、A86P、I87M、L92Y、E94D、N95G、E96Q、K97N、V98I、V99I、L100K、N102D、Y103I、D105N、V107I、G110E、R114S。在一些实施方案中，经设计的BMP任选地包括一个或多个不在I型、IIA型或IIB型结合结构域中的突变；可以各不相同地有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这样的突变。可选择或另外地，经设计的BMP表现出与野生型BMP不同的受体结合谱，该结合谱包括以下的一个、几个或全部：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。在一些情况下，经设计的BMP可以具有包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

还在另一方面，本发明涉及经设计的BMP，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38K、Q41A、H46D、D48E、P50S、A54N、D55A、L57M、S59A、N70H、S71L、V72P、S74P、S75E、在S75插入Y、I76V、A79P、V82A、S87N、M91V、L94F、E96D、Y97N、D98S、K99N、V101I。在一些实施方案中，经设计的BMP任选地包括一个或多个不在I型、IIA型或IIB型结合结构域中的突变；可以各不相同地有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这样的突变。可选地或另外地，经设计的BMP表现出与野生型BMP不同的受体结合谱，该结合谱包括以下的一个、几个或全部：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。在一些情况下，经设计的BMP可以具有包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在其他情况下，经设计的BMP还可以包括相对于SEQID NO:10的K38R突变，和/或可以包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

还在另一方面，本发明涉及经设计的BMP，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38K、Q41A、H46D、D48E、P50S、A54N、D55A、L57M、S59A、N70H、S71L、V71M、S74P、S75E、S75后插入Y、I76V、A79P、V82A、E85K、S87R、A88P、I89M、L94Y、E96D、Y97G、D98Q、K99N、V100I、V1010I、L102K、N104D、Y105I、E107N、V109I、G112E、R116S。在一些实施方案中，经设计的BMP任选地包括一个或多个不在I型、IIA型或IIB型结合结构域中的突变；可以各不相同地有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这样的突变。可选地或另外地，经设计的BMP表现出与野生型BMP不同的受体结合谱，该结合谱包括以下的一个、几个或全部：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。在一些情况下，经设计的BMP可以具有包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

还在另一方面，本发明涉及经设计的BMP，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38R、Q41A、H46D、D48E、P50S、A54N、D55A、L57M、S59A、N70H、S71L、V72M、S74P、S75E、S75后插入Y、I76V、A79P、V82A、E85K、S87R、A88P、I89M、L94Y、E96D、Y97G、D98Q、K99N、V100I、V101I、L102K、N104D、Y105I、E107N、V109I、G112E、R116S。在一些实施方案中，经设计的BMP任选地包括一个或多个不在I型、IIA型或IIB型结合结构域中的突变；可以各不相同地有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这样的突变。可选地或另外地，经设计的BMP表现出与野生型BMP不同的受体结合谱，该结合谱包括以下的一个、几个或全部：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。经设计的BMP任选地具有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

还在另一方面，本发明涉及经设计的BMP，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38E、Q41A、H46E、D48E、P50A、A54N、D55S、H56Y、L57M、S59A、N70H、S71F、V72I、N73后插入P、S74E、S75T、I76V、A79P、V82A、S87N、M91V、L94F、E96D、Y97S、D98S、K99N、V101I。在一些实施方案中，经设计的BMP任选地包括一个或多个不在I型、IIA型或IIB型结合结构域中的突变；可以各不相同地有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这样的突变。可选地或另外地，经设计的BMP表现出与野生型BMP不同的受体结合谱，该结合谱包括以下的一个、几个或全部：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。经设计的BMP可以具有包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

并且还在另一方面，本发明涉及经设计的BMP，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38E、Q41A、H46E、D48E、P50A、A54N、D55S、H56Y、L57M、S59A、N70H、S71F、V72I、N73后插入P、S74E、S75T、I76V、A79P、V82A、E85K、S87R、A88P、I89M、L94Y、E96D、Y97G、D98Q、K99N、V100I、V101I、L102K、N104D、Y105I、E107N、V109I、G112E、R116S。在一些实施方案中，经设计的BMP任选地包括一个或多个不在I型、IIA型或IIB型结合结构域中的突变；可以各不相同地有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这样的突变。可选地或另外地，经设计的BMP表现出与野生型BMP不同的受体结合谱，该结合谱包括以下的一个、几个或全部：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。经设计的BMP可以具有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

本发明还包括产生上述类型的经设计的BMP蛋白的方法。该方法通常包括将编码蛋白的核酸引入宿主细胞，在产生蛋白的条件下培养细胞，并纯化蛋白。

在各个方面，本发明涉及编码选自SEQ ID NO:8-15的氨基酸序列的核酸，或具体地编码SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:15的核酸。可以将核酸并入任何合适的表达载体中，其又可以被引入细胞中用于表达和收获，如下所述。

本发明还包括治疗有其需要的患者的与骨丢失相关的骨疾病的方法。在一方面，该方法包括给予治疗有效量的如上所述的经设计的BMP蛋白，从而治疗患者的骨疾病。在各种实施方案中，经设计的BMP蛋白包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:8-15，或具体地为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:15。

本发明包括治疗有其需要的患者的纤维化的方法。在一方面，本发明涉及包括给予治疗有效量的如上所述的经设计的BMP蛋白，从而治疗纤维化的方法。在各种实施方案中，经设计的BMP蛋白包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:8-15，或具体地为SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14和/或SEQ ID NO:15。

另外，本发明包括诱导组织中骨形成的方法。在这方面，该方法包括使组织与如上所述的经设计的BMP蛋白接触，从而诱导所述组织中的骨形成。在各种实施方案中，经设计的BMP蛋白包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:8-15，或具体地为SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和/或SEQID NO:15。

最后，本发明的一个方面涉及用于治疗患者的试剂盒，其包括如上所述的经设计的BMP。在各种实施方案中，经设计的BMP蛋白包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:8-15，或具体地为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:15。本发明的试剂盒任选地或另外地包含用于稀释经设计的BMP的流体，从而产生经设计的BMP溶液，和/或与经设计的BMP溶液一起使用的医疗器械或植入材料。

附图简述

为了说明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方案。然而，本发明不局限于附图中所描绘的实施方案的精确布置和手段。

图1是示出各种野生型和经设计的BMP的氨基酸序列比对并且显示(通过在框内)可能参与I型和II型受体相互作用的这些蛋白的区域的图。图1示出野生型BMP2(SEQ IDNO:1)、BMP4(SEQ ID NO:2)、BMP5(SEQ ID NO:3)、BMP6(SEQ ID NO:4)、BMP7(SEQ ID NO:5)、BMP8(SEQ ID NO:6)和BMP9(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列比对。

图2是示出结合两个I型和两个II型BMP受体的野生型BMP2同二聚体的结构模型的说明。

图3包括图A和B，是示出在中国仓鼠卵巢(CHO)(图3A)和大肠杆菌细胞(图3B)中产生的人BMP2中组氨酸门止动器(doorstop)(H54)的位置的结构模型图。

图4包括图A和B，是说明聚糖系链(glycan tether)和潜在的组氨酸(His)门止动器的位置的图。图4A示出所有在CHO中产生的BMP中在非门止动器方向上的聚糖系链(在N56处的N-连接的聚糖)和组氨酸54，以及聚糖系链与R16的相互作用。图4B示出在BMP6中聚糖系链(在N80处的N-连接的聚糖)和在H78处的非门止动器构型中的组氨酸以及对应于BMP2中的R16的R39。

图5包含图A-D，示出用于BMP和经设计的BMP的纯化方法中的各个步骤。图5A示出显示使用cellufine-硫酸盐柱梯度洗脱BMP的色谱图。图5B是含有来自cellufine-硫酸盐柱步骤的级分的样品的考马斯染色的SDS-PAGE(左侧为非还原的，右侧为还原的)凝胶的图。图5C示出显示来自制备型反相纯化步骤的曲线(profile)的色谱图。图5D是含有通过制备型反相纯化步骤获得的级分的样品的考马斯染色的SDS-PAGE(左侧为非还原的，右侧为还原的)凝胶的图。

发明详述

本发明涉及“经设计的”骨形态发生蛋白，本文称为“经设计的BMP”，“经设计的成骨蛋白”和“经设计的蛋白”。本发明的经设计的BMP可以对应于野生型未经修饰的BMP的氨基酸序列，例如但不限于BMP2(SEQ ID NO:1)、BMP4(SEQ ID NO:2)、BMP5(SEQ ID NO:3)、BMP6(SEQ ID NO:4)、BMP7(SEQ ID NO:5)、BMP8(SEQ ID NO:6)和BMP9(SEQ ID NO:7)。在特定的实施方案中，当与其对应的野生型BMP相比时，经设计的BMP示出与I型和/或II型BMP受体的结合改变。在进一步的实施方案中，当与其对应的BMP相比时，经设计的BMP可以被修饰为具有改变的半衰期、免疫原性或任何药代动力学/药效学(PK/PD)参数。

定义

除非本文另有定义，所使用的与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，所使用的与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白以及核酸化学和杂交有关命名法，以及本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白以及核酸化学和杂交的技术是本领域熟知和常用的那些。

本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的方法进行，并且如在贯穿本说明书所引用和讨论的各个一般的和更具体的参考文献中所描述的，除非另有说明。这样的参考文献包括例如Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Approach，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY(2001)，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(2002)和Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY(1990)，其通过引用并入本文。根据制造商的说明进行酶反应和纯化技术，如本领域通常完成的或如本文所述。所使用的与本文所述的分析化学、合成有机化学、医学和药物化学有关的命名法以及本文所述的分析化学、合成有机化学、医学和药物化学的实验过程和技术是本领域熟和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制剂(pharmaceutical preparation)、制剂(formulation)和递送，以及治疗患者。

如本文所使用的，以下每个术语具有在本节中与其有关的含义。

本文使用的冠词“a”和“an”是指一个或指多于一个(即指至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件(an element)”意是指一个元件或多于一个元件。

在本申请中，使用“或”意指“和/或”，除非另有说明。

本文使用常规标记法来描绘多肽序列：多肽序列的左手端是氨基末端；多肽序列的右手端是羧基末端。如本文所使用的，二十种常用氨基酸及其缩写遵照习惯用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编著,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其通过引用并入本文。如本文所使用的，氨基酸由其全名、与其相应的三字母代码、与其相应的单字母代码表示，如以下所示：

“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被另一个具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的具有侧链R基团的氨基酸残基取代的取代。通常，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列通过保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整百分比序列同一性或相似程度以校正取代的保守性质。用于进行此调整的手段是本领域技术人员所熟知的。参见例如，Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。

具有相似化学性质的具有侧链的氨基酸组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

或者，保守替换是在Gonnet等人，Science 256：1443-1445(1992)中所公开的在PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化，Gonnet等人，Science 256：1443-1445(1992)通过引用并入本文。“中度保守”取代是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。

优选的氨基酸取代是以下那些：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和性，以及(4)赋予或修饰这些类似物的其他物理化学或功能性质。包含取代、缺失和/或插入的类似物可以包括除特定肽序列以外的序列的多种突变蛋白。例如，单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)可以在特定的序列中进行(优选在形成分子间接触的结构域(多个结构域)之外，例如，在CDR或I型或II型受体结合位点之外的多肽的部分中)。保守氨基酸取代基本上不应该改变亲本序列的结构特征(例如，取代氨基酸不应该倾向于破坏在亲本序列中存在的螺旋，或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。在Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编著,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction toProtein Structure(C.Branden and J.Tooze编著,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等人,Nature 354:105(1991)中描述了本领域公认的多肽二级和三级结构的实例，其各自通过引用并入本文。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”是指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并且意指两个或更多核苷酸的任何链。多核苷酸可以是单链或双链的嵌合混合物或其衍生物或其修饰版本。寡核苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架处进行修饰，例如，以改进分子的稳定性，其杂交参数等。核苷酸序列通常携带遗传信息，包括通过细胞机制使用的以制备蛋白和酶的信息。这些术语包括双链或单链基因组和cDNA、RNA、任何合成和遗传操作的多核苷酸，以及有义和反义多核苷酸两者。这还包括含有经修饰的碱基，例如，硫尿嘧啶、硫鸟嘌呤和氟尿嘧啶的核酸，或含有碳水化合物或脂质的核酸。

在核苷酸序列的上下文中，术语“基本上相同”在本文中用于指第一核酸序列包含足够或最少数目的与第二核酸序列中比对的核苷酸相同的核苷酸，使得第一并且第二核苷酸序列编码具有共同功能性活性的多肽，或编码共同结构的多肽结构域或共同功能性多肽活性。例如，与参照序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

“经设计的BMP核酸”和本文中的语法上等同说法是指编码经设计的BMP的核酸。

术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换地使用。这些术语是指经由肽键连接在一起的顺序的氨基酸链。这些术语包括一种或多种作为离散单位(discrete unit)发挥功能的蛋白。如果单个多肽是离散的功能单位，并且不需要与其他多肽的永久的或临时的物理缔合以形成离散的功能单位，则术语“多肽”和“蛋白”可以可互换地使用。如果离散的功能单位由物理上彼此缔合的多个多肽组成，则本文所用的术语“蛋白”是指物理上偶联的并共同作为离散单位发挥功能的多个多肽。根据本发明的待表达的蛋白可以是蛋白治疗剂。蛋白治疗剂是对其所作用的身体中的区域或经由中间体其远程作用的身体的区域具有生物学作用的蛋白。下面更详细地讨论蛋白治疗剂的实例。

如本文所用的术语，“经设计的BMP”涉及与没有突变的相应野生型BMP相比包含至少一个氨基酸突变的BMP蛋白，其中与相应野生型BMP对I型和/或II型受体的结合相比，经设计的BMP具有可检测的改变的对于至少一种I型受体和/或至少一种II型受体的结合。

“相应的野生型蛋白”是指经设计的BMP在引入任何突变之前的野生型版本。例如，如果经设计的BMP是经设计的BMP2，则相应的野生型BMP是野生型BMP2。因此，在一个实施方案中，经设计的BMP的设计可以但不是必须由野生型BMP序列开始，其中将突变(例如，氨基酸取代、缺失和/或插入)引入野生型序列中。因此，经设计的BMP可以与野生型BMP相对应，并且突变的位置可以被称为例如对应于(correspond with)，相对于(relative to)和/或关于(respective with)野生型的相应和/或“参考”BMP序列的氨基酸序列。

本发明的蛋白包括本文所述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，以及其任何组合。当术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”指本发明的蛋白时，包括保留其来源蛋白的至少一些功能性质的任何蛋白。

本文所用的术语“片段”是指多肽，并且被定义为给定多肽的任何离散的部分(discrete portion)，其为该多肽独特的或是该多肽的特征。本文所用的术语还指保留至少部分全长多肽活性的给定多肽的任何离散部分。在某些实施方案中，保留的部分活性为全长多肽的活性的至少10％。在某些实施方案中，保留的部分活性为全长多肽的活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，保留的部分活性为全长多肽的活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，保留的部分活性为全长多肽的活性的100％或更多。可选地或另外地，本文所用的术语还指给定多肽的任何部分，其至少包括在全长多肽中存在的已确定的序列元件。在一些实施方案中，序列元件跨越全长多肽的至少约4-5、10、15、20、25、35、40、45、50或更多个氨基酸。本发明的蛋白的片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。

本发明的蛋白的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然存在或是非天然存在的。可以使用本领域已知的诱变技术产生非天然存在的变体。变体蛋白可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。

本发明的蛋白包括具有通过功能性侧基的反应化学衍生的一个或多个残基的蛋白。作为本发明的蛋白，还包括含有一个或多个二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的多肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；以及鸟氨酸可以取代赖氨酸。

本文所使用的“重组表达的多肽”和“重组多肽”是指由已经被操作以表达该多肽的宿主细胞表达的多肽。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，此操作可以包括一个或多个遗传修饰。例如，可以通过引入一个或多个编码被表达多肽的异源基因对宿主细胞遗传修饰。异源重组表达的多肽可以与在宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似。异源重组表达的多肽也可以是对宿主细胞而言外源的，例如与宿主细胞中正常表达的多肽异源。在某些实施方案中，异源重组表达的多肽是嵌合的。例如，多肽的部分可以包含与宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其他部分包含对宿主细胞而言外源的氨基酸序列。另外地或可选地，多肽可以包含来自均在宿主细胞中正常表达的两个或多个不同多肽的氨基酸序列。此外，多肽可以包含来自对宿主细胞而言均是外源的两个或多个多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过一种或多种内源基因的活化或上调对宿主细胞遗传修饰。

如下进行序列之间的同源性或序列同一性(本文中可互换使用的术语)计算。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较目的将序列进行比对(例如，为了最佳比对可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位(gap)并且出于比较目的可以忽略非同源序列)。在典型的实施方案中，出于比较目的所比对的参考序列的长度为参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％或60％、或至少70％、80％、90％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则该位置处的分子是相同的(如本文所使用的，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分比同一性，出于最佳比较目的将序列进行比对(例如，为了与第二个氨基酸或核酸序列的最佳比对，可以在第一个氨基酸或核酸序列的序列中引入空位)。两个序列之间的百分比同一性是由序列所共享的相同位置的数量的函数(即，％同源性＝相同位置的#/位置的总#×100)。使用数学算法可以实现确定两个序列之间的百分比同源性。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin等人Proc Natl Acad Sci U S A 87：2264-8(1990)的算法，在Karlin等人Proc Natl AcadSci U S A 90：5873-7(1993)中改进的。这样的算法被并入Altschul等人，J Mol Biol215：403-10(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序、分值(score)＝100、字长(wordlength)＝12进行BLAST核苷酸搜索。

可以用XBLAST程序、分值＝50、字长＝3进行BLAST蛋白搜索。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人，Nucleic Acids Res 25：3389-402(1997)中所述使用空位BLAST(Gapped BLAST)。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。

两个序列之间的百分比同一性是由序列所共享的相同位置的数量的函数，考虑到空位的数目和每个空位的长度，其需要被引入以用于两个序列的最佳比对。

序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。在一个实施方案中，使用已经并入GCG软件包(可在gcg.com获得)中的GAP程序中的Needleman-Wunsch算法(Needleman等人，J Mol Biol 48：443-53(1970))确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重，1、2、3、4、5或6的长度权重。还在另一个实施方案中，使用GCG软件包(可在互联网上的gcg.com获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。一组典型的参数(并且应使用的参数，除非另有说明)是具有空位罚分12、空位延伸罚分4、移码空位罚分5的Blossum 62得分矩阵。

两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用已经并入到ALIGN中程序(2.0版)的E.Merers和W.Miller(Myers等人，Comput Appl Bioscios 4：11-7(1988))的算法来确定，使用PAM 120权重残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。

如本文使用的术语，“说明材料”包括公开出版物、记录或图表或可用于说明试剂盒中的本发明的化合物、组合和/或组合物用于影响、减轻或治疗本文所述的各种疾病或障碍的有用性的任何其他表达介质。任选地或可选地，说明材料可以描述一种或多种减轻细胞、组织或哺乳动物的疾病或障碍的方法，包括如本文其他地方所公开的。

试剂盒的说明材料可以例如被固定到含有本发明的化合物和/或组合物的容器，或者与包含化合物和/或组合物的容器一起运输。可选地，说明材料可以与容器分开运输，意图是接受者结合使用说明材料和化合物。

除了被标注时，术语“患者”或“受试者”可互换地使用，并且是指哺乳动物，例如人类患者和非人灵长类动物，以及兽医受试者，例如兔、大鼠和小鼠以及其他动物。优选地，患者是指人。

如本文中可互换地使用术语，“有效量”或“治疗有效量”是当向组织或哺乳动物优选人给予时，与在不存在化合物时所检测的响应相比，介导可检测的治疗响应的量。治疗响应，例如，但不限于抑制和/或减少的纤维化、增加的骨量或骨密度等，可以通过多种本领域公认的方法容易地评估，包括例如，本文所公开的这样的方法。

技术人员将理解，本文所给予的化合物或组合物的有效量是变化的，并且可以基于许多因素例如所治疗的疾病或病症、疾病阶段、所治疗的哺乳动物的年龄和健康和身体状况、疾病的严重程度，所给予的具体化合物等容易地确定。

如本文所用，“治疗”意指降低患者所经历疾病(例如降低的骨密度、骨折、纤维化等)的症状的频率。该术语包括给予本发明的化合物或药剂以预防或延缓症状、并发症的发作或疾病的生化指标，减轻症状或阻止或抑制疾病、病症或障碍的进一步发展。治疗可以是预防性的(以预防或延缓疾病的发作，或以预防其临床或亚临床症状的表现)或在疾病表现后治疗性抑制或减轻症状。

如本文使用的，短语“特异性结合”是指在样品中识别并结合特定分子但基本上不识别或结合其他分子的化合物，例如蛋白、核酸、抗体等。例如，在样品中识别和结合同源受体(例如，BMP I型或II型受体、与其同源抗原结合的抗体等)，但是基本上不识别或结合其他分子的BMP蛋白、抗体或肽抑制剂。因此，在指定的检测条件下，特定的结合部分(例如，BMP或其受体结合片段)优先结合特定的靶分子，并且不以显著量结合测试样品中存在的其他组分。可以使用各种检测形式来选择特异性结合感兴趣分子的抗体。例如，固相ELISA免疫检测、免疫沉淀、BIAcore、FACS、Octet和免疫印迹分析属于可用于鉴定与BMP受体特异性反应的BMP的多种检测。典型地，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更优选地比背景信号或噪声大至少五倍，并且更典型地，超过背景的10倍，甚至更具体地说，当平衡解离常数(K_D)≤100μM，更优选≤10μM，甚至更优选≤1μM，还更优选≤100nM，最优选≤10nM时，BMP被称为“特异性结合”BMP受体。

术语“K_D”是指特定配体-受体相互作用的平衡解离常数。

“结合亲和性”通常是指分子(例如，BMP配体)与其结合配偶体(例如，BMP I型或II型受体)的结合位点之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指明，如本文所用的，“结合亲和性”是指反映结合对成员(例如BMP及其同源受体)之间的1:1相互作用的固有结合亲和性。分子X对其配偶体Y的亲和性通常可以由解离常数(Kd)表示。

亲和性可以通过本领域已知的常规方法测定，包括本文所述的那些。低亲和性的BMP通常缓慢地结合受体并趋向易于解离，而高亲和性的BMP通常更快地结合受体并趋向保持结合更长时间。测定结合亲和性的各种方法是本领域已知的，其中任何方法可以用于本发明的目的。具体说明性实施方案在本文其他地方描述。

本文所用的术语“k_on”意指正向的或复合物形成反应的缔合或开启速率常数(onrate constant)或特定反应速率，以单位：M^-1秒^-1测定。

本文所用的术语“k_off”意指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离或关闭速率常数(off rate constant)或特定反应速率，以单位：秒^-1测定。

本文所用的术语“K_d”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。它由以下公式计算：

k_off/k_on＝K_d

如本文所用的术语“改变的结合”意指当与相应的野生型BMP与相同的I型和/或II型受体的结合相比时，经设计的BMP包含对于至少一种I型受体和/或II型受体不同的结合特异性。与野生型BMP与该受体的结合相比，经设计的BMP可以以更大或更小的亲和性与受体结合。例如，如果野生型BMP以一定的结合亲和性结合某种I型受体，则与野生型BMP相比，相应的经设计的BMP以更大或更小的亲和性与该受体结合。经设计的BMP甚至可以与野生型BMP未可检测地结合的受体特异性结合，并且反之亦然，其中经设计的BMP将不再与野生型BMP结合的受体可检测地结合。因此，与通过相应的野生型BMP与该受体的结合相比，改变的结合包括通过经设计的BMP与I型或II型受体的结合中的任何可检测的变化。与相应的野生型BMP的k_on值相比，经设计的BMP可以具有更大或更小的k_on值，和/或与相应的野生型BMP的k_off值相比，经设计的BMP可以具有更大或更小的k_off值，使得经设计的BMP的K_d大于或小于相应野生型BMP对于相同的BMP受体的K_d。因此，如本文所用的，术语“改变的结合”包括经设计的BMP和相应的野生型BMP之间的结合特征和/或亲和性值的任何差异。

如本文所用的，术语“表面等离子体共振”是指能够通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度的变化，来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，乌普萨拉，瑞典和皮斯卡塔韦，新泽西州)。对于进一步的描述，参见例如，Johnsson等人，Ann.Biol.Clin.51：19-26(1993)；Johnsson等人，Biotechniques11：620-627(1991)；Johnsson等人，J.Mol.Recognit.8：125-131(1995)；和Johnsson等人，Anal.Biochem.198：268-277(1991)。

如本文所使用的，“基本上纯的”是指目标物质是存在的优势物质(即以摩尔计，其比组合物中的任何其他单一物质更丰富)，并且优选基本上纯化的部分是其中目标物质(例如，经设计的BMP)包含存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔计)的组合物。通常，基本上纯的组合物将包含大于约80％的组合物中存在的所有大分子物质，更优选大于约85％、90％、95％和99％。最优选地，将物质纯化至基本均质性(通过常规检测方法在组合物中不能检测到污染物质)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。

说明

骨形态发生蛋白(BMP)

如上所述，BMP是TGF-β蛋白超家族的成员，所有BMP均以6个保守半胱氨酸残基为特征(Lander等，(2001)Nature，409：860-921)，BMP/GDF亚家族包括但不限于BMP2、BMP3(成骨素)(参见例如第6,177,406号美国专利)、BMP3b(GDF-10)(参见例如第6,204,047号美国专利)、BMP4(BMP2b)(参见例如第6,245,889号美国专利)、BMP5(参见例如第5,543,394号美国专利)、BMP6(参见例如第6,613,744号美国专利)、BMP7(成骨蛋白-1或OP1)(参见例如第5,141,905号美国专利)，BMP8(OP2)(参见例如第5,688,678号美国专利)、BMP8B(OP3)(参见例如第5,854,071号美国专利)、BMP9(GDF2)(参见例如第6,287,816号美国专利)、BMP10(参见例如第5,703,043号美国专利)、BMP11(GDF11)(参见例如第6,437,111号美国专利)、BMP12(GDF7)(参见例如第6,027,919号美国专利)、BMP13(GDF6，CDMP2)(参见例如第6,027,919号美国专利)、BMP15(GDF9)(参见例如第6,034,229号美国专利)，BMP16(参见例如第6,331,612号美国专利)、GDF1(参见例如第2004/0039162号美国申请)、GDF3(参见例如第6,025,475号美国专利)、GDF5(CDMP1；MP52)(参见例如第5,994,094号美国专利)和GDF8(肌生成抑制素)(参见例如第5,827,733号美国专利)。

BMP特异性结合其同源受体，其包括I型受体：ALK-1、ALK-2(也称为ActRIa或ActRI)、ALK-3(也称为BMPRIa)和ALK-6(也称为BMPRIb)；和II型受体：ActRIIa(也称为ActRII)、ActRIIb和BMPRII。已经广泛研究了BMP-受体结合相互作用，并且每种野生型BMP对于每种I型和/或II型受体的结合特异性在本领域中通常是已知的，并示于表1中。参见例如，Nickel等，Cytokine Growth Factor Rev 20：367-77(2009)；Heinecke等，BMC Biol 7:59(2009)。

表1

ALK1

ALK2

ALK3

ALK6

ACTIIA

ACTIIB

BMPRII

BMP-2

不结合

++++

++

+++

++

BMP-4

不结合

++++

++

BMP-6

不结合

++

++++

BMP-7

不结合

++

++++

BMP-9

+++++

不结合

++

+++

++++

具有改进的成骨活性的经设计的骨形态发生蛋白

本发明部分地基于对每种BMP二聚体结合4个BMP受体：两个I型受体和两个II型受体的认识。每种BMP对每种受体的特异性在本领域中是已知的，如以上表1所示。并且，介导BMP结合每种受体的各种BMP的受体结合区已被定位并且示于表2中。例如，已经确定野生型BMP2和BMP4以高亲和性结合I型BMP受体Alk-3和ALK-6，并且以较低亲和性结合II型BMP受体。另一方面，已知野生型BMP6和BMP7以高亲和性结合II型受体ActrIIA、ActrIIB和BMPRII，但以比其结合II型低的亲和性结合I型受体。据认为，来自约四十三个TGFβ超家族成员的不同细胞响应通过与约十二个受体的相互作用进行信号传导，被认为是由于每种配体利用了其以不同的亲和性与之结合的受体的特异性受体谱。I型和II型的结合结构域在表2中描述。

表2

合理的氨基酸取代以改变经设计的BMP的受体结合

本领域熟知，野生型BMP2显示对I型受体相对高的亲和性，而野生型BMP6显示对II型受体的高亲和性。在本领域中还已知，野生型BMP2和BMP6的异二聚体以相对高的亲和性结合I型和II型受体两者，每种BMP似乎为每种受体提供更高亲和性的结合位点。见下表3。已知在体外和体内两种骨形成检测中，BMP2/6异二聚体比单独或作为同二聚体的BMP2或BMP6更具活性。表3示出BMP2和BMP6与I型和II型受体的结合亲和性的实例。

表3

因此，本发明的目的是提供具有改进的与I型和/或II型受体的结合的经设计的BMP，包括(但不限于)模拟，并优选地改进BMP异二聚体结合的结合。如图1和表2所示，每个BMP包含三个有助于受体结合的结合位点。从N到C末端，每个BMP包含II型受体结合位点A、I型受体结合位点和第二II型受体结合位点B。尽管野生型BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8和BMP9的示例性比对如图1所示，技术人员将理解，存在熟知的提供了在TGBβ超家族成员中各种氨基酸的相对定位的比对。除了别的以外，在第WO2009/086131号(例如，图15-17、图31A)、第WO2008/051526号(图9-12)、第WO2005/118636号(图6)、第WO2005/118635号、第WO2005/113585号(图3)、第WO2001/92298号(图6A-6C)国际公开申请、Kirsch等人，EMBOJ.19：3314-3324(2000)(图1)、第2007/0293425号美国公开专利申请(图6)、Groppe等人，Nature420：636-642(2002)、Nickel等人，J.Bone Joint Surg.Am.83：7-14(2001)和Weber等人，BMC Structural Biol.7：6(2007)中提供了这样的比对。因此，使用本领域熟知的蛋白序列比对算法和工具，包括各种TGFβ超家族成员的氨基酸序列的比对，以及本文提供的公开内容，可以相对于另一BMP/GDF蛋白中的任何位置的氨基酸确定一个BMP/GDF蛋白中的相应氨基酸。在一个实施方案中，示出BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8和BMP-9中相应的氨基酸残基(参见例如图1)。

根据本发明的经设计的BMP通常在I型结合结构域和/或II型结合结构域中包含突变，其中所述突变赋予对I型或II型BMP受体的改变的结合。在一些实施方案中，经设计的BMP在I型结合结构域和第一(结合结构域A)和/或第二(结合结构域B)II型结合结构域两者中包含一个或多个突变。在其他实施方案中，经设计的BMP在两个II型结合结构域中包含一个或多个突变。在其他实施方案中，经设计的BMP在第一II型结合结构域中，在第二II型结合结构域中和在I型结合结构域中包含一个或多个突变。在一些实施方案中，经设计的BMP在I型结合结构域中包含一个或多个突变。

在优选实施方案中，上述突变通过在不同TGFβ超家族成员的相应结构域之间的一个或多个“交换(swap)”产生，构建嵌合的经设计的BMP。例如，在Berasi等人的文章中，使用BMP-2和BMP-6之间的交换构建各种经设计的BMP。在本发明中，Berasi等人的文章的教导被扩展到包括BMP-2、4、6和7之间的交换，尽管技术人员将理解，在这些和其他TGFβ超家族成员之间的其他交换是可能的。

作为非限制性实例，BMP-GE27(SEQ ID NO:8)包含将BMP-7的I型和IIA和IIB型结构域交换到BMP-2中，得到BMP-2/7嵌合体。类似地，BMP-GE46(SEQ ID NO:10)和BMP-GE47(SEQ ID NO:14)包含将BMP-6和7的I型和IIA和IIB型结构域(分别地)交换到BMP-4中。

除了上述突变策略之外，本发明人发现(并由Berasi等人的文章公开)，将活化素-A的C-末端区域单独交换到经设计的BMP中导致经设计的BMP对ActRIIB受体具有极高的亲和性，使得所获得的分子在功能上与Noggin无关，甚至在高浓度的Noggin存在下结合BMP受体。因此，在某些实施方案中，本发明包括dBMP，其合并了一个或多个C末端突变点突变和/或“交换”，如BMP-GE27-NR(SEQ ID NO.9)、BMP-GE46-NR(SEQ SEQ ID NO:11)、BMP-GER46-NR(SEQ ID NO:13)或BMP-GE47-NR(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，突变改进与I型受体的结合。在其他实施方案中，突变改进与II型受体的结合。在其他实施方案中，突变减少与I型或II型受体的结合。在一些实施方案中，如下文更全面地阐述的，突变产生或破坏聚糖系链。在一些实施方案中，如以下更全面地阐述的，突变产生或破坏His门止动器。

因为BMP在本领域中被如此良好的表征和理解，所以应理解，一旦提供本文所提供的公开内容，将理解可以进行不会进一步影响经设计的BMP的活性的可能突变的位置。因此，本发明的经设计的BMP包括变体BMP，该变体BMP与相应的野生型或经设计的BMP的不同在于其包含不影响变体BMP的受体结合亲和性的另外的插入、缺失或取代。在一些非限制性实施方案中，本领域技术人员会理解参与半胱氨酸结形成的半胱氨酸和参与受体相互作用的氨基酸不应突变或应该以保守取代来改变，而其他氨基酸可以更自由地被取代、插入或缺失，而未不利地影响经设计的BMP的生物活性。

应当注意，除非另有说明，经设计的或修饰的BMP的所有位置编号均基于成熟天然BMP的序列。经设计的BMP的特征在于预先确定的有变化的性质，使得它们与BMP序列的天然存在的等位基因或种间变异相区分的特征。经设计的BMP的变体必须保留在一种或多种细胞类型中相应野生型或经设计的BMP活性的至少50％的活性，如使用下述适当的检测所确定的。保留至少75％、80％、85％、90％或95％的野生型活性的变体是更优选的，并且比野生型更有活性的变体是特别优选的。经设计的BMP可以在N-末端，C-末端或内部含有插入、缺失和/或取代。在优选的实施方案中，经设计或修饰的BMP具有至少1个与最相似的人BMP序列不同的残基，具有至少2、3、4、5、6、8、7、9、10个或更多个不同的残基是更优选的。

本发明的经设计的BMP维持与相应的野生型BMP蛋白序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。

本发明的经设计的BMP可以维持与相应的野生型BMP蛋白序列的C末端区域的保守半胱氨酸结构域至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。

经设计的BMP可以包含进一步的修饰，例如改变另外的蛋白性质如稳定性或免疫原性的突变，或者实现或阻止翻译后修饰如聚乙二醇化或糖基化的突变。经设计的BMP可以经受共翻译修饰或翻译后修饰，包括但不限于一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、环状排列、环化、与蛋白或蛋白结构域融合以及加入肽标签(tag)或标记(label)。

由于遗传密码的简并性，可以通过不改变经设计的BMP的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制备极大数量的核酸，所有这些核酸均编码本发明的经设计的BMP。本发明经设计的BMP的氨基酸序列不包括在WO2008/051526或WO2009/086131中阐述的这些序列。

如上所述，BMP天然表达为前蛋白，其包含长的前结构域(pro-domain)、一个或多个切割位点和成熟结构域。然后通过细胞机制加工该前蛋白以产生二聚体成熟BMP分子。在优选实施方案中，本发明的经设计的BMP以类似的方式生产。前结构域被认为有助于BMP的正确折叠和加工。此外，在一些但不是全部的BMP中，前结构域可以与成熟结构域非共价结合并且可以作为分子伴侣以及抑制剂(例如，Thies等人(2001)Growth Factors，18：251-295)。优选地，本发明的修饰的BMP以这种形式产生和/或在治疗上给予。可选地，BMP可以以其他形式生产，包括但不限于，其中成熟结构域直接产生或由包涵体重折叠，或包含全长完整的前蛋白。本发明的经设计的BMP将用于这些和其他形式。

在特定实施方案中，本发明的经设计的BMP包含骨架BMP，即经设计的BMP对应的野生型BMP。在特定实施方案中，该骨架BMP可以是野生型BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8或BMP9骨架。

在本发明的一些实施方案中，经设计的BMP在I型结合结构域和/或II型结合结构域中包含至少一个突变，其中与相应的不包含突变的野生型BMP的结合相比，突变赋予与I型或II型BMP受体改变的结合。在一些实施方案中，经设计的BMP在两个I型结合结构域中包含至少一个突变和在II型结合结构域中包含至少一个突变。在其他实施方案中，经设计的BMP在II型结合结构域A和II型结合结构域B中包含至少一个突变。在其他实施方案中，经设计的BMP在II型结合域A、II型结合结构域B和I型结合结构域中包含至少一个突变。

在某些实施方案中，突变可以包含氨基或核酸取代、缺失和/或插入。在优选的实施方案中，突变包括氨基酸取代。

在一些实施方案中，骨架BMP是野生型BMP，并且突变是表4至6中列出的一个或多个突变。经设计的BMP可以包含这些表中列出的任何组合和任何数目的突变。

在一些实施方案中，骨架BMP是野生型BMP，并且突变是表4至6中列出的一个或多个突变。经设计的BMP可以包含这些表中列出的或在本文其他地方公开的突变的排列和任何和所有突变。

表4

表5

表6

在一些实施方案中，突变改进与I型受体的结合。在其他实施方案中，改进与II型受体的结合。在其他实施方案中，突变减少与I型或II型受体的结合。

上述表4-6提供本发明的示例突变的非限制性的汇编，其中突变的位置相对于相应的野生型BMP氨基酸序列提供。因此，在一些实施方案中，经设计的BMP包含以下优选的突变组合：

经设计的BMP的示例性氨基酸序列在下表7中示出。表7显示所设计的分子的名称和序列。

表7

虽然以上所列的经设计的BMP包括本发明的实施方案，但是本发明不以任何方式局限于任何具体的分子。相反地，本发明包括包含改变的受体结合的任何经设计的BMP，其中经设计的BMP在II型受体结合结构域A内包含至少一个突变，甚至更优选地，经设计的BMP在I型受体结合结构域内包含至少一个另外的突变，最优选地，经设计的BMP在II型受体结合结构域B内还包含另一个至少一个另外的突变。

在其他实施方案中，本发明的经设计的BMP包含上述序列之一的至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或与之相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，经设计的BMP包含SEQ ID NO:8-15的序列的至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或与之相同的氨基酸序列。

还在另一实施方案中，经设计的BMP包含如SEQ ID NO:8-15中任一个所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，经设计的BMP的氨基酸序列由SEQ ID NO:8-15的序列之一组成。

进一步地，在一个实施方案中，经设计的BMP包含SEQ ID NO:8-15的序列之一的至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或与之相同的氨基酸序列。

本发明的经设计的BMP可以包含上述任一序列的片段。在实施方案中，经设计的BMP片段可以包含来自SEQ ID NO:8-15任一序列的不间断的至少20、22、24、25、26、27、28、30、32、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、47、50、53、54、56、58、60、62、66、68、70、71、74、77、80、83、85、88、90、91、93、95、97、99、100、102、105、108、110、112、115、117、119、120、121、122或125个氨基酸序列的片段。

在本领域中熟知的是，就蛋白的氨基和/或羧基末端而言，BMP通常是异质的(heterogeneous)。也就是说，本发明包含在氨基和/或羧基末端包含氨基酸缺失/截短的经设计的BMP，其包含经设计的BMP的C和/或N末端至少10个氨基酸残基、优选9个氨基酸残基、甚至更优选8个氨基酸残基、还更优选7个氨基酸残基、优选6个氨基酸残基、甚至更优选5个氨基酸残基、优选4个氨基酸残基、更优选3个氨基酸残基、甚至更优选2个氨基酸残基、最优选1个氨基酸的缺失。

在另一实施方案中，本发明包括经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:8-15中任一序列的氨基酸序列，并且还包含蛋白的氨基和/或羧基末端的缺失/截短。在另一实施方案中，本发明包含衍生自包含SEQ ID NO:8-15中任一序列的氨基酸序列的BMP蛋白的经设计的BMP蛋白，其中蛋白包含在氨基和/或羧基末端的氨基酸缺失/截短，其包含经设计的BMP的C和/或N末端至少10个氨基酸残基、优选9个氨基酸残基、甚至更优选8个氨基酸残基、还更优选7个氨基酸残基、优选6个氨基酸残基、甚至更优选5个氨基酸残基、优选4个氨基酸残基、更优选3个氨基酸残基、甚至更优选2个氨基酸残基、最优选1个氨基酸的缺失。

具有由糖基化介导的改变的受体亲和性的BMP的结构设计

本发明人之前已经发现，如在Berasi等人的文章中所解释的，在大肠杆菌中产生的未糖基化的BMP2同二聚体(本文中称为“大肠杆菌BMP2”)相较于在哺乳动物细胞，例如CHO细胞中产生的糖基化BMP2(本文称为“CHO BMP2”)活性较低。本发明人还发现与哺乳动物细胞培养物中产生的BMP6同二聚体相比，大肠杆菌产生的BMP6同二聚体基本上是无功能的。这些发现表明，大肠杆菌BMP2和CHO BMP2的I型受体结合区域的晶体结构之间存在显著差异。

本发明人以前也发现(并且在Berasi等人的文章中公开)，在哺乳动物(例如CHO)细胞产生的野生型BMP2中，D53指向受体界面，而H54的指向远离受体。这与大肠杆菌产生的BMP2相反，其中D53残基的指向远离受体界面，并且H54残基朝向受体排列，如在图3中所示靠着脯氨酸的“堆叠”，显然充当“门止动器”。Berasi等人的文章首次进一步证明，CHO产生的完全糖基化和活性的BMP6还包含指向到来的受体(incoming receptor)的组氨酸残基，即组氨酸“门止动器”。

不希望被任何特定理论约束，本发明人的发现，如在Berasi等人的文章中阐述的，首次提出将“门止动器”残基从受体界面移除可以介导BMP配体及其受体之间的结合增加。数据进一步证明门止动器残基可以自身突变以移除门止动器，或者可以突变其他残基以移动门止动器残基的位置。在Berasi等人的文章中所公开的数据进一步证明可以突变其他残基以提供“聚糖系链(glycan tether)”，其然后进而可以定向(orient)多糖，使得聚糖的系链将重新定向该门止动器残基。

本发明强化了Berasi等人的文章中的结果，其在一些实施方案中包括通过并入影响聚糖系链的至少一个氨基酸突变和/或移除组氨酸门止动器结构而产生经设计的BMP，从而提供具有改变的受体结合的经设计的BMP。

总之，在一些实施方案中，本发明的经设计的BMP可以在BMP的I型和/或II型结合结构域中包含至少一个突变，该突变赋予改变的I型和/或II型受体结合。在一个实施方案中，为了改变和改进工程化的或“经设计的”BMP的受体结合和/或成骨活性，将BMP序列工程化以改变BMP的受体亲和性。在一个实施方案中，此工程化涉及识别在I型和II型受体结合中所涉及的残基并取代它们，以构建经设计的BMP分子，除了别的之外，其显示与设计物所来源的亲本BMP相比，对I型和II型受体两者更高的亲和性。

在其他实施方案中，本发明的经设计的BMP包含产生新的精氨酸“聚糖系链”或破坏现有的一个以重塑I型受体结合结构域的突变。也就是说，在从第一个半胱氨酸起C末端的两个残基的位置处的精氨酸(相当于BMP2的R16)的突变似乎导致聚糖链被“栓”到BMP表面上，并因此与缺乏突变的野生型BMP相比改变了前螺旋环区域的构象。在其他实施方案中，本发明的经设计的BMP可以包含至少一个突变，该突变改变、构建或破坏(废除)阻止I型受体进一步与BMP接合的“门止动器”残基。也就是说，经设计的BMP中的H54或其相应的等同残基的突变以这样的方式定向，即它阻碍或增加经设计的BMP与I型受体的相互作用。

在一些实施方案中，氨基酸突变影响经设计的BMP的构象，使得突变介导否则存在于相应野生型BMP中的精氨酸“聚糖系链”的产生和/或废除。在一些实施方案中，突变介导改变的构象，其在经设计的BMP中产生或移除/废除组氨酸门止动器构象，其中这种门止动器构象在相应的野生型BMP中分别不存在或活跃。

因此，一旦拥有本文提供的和在Berasi等人的文章中的教导，技术人员将会意识到，在TGFβ超家族成员中精氨酸“聚糖系链”和/或组氨酸“门止动器”的存在或不存在可以使用本领域已知的用于蛋白结构分析的任何方法进行评估，包括但不限于本文示例的方法。一旦已经鉴定了“门止动器”残基的存在，则可以将至少一个突变引入分子中以使组氨酸远离受体结合界面重新定向。可选地，可以引入产生或增强“聚糖系链”的突变，使得组氨酸“门止动器”的抑制作用(如果存在的话)降低或更优选地消除。

在一个实施方案中，当TGFβ超家族成员是BMP2时，移除组氨酸门止动器的突变是另一氨基酸取代H54。在一些实施方案中，H54被丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。

虽然本发明公开了针对BMP2的这种“门止动器”移除突变，但是技术人员将基于本领域的知识理解如何识别其他TGFβ超家族成员的相应突变，并且容易地产生缺少“门止动器”的突变体，即通过面向或突出到结合界面中移除或重新定向残基，否则所述残基会干扰受体结合。突变对蛋白构象的影响可以使用任何本领域公认的蛋白结构分析方法来确定，例如但不限于本文所公开的那些。可选地，可以使用本领域中可获得的计算机建模方法在电脑中识别可以移除门止动器并增加配体与I型受体的结合的突变。因此，本发明包含具有改进的与I型受体的结合的TGFβ超家族成员的设计，因为它们缺少否则存在于受体界面中的组氨酸“门止动器”残基。

本发明进一步向技术人员提供了对如何识别将产生或破坏精氨酸聚糖系链的其他TGFβ家族成员的突变的理解。本发明考虑了将精氨酸聚糖系链添加到缺少系链的蛋白的突变。因此，本发明包括具有改进的与I型受体结合的TGFβ超家族成员的设计，因为它们含有改变I型受体结合结构域构象的精氨酸聚糖系链。

在一些实施方案中，移除组氨酸门止动器从而消除对聚糖系链的需求，提供了可以在无糖基化的情况下产生但维持生物活性的经设计的BMP。例如，经设计的BMP可以在不同于哺乳动物细胞的具有糖基化活性的或不存在糖基化活性的细胞中产生，例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或粘菌细胞。在特定实施方案中，经设计的BMP可以在大肠杆菌中产生并维持生物活性。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于设计和产生可以在缺乏糖基化或包含改变的糖基化的细胞中产生BMP的方法，使得与哺乳动物细胞产生的聚糖不同的改变的聚糖产生。也就是说，本发明包括引入突变的方法，该突变移除否则损害或抑制受体结合的门止动器残基。技术人员将理解，一旦提供本发明的教导，可以突变对受体-配体界面有影响的门止动器残基以完全移除残基，或者可以引入其他突变，使得残基远离界面定向。这样的其他突变包括但不限于提供将改变聚糖构象的聚糖系链，并从而改变配体的构象，使得门止动器残基远离结合界面定向。

编码经设计的BMP的核酸

本发明还包括编码本文所述的经设计的BMP的核酸。编码本文所述的经设计的BMP的核酸可以根据本领域已知许多方法中的任何一种或多种合适的手段制备。

其中，编码经设计的BMP的核酸通过全基因合成或通过编码野生型或修饰的BMP的核酸的定点诱变来制备。可以使用包括模板定向连接、递归PCR、盒式诱变、定点诱变或其他本领域熟知的技术的方法(参见例如Strizhov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15012-15017(1996)；Prodromou和Perl，Prot.Eng.5：827-829(1992)；Jayaraman和Puccini，Biotechniques 12：392-398(1992)；和Chalmers等人，Biotechniques 30：249-252(2001))。

因此，本发明的实施方案可以包含编码本发明的经设计的BMP的核酸分子。在某些实施方案中，本发明提供了编码SEQ ID NO:8-15的氨基酸序列之一的核酸分子。

在其他实施方案中，核酸分子编码经设计的BMP蛋白，其包含与SEQ ID NO:8-15的氨基酸序列之一至少70％、75％、80％、85％、87％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列。

产生经设计的BMP的方法

BMP天然表达为前蛋白，其包含长的前结构域、一个或多个切割位点和成熟结构域。然后通过细胞机制加工该前蛋白以产生典型的二聚体成熟的BMP分子。在一些实施方案中，经设计的BMP以类似的方式生产。前结构域被认为在BMP的折叠和加工中起作用。此外，在一些BMP中，前结构域可以非共价结合成熟蛋白，并且充当溶解增强剂、伴侣或抑制剂。在一些实施方案中，BMP可以生成为成熟蛋白，该成熟蛋白直接由包涵体产生或重折叠。在其他实施方案中，BMP经由化学合成法或用于蛋白产生的任何其他已知的方法产生。

例如，在一些情况下，编码经设计的BMP的核酸通过全基因合成，或通过编码野生型、经设计的或变体BMP的核酸的定点诱变来制备。方法包括模板定向连接、PCR、盒式诱变、定点诱变、限制性内切酶消化和连接、或本领域熟知的其他技术(参见例如Prodromou等人，Protein Eng 5：827-9(1992)；Jayaraman等人，Biotechniques 12：392-8(1992)；Chalmers等人，Biotechniques 30：249-52(2001)；和Sambrook和Russell，In：Molecular Cloning，ALaboratory Approach，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(2001))。

在一些实施方案中，制备包含编码经设计的BMP的基因的表达载体。多种类型的合适的表达载体和用于各种宿主细胞的合适的调节序列是本领域已知的。表达载体可以包含转录和翻译调节序列，包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录终止子信号、聚腺苷酸化信号和增强子或激活子序列。在一些实施方案中，调节序列包括启动子和转录起始和终止序列。此外，表达载体可以包含另外的元件，例如两种复制系统以使其保持在两种生物体中。表达载体可以是染色体外载体或整合到宿主细胞的基因组中的载体。在一些实施方案中，表达载体含有至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，以促进整合到基因组中。用于整合载体的构建体是本领域熟知的。在一些实施方案中，表达载体包含可选择的标记基因以实现稳定转化的宿主细胞的选择。选择标记基因是本领域熟知的，并且将随所用的宿主细胞而变化。

表达载体可以包括分泌前导序列或信号肽序列，其提供经设计的BMP从宿主细胞的分泌。合适的分泌前导序列和信号肽是本领域已知的。

编码经设计的BMP的核酸可单独或与表达载体组合引入宿主细胞，使得经设计的BMP由核酸表达。引入方法主要由宿主细胞类型决定。转染/转化的示例性方法包括磷酸钙(CaPO₄)沉淀、脂质体融合、电穿孔、病毒感染、葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、直接显微注射和本领域已知的其他方法。编码经设计的BMP的核酸可以稳定整合到宿主细胞基因组中，或者可以在细胞质中瞬时或稳定存在。

用于表达经设计的BMP的合适的宿主细胞包括适于表达野生型或天然BMP的任何细胞，包括但不限于酵母、细菌、古细菌、真菌、昆虫和动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或大肠杆菌(Escheria coli)。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如293(例如293-T和293-EBNA)、BHK、CHO(例如CHOK1和DG44)、COS、Jurkat、NIH3T3或C2C12细胞。其他合适的细胞可以在ATCC目录中找到。经设计的BMP可以在更复杂的生物体中产生，包括但不限于植物和动物。在一个实施方案中，细胞可另外地进行遗传工程改造，即含有除包含经设计的BMP核酸的表达载体以外的外源核酸。

在一些实施方案中，通过以下产生经设计的BMP：在适当条件下培养使用包含编码经设计的BMP的核酸的表达载体转化的宿主细胞，以诱导或引起经设计的BMP的表达。适于经设计的BMP表达的条件是已知适合于表达天然或野生型BMP的相同条件。这些条件将随着表达载体和宿主细胞的选择而变化，并且可以由本领域技术人员通过常规实验容易地确定。

在一些实施方案中，经设计的BMP可以在表达后纯化或分离。标准纯化方法包括电泳、分子、免疫学和色谱技术，包括离子交换、疏水、亲和和反相HPLC色谱、以及色谱聚焦。合适的纯化技术的一般指导可见于Scopes，In：Protein Purification，Springer-Verlag，NY，第三版(1994)。必需的纯化程度将根据所需的用途而变化，并且在一些情况下纯化不是必需的。

由细菌细胞的纯化可能导致BMP在包涵体中表达和随后的在CHAPS/高盐系统中的重折叠步骤。由哺乳动物细胞纯化可能涉及经由Cellufine-硫酸盐和反相色谱柱的两步纯化。

在一些实施方案中，经设计的BMP可以共价或非共价修饰。可以通过使蛋白的目标氨基酸残基与能够与所选择的侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂反应，将共价修饰引入蛋白。可以使用各种标准来选择用于修饰的最佳位点，包括但不限于目视检查、结构分析、序列分析和分子模拟。

在一些实施方案中，经设计的BMP可以用至少一种元素、同位素或化合物标记。标记可以是同位素标记，例如放射性或重同位素。在一些实施方案中，标记可以是免疫标记，例如抗体或抗原。在一些实施方案中，标记可以是有色或荧光标记，例如荧光素。在一些实施方案中，标记可以是生物素、标签(例如，FLAG、Myc、His)。

经设计的BMP可以用双功能试剂衍生化，以将经设计的BMP交联到支持基质或表面，用于纯化与蛋白结合的抗体或蛋白，或用以在筛选检测中检测结合。通常使用的交联剂包括但不限于1,1-双(重氮乙酰基(diazoacetyl))-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如具有4-叠氮基水杨酸的酯，同双官能的亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，双功能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷。其他修饰包括谷氨酰胺基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸(praline)和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and MolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。这种衍生化可以改进溶解性、吸收、通过血脑屏障、血清半衰期等。经设计的BMP的修饰可以供选择地消除或减弱蛋白的任何可能的不期望的副作用。能够介导这种效果的部分例如在Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，MackPublishing Co.，Easton，PA(1980)中公开。

另一种类型的经设计的BMP的共价修饰包括将蛋白与各种非蛋白聚合物之一连接，例如，聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇或聚氧化烯，以在第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号或第4,179,337号美国专利中阐述的方式进行。可以使用各种偶联化学来实现PEG连接，如本领域熟知的那样。

在另一个实施方案中，经设计的BMP包括通过CovX-体(CovX-body)连接子将蛋白连接到CovX-体抗体，例如但不限于在第5,733,757号美国专利和第US2009/0098130号美国公开专利申请中所述的CovX-体。这样的CovX-体可以表现出改进的特性，包括但不限于改进的稳定性和延长的血清半衰期。

检测经设计的BMP受体结合活性的方法

可以使用用于评估野生型BMP的活性的任何方法来评估经设计的BMP的受体结合活性。

经设计的BMP对一种或多种BMP受体的亲和性可以通过受体结合检测来确定。例如，可以确定对ALK-2、ALK-3、ALK-6、ActRII、ActRIIb或BMPRII的亲和性。合适的结合检测包括但不限于ELISA、荧光各向异性(fluorescence anisotropy)和强度、闪烁迫近检测法(scintillation proximity assays，SPA)、Biacore(Pearce等人，Biochemistry 38:81-89(1999))、DELFIA检测和AlphaScreen ^TM(可从PerkinElmer商购；Bosse R.，Illy C和Chelsky D(2002))。

在一些实施方案中，使用Biacore或表面等离子体共振检测。参见，例如，McDonnell，Curr.Opin.Chem.Biol.5：572-577(2001)。以前已经使用Biacore实验来表征TGF-β同种型与其受体的结合(De Crescenzo等人，J.Biol.Chem.，276：29632-29643(2001)；De Crescenzo等人，J.Mol.Biol.328：173-183)(2003)。

在其他实施方案中，使用基于板的直接结合检测来确定一种或多种修饰的BMP对一种或多种BMP受体的亲和性。该方法是改良的夹心ELISA，其中使用抗BMP单克隆抗体捕获BMP，然后使用BMP受体-Fc融合蛋白检测。

在其他实施方案中，AlphaScreen ^TM检测(Bosse R.等人，Principles ofAlphaScreen^TM，PerkinElmer Literature Application Note Ref # 4069，http://lifesciences.perkinelmer.com/Notes/S4069-0802.pdf(2002))可用于表征受体和抑制剂结合。荧光检测也可用于表征受体和抑制剂结合。例如，BMP2或BMP2受体或抑制剂可以用荧光染料标记(例如合适的染料，参见Molecular Probes目录)。另外地，闪烁迫近检测法(SPA)可用于确定受体结合亲和性。例如，BMP受体-Fc融合蛋白可以结合蛋白A包被的SPA珠或闪光板并用S35标记的BMP进行处理；结合事件导致光的产生。

在特定实施方案中，可以通过使用人IgG-Fc与受体细胞外结构域融合来确定具体的BMP突变体对I型或II型受体的K_D。可以使用抗人IgGg-Fc传感器将受体结合到八隅体(Octet)传感器，并且BMP可以结合溶液中的受体细胞外结构域以确定Kon和Koff率。八隅体(Octet)系统利用专有的BioLayer干涉测量法(BLI)实现对生物分子相互作用的实时、无标记分析，并提供关于亲和性、动力学和浓度的信息。当蛋白结合八隅体(octet)传感器时，通过传感器的光具有可以用分光光度计测量的波长偏移。当分析物结合传感器和当其失去结合时，测量偏移率。

检测经设计的BMP的成骨活性的方法

可以使用用于评估野生型BMP的活性的任何方法来评估经设计的BMP的成骨活性。

BMP促进许多类型的细胞的生长和分化。可以使用例如用于碱性磷酸酶的发光报告物或比色试剂如阿尔新蓝(Alcian Blue)或PNPP来监测分化(Asahina等人，(1996)Exp.Cell Res，222：38-47；Inada等人，(1996)Biochem.Biophvs.Res.Commun.222：317-322；Jortikka等人(1998)Life ScL 62：2359-2368；Cheng等人，(2003)J.Bone JointSurgery 95A：1544-1552)。

大鼠肢芽软骨分化检测也可用于监测原代细胞中的活性。在可选的实施方案中，可以使用报道基因或激酶检测。由于BMP激活JAK-STAT信号转导途径，所以可以使用含有STAT-反应性报告物如GFP或荧光素酶的BMP响应性细胞系(Kusanagi等人(2000)MolBiol.Cell，11：555-565)。例如，可以使用基于细胞的检测来确定肾细胞中的BMP活性；参见例如Wang和Hirschberg(2004)J.Biol.Chem，279：23200-23206。

成骨活性可以在基于细胞的检测，例如碱性磷酸酶、BRE-荧光素酶或茜素红(Alizarinred)矿化中测定，所有这些均在Isaacs等人，Mol.Endocrinol.24：1469-1477(2010)中描述。

也可以经由大鼠异位骨检测或哺乳动物骨生长模型在体内测定成骨活性。在一些实施方案中，在非人灵长类动物模型中测定成骨活性。这些模型在Isaacs等人，Mol.Endocrinol.24：1469-1477(2010)中描述。

用于评价骨量和骨质量的方法是本领域已知的，且包括但不限于X射线衍射；DXA；DEQCT；pQCT，化学分析，密度分离法，组织光度测定法(hisfophofometry)，组织形态测定法和组织化学分析，例如在Lane等人，J.Bone Min.RES.18：2105-21 15(2003)中所述的。用于确定皮质骨密度的一种检测法是MicroCT检测法(MicroCT assay)。在进行pQCT测定之后，可以例如使用Scanco mCT40(Scanco Medical AG)在股骨上进行microCT评估。

用于评估骨生长/密度/强度的任何已知或以后开发的体外或体内方法可用于评估本发明的经设计的BMP的成骨活性。

药物组合物

可以配制本发明的经设计的BMP，以作为药物组合物的一部分用于给予哺乳动物，优选有其需要的人。组合物可以通过任何合适的方式给药，例如肠胃外、口服或局部。当经设计的BMP将局部给药，例如通过注射至期望的组织部位，或全身给药，如通过静脉内、皮下、肌内、眶内、眼内、脑室内、颅内、囊内(intracapsular)、脊柱内、脑池内、腹膜内、口腔、直肠、阴道、鼻内或气雾剂给药，组合物优选包含水溶液。溶液优选在生理上是可接受的，使得将其给予哺乳动物不会不利地影响哺乳动物的正常电解质和流体体积平衡。因此，水溶液可以包含例如正常生理盐水(0.9％的NaCl，0.15M)，pH 7-7.4。

用于口服或肠胃外全身给药的有用的溶液可以通过制药领域熟知的任何方法制备，例如在“Remington's Pharmaceutical Sciences”(Gennaro，A.，编著，Mack Pub.，1990，其公开内容通过引用并入本文)所述。制剂可以包含例如聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等。用于直接给药的制剂尤其可以包含甘油和其他高粘性的组合物。

生物相容的，优选生物可再吸收的聚合物包括例如透明质酸、胶原、磷酸三钙、聚丁酸酯、聚丙交酯、聚乙交酯和丙交酯/乙交酯共聚物，可以是有用的赋形剂以控制经设计的BMP的体内释放。用于该经设计的BMP的其他可能有用的胃肠外递送系统可以包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。用于吸入给药的制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐或脱氧胆酸盐的水溶液，或以滴鼻剂形式或作为凝胶于鼻内施加的用于给药的油性溶液。

可选地，本发明的经设计的BMP可以口服给药。例如，经设计的BMP的液体制剂可以根据诸如“Remington's Pharmaceutical Sciences”(同上)中所述的那些的标准操作来制备。然后可以将这样的液体制剂加入用于给药的饮料或另一种食品补充剂。也可以使用这些液体制剂的气雾剂来实现口服给药。可选地，使用本领域公认的乳化剂制备的固体制剂可以制成适于口服给药的片剂、胶囊或锭剂。

任选地，经设计的BMP可以配制成包含用于增强蛋白被期望的组织摄取的手段的组合物。例如，已知当四环素和二膦酸盐(双膦酸盐)在哺乳动物中全身提供时，它们结合骨矿物质，特别是在骨重塑区域。因此，这些组分可用于增强本发明经设计的BMP向骨组织的递送。可选地，也可以使用与可进入物质特异性结合的抗体或其部分，该可进入物质与所期望的靶组织例如细胞表面抗原特异性连接。如果需要，这样的特异性靶向分子可以共价结合到该经设计的BMP，例如，通过化学交联或通过使用标准的遗传工程技术来产生例如酸不稳定键，例如Asp-Pro键。有用的靶向分子可以例如根据第5,091,513号美国专利的教导来设计。

还考虑到，当与包括但不限于聚合物基质的载体基质组合时，一些经设计的BMP可以在体内表现出最高水平的活性。参见例如第5,266,683号美国专利，其公开内容通过引用并入本文。目前优选的载体基质本质上是异源的、同种异体的或自体的。然而，考虑了包含聚乳酸、聚乙醇酸、聚丁酸、其衍生物和共聚物的合成材料也可用于产生合适的载体基质。优选的合成和天然衍生的基质材料、其制备方法、其与本发明的经设计的BMP一起配制的方法和给药方法是本领域熟知的，因此在本文中不详细讨论。参见例如，第5,266,683号美国专利。

在某些实施方案中，可以将经设计的BMP单独或与另一已知对组织形态发生具有有益效果的物质组合给予有其需要的哺乳动物。这些物质(本文中，辅因子)的实例包括促进组织修复和再生和/或抑制炎症或纤维化的物质。例如，用于刺激骨质疏松个体中骨组织生长的有用的辅助因子的实例例如包括但不限于维生素D3、降钙素、前列腺素、甲状旁腺激素、地塞米松、雌激素和IGF-I或IGF-II。用于神经组织修复和再生的有用辅因子可以包括神经生长因子。其他有用的辅因子包括减轻症状的辅因子，包括防腐剂、抗生素、抗病毒和抗真菌剂、止痛剂和麻醉剂。

经设计的BMP优选通过与药学上可接受的无毒赋形剂和载体混合而配制成药物组合物。如上所述，这样的组合物可以制备成用于全身，例如，肠胃外给药，特别是以液体溶液或悬浮液的形式；用于口服给药，特别是以片剂或胶囊剂的形式；或鼻内给予，特别是以粉末、滴鼻剂或气雾剂的形式。当期望粘附到组织表面时，组合物可以包含纤维蛋白原-凝血酶分散剂或其他生物粘附剂，例如在PCT US91/09275中公开的，其公开内容通过引用并入本文。然后可以将组合物涂布、喷涂或以其他方式施加到所期望的组织表面。

当给予时，本发明的药物组合物通常以无热原、生理上可接受的形式递送。进一步地，组合物可理想地以粘稠形式被包封或注射，用于递送至骨软骨或组织损伤部位。局部给药可适用于伤口愈合和组织修复。优选地，对于骨和/或软骨形成，组合物包括能够将BMP蛋白递送至骨和/或软骨损伤部位、提供用于发育骨和软骨的结构并且能够最佳地被再吸收到体内的基质。这样的基质可以由目前用于其他植入医疗应用的材料形成。

基质材料的选择基于生物相容性、生物可降解性、机械性能、美学外观和界面性质。经设计的BMP组合物的具体应用将限定适当的配方。用于组合物的潜在基质可以是生物可降解的和化学上确定的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸和聚酐。其他潜在的材料是生物可降解和生物学上良好定义的，如骨或皮肤胶原蛋白。另外的基质由纯蛋白或细胞外基质组分组成。其他潜在的基质是非生物可降解的和化学上确定的，如烧结的羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其他陶瓷。基质可以由任何上述类型的材料的组合组成，例如聚乳酸和羟基磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷的组成，如钙-铝酸盐-磷酸盐可以改变并加工以改变孔大小、粒度、颗粒形状和生物可降解性。

剂量方案将由主治医师考虑改变经设计的BMP蛋白的作用的各种因素来确定。这些因素包括但不限于所期望形成的骨重量的量，骨损伤的部位，受损骨的状况，伤口的大小，受损组织的类型，患者的年龄、性别和饮食，任何感染的严重程度，给药时间和其他临床因素。剂量可以随着重构中所使用的基质的类型而变化。将其他已知的生长因子例如IGF I(胰岛素样生长因子I)加到最终组合物也可以影响剂量。可以通过对骨生长和/或修复的定期评估来监测进展。在许多本领域公认的方法中，评估骨生长或修复的一种方法是通过X射线成像和/或CT扫描。

组合物可以配制成以治疗有效量肠胃外或口服给予人或其他哺乳动物，例如提供合适浓度的经设计的BMP至靶组织持续足够时间以诱导所需效果的量。优选地，本发明组合物减轻或缓和哺乳动物对形态发生相关生物响应的需要，例如对衰老组织(例如骨质减少的骨组织)维持组织特异性功能或恢复组织特异性表型或在组织中抑制或逆转的纤维化反应。

如本领域技术人员将理解的，治疗性组合物中所述的化合物的浓度将取决于许多因素而变化，包括待给予药物的剂量、所使用的化合物的化学特性(例如，疏水性)和给药途径。待给予的药物的优选剂量也可能取决于一些变量，诸如疾病的类型和程度、组织损失或缺陷、特定患者的总体健康状况、所选化合物的相对生物学功效、化合物的制剂、制剂中赋形剂的存在和类型以及给药途径。

一般来说，本发明的化合物可以以含有约0.1-10％w/v化合物的含水生理缓冲液提供，用于胃肠外给药。典型的剂量范围为从每天约10ng/kg至约1g/kg体重；优选的剂量范围为从约0.1mg/kg至100mg/kg体重。

治疗用途

经设计的BMP可用于野生型BMP对其有用的任何适应症或可用于其中可以使用TGFβ超家族成员的任何方法。经设计的BMP能够诱导骨和软骨形态发生的发育级联并诱导或介导Smad信号通路。经设计的BMP诱导更大的骨扩增(bone augmentation)和修复，包括但不限于比相应的野生型BMP产生更大的骨量、骨硬度(bone stiffness)和骨密度。因此，经设计的BMP可用于诱导组织中的骨形成。此外，经设计的BMP可用于在体内在各个部位诱导骨和软骨的增生。例如，经设计的BMP可用于修复关节，例如膝、肘、踝和指。例如，经设计的BMP可以用于患有关节炎或其他软骨退化疾病的患者的软骨再生。另外，经设计的BMP用于治疗由于损伤而在软骨中的撕裂。此外，经设计的BMP可用于诱导患者的骨生长。例如，经设计的BMP用于治疗患有骨折或骨裂、骨质疏松症的患者，或需要脊柱融合或脊柱、椎骨等修复的患者的用途。

在另一实施方案中，本发明包括骨扩增和/或修复的方法。因此，本发明包括将治疗有效量的经设计的BMP给予介导可检测的骨扩增或修复的部位。

在另一实施方案中，本发明包括诱导或增加Smad表达的方法。该方法包括使包含Smad介导的表达途径的细胞与本发明的经设计的BMP接触。

经设计的BMP能够诱导哺乳动物中不同于骨或骨软骨的各种组织的骨形态发生和组织形态发生的发育级联。这种形态发生活性包括诱导祖细胞增殖和分化的能力，以及通过导致骨、软骨、非矿化骨或结缔组织和其他成人组织形成的事件的进展来支持和维持分化表型的能力。

例如，经设计的BMP可以用于治疗以在代谢性骨疾病中预防骨丢失和/或增加骨量。在第5,674,844号美国专利中公开了使用成骨蛋白用于治疗以在代谢性骨疾病中预防骨丢失和/或增加骨量的通用方法，其公开内容通过引用在此并入。还可以给予经设计的BMP来替代或修复损伤部位，例如骨裂，骨折和软骨撕裂处的骨或软骨。本发明的经设计的BMP可用于牙周组织再生。在第5,733,878号美国专利中公开了使用成骨蛋白用于牙周组织再生的通用方法，其公开内容通过引用在此并入。

经设计的BMP可用于肝脏再生。在第5,849,686号美国专利中公开了使用成骨蛋白用于肝再生的通用方法，其公开内容通过引用在此并入。经设计的BMP可用于治疗慢性肾功能衰竭。在第6,861,404号美国专利中公开了使用成骨蛋白治疗慢性肾衰竭的通用方法，其公开内容通过引用在此并入。经设计的BMP可用于增强中枢神经系统缺血或创伤后的功能恢复。在第6,407,060号美国专利中公开了使用成骨蛋白增强中枢神经系统缺血或创伤后的功能恢复的通用方法，其公开内容通过引用在此并入。

经设计的BMP可用于诱导树突生长。在第6,949,505号美国专利中公开了使用成骨蛋白诱导树突生长的通用方法，其公开内容通过引用在此并入。

经设计的BMP可用于诱导神经细胞粘附。在第6,800,603号美国专利中公开了使用成骨蛋白诱导神经细胞粘附的通用方法，其公开内容通过引用在此并入。

经设计的BMP可用于治疗和预防帕金森病。在第6,506,729号美国专利中公开了使用成骨蛋白治疗和预防帕金森病的通用方法，其公开内容通过引用在此并入。

使用本发明的修饰的BMP以改变用于上述各种治疗性用途的通用方法在普通技术人员的技能范围内。以下进一步描述本发明的修饰的BMP的治疗应用的示例性实施方案。

经设计的BMP可用于修复患病或受损的哺乳动物组织。优选评估待修复的组织，并且根据需要通过手术、化学、切除或医学领域已知的其他方法移除多余的坏死的或干扰的瘢痕组织。然后可以将经设计的BMP作为无菌、生物相容性组合物的一部分，通过手术植入或注射直接提供给组织位点(tissue locus)。供选择地，可以向组织位点提供含有修饰的BMP刺激的祖细胞的无菌、生物相容性组合物。无论患病或受损，在该位点的现存组织都提供合适的基质以实现祖细胞的增殖和组织特异性分化。此外，受损或患病的组织位点，特别是经外科手段进一步破坏的组织位点，提供形态学上允许的环境。对于一些组织，可以设想，修饰的BMP的全系统供应将是足够的。

经设计的BMP可用于预防或基本上抑制损伤后的瘢痕组织形成。如果将经设计的BMP提供给新受伤的组织位点，则可以在该位点处诱导组织形态发生，从而阻止迁移到非分化的结缔组织中的成纤维细胞的聚集。优选提供作为在损伤的5小时内注射到组织位点中的无菌药物制剂的经设计的BMP。

例如，经设计的BMP可以用于部分肝切除术后基本上受损的肝组织的蛋白诱导的形态发生。对该通用方案的变化可用于其他组织。通用方法涉及切除组织的基本上不再生的部分，并提供修饰的BMP，优选地作为可溶性药物制剂至切除的组织位点，闭合伤口并在将来的日期检查该部位。像骨一样，肝脏在胎后生命期间具有损伤时再生的潜力。

作为另一实例，经设计的BMP也可以用于诱导牙本质生成。到目前为止，牙髓组织对损伤的不可预期的响应是牙科中的基本临床问题。使用标准牙科手术程序，通过立即去除样品牙齿牙髓上方(通过钻孔)的牙釉质和牙本质，可手术暴露牙髓的小区域(例如2mm)，进行牙髓冠组织的部分切断，诱导止血，施用牙髓治疗，并通过标准程序封闭和填充腔体。

本发明的经设计的BMP可用于治疗纤维化。纤维化可以位于身体的各个部位中，并且可以是特定种类的，例如，纤维化可以位于以下：肾脏中，例如在肾小球肾炎、糖尿病肾病、同种异体移植排斥和HIV肾病中观察到的纤维化；在肝脏中，例如，肝硬化和静脉闭塞性疾病；在肺中，例如，特发性纤维化(和自身免疫性纤维化)；在皮肤中，例如，系统性硬化症、瘢痕疙瘩、瘢痕和嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征；在中枢神经系统中，例如，眼内纤维化；在心血管系统中，例如，血管再狭窄；在鼻子中，例如，鼻息肉；在骨或骨髓中；在内分泌器官中；以及在胃肠系统中。

在一个实施方案中，具有BMP7的结合特性的经设计的BMP或其有用的修饰(延长的半衰期，与野生型BMP7相比增加对相同或不同受体结合的亲和性、对BMP7拮抗剂例如但不限于Noggin等的抑制的抗性)可用于治疗、缓解或逆转纤维化。也就是说，如最近在Weiskirchen等人，2009年，Frontiers in Biosci.14：4992-5012中所综述的，TGFβ₁介导导致纤维化增加的级联，包括但不限于上皮-至-间质转化。TGFβ₁的纤维化诱导作用可被BMP7抑制或逆转。还参见Loureiro等人，2010，Nephrol.Dial.Transplant.25:1098-1108。另外，也可以通过给予BMP4来治疗或缓解某些纤维化病症(参见Pegorier等人，2010，Resp.Res.11：85)。因此，本发明包括基于BMP7框架和/或引入本文其他地方公开的I型和II型突变体的经设计的BMP，以改变受体结合以及提供用于治疗有其需要的患者的纤维化的潜在有用的治疗剂。

纤维化疾病可以由许多原因引起，包括：化学疗法，例如，由博来霉素(bleomycin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophsphamide)、氨甲蝶呤(methotrexate)、氮芥(mustine)或丙卡巴肼(procarbazine)治疗引起的肺纤维化；放射治疗中意外或有目的的辐射暴露，例如辐射引起的间质性肺病(ILD)；环境或工业因素或污染物如化学物质、烟雾、金属、蒸气、气体等，例如由石棉或煤尘引起的ILD；药物或药物的组合，例如，抗生素(如青霉素、磺胺类等)、心血管药物(如肼屈嗪(hydralazine)、β受体阻滞剂等)、CNS药物(苯妥英(phenytoin)、氯丙嗪(chlorpromazine)等)；抗炎药物(例如金盐、苯基丁氮酮等)等可引起ILD；免疫反应障碍，例如，具有真皮纤维化的慢性移植物抗宿主病；例如作为ILD的已知原因的吸入性肺炎的疾病状态，和寄生虫诱导的纤维化；和伤口，如钝伤、手术切口、战场伤口等，如在CNS的穿刺伤中。

在特定实施方案中，具有改进的与I型受体ALK2，例如BMPE结合的经设计的BMP可用于治疗与ALK2相关的疾病。

试剂盒

本发明包括各种试剂盒，其包含治疗有效量的本发明的经设计的BMP，以及施用器和描述使用经设计的BMP来进行本发明的方法的说明材料。尽管下面描述了示例性试剂盒，但是根据本发明，其他有用的试剂盒的内容对于技术人员是显而易见的。这些试剂盒中的每一个都包括在本发明内。

本发明包括用于治疗的试剂盒，以在有其需要的患者的代谢性骨疾病中预防骨丢失和/或增加骨量。该试剂盒包括本发明的经设计的BMP。该试剂盒还包括施加器，包括但不限于注射器、骨水泥混合装置等，用于将试剂盒的组分给予患者。进一步地，该试剂盒包括阐明试剂盒用于在患者中治疗或预防骨量和/或增加骨量的用途的相关信息的说明材料。

更优选地，试剂盒包含至少一种经设计的BMP，其选自具有选自SEQ ID NO:8-15的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体，即经设计的BMP包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

试剂盒可以包含任何数量的用于治疗以防止骨丢失和/或增加骨量的另外的治疗剂。此类试剂如前所述，并且除了许多其他的之外，包括治疗化合物、细胞因子、维生素、TGFβ超家族的其他成员。

本发明还涉及制品(例如，适于静脉内或口服给药的剂型)，其以有效预防骨丢失和/或增加骨量的量(例如，超过10mg/kg、至少15mg/kg、或15mg/kg)包括经设计的BMP。在某些实施方案中，制品包括容器或多个容器，所述容器包含经设计的BMP和标签和/或用于治疗或预防骨丢失和/或增加骨量的用途的说明书。

本发明还包括用于治疗或预防有其需要的患者的组织或器官中的纤维化的试剂盒。试剂盒包含本发明的经设计的BMP。试剂盒还包含施加器，包括但不限于用于递送蛋白的注射器或装置、混合装置等，用于将试剂盒的组分给予患者。进一步地，试剂盒包括阐述试剂盒用于治疗或预防患者的纤维化的用途的相关信息的说明材料。

更优选地，试剂盒包含至少一种经设计的BMP，其选自具有选自SEQ ID NO:8-15的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，即经设计的BMP包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

试剂盒可以包含任何数量的用于治疗以防止骨丢失和/或增加骨量或治疗或预防纤维化的另外的治疗剂。此类试剂如前所述，并且除了许多其他的之外，包括治疗化合物、细胞因子、维生素、TGFβ超家族的其他成员。

本发明还涉及制品(例如，适于静脉内或口服给药的剂型)，其以有效预防骨丢失和/或增加骨量或治疗或预防纤维化的量(例如，超过1mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg或15mg/kg)包括经设计的BMP。在某些实施方案中，制品包括容器或多个容器，该容器包含经设计的BMP和标签和/或用于治疗或预防骨丢失和/或增加骨量或治疗或预防纤维化的用途的说明书。

示例性实施方案的列表：

以下非限制性实施方案是对本发明的各种实施方案的说明：

1.一种经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13、14或15中任一个的氨基酸序列。

2.实施方案1所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

3.实施方案2所述的经设计的BMP蛋白，其中所述至少一个突变不超过10个突变。

4.实施方案1所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

5.实施方案4所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

6.编码实施方案1所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

7.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含实施方案6所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

8.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据实施方案1所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

9.实施方案8所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的经设计的BMP。

10.实施方案8所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的经设计的BMP。

11.一种经设计的BMP蛋白，其包含相对于SEQ ID NO:1的以下突变：V33I、P36E、H39A、H44E、P48A、A52N、D53S、H54Y、L55M、S57A、N68H、S69F、V70I、S72P、K73E、K73后插入T、I74V、A77P、V80A、S85N、M89V、L92F、E94D、N95S、E96S、K97N、V99I。

12.实施方案11所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

13.实施方案11所述的经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

14.实施方案11所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

15.实施方案14所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

16.编码实施方案11所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

17.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含实施方案错误！参考来源未找到所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

18.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据实施方案11所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

19.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的所述经设计的BMP。

20.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的经设计的BMP。

21.一种经设计的BMP蛋白，其包含相对于SEQ ID NO:1的以下突变：V33I、P36E、H39A、H44E、P48A、A52N、D53S、H54Y、L55M、S57A、N68H、S69F、V70I、S72P、K73E、K73后插入T、I74V、A77P、V80A、E83K、S85R、A86P、I87M、L92Y、E94D、N95G、E96Q、K97N、V98I、V99I、L100K、N102D、Y103I、D105N、V107I、G110E、R114S。

22.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

23.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

24.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

25.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

26.编码实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

27.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含实施方案错误！参考来源未找到所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

28.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

29.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的所述经设计的BMP。

30.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的所述经设计的BMP。

31.一种经设计的BMP蛋白，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38K、Q41A、H46D、D48E、P50S、A54N、D55A、L57M、S59A、N70H、S71L、V72P、S74P、S75E、S75后插入Y、I76V、A79P、V82A、S87N、M91V、L94F、E96D、Y97N、D98S、K99N、V101I。

32.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

33.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:10或12之一的氨基酸序列。

34.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

35.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

36.编码实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

37.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含实施方案错误！参考来源未找到所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

38.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

39.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的所述经设计的BMP。

40.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的经设计的BMP。

41.一种经设计的BMP蛋白，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38K、Q41A、H46D、D48E、P50S、A54N、D55A、L57M、S59A、N70H、S71L、V71M、S74P、S75E、S75后插入Y、I76V、A79P、V82A、E85K、S87R、A88P、I89M、L94Y、E96D、Y97G、D98Q、K99N、V100I、V1010I、L102K、N104D、Y105I、E107N、V109I、G112E、R116S。

42.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

43.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

44.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

45.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

46.编码实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

47.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含实施方案错误！参考来源未找到所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

48.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

49.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的所述经设计的BMP。

50.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的所述经设计的BMP。

51.一种经设计的BMP蛋白，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38R、Q41A、H46D、D48E、P50S、A54N、D55A、L57M、S59A、N70H、S71L、V72M、S74P、S75E、在S75后插入Y、I76V、A79P、V82A、E85K、S87R、A88P、I89M、L94Y、E96D、Y97G、D98Q、K99N、V100I、V101I、L102K、N104D、Y105I、E107N、V109I、G112E、R116S。

52.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

53.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

54.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

55.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

56.编码实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

57.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含实施方案错误！参考来源未找到所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

58.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

59.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的所述经设计的BMP。

60.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的所述经设计的BMP。

61.一种经设计的BMP蛋白，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38R、Q41A、H46D、D48E、P50S、A54N、D55A、L57M、S59A、N70H、S71L、V72M、S74P、S75E、在S75后插入Y、I76V、A79P、V82A、E85K、S87R、A88P、I89M、L94Y、E96D、Y97G、D98Q、K99N、V100I、V101I、L102K、N104D、Y105I、E107N、V109I、G112E、R116S。

62.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

63.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

64.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

65.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

66.编码实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

67.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含实施方案错误！参考来源未找到所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

68.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

69.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的所述经设计的BMP。

70.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的所述经设计的BMP。

71.一种经设计的BMP蛋白，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38R、Q41A、H46D、D48E、P50S、A54N、D55A、L57M、S59A、N70H、S71L、V72M、S74P、S75E、在S75后插入Y、I76V、A79P、V82A、E85K、S87R、A88P、I89M、L94Y、E96D、Y97G、D98Q、K99N、V100I、V101I、L102K、N104D、Y105I、E107N、V109I、G112E、R116S。

72.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

73.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

74.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

75.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

76.编码实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

77.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含实施方案错误！参考来源未找到所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

78.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

79.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的所述经设计的BMP。

80.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的所述经设计的BMP。

81.一种经设计的BMP蛋白，其包含相对于SEQ ID NO:2的以下突变：V35I、P38E、Q41A、H46E、D48E、P50A、A54N、D55S、H56Y、L57M、S59A、N70H、S71F、V72I、N73后插入P、S74E、S75T、I76V、A79P、V82A、E85K、S87R、A88P、I89M、L94Y、E96D、Y97G、D98Q、K99N、V100I、V101I、L102K、N104D、Y105I、E107N、V109I、G112E、R116S。

82.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

83.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

84.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

85.实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

86.编码实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

87.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含实施方案错误！参考来源未找到所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

88.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据实施方案错误！参考来源未找到所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

89.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的所述经设计的BMP。

90.实施方案错误！参考来源未找到所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的所述经设计的BMP。

结论

本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用以其全部并入本文。

虽然已经参考具体实施方案公开了本发明，但是显然本领域技术人员可以设计出本发明的其他实施方案和变化，而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在解释为包括所有这样的实施方案和等同变化。

Claims

2.权利要求1所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

3.权利要求2所述的经设计的BMP蛋白，其中所述至少一个突变不超过10个突变。

4.权利要求1所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

5.权利要求4所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的所述结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。

6.一种编码权利要求1所述的经设计的BMP蛋白的核酸。

7.一种产生经设计的BMP蛋白的方法，其包括将包含权利要求6所述的核酸的表达载体引入细胞的步骤。

8.一种治疗患者的方法，其包括使患者与根据权利要求1所述的经设计的BMP蛋白接触的步骤。

9.权利要求8所述的方法，其中治疗患者包括治疗与骨丢失相关的骨疾病，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗骨疾病剂量的所述经设计的BMP。

10.权利要求8所述的方法，其中治疗患者包括治疗纤维化，并且其中所述使患者与经设计的BMP接触的步骤包括给予患者有效治疗纤维化剂量的所述经设计的BMP。

12.权利要求11所述的经设计的BMP蛋白，其还包含至少一个突变，所述突变不在所述经设计的BMP蛋白的I型、IIA型或IIB型结合结构域内。

13.权利要求11所述的经设计的BMP蛋白，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

14.权利要求11所述的经设计的BMP蛋白，其具有不同于相应野生型BMP的结合谱的结合谱。

15.权利要求14所述的经设计的BMP蛋白，其中所述经设计的BMP蛋白的结合谱包括以下至少一种：以不大于约2nM的K_D与ALK2受体结合；以不大于约2nM的K_D与ALK3受体结合；以不大于约1nM的K_D与ALK6受体结合；以不大于约2nM的K_D与ActRIIA受体结合；以不大于约0.5nM的K_D与ActRIIB受体结合；并且以不大于约3.5nM的K_D与BMPRIIA受体结合。