KR102356057B1

KR102356057B1 - Led를 이용한 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법

Info

Publication number: KR102356057B1
Application number: KR1020190108887A
Authority: KR
Inventors: 양재경; 정지영; 하시영
Original assignee: 경상국립대학교산학협력단
Priority date: 2019-09-03
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2022-01-26
Also published as: KR20210027874A

Abstract

본 발명은 본 발명은 LED를 이용한 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법에 관한 것으로, 밀리타리스 동충하초 균사를 배지에 접종하는 접종단계; 및 접종된 배지를 광조건에서 배양하여 배양된 밀리타리스 동충하초 균사체 및 배양액에서 코디세핀을 얻는 단계; 를 포함하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법으로 이루어져 배지 및 광조건에 따라 밀리타리스 동충하초 균사체는 최대 코디세핀 함량을 갖음을 확인하였으며, 반응 표면 분석을 통하여 최적의 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간 조건을 도출하고, 이를 배양조건으로 이용함으로써 밀리타리스 동충하초 균사체로부터 최대 함량의 코디세핀을 효율적으로 수득할 수 있다.

Description

LED를 이용한 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법{Culture method for enhancing cordycepin content of Cordyceps Militaris Mycelium using Light-Emitting Diode}

본 발명은 LED를 이용한 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법에 관한 것이다.

동충하초(冬蟲夏草)는 겨울에는 벌레 여름에는 버섯으로 나온다는 뜻에서 이름이 붙여졌다. 대부분이 곤충병원성진균(entomopathogenic fungi)으로 약 800여종이 알려져 있으며, 기주 곤충에 감염되어 내부에서 균사 생장을 하여 자실체를 생성하는 것이 큰 특징이다. 이러한 동충하초는 아시아(중국, 한국, 일본 등)에서 예전부터 약초로 쓰여 왔다. 그 효능으로는 면역력 증강, 성인병 예방, 천식, 빈혈에 좋은 약재로 사용되어져 왔다.

또한, 동충하초는 작물들 중 단백질 함량이 가장 높은 (건조함량의 28%이상) 군에 속하고, 면역력을 강화시키는 물질이 다량 함유되어 있다. 특히, 동충하초의 면역활성물질 중에는 키닉산(quinic acid)의 이성체로 밝혀진 '코디세핀(Cordycepin :3'-deoxy-adenosine)' 이 포함되어 있다. 코디세핀은 핵산 물질로서 세포의 유전정보에 관여하면서 저하된 면역기능을 활성화하여 정상세포가 암세포로 전환되는 것을 방지하는 작용을 한다. 동충하초를 투입한 임상실험에서 암세포를 죽이는 면역세포인 NK세포(natural killer cell/자연살해세포)와 면역세포에서 분비되는 사이토카인의 함량이 18%~25% 증가되는 것으로 확인되어 코디세핀이 혈액암치료용으로 활용되고, 건강기능식품으로서도 많은 관심을 받고 있다.

이러한 결과를 토대로 국내에서는 코디세핀이 함유된 동충하초가 건강기능식품으로 식약처 인증을 받았으며, 코디세핀의 면역증강활성, 항암활성 외 항바이러스 효과와 항염증 효과 등 다양한 기능 등이 발표되고 있다.

상기와 같은 코디세핀의 기능으로 인해 최근에는 동충하초로부터 코디세핀을 추출하는 연구가 많이 진행되고 있는데, 한국공개특허 제2001-0054264호에 동충하초로부터 분리 추출된 항암제용 코디세핀과 그 제조방법이 개시되어 있으나, 상기 한국공개특허 제2001-0054264호에 개시된 분리방법은 HPLC를 이용한 정제방법이기 때문에 소량으로밖에 활성물질을 분리하지 못해 상업적으로 적당하지 않은 문제점이 있어 왔으며, 현재까지 동충하초의 코디세핀 함량 증대에 적합한 최적 조건에 관한 연구는 미비한 실정이다.

따라서 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대시켜 코디세핀 수득량을 증가시키기 위한 최적 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.

1. 대한민국공개특허 제10-2001-0054264호(2001.07.02.)

본 발명의 목적은 밀리타리스 동충하초의 최대 코디세핀 함량을 위한 최적의 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따른 밀리타리스 동충하초로부터 수득된 코디세핀 조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 밀리타리스 동충하초 균사체의 최대 코디세핀 함량 예측방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀리타리스 동충하초 균사를 배지에 접종하는 접종단계; 및 접종된 배지를 광조건에서 배양하여 배양된 밀리타리스 동충하초 균사체 및 배양액에서 코디세핀을 얻는 단계; 를 포함하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법에 따라 수득된 코디세핀 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 예측하는 방법에 있어서, (a) 박스 벤켄 계획법(Box-Behnken design)으로 광량(X₁), 배지의 글루코스(glucose) 함량(X₂), 배양시간(X₃)에 대하여, -1, 0 및 1로 코드화하여 실험범위를 설계하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 설계된 실험범위로, 상기 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간에 대한 실험값을 얻는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 실험값을 이용하여 하기 수학식 1로 표시되는 이차 회귀식 모델을 도출하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 도출된 수학식 1로 표시되는 이차 회귀식 모델을 변량분석(ANOVA)하여 상기 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 예측하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 예측방법을 제공한다.

[수학식 1]

Y₁=3312.67+1019.78X₁+578.64X₂-297.05X₃+266.00X₁X₂-176.99X₁X₃-93.07X₂X₃-1688.99X₁ ²-263.51X₂ ²-672.94X₃ ²

(상기 수학식 1에서 Y₁은 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량(mg/L), X₁은 광량, X₂는 배지의 글루코스 함량 및 X₃는 배양시간을 의미함.)

본 발명에 따라 밀리타리스 동충하초 균사체는 SDB(Sabouraud dextrose broth) 액체배지에서 파란색 및 적색 혼합 LED 광을 조사하여 배양한 경우 최대 코디세핀 함량을 나타내었으며, 반응 표면 분석을 통하여 최적의 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간 조건을 도출하고, 이를 배양조건으로 이용함으로써 밀리타리스 동충하초 균사체로부터 최대 함량의 코디세핀을 효율적으로 수득할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 배양방법에 따라 수득된 밀리타리스 동충하초 균사체및 배양액에는 면역증강활성, 항암활성, 항바이러스 및 항염증 효과가 뛰어난 코디세핀 함량이 높아 건강기능식품으로도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체를 나타낸 도면이다.
도 2는 밀리타리스 동충하초의 배양과정 및 코디세핀 함량 측정 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 밀리타리스 동충하초의 액체배지 종류에 따른 균사체의 코디세핀 함량을 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 4는 밀리타리스 동충하초의 배양기간에 따른 균사체의 코디세핀 함량을 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 5는 형광등 및 UV-A가 설치된 shaking incubator를 나타낸 도면이다.
도 6은 형광등 및 UV-A 광량 및 on/off 조절을 위한 컨트롤 박스를 나타낸 도면이다.
도 7은 형광등 및 UV-A의 조사에 따른 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 8은 LED 단일광(red, green, blue)이 설치된 shaking incubator를 나타낸 도면이다.
도 9는 LED 단일광 광량 및 on/off 조절을 위한 컨트롤 박스를 나타낸 도면이다.
도 10은 밀리타리스 동충하초의 LED 단일광(red, green, blue)조사에 따른 균사체의 코디세핀 함량 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 11은 LED 단일광의 조사시간에 따른 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 12는 밀리타리스 동충하초의 LED 단일광 및 혼합광 종류에 따른 균사체의 코디세핀 함량 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 13은 밀리타리스 동충하초 균사체에서 혼합광 red*blue의 혼합비율에 따른 코디세핀 함량 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 14는 밀리타리스 동충하초 균사체에서 혼합광 red*blue(5:5)의 조사시간에 따른 균사체 코디세핀 함량 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 15는 밀리타리스 동충하초 균사체 배양 조건과 균사체 코디세핀 함량간의 상관관계를 나타낸 도면이다.
도 16은 LED 제어조건과 밀리타리스 동충하초 균사체 코디세핀 함량간의 fit model을 나타낸 도면이다.
도 17은 밀리타리스 동충하초 균사체의 최대 코디세핀 함량을 위한 최적 LED 제어조건을 나타낸 도면이다.
도 18은 밀리타리스 동충하초 균사체의 최대 코디세핀 함량을 위한 최적 LED 제어조건 반응 모델의 적합도를 나타낸 도면이다.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 SDB(Sabouraud dextrose broth) 액체배지에서 파란색 및 적색 혼합 LED 광을 1일 12시간으로 2 내지 3일 동안 조사하여 배양한 경우, 밀리타리스 동충하초 균사체의 최대 코디세핀 함량을 나타냄을 확인하였으며, 반응 표면 분석을 통하여 최적의 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간 조건을 도출하고, 이를 배양조건으로 이용함으로써 밀리타리스 동충하초 균사체로부터 최대 함량의 코디세핀을 효율적으로 수득할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 밀리타리스 동충하초 균사를 배지에 접종하는 접종단계; 및 접종된 배지를 광조건에서 배양하여 배양된 밀리타리스 동충하초 균사체 및 배양액에서 코디세핀을 얻는 단계; 를 포함하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법을 제공한다.

이때, 상기 배지는 사브로드 덱스트로스 브로스(Sabouraud dextrose broth) 배지일 수 있으며, 상기 배양은 1일 내지 4일 동안 수행하는 것을 특징으로 하나, 바람직하게는 2일 내지 3일일 수 있다.

또한, 상기 배지에는 80 내지 120 mesh 크기의 볏짚을 5 내지 20 g/L 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 80 mesh 크기의 볏짚을 15g/L 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 광조건은 LED 단일광 또는 혼합광을 접종된 배지에 조사하여 균사체를 배양하며, LED 단일광은 400nm 내지 500nm의 파장을 갖는 파란색광이며, LED 혼합광은 400nm 내지 500nm의 파장을 갖는 파란색광과 620nm 내지 780nm의 파장을 갖는 적색광을 혼합한 광인 것을 특징으로 하나, 바람직하게는 400nm 내지 500nm의 파장을 갖는 파란색광과 620nm 내지 780nm의 파장을 갖는 적색광을 혼합한 광을 이용할 수 있으며, 상기 LED 파란색 및 적색 혼합광의 혼합비율은 각각 7 : 3 내지 3 : 7인 것을 특징으로 하나, 바람직하게는 5 : 5일 수 있다. 이때 상기의 바람직한 광조건에서 밀리타리스 동충하초 균사체의 최대 코디세핀 함량을 나타낼 수 있다.

또한, 상기 LED 단일광 또는 혼합광을 1일 5 내지 15시간 동안 접종된 배지에 조사하여 균사체를 배양하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 1일 12시간 동안 조사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기와 같은 배양조건 및 광조건을 벗어나면 본 발명에 따른 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량이 증대되지 않아 코디세핀의 수득 수율이 현저히 낮아져 경제적이지 못한 문제가 야기될 수 있다.

또한, 상기 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량은 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간과 하기의 수학식 1과 같은 상관관계를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

[수학식 1]

이때, 밀리타리스 동충하초 균사체의 최대 코디세핀 함량을 얻기 위한 상기 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 500 내지 1500 lux, 5 내지 15 g/50mL, 30 내지 70 시간인 것을 특징으로 하며, 바람직하게 상기 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 922.788 lux, 9.19497 g/50mL, 53.1126 시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기의 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법에 따라 수득된 코디세핀 조성물을 제공한다.

상기와 같이 배양된 밀리타리스 동충하초 균사체 및 배양액에는 코디세핀 함량이 높아 면역증강활성, 항암활성을 위한 건강기능식품으로도 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

[수학식 1]

이때, 밀리타리스 동충하초 균사체의 최대 코디세핀 함량을 얻기 위한 상기 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간의 배양조건은 500 내지 1500 lux, 5 내지 15 g/50mL, 30 내지 70 시간인 것을 특징으로 하며, 바람직하게 상기 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 922.788 lux, 9.19497 g/50mL, 53.1126 시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 동충하초 균사체의 액체배양기술 확립

1. 공시재료

동충하초 균사체의 코디세핀(cordycepin) 함량을 평가하기 위하여 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)(KCCM 60304)를 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받았다(도 1).

2. 밀리타리스 동충하초( Cordyceps militaris )의 액체배양 및 코디세핀 함량 분석

밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체의 코디세핀 함량 증대를 위한 배양환경 조건을 확립하기 위해 하기 표 1의 배양조성을 갖는 3종(YMG(yeast extract, malt extract, glucose 배지), PDB(potato dextrose broth), SDB(Sabouraud dextrose broth)의 액체 배양배지를 이용하였다.

배지 명	배지 pH	배지 조성(g/L)
배지 명	배지 pH	Yeast extract	Malt extract	Glucose	Potato extract	Peptone
YMG	6.0	4	10	4	-	-
PDB	5.2	-	-	20	4	-
SDB	4.5	-	-	20	-	10

상기 KCCM으로부터 분양받은 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris) 균사를 PDA(Potato Dextrose Agar) 평판배지를 이용하여 항온 배양기에서 25℃로 7일간 배양하였다. 이후, 배양된 균사의 가장자리 부위를 직경 5 mm 코르크 보러를 사용하여 3core씩 액체배지(YMG, PDB, SDB)에 접종하여 25℃에서 7일간 진탕배양(100 rpm)하여 액체 종균을 생산하였으며, 하루간격으로 배양된 액체 종균의 균사체 코디세핀 함량을 측정하였다.

상기 YMG, PDB 또는 SDB 배지는 100mL 삼각플라스크에 50mL 씩 각각 투입하고 121℃에서 15분간 살균한 다음 냉각시켜 사용하였다.

또한, 배양된 밀리타리스 동충하초 균사체 및 배양액의 코디세핀 함량은 Wang et al. (2005)의 비색법에 의해 하기의 방법으로 측정되었으며, 밀리타리스 동충하초 균사체의 배양과정 및 코디세핀 함량 측정 과정을 도 2에 나타내었다.

① 배양이 끝난 균사체 배양액을 펠콘 튜브(falcon tube)에 옮김.

② 원심분리 (4000 rpm, 10 min, 2회, Union 32R Plus, HANIL, Korea)를 실시함.

③ 배양액과 균사체 분리 후 배양액은 냉장보관, 균사체는 60 ℃에서 24시간 건조시킴.

④ 60 ℃에서 24시간 건조된 균사체에 50% 에탄올 10 mL 를 투입함.

⑤ 1시간동안 50 ℃에서 초음파 처리(ultrasonication) (40 kHz 250 W, JINWOO 2010, Korea)를 실시함.

⑥ 1000 rpm으로 20분간 원심분리 (Union 32R Plus, HANIL, Korea)한 후 상등액을 코디세핀(cordycepin) 측정에 이용함.

⑦ 안트론(Anthron) 0.2g을 90% 황산 100 mL에 녹여 준비함 (Solvent A).

⑧ 냉장보관된 배양액과 균사체 에탄올 추출물 1mL에 Solvent A 5mL를 투입함.

⑨ 100 ℃ 워터 베스(water bath)에서 10분 동안 반응시킨 후 UV-spectrophotometer (7205, ZENWAY, UK)를 이용하여 460 nm에서 흡광도 측정.

⑩ 표준 시약 (cordycepin, sigma) 검량선 y=0.0075x+0.0378 (r²=0.9913)에 대입하여 코디세핀(cordycepin) 함량 도출.

3. 밀리타리스 동충하초( Cordyceps militaris )의 액체배양 배지에 따른 코디세핀 함량

밀리타리스 동충하초 균사체의 액체배지 종류에 따른 균사체 및 배양액의 코디세핀 함량은 도 3에 나타냈다.

결과적으로, 밀리타리스 동충하초 균사체를 SDB 배지에서 배양했을 때, 배양액(extra-mycelium)은 92.3 μg/mL, 균사체(intra-mycelium)는 76.8 μg/mL으로 가장 높은 코디세핀(cordycepin) 함량을 나타냈으며, 밀리타리스 동충하초 균사체 보다 배양액에서 더 높은 코디세핀 함량을 나타냄을 확인하였다.

또한, 배양기간에 따른 밀리타리스 동충하초의 코디세핀 함량을 분석한 결과, 도 4와 같이 2일 경과 후 유의성 있게 높아짐을 나타내어 3일 이후 코디세핀 함량의 감소를 나타내어 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 측정을 위한 배양기간을 2일로 고정하였다.

< 실시예 2> 형광등 및 UV-A가 동충하초 균사체의 코디세핀 함량에 미치는 영향 평가

1. 공시재료 및 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 평가

형광등 및 UV-A의 조사에 따른 상기 <실시예 1-1>에서 분양받은 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 변화를 평가하기 위하여 도 5와 같이 shaking incubator에 형광등과 UV-A (356 nm)를 설치하였다. 상기 광원은 배양액의 약 30cm 높이에 설치하였으며, 광도는 100pmol·m^-2·s^-1 로 설정하였다.

또한, 상기 광원의 on/off를 위한 컨트롤 박스는 도 6과 같이 (주)이에스레즈의 식물생장용 LED 조명 브랜드인 빛솔 LED로부터 구매하여 설치하였으며, 배양은 상기 <실시예 1-2>와 같은 조건으로 SDB 배지에서 25℃로 7일간 진탕배양(100 rpm)하여 액체 종균을 생산하였고, 형광등 및 UV-A는 12 h/day로 2일 동안 조사하여 비색법에 의해 배양된 동충하초 균사체 및 배양액의 코디세핀 함량을 측정하였다.

대조군으로는 암배양 조건으로 배양된 밀리타리스 동충하초 균사체를 이용하였다.

2. 밀리타리스 동충하초의 형광등 및 UV-A 광원에 따른 코디세핀 함량

도 7은 밀리타리스 동충하초의 형광등 및 UV-A 조사에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 것으로, 밀리타리스 동충하초는 암배양이나 형광등 광원보다 UV-A에서 배양했을 때 가장 많은 코디세핀 함량을 나타냄을 확인하였으며, 암배양보다 약 8배 더 많은 코디세핀 함량을 나타내는 것으로 확인되었다.

< 실시예 3> LED 단일광의 제어조건(파장 종류, 조사 시간)에 따른 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 평가

LED 단일광의 조사에 따른 밀리타리스 동충하초 균사체 코디세핀 함량 변화를 평가하기 위하여 도 8과 같이 shaking incubator에 LED 단일광을 설치하였다. 단일광은 red, green, blue로 총 3종의 색을 설치했으며, 각 색상 당 120개의 수량으로 설치하였다(표 2). 상기 광원은 배양액의 약 30cm 높이에 설치하였으며, 광도는 64.9~108.0 pmol·m^-2·s^-1 로 설정하였다.

또한, 상기 LED 및 컨트롤 박스는 도 9와 같이 (주)이에스레즈의 식물생장용 LED 조명 브랜드인 빛솔 LED를 구매하여 설치하였으며, <실시예 1-2>와 같은 조건으로 PDB 배지에서 25℃에서 7일간 진탕배양(100 rpm)하여 액체 종균을 생산하였고, 단일광 3종은 12 h/day로 2일 동안 조사하여 비색법에 의해 배양된 동충하초 균사체 및 배양액의 코디세핀 함량을 측정하였다.

대조군으로는 암배양, 형광등 및 UV-A 조건(실시예 2)으로 배양된 동충하초 균사체를 이용하였다.

색상	파장(nm)	LED 수량	PCB 수량	PCB 한 개당 LED 수량
Red	650	120	10	12
Green	525	120	10	12
Blue	450	120	10	12

2. 밀리타리스 동충하초의 LED 단일광 조건에 따른 코디세핀 함량

도 10은 밀리타리스 동충하초의 LED 단일광 조사에 따른 균사체의 코디세핀 함량을 나타낸 것으로, 암배양, 형광등 배양, UV-A 배양, red광 배양, green광 배양, blue광 배양 각각 92.3 mg/L, 637.6 mg/L, 804.3 mg/L, 594.9 mg/L, 1005.6 mg/L, 3026.9 mg/L의 코디세핀 함량을 나타내어, 밀리타리스 동충하초는 대조군인 암배양, 형광등 또는 UV-A 뿐만 아니라 red광 또는 green광을 조사했을 때보다 blue 광으로 조사했을 때, 코디세핀 함량이 유의성 있게 높아짐을 확인하였다.

따라서, LED blue 광은 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 증대에 효과적인 것으로 판단되며, 도 11은 LED 단일광 중 blue 광의 조사시간에 코디세핀 함량 변화를 나타낸 것으로, 하루에 12시간 blue 광을 조사했을 때 가장 높은 코디세핀 함량을 나타냄을 확인하였다.

< 실시예 4> LED 혼합광의 제어조건( 혼합광 종류, 혼합비율, 조사 시간)에 따른 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 평가

LED 혼합광의 조사에 따른 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 변화를 평가하기 위하여 혼합광은 red*green (650+525nm), red*blue (650+450nm), green*blue (525+450nm)를 이용하였으며, 상기 광원의 광도는 64.9~108.0 pmol·m^-2·s^- ¹ 로 설정하였다.

또한, 배양은 <실시예 1-2>와 같은 조건으로 SDB 배지에서 25℃에서 7일간 진탕배양(100 rpm)하여 액체 종균을 생산하였으며, 혼합광 3종은 12 h/day로 2일 동안 조사하여 비색법에 의해 배양된 동충하초 균사체 및 배양액의 코디세핀 함량을 측정하였다.

2. 밀리타리스 동충하초의 LED 혼합광 조건에 따른 코디세핀 함량

도 12는 밀리타리스 동충하초의 LED 혼합광 조사에 따른 균사체의 코디세핀 함량을 나타낸 것으로, red*blue 조사 시, 가장 높은 코디세핀 함량인 3641.5 mg/L, red*green 혼합광 조사 시 가장 낮은 코디세핀 함량인 1340.8 mg/L를 나타냈으며, 단일광 blue를 적용했을 때 (3026.0 mg/L) 보다 혼합광 red*blue를 적용했을 때 (3640.8 mg/L) 더 높은 코디세핀 함량을 나타냈다.

따라서 혼합광 중 red*blue를 동충하초 균사체에 조사했을 때, 균사체의 코디세핀 함량 증대에 가장 효과적인 것으로 확인되었다.

3. 밀리타리스 동충하초의 LED 혼합비율 조건에 따른 코디세핀 함량

상기와 같이 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 증대에 가장 효과적이었던 red*blue 혼합광의 혼합비율을 red:blue를 7:3, 5:5, 3:7로 설정하고, 상기 <실시예 1-2>와 같은 방법으로 배양된 동충하초 균사체 및 배양액의 코디세핀 함량을 측정하였다.

그 결과, 도 13과 같이 red:blue가 5:5일 때 가장 높은 코디세핀 함량을 나타냄을 확인하였다.

4. 밀리타리스 동충하초의 LED 조사시간 조건에 따른 코디세핀 함량

LED 혼합광 red*blue(5:5)의 조사시간에 따른 코디세핀 함량 평가를 위하여 6 h/day, 12 h/day, 24 h/day 조건으로 조사하였으며, 상기 <실시예 1-2>와 같은 방법으로 배양된 동충하초 균사체 및 배양액의 코디세핀 함량을 측정하였다.

대조군으로는 암배양된 동충하초 균사체를 이용하였다.

그 결과, 도 14와 같이 혼합광 red*blue(5:5)을 하루에 12시간 조사했을 때, 3679.5 mg/L로 가장 높은 코디세핀 함량을 나타냈으며, 이는 암배양 보다 약 39배 높은 코디세핀 함량을 나타냄을 확인하였다.

<실시예 5> LED 혼합광과 볏짚이 포함된 배지에 따른 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 평가

LED 혼합광 red*blue(5:5)의 12시간 조사에서 SDB 배지에 볏짚을 포함했을 때, 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 변화를 평가하기 위하여 볏짚은 분쇄 후 ASTM 규격 mesh No. 80, No. 100, No. 120로 분급하여 5 ~ 20 g/L 첨가하였으며, 상기 <실시예 1-2>와 같은 방법으로 배양된 동충하초 균사체 및 배양액의 코디세핀 함량을 측정하였다.

대조군으로는 암배양된 동충하초 균사체를 이용하였으며, LED 혼합광은 red*blue (5:5), 조사시간은 12시간으로 고정하여 평가하였다.

2. 밀리타리스 동충하초의 LED 혼합광과 볏짚이 포함된 배지 조건에 따른 코디세핀 함량

LED 혼합광 red*blue(5:5) 조사와 볏짚의 크기에 따른 코디세핀 함량 변화를 표 3에 나타냈으며, 이때의 볏짚 첨가량은 15 g/L로 고정하였다.

결과적으로, 볏짚을 포함하지 않는 SDB 배지에서 혼합광 red*blue (5:5)를 적용했을 때, 3779.5 mg/L, Mesh No. 80 pass의 볏짚을 포함한 SDB 배지에서 혼합광 red*blue (5:5)를 적용했을 때, 3915.5 mg/L의 코디세핀 함량을 나타냈다.

따라서, 동충하초 균사체에서 LED 혼합광 red*blue (5:5)를 볏짚이 포함된 SDB 배지에 적용했을 때, 코디세핀 함량 증대에 대한 시너지 효과가 있는 것으로 판단되며, 볏짚의 크기는 No. 100 mesh 및 No. 120 mesh 보다 No. 80 mesh가 코디세핀 증대에 가장 효과적인 것으로 확인하였다.

또한, 표 4는 배지에서 볏짚의 첨가량 (5 ~ 20 g/L)에 따른 밀리타리스 동충하초의 코디세핀 함량을 나타낸 것으로, 볏짚 크기는 mesh No. 80 pass로 고정하였다.

그 결과, 15 g/L의 볏짚을 배지에 첨가했을 때, 가장 높은 코디세핀 함량(3915.5 mg/L)을 나타내었으며, 이로써 80 mesh 크기의 볏짚을 15 g/L로 SDB 배지에 포함시켰을 때 밀리타리스 동충하초의 코디세핀 함량 증대가 높은 것으로 확인하였다.

조건	코디세핀 함량(㎍/mL)
Red:Blue (5:5)	3779.5 ±0.0d
Red:Blue (5:5) + media based 80mesh pass rice straw	3915.5 ±0.0a
Red:Blue (5:5) + media based 100mesh pass rice straw	3834.2 ±0.1b
Red:Blue (5:5) + media based 120mesh pass rice straw	3811.7 ±0.0c

조건	코디세핀 함량(㎍/mL)
Red:Blue (5:5)	3779.5 ±0.0e
Red:Blue (5:5) + media based 5g rice straw/L	3785.7 ±0.1d
Red:Blue (5:5) + media based 10g rice straw/L	3857.6 ±0.0c
Red:Blue (5:5) + media based 15g rice straw/L	3915.5 ±0.0a
Red:Blue (5:5) + media based 20g rice straw/L	3897.2 ±0.1b

< 실시예 6> 균사체의 최대 코디세핀 함량을 위한 LED의 최적 제어 조건 도출

1. LED 제어조건과 균사체 코디세핀 함량 간의 상관관계 도출

LED 제어조건을 포함한 동충하초 균사체 배양 조건과 균사체 코디세핀 함량간의 상관관계 도출은 피어슨 상관계수(Hauke and Kossowski, 2001)와 히트맵(Wilf et al., 2016)을 이용하였으며, 통계 프로그램은 R program (version 3.4.3)을 이용하였다.

밀리타리스 동충하초 균사체 배양조건 인자는 LED 파장, LED 광량, LED 조사 시간, 배지의 글루코스(glucose) 함량, 배지의 pH로 설정하였다.

상기 피어슨 상관계수에서 계수가 높은 수치를 나타낼수록 배양 조건 인자와 코디세핀 함량간의 상관관계가 높다고 평가하였으며, LED 제어조건과 동충하초 균사체의 코디세핀 함량간의 회귀식을 도출하기 위하여 CurveExpert program (version 3.4.3)의 fit model을 이용하였다.

결과적으로, 밀리타리스 동충하초 균사체 배양 조건과 균사체 코디세핀 함량간의 상관관계를 도 15에 나타내었으며, 밀리타리스 동충하초 균사체 코디세핀 함량에 가장 큰 영향을 미치는 배양 조건은 LED 파장으로, 이때 LED 파장은 균사체 코디세핀 함량과 음의 상관관계(-0.50)를 나타내는 것으로 확인되었다.

또한, LED 제어조건과 동충하초 균사체의 코디세핀 함량간의 fit model은 도 16에 나타내었으며, LED 제어 조건과 균사체 코디세핀 함량간의 가장 상관관계가 높았던 LED 파장은 ‘Ratkowsky’ model인 것으로 확인되었다. 이를 이용한 회귀식은 표 5에 나타내었으며, 도출된 LED 제어조건과 균사체 코디세핀 함량간의 회귀식을 통해 LED 제어조건(파장, 광량, 조사시간)만을 이용하여 코디세핀 함량을 예측할 수 있을 것으로 판단된다.

No.	χ	y	회귀식	상수
1	파장	코디세핀 함량	y=a/(1+eb^-cχ)	a=0.96; b=3.71; c=0.03
2	광량	코디세핀 함량	y=a/(1+eb^-cχ)	a=3.61; b=162.78; c=0.11
3	조사시간	코디세핀 함량	y=(a+bχ)/(1+cχ+dχ²)	a=26.45; b=-0.27; c=-3.03; d=1.96

2. 균사체 코디세핀 함량 증대를 위한 최적 LED 조건 확립

밀리타리스 동충하초 균사체 코디세핀 함량 증대를 위한 최적 LED 제어 조건은 반응 표면 모델(Response Surface Model;RSM)의 박스 벤켄 계획법(Box-Benkhen design;BBD) 실험설계를 이용하였으며, 프로그램은 Design-Expert Software Version 10을 이용하였다.

고정 인자는 밀리타리스 동충하초(C.militaris) 균사체이며, 변수는 광량 조건, 배지의 글루코스 함량, 배양시간으로 설정하였다. 이때, 변수의 범위는 예비 실험을 통하여 설정하였으며, BBD 실험 설계는 하기 표 6에서와 같이 총 17조건으로 설정하였다.

Run	독립변수(Independent variables) (coded)			독립변수(Independent variables) (actual)				코디세핀 함량(Cordycepin content), mg/L
	X ₁	X ₂	X ₃	X ₁	X ₂		X ₃	Y ₁
1	1	0	-1	1338	7.5		24	2134.16
2	0	0	0	669	7.5		72	3133.58
3	1	0	1	1338	7.5		120	1416.22
4	-1	1	0	0	10		72	192.13
5	0	0	0	669	7.5		72	3224.84
6	0	-1	-1	669	5		24	1851.05
7	-1	0	-1	0	7.5		24	131.29
8	1	-1	0	1338	5		72	1996.21
9	-1	0	1	0	7.5		120	121.31
10	0	-1	1	669	5		120	1212.97
11	1	1	0	1338	10		72	3154.37
12	0	1	1	669	10		120	2715.24
13	0	0	0	669	7.5		72	3157.76
14	0	0	0	669	7.5		72	3215.66
15	-1	-1	0	0	5		72	97.98
16	0	1	-1	669	10		24	3725.61
17	0	0	0	669	7.5		72	3831.52
Independent variables				Levels
				-1		0			1
X₁: 광량, lux				0		669			1338
X₂: 글루코스 함량, g/50 mL				5		7.5			10
X₃: 배양시간, h				24		72			120

도 17은 각 인자간의 상호관계를 반응 표면으로 나타낸 3차원 반응 표면 그래프와 유도된 2차 다항방정식 회귀식 모델을 나타낸 것으로, 결과적으로 밀리타리스 동충하초 균사체의 최대 코디세핀 함량을 위한 최적 배양 조건이 광량 922.788 lux, 배지의 glucose 함량 9.19497 g/50mL, 배양기간 53.1126시간 일 때, 3860.01 mg/L까지 코디세핀 함량이 증대되는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 2차 다항방정식 회귀식 모델을 변량분석(ANOVA)하여 도 18에서와 같이 반응 모델의 적합도를 나타내는 R²(결정계수)를 얻었다. 그 결과 R²(결정계수)는 0.9539로 높은 신뢰성을 나타내었으며, 이에 따라 상기 도 17에서 유도된 2차 다항방정식은 밀리타리스 동충하초의 최대 코디세핀 함량을 위한 최적 배양 조건의 반응값 예측에 적합한 것으로 판단된다.

Claims

밀리타리스 동충하초 균사를 사브로드 덱스트로스 브로스(Sabouraud dextrose broth) 배지에 접종하는 접종단계; 및
접종된 배지를 450nm 파장과 650nm 파장을 갖는 LED 파란색 및 적색 혼합 광조건에서 배양하여 배양된 밀리타리스 동충하초 균사체 및 배양액에서 코디세핀을 얻는 단계; 를 포함하며,
상기 LED 파란색 및 적색 혼합광의 혼합비율은 각각 5 : 5이고, 상기 배지에 80mesh 크기의 볏짚을 15g/L 첨가하여, 12시간/일으로 2일 내지 3일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법.
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제 1항에 있어서,
밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량은,
광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간과 하기의 수학식 1과 같은 상관관계를 가지는 것을 특징으로 하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법:
[수학식 1]
Y₁=3312.67+1019.78X₁+578.64X₂-297.05X₃+266.00X₁X₂-176.99X₁X₃-93.07X₂X₃-1688.99X₁ ²-263.51X₂ ²-672.94X₃ ²
(상기 수학식 1에서 Y₁은 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량(mg/L), X₁은 광량, X₂는 배지의 글루코스 함량 및 X₃는 배양시간을 의미함.)
제 10항에 있어서,
광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 500 내지 1500 lux, 5 내지 15 g/50mL, 30 내지 70 시간인 것을 특징으로 하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법.
제 11항에 있어서,
광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 922.788 lux, 9.19497 g/50mL, 53.1126 시간인 것을 특징으로 하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 증대하는 배양방법.
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제 1항에 따른 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 예측하는 방법에 있어서,
(a) 박스 벤켄 계획법(Box-Behnken design)으로 광량(X₁), 배지의 글루코스(glucose) 함량(X₂), 배양시간(X₃)에 대하여, -1, 0 및 1로 코드화하여 실험범위를 설계하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 설계된 실험범위로, 상기 광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간에 대한 실험값을 얻는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 실험값을 이용하여 하기 수학식 1로 표시되는 이차 회귀식 모델을 도출하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 도출된 수학식 1로 표시되는 이차 회귀식 모델을 변량분석(ANOVA)하여 상기 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량을 예측하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 예측방법:
[수학식 1]
Y₁=3312.67+1019.78X₁+578.64X₂-297.05X₃+266.00X₁X₂-176.99X₁X₃-93.07X₂X₃-1688.99X₁ ²-263.51X₂ ²-672.94X₃ ²
(상기 수학식 1에서 Y₁은 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량(mg/L), X₁은 광량, X₂는 배지의 글루코스 함량 및 X₃는 배양시간을 의미함.)
제 14항에 있어서,
광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 500 내지 1500 lux, 5 내지 15 g/50mL, 30 내지 70 시간인 것을 특징으로 하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 예측방법.
제 15항에 있어서,
광량, 배지의 글루코스 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 922.788 lux, 9.19497 g/50mL, 53.1126 시간인 것을 특징으로 하는 밀리타리스 동충하초 균사체의 코디세핀 함량 예측방법.