KR102347516B1

KR102347516B1 - Ｐａｒｐ 저해용 화합물 및 이의 의약 용도

Info

Publication number: KR102347516B1
Application number: KR1020200056740A
Authority: KR
Inventors: 김현진; 남혜진; 하재두; 황종연; 김필호; 조성윤
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2022-01-04
Also published as: KR20210138429A

Abstract

본 발명은 PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase)를 분해하는 기전을 갖는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 암 치료용 의약 용도를 제공한다.

Description

ＰＡＲＰ 저해용 화합물 및 이의 의약 용도{Compound for inhibiting PARP and medical use thereof}

본 발명은 PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase)를 분해하는 효과를 나타내는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 암 치료용 의약 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물들의 제조 방법에 관한 것이다.

PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase)은 생체 내의 손상된 DNA 복구에 관여한다. 암세포의 경우 이와 같은, 손상 및 복구 과정의 횟수가 수백 배 높기에, 이와 같은 DNA 복구 과정에서 PARP가 관여하는 횟수가 많아지게 된다.

DNA 복구 과정은 크게 DNA 단일가닥 절단 (SSB)와 이중가닥 절단 (DSB)으로 나뉘어지는데, PARP의 경우 SSB 과정에서의 key protein으로 알려져 있다. PARP의 경우 무엇보다 DSB 과정에서 가장 큰 역할을 하는 BRCA의 유무에 따라서 활성이 달라진다. 이와 같은 컨셉은 Synthetic lethality이라 불리며(J. Med. Chem. 2015, 58 3302), BRCAness와 같은 유전자 결핍/변이가 동반된 암종에 대해서 PARP 저해제의 활성을 나타내게 된다.

이와 같은 BRCA 변이로 인해 발생하는 대표 질병군으로서는, 유방암, 난소암 그리고 전립선암이 존재한다. 이를 타겟으로 2014년 Olaparib이 최초로 유방암 및 난소암 치료제로 승인되었으며 현재 전립선암으로 적응증을 확대하고 있는 상황이다. 두 번째 저해제인 Rucaparib의 경우 2016년 BRCA 변이가 있는 난소암 환자를 대상으로 승인을 받았으며, 이후 Niraparib, Veliparib, Talazoparib, Pamiparib과 같은 화합물들이 현재 개발 중에 있으나, 아직 효과가 뛰어나다고 할 수는 없는 상황이다.

미국 특허공보 제7,151,102호

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 의약품 성분으로 다양한 측면에서 장점을 가진 PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase) 억제용 화합물, 및 이의 의약 용도를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 Olaparib을 기반으로 Olaparib의 효과가 더욱 개선된 신규 화합물, 및 이들의 의약 용도를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

바람직하게, 본 발명에 있어 상기 Hydrophobic Tagging은 하기 moiety들 중 어느 하나이다.

본 발명자들은 olaparib에 다양한 moiety를 연결하여 UPS 시스템을 이용한 단백질 분해 유도제들을 합성하였고, MDA-MB-231 cell line을 이용하여 Degradation effect를 검증하였다. 그러나, Olaparib과 E3 ligase recruiter를 링커로 연결한 화합물들 중 단백질 분해 동정을 보이는 화합물을 찾을 수는 없었다.

그러나, olaparib의 cyclopropylcarbonyl moiety를 제거하고 naked piperidine amine을 기반으로 여기에 본 발명과 같은 Hydrophobic tagging을 통한 단백질 분해 경로를 도입할 경우 PARP도 생체 내 분자 동력학 경로에 따른 단백질 분해가 가능하다는 확인을 하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 화합물은 PARP의 분해를 유도할 뿐만 아니라, 세포내 ER 스트레스를 유발하여 unfolded protein response (UPR), 오토파지, 그리고 세포사멸을 유도하였으나, 본 발명은 이러한 이론적 기전에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 화합물에 있어 상기 링커는 존재하지 않거나 (직접 연결) 또는 **-(R₁)-(C_1-10 알킬)-(R₂)-*일 수 있으며, 여기에서 R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 존재하지 않거나 또는 NH, O, CO, SO₂O, 또는 C(O)O이다. 본 발명의 다른 태양에 있어, 상기 링커는 직접연결 또는 **-(C_1-10알킬)NH-*이다.

본 명세서에서 “C_1-4” 또는 “C1 내지 C6”와 같이 기재될 경우 이는 탄소수가 1 내지 6개임을 의미한다. 예를 들어, C_1-6 알킬은 탄소수가 1 내지 6인 알킬을 의미한다.

본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 무기산 또는 유기산으로 유도된 염 형태로 사용될 수 있으며, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 만델산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 산에 의해 유도된 염 형태로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어인 "본 발명의 화합물"은 화학식 1 각각의 화합물들뿐만 아니라, 이들의 클라드레이트 (clathrates), 수화물, 용매화물, 또는 다형체를 포함하는 의미이다. 또한 용어 “본 발명의 화합물”은 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 언급되지 않을 경우 본 발명 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염도 포함하는 의미이다.

일 실시예에 본 발명의 화합물은 입체이성질체적으로 순수한 화합물들(예를 들어, 다른 입체이성질체가 실질적으로 없는(예를 들어, 85% ee 이상, 90% ee 이상, 95% ee 이상, 97% ee 이상, 또는 99% ee 이상))로 존재할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 또는 그의 염이 호변이성적 (tautomeric) 이성질체 및/또는 입체이성질체 (예를 들어, 기하이성질체 (geometrical isomer) 및 배좌 이성질체 (conformational isomers))일 경우 그들의 분리된 이성질체 및 혼합물 각각 또한 본 발명의 화합물의 범주에 포함된다. 본 발명의 화합물 또는 그의 염이 구조 내에 비대칭 탄소 (asymmetric carbon)를 가지고 있는 경우에, 그들의 광학 활성 화합물 및 라세믹 혼합물들 또한 본 발명의 화합물의 범위에 포함된다.

본 명세서에서 사용될 경우, 용어 "결정다형(polymorph)"은 본 발명의 화합물의 고체 결정 형태 또는 그것의 복합체를 의미한다. 같은 화합물의 다른 결정다형은 다른 물리적, 화학적 그리고/또는 스펙트럼적 특성을 보인다. 물리적 특성 측면의 차이점으로는 안정성(예를 들어, 열 또는 빛 안정성), 압축성과 밀도(제제화 및 생산물 제조에 중요함), 그리고 용해율(생물학적 이용률에 영향을 줄 수 있음)을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다. 안정성에서 차이는 화학반응성 변화들(예를 들어, 또 다른 다형으로 구성되었을 때보다 하나의 다형으로 구성되었을 때 더 빠르게 변색이 되는 것 같은 차별적 산화) 또는 기계적인 특징들(예를 들어 동역학적으로 선호된 다형체로서 저장된 정제 파편들이 열역학 적으로 더 안정된 다형으로 변환) 또는 둘 다(하나의 다형의 정제는 높은 습도에서 더 분해에 예민)를 야기한다. 결정다형의 다른 물리적 성질들은 그들의 가공에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 한 결정다형은 또 다른 결정다형에 비하여, 예를 들어, 그것의 형태 또는 입자의 크기 분포에 기인하여 용매화합물을 형성할 가능성이 많을 수 있거나, 여과 또는 세척이 더 어려울 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "용매화물"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 용매를 포함하는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다. 바람직한 용매들은 휘발성이고, 비독성이며, 인간에게 극소량 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "수화물 (hydrate)"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 물을 포함하는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "클라드레이트 (clathrate)"은 게스트 분자(예를 들어, 용매 또는 물)를 가두어 놓은 공간 (예를 들어, 채널(channel))을 포함한 결정 격자의 형태의 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "정제된 (purified)"은 분리될 때, 분리체는 90% 이상 순수한 것을 의미하며, 일 실시예에서는 95% 이상 순수하고, 다른 실시 예에서는 99% 이상 순수하고, 또 다른 실시예에서는 99.9% 이상 순수한 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "치료"는 원발, 국소성 또는 전이성 암조직의 근절, 제거, 변형, 또는 통제를 포함하고; 암의 확장을 최소화하거나 지연시키는 것이다.

본 명세서에서 사용된 "유효량"은 원발, 국소성 또는 전이성(metastatic) 암세포 또는 암조직을 파괴, 변형, 통제 또는 제거하거나; 암의 확장을 늦추거나 또는 최소화하거나; 또는 암, 신생물 질환, 또는 종양의 치료 또는 관리에서 치료상 이점을 제공하기에 충분한 본 발명의 화합물의 양을 말한다. "유효량" 은 또한 암 또는 신생물 세포 사멸을 야기하기에 충분한 본 발명의 화합물의 양을 말한다. "유효량"은 또한 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 어떤 쪽이든 변이성 PARP 을 억제 또는 줄이기에 충분한 양을 말한다.

비-한정적인, 본 발명에 따른 바람직한 화합물의 예로는 하기 화합물들 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

4-(3-(4-(2-(adamantan-1-yl)acetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one,

4-(3-(4-(2-(9H-fluoren-9-yl)acetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one,

(S)-4-(4-fluoro-3-(4-(2-(4-isobutylphenyl)propanoyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)phthalazin-1(2H)-one,

4-(3-(4-(2,2-diphenylacetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one,

4-(3-(4-(2,2-dicyclohexylacetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one,

2-(adamantan-1-yl)-N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)acetamide,

2-(adamantan-1-yl)-N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)acetamide,

2-(adamantan-1-yl)-N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)acetamide,

2-(9H-fluoren-9-yl)-N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)acetamide,

2-(9H-fluoren-9-yl)-N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)acetamide,

2-(9H-fluoren-9-yl)-N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)acetamide,

(S)-N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-(4-isobutylphenyl)propanamide,

(S)-N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)-2-(4-isobutylphenyl)propanamide,

(S)-N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)-2-(4-isobutylphenyl)propanamide,

N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)-2,2-diphenylacetamide,

N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)-2,2-diphenylacetamide,

N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)-2,2-diphenylacetamide,

2,2-dicyclohexyl-N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)acetamide,

2,2-dicyclohexyl-N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)acetamide, 또는

2,2-dicyclohexyl-N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)acetamide.

바람직하게, 본 발명에 따른 화합물은 화합물 3a로 표시되는 4-(3-(4-(2-(9H-fluoren-9-yl)acetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 본 발명에 따른 화합물 3a는 다른 화합물들 보다 월등히 뛰어난 효과를 나타내었다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료적으로 유효한 양, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 (약학) 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 치료적으로 유효한 양 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 본 발명의 화합물이 아닌 다른 항암제, 세포 증식 억제제(cytostatic drug), 혈관 신생 억제제(angiogenesis inhibitor), 키나아제 억제제(kinase inhibitor), 사이토카인 차단제(cytokine blocker) 및 세포 접착 분자(cell adhesion molecule)의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 약학 성분(active pharmaceutical ingredient)의 치료적으로 유효한 양을 포함하는 (약학) 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 질병(disease) 또는 상태(condition)를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 질병 또는 상태(condition)는 PARP 저해로 개선될 수 있는 질병 또는 상태이다. 다른 양태에서, 상기 질병 또는 상태는 PARP 분해로 개선될 수 있는 질병 또는 상태이다. 다른 양태에서, 상기 질병 또는 상태는 암이다. 또 다른 양태에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 또는 전립선암이다. 또 다른 양태에서, 상기 암은 유방암이다. 또 다른 양태에서 상기 암은 estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), 및 human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu)의 3가지 수용체를 발현하지 않는 유방암이다.

일 양태에서, 상기 치료는 예방 치료(preventative treatment)이다. 또 다른 양태에서, 상기 치료는 완화 치료(palliative treatment)이다. 또 다른 양태에서, 상기 치료는 회복 치료(restorative treatment)이다.

즉, 본 발명은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 이용하는 것을 특징으로 하는 의약 용도를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명의 의약 용도는 본 명세서에서 설명된 질병 또는 상태의 치료 또는 예방 용도이다.

본 발명에 따른 신규 화합물들이 항암제로 사용될 경우의 투여량은 다음과 같다. 본 발명의 화합물은 임의의 적합한 경로에 의하여 이러한 경로에 적당한 약학 조성물의 형태, 그리고 의도된 치료를 위하여 효과적인 투여량으로 투여될 수 있다. 효과적인 투여량은 단일 또는 분할 투여로 일반적으로 약 0.001 내지 약 100 mg/체중kg/일이고, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 30 mg/kg/일이다. 다른 태양에서, 본 발명 화합물의 투여량은 10 내지 2000 mg/일이다. 또 다른 태양에서 본 발명 화합물의 투여량은 20 내지 1000 mg/일이다. 나이, 종, 및 치료될 질병 또는 상태(condition)에 따라 이 범위의 하한 미만의 투여량 수준이 적합할 수 있다. 다른 경우에는, 여전히 더 큰 투여량이 해로운 부작용없이 사용될 수 있다. 더 큰 투여량은 하루 동안 투여를 위하여, 여러 작은 투여량으로 분할될 수 있다. 적절한 투여량을 결정하기 위한 방법들이 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있다.

상기 설명된 질병 또는 상태(condition)의 치료를 위하여, 본 명세서에서 설명된 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 다음과 같이 투여될 수 있다.

구강 투여(Oral administration)

본 발명의 화합물은 구강으로 투여될 수 있으며, 구강은 연하(swallowing)를 포함하는 개념이다. 구강 투여에 의하여 본 발명의 화합물이 위장관(gastrointestinal tract)에 들어가거나, 예를 들어, 구강(buccal) 또는 설하(sublingual) 투여와 같이, 입으로부터 혈류로 직접적으로 흡수될 수 있다.

구강 투여를 위한 적합한 조성물은 고형상, 액상, 겔(gel), 또는 파우더 형상일 수 있으며, 정제(tablet), 로젠지(lozenge), 캡슐(capsule), 과립제, 산제 등의 제형을 가질 수 있다.

구강 투여를 위한 조성물은 선택적으로 장용 코팅(enteric coating)될 수 있으며, 장용 코팅을 통하여 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출을 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 구강 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된(modified) 방출 패턴을 가진 제형일 수 있다.

액체 제형은 용액, 시럽 및 현탁액을 포함할 수 있으며, 이러한 액상 조성물은 연질 또는 경질 캡슐 내에 함유된 형태일 수 있다. 이러한 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 셀룰로오스, 또는 오일(oil)을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다.

정제(tablet) 제형에서, 활성 성분인 약물의 양은 정제 총 중량 대비 약 0.05 중량% 내지 약 95 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 50 중량%로 존재할 수 있다. 또한, 정제는 약 0.5 중량% 내지 약 35 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 25 중량%를 포함하는 붕해제를 함유할 수 있다. 붕해제의 예로는 유당, 전분, 소디움스타치글리콜레이트, 크로스포비돈, 크로스카멜로스소디움(croscarmellose sodium), 말토덱스트린 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

정제로 제조하기 위해 포함되는 적합한 활택제는 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량% 양으로 존재할 수 있고, 탈크(talc), 이산화규소, 스테아린산, 칼슘, 아연 또는 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아릴 푸마레이트 등이 활택제로 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다.

정제로 제조하기 위한 결합제(binder)로는 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜, 당(sugar), 검(gum), 녹말(starch), 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등이 사용될 수 있으며, 정제로 제조하기 위한 적합한 희석제로는 만니톨, 자일리톨, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 녹말(starch), 미결정셀룰로오스 등이 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다.

선택적으로 정제에 포함될 수 있는 가용화제는 정제 총 중량 대비 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량% 양이 사용될 수 있고, 예를 들어, 폴리소르베이트, 소디움 라우릴설페이트, 소디움 도데실설페이트, 프로필렌 카보네이트, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, 폴리옥시에틸렌글리콜화된 천연 또는 수소화 피마자유, HCOR^TM(Nikkol), 올레일에스테르, 젤루시어(Gelucire^TM), 카프릴릭/카프릴산 모노/디글리세리드, 소르비탄지방산에스테르, 솔루톨HS^TM 등이 본 발명에 따른 약학 조성물에 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 가용화제의 구체적 종류에 한정되는 것은 아니다.

비경구 투여(Parenteral Administration)

본 발명의 화합물은 혈류, 근육, 또는 내장 내로 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 방법은 정맥내(intravenous), 근육내(intra-muscular), 피하 동맥내(subcutaneous intraarterial), 복강내(intraperitoneal), 척추강내(intrathecal), 두개내(intracranial) 주사 등을 포함한다. 비경구 투여를 위한 적합한 장치는 (바늘 및 바늘 없는 주사기를 포함하는) 주사기(injector) 및 주입 방법(infusion method)을 포함한다.

비경구 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된 방출 패턴을 가진 제형일 수 있으며, 변형된 방출 패턴은 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출 패턴일 수 있다.

대부분의 비경구 제형은 액상 조성물이며, 이러한 액상 조성물은 본 발명에 따른 약효 성분, 염, 완충제, 등장화제 등을 포함하는 수용액이다.

비경구 제형은 또한 건조된 형태(예를 들어, 동결 건조) 또는 멸균 비-수용액으로서 제조될 수 있다. 이들 제형은 멸균수(sterile water)와 같은 적합한 비히클(vehicle)과 함께 사용될 수 있다. 용해도 증강제(solubility-enhancing agents) 또한 비경구 용액의 제조에 사용될 수 있다.

국소 투여(Topical Administration)

본 발명의 화합물은 피부 또는 경피로 국소적으로 투여될 수 있다. 이 국소 투여를 위한 제형은 로션, 용액, 크림, 젤, 하이드로젤, 연고, 폼(foam), 임플란트(implant), 패치 등을 포함한다. 국소 투여 제형을 위한 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 알코올, 미네랄 오일, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 등을 포함할 수 있다. 국소 투여는 또한 전기천공법(electroporation), 이온도입법(iontophoresis), 음파영동(phonophoresis) 등에 의하여 수행될 수 있다.

국소 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된 방출 패턴을 가진 제형일 수 있으며, 변형된 방출 패턴은 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출 패턴일 수 있다.

본 발명의 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 PARP를 분해하여 다양한 암 치료에 우수한 효과를 나타낸다. 또한 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 본 발명의 암 치료용 약제학적 조성물은 다양한 암종, 특히 유방암, 난소암, 또는 전립선암 치료에 우수한 활성을 제공한다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은, 전술한 발명의 내용과 함께, 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것으로 본 발명은 하기 도면에 기재된 사항으로 한정되는 것은 아니다.
Fig 1은 본 발명에 따른 화합물로 처리된 MDA-MB-231 cells의 Immunoblot analysis 결과이다.
Fig 2는 본 발명에 따른 일 태양인 화합물 3a 및 비교 화합물인 Olaparib으로 처리된 HCC1937 cells의 Immunoblot analysis 결과이다.
Fig 3은 본 발명에 따른 화합물 3a가 PARP degradation을 통해 TNBC 세포의 apoptosis를 야기하는 것을 보여주는 실험결과이다. (A)는 표시된 시간에 대한 화합물 3a 처리 후 MDA-MB-231 세포의 전체 세포 용해물에서 면역블롯 분석을 수행한 결과이다. (B 및 C) proapoptotic (B) 또는 antiapoptotic (C) 표적 유전자의 정량적 RT-PCR 분석결과이며, 값은 평균 ± SD; n=3. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.001 (one-way ANOVA)이다. (D) CCK-8 분석 결과로, 연속적으로 희석된 화합물 3a 또는 olparib로 96 시간 동안 처리한 후의 결과이다. 값은 평균 ± SD; n=3이다.
Fig 4는 화합물 3a 처리가 ER 스트레스-관련 자가포식 및 세포사멸을 유도하는 것을 보여주는 실험결과이다. (A) 접히지 않거나(unfolded) 잘못 접힌(misfolded) 단백질이 세포 사멸을 유도하는 신호전달 경로를 보여준다. (B 및 C) 지시된 시간에 화합물 3a (B 및 C) 또는 olaparib (c)로 처리한 후 MDA-MB-231 세포의 전체 세포 용해물에서 수행된 면역블롯 분석 결과이다. (D) ER 스트레스 및 자가포식 관련 유전자의 정량적 RT-PCR 분석 결과로, 지시된 시간 동안 비히클 또는 화합물 3a 로 처리된 MDA-MB-231 세포를 사용하여 수행된 결과이다. 값은 평균 ± SD; n=3. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.001 (one-way ANOVA)로 표현되었다. (E) MDA-MB-231 세포의 대표적인 TEM 이미지이다. 스케일 바는 2 ㎛이다. 적색 화살표는 autophagomes를 나타내고, 황색 화살표는 아팝토시스를 나타낸다. 5 μM 화합물 3a로의 처리는 기재된 시간에 수행하였다. (F) 화합물 3a 에 의한 PARP 분해의 개략적인 모델이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기 실시예들에 있어, TLC는 예비코팅된 실리카 겔 F254 플레이트 (Merck, art. 5715) 상에서 수행하였다. 5715). 컬럼 크로마토그래피를 MPLC (Puchem Flash Column 또는 Biotage ZIP KP-Sil) 를 사용하여 실리카 카트리지 상에서 수행하였다. 1H 스펙트럼을 TMS 또는 내부 표준으로서 잔류 용매 피크를 사용하여 Bruker Avance 500으로 기록하였다. LC/MS 분석은 포지티브 또는 네가티브 이온 모드에서 전기분무 이온화 (electrospray ionization) 를 갖는 Waters Acquity UPLC 시스템에서 수행되었다. 모든 최종 화합물의 순도는 NMR 및 HPLC 에 의해 측정하였을 때 95% 이었다. 화합물 1은 U-Chem으로부터 구입하여 사용하였다

화합물 2a 내지 6a의 제조

[반응식 1]

Reaction conditions: (a) HATU, DIPEA, DMF, rt, 12 hours

산 (0.1 mmol, 1 당량)이 DMF (0.5 mL)에 첨가되었고, 이후 화합물 1 (0.1 mmol, 1 당량), HATU (0.11 mmol, 1.1 당량) 및 DIPEA (0.4 mmol, 4 당량)이 첨가되었다. 이를 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 EtOAc 및 물로 희석하고, 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시키고, 용리제로서 MeOH/DCM 8% 를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물 (51-94%)을 각각 수득하였다

합성된 각 화합물 및 그의 분석결과를 하기에 나타내었다.

4-(3-(4-(2-(adamantan-1-yl)acetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2 H )-one (2a, Scheme 1).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.22-10.18 (m, 1H), 8.50-8.48 (m, 1H), 7.83-7.76 (m, 2H), 7.75-7.69 (m, 1H), 7.42-7.31 (m, 2H), 7.09-7.04 (m, 1H), 4.31 (s, 2H), 3.80 (bs, 2H), 3.66-3.62 (m, 2H), 3.52 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.36-3.25 (m, 2H), 2.22-2.15 (m, 2H), 2.00 (s, 3H), 1.78-1.59 (m, 13H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺ : 543.1; [M-H]^- : 541.1

4-(3-(4-(2-(9 H -fluoren-9-yl)acetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2 H )-one (3a, Scheme 1).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.22 (s, 1H), 8.54-8.44 (m, 1H), 7.81-7.66 (m, 5H), 7.58-7.51 (m, 2H), 7.43-7.34 (m, 4H), 7.33-7.27 (m, 2H), 7.09-6.98 (m, 1H), 4.64 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 4.32-4.28 (m, 2H), 3.88-3.68 (m, 4H), 3.52-3.13 (m, 4H), 2.81 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 2.73 (d, J = 7.3 Hz, 1H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:573.0 ; [M-H]^-:571.0

( S )-4-(4-fluoro-3-(4-(2-(4-isobutylphenyl)propanoyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)phthalazin-1(2 H )-one (4a, Scheme 1).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.11 (s, 1H), 8.52-8.45 (m, 1H), 7.76 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 7.73-7.66 (m, 1H), 7.33-7.23 (m, 2H), 7.18-6.93 (m, 5H), 4.30-4.22 (m, 2H), 4.02 (bs, 1H), 3.86 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.80-3.70 (m, 1H), 3.52-3.23 (m, 4H), 3.11 (bs, 1H), 2.46-2.38 (m, 2H), 1.47-1.38 (m, 3H), 1.30-1.18 (m, 2H), 0.89-0.84 (m, 6H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:555.2 ; [M-H]^-:553.1

4-(3-(4-(2,2-diphenylacetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2 H )-one (5a, Scheme 1).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.35 (s, 1H), 8.50-8.44 (m, 1H), 7.77-7.75 (m, 2H), 7.70 (s, 1H), 7.35-7.28 (m, 7H), 7.25-7.17 (m, 5H), 7.07-6.95 (m, 1H), 5.22 (s, 1H), 5.13 (s, 1H), 4.28-4.21 (m, 2H), 3.77-3.23 (m, 8H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺: 561.0; [M-H]^-: 559.0

4-(3-(4-(2,2-dicyclohexylacetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2 H )-one (6a, Scheme 1).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.35 (s, 1H), 8.50-8.44 (m, 1H), 7.77-7.75 (m, 2H), 7.70 (s, 1H), 7.35-7.28 (m, 7H), 7.25-7.17 (m, 5H), 7.07-6.95 (m, 1H), 5.30 (s, 1H), 4.28-4.21 (m, 2H), 3.77-3.23 (m, 8H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺: 561.0; [M-H]^-: 559.0

화합물 2b 내지 6d의 제조

[반응식 2]

Reaction conditions: (a) HATU, DIPEA, DMF, rt, 12 hours; (b) DIPEA, DMF, 70 ℃, 12 hours; (c) 4 N HCl in dioxane, DCM, rt, 30 min.

단계 1 (N-알킬화):

DMF (1.5 mL) 중 알킬 토실레이트 (0.5 mmol, 1.3 당량) 의 용액에 프탈라지논 (0.37 mmol, 1 당량) 및 DIPEA (0.75 mmol, 2.0 당량) 를 첨가하고, 70

에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후, 물 및 EtOAc를 잔류물에 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 여과하고, 증발시켰다. 반응 혼합물을 용출제로서 MeOH/DCM 8% 를 사용하여 플래쉬 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물을 수득하였다

단계 2 (Boc-탈보호):

DCM 중의 Boc-보호된 기질(substrate) 용액을 1,4-디옥산 용액 (1 mL) 중의 4 N HCl 로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 담황색 고체의 생성물을 얻었다. 이 생성물을 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.

단계 3 (아미드 커플링):

HATU (0.11 mmol, 1.1 당량) 및 DIPEA (0.4 mmol, 4 당량) 를 DMF 중의 아민 (0.1 mmol) 및 카르복실산 (0.1 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하고, 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 물 및 EtOAc 를 잔류물에 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 여과하고, 증발시켰다. 반응 혼합물을 용출제로서 MeOH/DCM 8%를 사용하여 플래쉬 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물을 수득하였다.

합성된 각 화합물 및 그의 분석결과를 하기에 나타내었다.

2-(adamantan-1-yl)- N -(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)acetamide (2b, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.25 (s, 1H), 8.48 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.83-7.71 (m, 3H), 7.38- 7.30 (m, 2H), 7.03 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 5.96 (s, 1H), 4.31 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.42-3.25 (m, 4H), 2.57-2.52 (m, 4H), 2.41 (s, 2H), 1.96-1.93 (m, 5H), 1.72-1.68 (m, 3H), 1.72-1.68 (m, 9H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺ : 586.2; [M-H]^- : 584.2

2-(adamantan-1-yl)- N -(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)acetamide (2c, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.13 (s, 1H), 8.48 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.80-7.72 (m, 3H), 7.33-7.28 (m, 2H), 7.03 (t, J = 8.7 Hz, 1zH), 5.72 (s, 1H), 4.30 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.38-3.23 (m, 4H), 2.52-2.50 (m, 2H), 2.44-2.30 (m, 4H), 1.96-1.90 (m, 5H), 1.72-1.68 (m, 3H), 1.64-1.59 (m, 9H), 1.53 (s, 4H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺ : 614.1; [M-H]^- : 612.1

2-(adamantan-1-yl)- N -(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)acetamide (2d, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.39 (dd, J = 7.7, 1.5 Hz, 1H), 7.99-7.94 (m, 1H), 7.91-7.82 (m, 3H), 7.52-7.47 (m, 1H), 7.35 (dd, J = 6.3, 2.3 Hz, 1H), 7.17 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.40 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.24-3.14 (m, 2H), 2.63 (s, 2H), 2.51-2.38 (m, 4H), 1.98-1.91 (m, 5H), 1.76 (d, J = 12.4 Hz, 4H), 1.72-1.62 (m, 10H), 1.59-1.48 (m, 5H), 1.44-1.36 (m, 4H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺ : 642.2; [M-H]^- : 640.2

2-(9 H -fluoren-9-yl)- N -(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)acetamide (3b, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.77 (s, 1H), 8.45 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.74 (m, 5H), 7.50 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.33-7.26 (m, 4H), 7.02 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 4.49 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.27 (s, 2H), 3.71 (s, 2H), 3.41 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 3.23 (s, 2H), 2.65 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 2.48-2.45 (m, 4H), 2.34 (s, 2H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:616.1 ; [M-H]^-:614.0

2-(9 H -fluoren-9-yl)- N -(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)acetamide (3c, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.70 (s, 1H), 8.41 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.77-7.69 (m, 5H), 7.49 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.29-7.26 (m, 4H), 7.02 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 4.50 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.27 (s, 2H), 3.73 (s, 2H), 3.37-3.14 (m, 4H), 2.61 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 2.52-2.24 (m, 6H), 2.04-2.02 (m, 2H), 1.27-1.24 (m, 2H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:644.1 ; [M-H]^-:642.0

2-(9 H -fluoren-9-yl)- N -(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)acetamide (3d, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.65 (s, 1H), 8.45 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.78-7.69 (m, 5H), 7.50 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.29-7.26 (m, 4H), 7.02 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 5.47 (s, 1H), 4.50 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.27 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.31-3.25 (m, 4H), 2.61 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 2.51 (s, 2H), 2.36 (s, 4H), 1.49-1.41 (m, 4H), 1.28 (s, 4H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:672.1 ; [M-H]^-:670.0

( S )- N -(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-(4-isobutylphenyl)propanamide (4b, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.78 (s, 1H), 8.47 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 7.82-7.74 (m, 2H), 7.72-7.70 (m, 1H), 7.34-7.25 (m, 2H), 7.19 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.02 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 5.96 (s, 1H), 4.28 (s, 2H), 3.63 (bs, 1H), 3.54 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 3.28 (s, 2H), 3.14 (s, 2H), 2.44-2.42 (m, 6H), 1.85-1.79 (m, 1H), 1.51 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 1.27-1.24 (m, 3H), 0.88 (d, J = 6.5 Hz, 6H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:598.2 ; [M-H]^-:596.1

(S)- N -(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)-2-(4-isobutylphenyl)propanamide (4c, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.53 (s, 1H), 8.48 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.78-7.72(m, 3H), 7.33-7.30 (m, 2H), 7.20 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.04 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 5.55 (s, 1H), 4.30 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), 3.53 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 3.30 (s, 2H), 3.22 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.46-2.44 (m, 4H), 2.35-2.31 (m, 4H), 2.05 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 1.52 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.45 (s, 4H), 0.91 (d, J = 6.3 Hz, 6H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:626.2 ; [M-H]^-:624.1

( S )- N -(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)-2-(4-isobutylphenyl)propanamide (4d, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.60 (s, 1H), 8.46 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.82 - 7.68 (m, 3H), 7.35 - 7.27 (m, 2H), 7.18 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.02 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 5.35 (s, 1H), 4.28 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.52 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 3.31 (s, 2H), 3.16 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 2.56 - 2.41 (m, 4H), 2.41 - 2.26 (m, 4H), 1.87 - 1.83 (m, 1H), 1.50 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.40 (dd, J = 18.2, 10.9 Hz, 4H), 1.22 (d, J = 9.5 Hz, 4H), 0.89 (dd, J = 6.6, 1.5 Hz, 6H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:654.2 ; [M-H]^-:652.1

N -(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)-2,2-diphenylacetamide (5b, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.97 (s, 1H), 8.47 (dd, J = 6.7, 2.6 Hz, 1H), 7.82-7.68 (m, 3H), 7.35-7.21 (m, 12H), 7.02 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 6.26 (s, 1H), 5.29 (s, 2H), 4.95 (s, 1H), 4.28 (s, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.38 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 3.12 (s, 2H), 2.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.41 (s, 2H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺: 604.1; [M-H]^-: 602.1

N -(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)-2,2-diphenylacetamide (5c, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.78 (s, 1H), 8.48 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.8-7.72 (m, 3H), 7.36-7.25 (m, 12H), 7.05 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 5.32 (s, 2H), 4.93 (s, 1H), 4.30 (s, 2H), 3.78 (s, 2H), 3.34-3.27 (m, 4H), 2.46-2.44 (m, 2H), 2.37-2.23 (m, 2H), 1.53-1.45 (m, 4H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺: 632.1; [M-H]^-: 630.1

N -(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)-2,2-diphenylacetamide (5d, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.31 (s, 1H), 8.52-8.44 (m, 1H), 7.84-7.71 (m, 3H), 7.39-7.31 (m, 5H), 7.30-7.26 (m, 7H), 7.09-7.00 (m, 1H), 5.70-5.58 (m, 1H), 4.95 (s, 1H), 4.30 (s, 2H), 3.89-3.77 (m, 2H), 3.34-3.26 (m, 3H), 2.55-2.47 (m, 2H), 2.38-2.32 (m, 3H), 1.55-1.41 (m, 4H), 1.37-1.23 (m, 5H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺: 604.1; [M-H]^-: 602.1

2,2-dicyclohexyl- N -(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)acetamide (6b, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.72 (s, 1H), 8.49 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.84-7.72 (m, 3H), 7.37-7.30 (m, 2H), 7.04 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 5.92 (bs, 1H), 4.30 (s, 2H), 3.82 (s, 2H), 3.44-3.26 (m, 4H), 2.65-2.52 (m, 4H), 2.44 (s, 2H), 2.06-2.04 (m, 2H), 1.69 (s, 6H), 1.29-1.03 (m, 12H), 1.01-0.83 (m, 3H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:616.2 ; [M-H]^-:614.1

2,2-dicyclohexyl- N -(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)acetamide (6c, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.16 (s, 1H), 8.46 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 7.72 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.34-7.26 (m, 2H), 7.03 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 5.62 (s, 1H), 4.28 (s, 2H), 3.83 (s, 2H), 3.33 (s, 2H), 3.25 (d, 2H, J =6.7 Hz), 2.58 (s, 2H), 2.47-2.43 (m, 4H), 2.08-1.95 (m, 4H), 1.55-1.48 (m, 8H), 1.18-1.02 (m, 9H), 0.99-0.86 (m, 6H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:644.2.

2,2-dicyclohexyl- N -(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)acetamide (6d, Scheme 2).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.59 (s, 1H), 8.47 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.81-7.70 (m, 3H), 7.35-7.28 (m, 2H), 7.02 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 5.39 (s, 1H), 4.28 (s, 2H), 3.81 (s, 2H), 3.32 (s, 2H), 3.23 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 2.53 (s, 2H), 2.38-2.35 (m, 4H), 2.04-2.02 (m, 1H), 1.75-1.57 (m, 14H), 1.52-1.46 (m, 4H), 1.50-1.44 (m, 4H), 1.23-1.02 (m, 8H); LC/MS (ESI) m/z [M+H]⁺:672.2.

본 발명 화합물들의 활성 평가

실험 방법

세포 배양

MDA-MB-231 세포 (ATCC) 를 10% 태아 소 혈청 (Gibco) 이 보충된 DMEM 배지에서 ZellShield (Minerva Biolabs)로 배양하였다. 세포주를 마이코플라즈마 오염에 대해 시험하였다. MDA-MB-231 세포는 TNBC(triple-negative breast cancer) cell line으로, estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), 및 human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu)의 3가지 수용체를 발현하지 않는 유방암 세포주이다.

항체 및 물질

상업적으로 입수가능한 항체를 사용하였다. Cell Signaling사의 anti-PARP (#9542), anti-Bax (#2772), anti-cytochrome C (#12959), anti-Bcl2 (#3498), anti-CHOP (#2895), anti-XBP-1s (#12782), anti-LC3B (#2775); Sigma 사의 anti-b-actin (A1978); 및 Santa Cruz Biotechnology의 anti-p21 (sc-6246)를 이용하였다. Cafilzomib (# 2385) 는 바이오비전 (BioVision) 으로부터 구입하였다. Bortezomib (504314) 를 Calbiochem 으로부터 구입하였다.

RNA 제조 및 정량적 RT-PCR

TRIzol (Invitrogen)을 사용하여 총 RNA 를 단리하였다. RNA 를 올리고 (dT) 프라이머 및 SuPrimeScript Reverse Transcriptase (GeNetBio)로 역전사시켰다. 얻어진 cDNA 를 PCR을 위해 TOPreal?? qPCR 2X PreMIX (SYBR Green with low ROX, Enzynomics) 및 유전자-특이적 프라이머와 혼합하였다. mRNA의 풍부성은 SYBR Green과 함께 Rotor-Gene Q system (Qiagen) 또는 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems)에 의해 검출되었다. 하기 프라이머를 사용하였다.

human Bax Forward 5'- CGAGTGGCAGCTGACATGTTT -3',

human Bax Reverse 5'- AGGGCCTTGAGCACCAGTTT-3',

human p21 Forward 5'- GGCTTCATGCCAGGCTACTTC -3',

human p21 Reverse 5'- CCCTAGGCTGTGCTCACTTC -3',

human Puma Forward 5'- ATGCCTGCCTCACCTTCATC -3',

human Puma Reverse 5'- GGTCACACGTCGCTCTCTCTA A -3',

human Survivin Forward 5'- TGCAAAGGAAACCAACAATAAGAA -3',

human Survivin Reverse 5'- ATGGCACGGCGCACTT -3',

human Bcl2 Forward 5'- CTGCACCTGACGCCCTTCACC -3',

human Bcl2 Reverse 5'- CACATGACCCCACCGAACTCAAAGA -3',

human LC3A Forward 5'- CGTCCTGGACAAGACCAAGT -3',

human LC3A Reverse 5'- CTCGTCTTTCTCCTGCTCGT -3',

human LC3B Forward 5'- GATGTCCGACTTATTCGAGAGC -3',

human LC3B Reverse 5'- TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA -3',

human ATF4 Forward 5'- GGGACAGATTGGATGTTGGAGA -3',

human ATF4 Reverse 5'- ACCCAACAGGGCATCCAAGT -3',

human CHOP Forward 5'- CAGAACCAGCAGAGGTCACA -3',

human CHOP Reverse 5'- AGCTGTGCCACTTTCCTTTC -3',

human XBP-1s Forward 5'- TGCTGAGTCCGCAGCAGGTG -3',

human XBP-1s Reverse 5'- GCTGGCAGGCTCTGGGGAAG -3'.

전체-세포 용해물 제조

모든 세포를 수거하기 전에 빙냉 PBS 로 간단히 헹구었다. 전체 세포 용해물에 대해, 세포를 inhibitor complete (Roche)이 방금 추가된 RIPA 완충액에 재현탁시켰다. 4 ℃ 에서 30 분 동안 격렬하게 요동시킨 후, 4 ℃ 에서 15 분 동안 13000 rpm 으로 회전시켰다. 상청액 (전체 세포 용해물) 을 새로운 튜브로 옮겼다. 모든 용해물을 Pierce BCA protein assay kit (Thermo, 23227)로 정량하고 SDS-PAGE 로 분석하였다.

SDS-PAGE 및 면역블롯 분석

4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels (Bio-rad, #459-1096)을 SDS-PAGE 에 사용하였다. 이어서, 단백질을 Mini Trans-Blot Cell system (Bio-Rad)을 이용하여 겔로부터 PVDF 막으로 옮겼다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 막을 차단 용액 (TBS-T 중의 5% 탈지유) 에서 30분 동안 인큐베이션하여 항체의 비-특이적 결합을 차단하였다. 이어서 TBS-T (1:100 dilution, p21; 1:500 dilution, Bcl2; 1:1000 dilution, PARP, Bax, Cytochrome C, CHOP, XBP-1s, LC3B; 1:5000 dilution, b-actin) 에서 3% BSA 로 희석된 1 차 항체로 인큐베이션하였다. TBS-T 로 6 회 세척한 후, 막을 적절한 2 차 HRP-컨주게이트된 항체 (Thermo, 1:5000 dilutions in blocking solutions)와 배양하였다. TBS-T로 6 회 세척한 후, 막을 ECL 기질 (Pierce, 34096) 에서 배양하고, ChemiDoc MP (Bio-Rad) 또는 LAS-3000 (Fuji)로 이미지화하였다.

세포 생존력 분석

웰 당 10,000 개의 세포를 96-웰 투명 바닥 플레이트 상에 완전 배지로 시딩하였다. 다음날, 완전 배지를 무혈청 (serum-free) 으로 대체하였다. 24 시간 후, 화합물을 첨가하고, 표시된 시간 지점에 대해 지시된 농도의 화합물을 첨가 및 적정한 다음 지시된 시간 포인트 동안 배양하였다. CCK8 (Dojindo)을 제조자의 지시에 따라 첨가하고 OD 값을 측정하였다. 값은 DMSO 제어에 의해 정규화되고, IC₅₀은 GraphPad Prism 8을 사용하여 계산되었다.

투과 전자 현미경 (TEM)

세포를 지시된 시간 동안 시험 화합물(예를 들어, 화합물 3a)로 처리하였다. 세포를 2% 파라포름알데히드 (EM 등급) 및 2% 글루타르알데히드 (EM 등급) 를 함유하는 PBS 에 4

에서 24 시간 동안 고정시키고, 실온에서 1 시간 동안 2% 오스뮴 테트로옥사이드로 후-고정시켰다. 세척 후, 세포를 50% 에탄올로부터 출발하여 100% 에탄올로 끝나는, 각 단계 20 분의 구배 시리즈의 에탄올을 통해 탈수시켰다. 그 후, 세포를 에탄올에 용해된 점진적으로 농축된 프로필렌 옥사이드와 함께 인큐베이션한 다음, Epon 812 수지의 농도를 증가시키면서 침투시켰다. 샘플을 60

오븐에서 48 시간 동안 베이킹한 다음, Ultra microtome (70 nm thickness, Leica EM UC7)을 사용하여 절단하였다. TEM (JEM-2100f, JOEL) 를 이용하여 측정되었다.

실험 결과

Fig 1에 본 발명에 따른 화합물로 처리된 MDA-MB-231 cells의 Immunoblot analysis 결과를 나타내었다.

Fig 1에 나타나는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물들은 PARP를 저해하는 활성을 나타내었으며, 본 발명에 따른 여러 화합물들 중에 화합물 3a, 4d, 및 6d가 바람직하였다. 특히, 본 발명에 따른 여러 화합물들 중에 화합물 3a의 효과가 다른 화합물들 대비 탁월하였다.

Fig 2에 본 발명에 따른 일 태양인 화합물 3a 및 비교 화합물인 Olaparib으로 처리된 HCC1937 cells의 Immunoblot analysis 결과를 나타내었다.

Fig 2에 나타나는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물 3a는 비교예인 Olaparib 대비 그 효과가 탁월하였다.

Fig 3에 본 발명에 따른 화합물 3a가 PARP degradation을 통해 TNBC 세포의 apoptosis를 야기하는 결과를 나타내었다. (A)는 표시된 시간에 대한 화합물 3a 처리 후 MDA-MB-231 세포의 전체 세포 용해물에서 면역블롯 분석을 수행한 결과이다. (B 및 C) proapoptotic (B) 또는 antiapoptotic (C) 표적 유전자의 정량적 RT-PCR 분석결과이며, 지시된 시간 동안 비히클 또는 화합물 3a 로 처리된 MDA-MB-231 세포를 사용하여 수행하였다. 값은 평균 ± SD; n=3. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.001 (one-way ANOVA)으로 표현된다. (D) CCK-8 분석 결과로, 연속적으로 희석된 화합물 3a 또는 olparib로 96 시간 동안 처리한 후의 결과이다. 비선형 회귀를 사용하여 용량-반응 곡선 피팅을 수행하였다. 값은 평균 ± SD; n=3이다.

Fig 3은 PARP1 분해가 TNBC 세포 생존능에 영향을 미치는지를 보여주는 결과이다. 본 발명 화합물의 처리 결과 세포자멸성 마커 단백질 (Bax, p21, 시토크롬 C)의 발현은 PARP 분해 (Fig 3A)와 함께 유도되었다. 항아포토시스 단백질인 Bcl2은 본 발명 화합물 처리 과정 동안 점진적으로 감소하였다 (Fig 3A). 또한, 본 발명 화합물은 세포자멸사 유전자의 mRNA 수준을 상향조절하였고, 항-아포토시스 유전자의 수준을 하향조절하였다(Fig 3B 및 3C). 화합물 3a 로 처리하여 PARP 분해를 일으키고 아팝토시스 시그날링을 상향조절하므로, 본 발명 화합물 3a가 TNBC 에서 olparib 와 비교하여 우수한 항암 효과를 제공함을 알 수 있었다. 실제로, 5 μM 농도에서 3a로 처치는 96 시간 동안 인큐베이션 후 대략 80% 만큼 세포 성장을 억제하였지만, olaparib (olaparib, IC₅₀=32.36 ± 0.63 mM; compound 3a, IC₅₀=2.10 ± 0.31 mM) (Fig 5D)로 치료시 한계 억제 효과만이 관찰되었다.

Fig 4는 화합물 3a 처리가 ER 스트레스-관련 자가포식 및 세포사멸을 유도하는 것을 보여주는 실험결과이다. (A) 접히지 않거나(unfolded) 잘못 접힌(misfolded) 단백질이 세포 사멸을 유도하는 신호전달 경로를 보여준다. (B 및 C) 지시된 시간에 화합물 3a (B 및 C) 또는 olaparib (c)로 처리한 후 MDA-MB-231 세포의 전체 세포 용해물에서 수행된 면역블롯 분석 결과이다. (D) ER 스트레스 및 자가포식 관련 유전자의 정량적 RT-PCR 분석 결과로, 지시된 시간 동안 비히클 또는 화합물 3a 로 처리된 MDA-MB-231 세포를 사용하여 수행하였다. 값은 평균 ± SD; n=3. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.001 (one-way ANOVA)로 표현되었다. (E) MDA-MB-231 세포의 대표적인 TEM 이미지이다. 스케일 바는 2 ㎛이다. 적색 화살표는 autophagomes를 나타내고, 황색 화살표는 아팝토시스를 나타낸다. 5 μM 화합물 3a로의 처리는 기재된 시간에 수행하였다. (F) 화합물 3a 에 의한 PARP 분해의 개략적인 모델이다.

C/EBP homologous protein (CHOP) 은 ER 스트레스에 의해 촉발된 주요 proapoptotic 전사 인자이다. CHOP는 또한 LC3 의 전사 상향조절 (transcriptional upregulation), 자가포식 (autophagy) 및 세포자멸사 경로 (apoptosis pathway)와 관련된 유전자를 유발하는 것으로 보고되었다. X box-binding protein 1 (XBP-1s)은 ER 스트레스에 의해 unspliced XBP-1u로부터 ER 스트레스에 의해 스플라이싱되고 UPR 표적 유전자를 활성화시킨다. CHOP 및 XBP-1s는 화합물 3a 처리 후 24 시간으로부터 극적으로 증가하였다 (Fig 4B 및 C). 또한, LC3B 의 단백질 발현은 48 시간 후에 유도되었다. 한편, olaparib 는 PARP 분해, UPR 및 ER 스트레스를 유도하지 않았으며, 이는 본 발명의 화합물과 같은 특정 구조가 UPR 및 ER 스트레스의 유도를 위해 중요하다는 것을 나타낸다. UPR, ER 스트레스 및 자가포식-관련 유전자의 전사 수준은 또한 화합물 3a 처리 에 따라 증가하였다(Fig 4D). 본 발명자들은 투과 전자 현미경 (TEM) 에 의해 세포를 모니터링하여 화합물 3a 처리 후 세포의 ultrastructure를 평가하였다. 세포질 성분 (적색 화살표) 을 둘러싸는 큰 이중 막-결합 소포체를 화합물 3a-처리된 세포에서 검출하였다. 또한, 3a 의 인큐베이션 시간에 따라 세포자멸체 (황색 화살표) 가 점진적으로 증가하였다. 3a 에 의해 촉발된 UPR 및 ER 스트레스-매개 세포사멸은 MDA-MB-231 세포에서 Olaparib 보다 우수한 항종양 효과를 갖는 중요한 작용 기작일 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
[화학식 1]

여기에서, 상기 Hydrophobic Tagging은 하기들 중 어느 하나이고,

링커는 직접연결 또는 **-(C_1-10알킬)NH-*임.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 화합물은
4-(3-(4-(2-(adamantan-1-yl)acetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one,
4-(3-(4-(2-(9H-fluoren-9-yl)acetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one,
(S)-4-(4-fluoro-3-(4-(2-(4-isobutylphenyl)propanoyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)phthalazin-1(2H)-one,
4-(3-(4-(2,2-diphenylacetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one,
4-(3-(4-(2,2-dicyclohexylacetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one,
2-(adamantan-1-yl)-N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)acetamide,
2-(adamantan-1-yl)-N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)acetamide,
2-(adamantan-1-yl)-N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)acetamide,
2-(9H-fluoren-9-yl)-N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)acetamide,
2-(9H-fluoren-9-yl)-N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)acetamide,
2-(9H-fluoren-9-yl)-N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)acetamide,
(S)-N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-(4-isobutylphenyl)propanamide,
(S)-N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)-2-(4-isobutylphenyl)propanamide,
(S)-N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)-2-(4-isobutylphenyl)propanamide,
N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)-2,2-diphenylacetamide,
N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)-2,2-diphenylacetamide,
N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)-2,2-diphenylacetamide,
2,2-dicyclohexyl-N-(2-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)ethyl)acetamide,
2,2-dicyclohexyl-N-(4-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)butyl)acetamide, 또는
2,2-dicyclohexyl-N-(6-(4-(2-fluoro-5-((4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)benzoyl)piperazin-1-yl)hexyl)acetamide인
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제4항에 있어서, 상기 화합물은 4-(3-(4-(2-(9H-fluoren-9-yl)acetyl)piperazine-1-carbonyl)-4-fluorobenzyl)phthalazin-1(2H)-one인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
삭제
제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 또는 전립선암인 약학 조성물.
제8항에 있어서, 상기 암은 유방암인 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 유방암은 estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), 및 human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu)의 3가지 수용체를 발현하지 않는 유방암인 약학 조성물.