KR102344837B1 - 악성 육종을 치료하기 위한 약물의 제조에서 유전적으로 조작된 박테리아 vnp20009-m의 응용 - Google Patents

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Abstract

악성 육종을 예방 및 치료하기 위한 약물의 제조에서 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 응용을 제공한다.

Description

악성 육종을 치료하기 위한 약물의 제조에서 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 응용
본 발명은 유전 조작 약물의 기술분야에 속하며, 구체적으로 악성 육종을 예방 및 치료하기 위한 약물의 제조에서 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 새로운 응용에 관한 것이다.
암은 이미 인간 사망의 중요한 원인이 되었으며, 2005년부터 2015년까지 암 발병률이 33% 증가하였다. 세계보건기구(WHO)가 발행한 세계 암 보고서 2014는 세계 암 사례가 급격히 증가하여 2012년 1400만 건에서 2025년 1900만 건으로 해마다 점차 증가하여 2035년에 2400만 건에 도달할 것으로 예측했다.
육종(Sarcoma)은 간엽 조직(결합 조직 및 근육을 포함함)에서 기원하는 악성 종양이고, 지방, 근막, 근육, 섬유, 림프와 혈관, 골막과 관상골양단에 많이 발생한다. 모든 종류의 육종은 서로 다른 조직학, 생물학 특징과 서로 다른 국소 침윤, 혈행 및 임파 전이 경향을 가지며, 그 중 육종이 폐로 전이되는 것이 비교적 흔하다.
육종의 임상증상은 종양 덩어리이고, 종양 덩어리가 증대하여 주변조직을 압박할 때 증상이 발생한다. 육종의 발병률은 낮으며, 연발생률은 2.4-5건/10만명이고, 약 성인 악성 종양의 1%를 차지하고, 아동 악성 종양의 15%를 차지하나, 모든 암 관련 사망률의 2%를 차지한다. 육종 아형은 매우 많고, 생물학적 행동이 매우 다양하기 때문에, 진단이 비교적 곤란하고, 발견했을 때는 종종 병세가 비교적 말기여서, 약 1/3-1/2의 환자가 육종 재발 및 전이로 사망한다. 종래 의료 수단은 말기 육종에 대한 치료의 발전이 계속해서 정체되어 있다. 화학 치료는 여전히 표준의 치료방법이고, 예를 들어 아드리아마이신을 포함하는 치료는 표준 방안이며, 치료에 의한 환자의 총 생존 기간은 대략 12-16개월에 불과하다. 전체적으로, 조기 환자의 5년 생존률은 약 60%-80%이고, 말기 환자의 5년 생존률은 20%에 미치지 못한다.
종래 기술에 따르면 메티오닌 의존성은 대부분의 종양 세포의 특성이고, 이는 종양 세포에 의한 메티오닌에 대한 과도한 요구에 의해 나타나며, 메티오닌이 제거되었거나 전구체 호모시스테인 치환된 배양 배지에서 배양될 때 세포 증식이 억제되고; 반면 메티오닌의 존재 하에서 세포는 정상적으로 성장할 수 있고, 이는 전립선암, 유방암, 폐암 등 10종 이상의 악성 종양 세포를 포함한다. 그러나, 정상 세포에서는 메티오닌 의존성이 존재하지 않는다. 메티오닌 결핍을 유발하는 방법은 주로 식이에서 메티오닌을 제거하거나 또는 메티오니나제를 사용하여 메티오닌을 분해하는 것을 포함한다. 그렇지만, 단독으로 식이에서 메티오닌 섭취를 제한하는 것은 메티오닌 수준을 낮추는 효과가 제한적이며, 메티오닌 섭취를 장기간 제한하면 신체 영양실조 및 대사 장애를 유발할 수 있다. 식이 제한 메티오닌 섭취와 비교하여, 메티오니나제(methioninase)의 사용은 과도한 대사 문제를 유발하지 않으며 항종양 효과를 가진다.
살모넬라는 인간과 동물의 내장에서 기생하는 그람 음성 및 침습성 세포내 조건적 혐기성 박테리아의 그룹이다. 그 중에서, 공지된 박테리아 균주 VNP20009는 높은 종양 표적화 특성, 안전성 및 항종양 효과를 갖는 벡터이다. VNP20009는 악성 흑색종, 폐암 등의 다양한 마우스 고형 종양 모델에 대해 현저한 종양 성장 억제 효과를 가진다. 미국에서 진행된 2상 I 임상 연구는 VNP20009가 인체에 사용될 수 있고 안전성을 가지지만 항종양 효과는 관찰되지 않았음을 보여주었다.
이를 위해, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 육종을 예방 및 치료하기 위한 약물의 제조에서 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 새로운 응용을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 악성 육종을 예방 및 치료하기 위한 약물의 제조에서 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 응용을 개시한다.
더욱이, 상기 육종은 결합 조직 및 근육 등 간엽 조직에서 기원된 악성 육종이다.
더욱이, 상기 육종은 지방, 근막, 근육, 섬유, 림프와 혈관, 골막과 관상골양단에서 발생된 육종을 포함한다.
더욱이, 상기 육종은 연조직육종 및 골육종을 포함한다.
종래 연조직육종 환자 중, 다형성미분화육종(undifferentiated pleomorphic sarcoma, UPS)이 가장 흔하고, 25-35%를 차지하며; 그 다음은 지방육종(liposarcoma, LPS)이 25-30%를 차지하고; 평활근육종(leiomyosarcoma, LMS) 12%; 활막육종(synovial sarcoma, SS)이 10%를 차지하고; 악성 말초신경 종양(malignant peripheral nerve sheath tumor, MPNST)이 6%를 차지한다.
골육종은, 성골육종이라고도 알려져 있으며, 20세 이하의 청소년 또는 아동에게서 많이 발생한다. 골육종은 간질세포 계통에서 발전되며, 연골 단계를 통해 종양 유골 조직 및 골 조직을 직접 또는 간접적으로 형성하여 종양이 신속하게 성장한다. 골육종은 소아 골 악성 종양 중 가장 흔하며, 소아 종양의 약 5%이다.
상기 육종은 원발성 육종, 수술 후 재발성 육종, 또는 수술 후 기타 부위로 전이된 육종을 포함한다.
더욱이, 상기 육종은 악성 육종 수술 후 폐 부위로 전이된 종양이다.
바람직하게는, 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 6.4×107 CFU/m2의 최소 유효 투여량을 갖는다.
상기 종양을 예방 및 치료하기 위한 투여는 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비제한적으로 하기를 포함한다: 경구 투여, 국소 투여, 주사 투여(비제한적으로 정맥, 복막, 피하, 근육, 종양내 투여를 포함함) 등.
종래 기술에서 알려진 바와 같이, 본 발명의 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 공지된 박테리아 균주이고, VNP20009-M의 성능, 형태 및 제조 방법은 모두 중국 특허 CN105983103A에 기재된 바와 같다.
상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 L-메티오니나제(L-methioninase) 유전자로 클로닝된 약독화 살모넬라 티피뮤리움 VNP20009이다.
더욱이, 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 플라스미드를 함유하는 약독화 살모넬라 티피뮤리움 VNP20009이고, 여기에서, 상기 플라스미드는 L-메티오니나제 유전자로 클로닝된 것이다.
상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 하기 방법에 의해 제조된다: L-메티오니나제 유전자를 플라스미드 내로 서브클로닝하여 L-메티오니나제 발현 플라스미드를 얻는 단계, 상기 L메티오니나제 발현 플라스미드를 약독화 살모넬라 티피뮤리움 VNP20009 내로 전기충격 형질전환하는 단계, 및 VNP20009-M을 얻는 단계.
상기 플라스미드는 비제한적으로 pSVSPORT 플라스미드, pTrc99A 플라스미드, pcDNA3.1 플라스미드, pBR322 플라스미드 또는 pET23a 플라스미드를 포함한다.
가장 바람직하게는, 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 제조 과정에서, pSVSPORT 플라스미드가 선택될 때, L-메티오니나제 유전자가 플라스미드 내로 서브클로닝되어 L-메티오니나제 발현 플라스미드를 얻고, 그 다음에 L메티오니나제 발현 플라스미드는 약독화 살모넬라 티피뮤리움 VNP20009 내로 전기충격 형질전환되어 상기 유전적으로 조작된 박테리아를 얻는다.
여기에서, 상기 전기충격 형질전환 조건은 전압 2400V, 저항 400Ω, 정전용량 25μF, 방전시간 4ms이다.
본 발명은 또한 메티오니나제 제제의 제조에서 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 응용을 개시한다.
본 발명은 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M을 현존하는 것에 기초하여 악성 육종을 치료하는 데 사용하기 위한 새로운 응용을 개시하고, 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 유효하게 종양 세포를 죽일 수 있고, 종양 병변을 제거하며, 원발성육종, 수술 후 재발성 육종 및 악성 육종 수술 후 기타 부위로 전이된 종양 세포에 대해 모두 더 나은 살생 효과 및 더 나은 치료 효과를 가질 수 있다; 특히 연조직육종 수술 후 폐 부위로 전이된 종양에 대해 더 나은 살생 효과를 가진다; 게다가, 상기 유전적으로 조작된 박테리아는 인체에 대해 명백한 독성 및 부작용을 가지지 않으며, 악성 육종의 치료를 위한 안전하고 효과적인 새로운 방법을 제공한다.
본 발명의 내용을 보다 쉽게 명확히 이해할 수 있도록 하기 위해, 하기에서 본 발명의 구체적인 실시예를 참조하고 도면을 결합하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명할 것이다. 여기에서,
도 1은 플라스미드 pSVSPORT-L-메티오니나제 효소 절단 확인의 1% 아가로즈 겔 전기영동도이고;
도 2는 본 발명에 따른 웨스턴 블롯에 의해 확인된 메티오니나제 발현 결과를 나타낸 도면이고;
도 3은 본 발명에 따른 살모넬라에서 메티오니나제 활성 검출 결과를 나타낸 도면이고;
도 4는 실시예 2에서 환자 치료 전의 흉부 CT 검사 한 병변 상태를 나타내고;
도 5는 실시예 2에서 환자 치료 4주 후의 흉부 CT 검사 결과를 나타낸다.
실시예 1: 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 제조
본 발명의 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 제조 방법 및 과정은 중국 특허 CN105983103A의 실시예에 기재된 바와 같다.
(1) L-메티오니나제 유전자를 발현하는 플라스미드의 제조
먼저 L-메티오니나제(GenBank: L43133.1) 유전자를 합성하여 pUC57 플라스미드(GenScript)로 서브클로닝 한 다음, KpnI 및 HinIII 효소 절단 위치를 통해 pSVSPORT 플라스미드(invitrogen)로 서브클로닝하여 pSVSPORT-L-메티오니나제 발현 플라스미드를 얻었다. 구체적인 제조 과정은 다음과 같다:
pSVSPORT 플라스미드를 KpnI 및 HindIII 이중 효소 절단에 적용했다. 효소 절단 시스템은: 2μg 플라스미드 DNA, 3μL 10x완충액, 1.5μL KpnI 효소, 1.5μL HindIII 효소에 ddH2O를 첨가하여 30μL 부피까지 보충하여 채웠다. 웜 바스(warm bath)를 37 ℃에서 3시간 동안 수행하였다. 그리고 효소 절단 시스템을 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 통해 분리하여 4.1kb 크기의 DNA 밴드를 얻었고, 겔 회수 및 정제 키트로 DNA를 정제하였다.
전체-게놈 합성을 통해 L-메티오니나제 암호화 영역의 DNA 단편을 수득하고, pUC57 플라스미드(GenScript)로 서브클로닝하고, KpnI 및 HindIII 이중 효소 절단에 적용했다. 효소 절단 시스템은: 3μg 플라스미드 DNA, 3μL 10x완충액, 1.5μL KpnI 효소, 1.5μL HindIII 효소에 ddH2O를 첨가하여 30 \μL 부피까지 보충하여 채웠다. 웜 바스를 37℃에서 3시간 동안 수행하였다. 그리고 효소 절단 시스템을 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 통해 분리하여 1.2kb 크기의 DNA 밴드를 얻었고, 겔 회수 및 정제 키트로 DNA를 정제하였다.
pSVSPORT(KpnI/HinIII) 및 L-메티오니나제 암호화 영역의 DNA 단편(KpnI/HindIII)을 결찰하고, 결찰 반응 동안 2μL 벡터, 6μL 삽입 단편 및 1μL T4DNA 리가아제를 첨가하고, 웜 바스를 16℃에서 16시간 동안 수행하였다.
결찰 산물을 대장균 DH5α(Takara)의 수용성 세포(competent cell) 내로 형질전환시켰다. 50μL의 DH5α 수용성 세포의 한 개 튜브를 얼음에 두고, 얼음이 녹은 후, 5μL의 상기 결찰 산물을 DH5α 수용성 세포에 첨가하고, 가볍게 플립핑(flipping)하고 균일하게 혼합하고, 얼음에서 30분 동안 인큐베이션하고; 42℃에서 60초 동안 열 쇼크를 수행하고, 2분 동안 얼음에 두었고; 500μL의 비-내성 LB 액체 배지를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 후, 암피실린 함유 내성 LB 배양 배지 플레이트에 도포하고 밤새 배양하였다.
클론이 자란 후, 단일 클론 균락을 3 mL의 암피실린 함유 LB 배양액에 접종하고, 37℃에서 16시간 동안 진탕 배양하고, 플라스미드 DNA를 추출하고, KpnI 및 HinIII 효소 절단으로 동정하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 양성 클론에서 4.1kb 및 1.2kb의 2개의 DNA 밴드를 얻을 수 있었다. 추가 시퀀싱에 의해 양성 클론의 서열이 완전히 정확하다는 것을 확인하였다.
(2) 플라스미드를 함유하는 VNP20009 박테리아 및 L-메티오니나제 유전자로 클로닝된 플라스미드를 함유하는 VNP20009 박테리아의 제조
pSVSPORT 및 pSVSPORT-L-메티오니나제 발현 플라스미드를 각각 VNP20009 박테리아 균주(YS1646, ATCC No.202165)로 전기충격 형질전환하고, 각각 VNP20009-V 및 VNP20009-M으로 명명하였다. 구체적인 제조 과정은 다음과 같다:
수용성 박테리아 VNP20009를 얼음에 두고, 얼음이 녹은 후 미리 냉각시킨 전기 회전 컵으로 옮기고, 여기에 2μL 플라스미드를 첨가하고, 가볍게 플립핑하고 균일하게 혼합하고, 얼음에서 1분 동안 인큐베이션을 수행하였다. 전기 회전 컵을 전기 회전 기구에 넣고, 조건을 전압 2400V, 저항 400 Ω, 정전용량 25μF 및 방전시간 4ms로 설정하였다. 전기 충격 후 즉시 1mL SOC 배양 배지를 첨가하고, 부드럽게 균일하게 혼합하였다. 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하고; 피펫을 사용하여 박테리아를 침전시키고 골고루 불어낸 후, 암피실린 함유 내성 LB-O 배양 배지 플레이트에 도포하였다. 그리고 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 넣고 16시간 동안 배양하였다. VNP20009-V 및 VNP20009-M을 LB-O로 배양한 후, 플라스미드를 추출하고, 효소 절단에 의해 정확함을 확인하였다.
1x108의 살모넬라에서 단백질 용해물을 사용하여 단백질을 추출하고, 10% SDS-PAGE 전기영동을 수행하고, 안정된 압력 하에 아이스 바스에서 PVDF 막으로 전기충격 형질전환을 수행하였고, 상온에서 BSA로 1시간 동안 차단한 후, TBST로 5분씩 3회 헹구고, 래빗 항-L-메티오니나제 항체를 첨가하고(1:1000), 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. TBST로 3회, 매회마다 5분씩 헹구고, HRP-표지된 항-래빗 2차 항체(1:1000)를 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 하고, TBST로 3회, 매회마다 5분씩 헹구고, ECL 화학발광법으로 현상하였다. 결과는 도 2에 나타낸 바와 같이, 분자량 약 43kD에서 특이 밴드가 관찰되었고, 이는 VNP20009 및 VNP20009-V와 비교하여 VNP20009-M에서 L-메티오니나제의 발현량이 현저히 증가하였다는 것을 설명한다.
L-메티오닌 및 피리독살을 각각 VNP20009-V 및 VNP20009-M 균체와 혼합하였다. 37℃에서 10분 동안 인큐베이션을 수행한 후, 50% 트리클로로아세트산으로 종결시키고, 원심분리하여 상등액을 얻은 다음, 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드라존 하이드로클로라이드 하이드레이트 (MBTH)와 충분히 혼합하였다. 50℃에서 30분 동안 인큐베이션을 수행한 후, 320nm에서 흡광도를 측정하고, 분당 1μmol의 α-케토부티르산을 촉매 전환하기 위해 사용된 효소의 양을 1 효소 활성 단위로 정의하였다. 결과는(도 3에 나타낸 바와 같이) 살모넬라 VNP20009-M의 메티오니나제 활성이 VNP20009-V의 활성보다 10배 높다는 것을 나타낸다.
이로부터 알 수 있듯이, 상기 제조된 유전적으로 조작된 살모넬라 VNP20009-M은 비교적 높은 메티오니나제 활성을 가지며, 메티오니나제 제제의 제조를 위해 사용될 수 있다.
실시예 2: 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M의 연조직육종의 치료 효과
1) 과거 병력 및 진단
왼쪽 다리에 종양 덩어리가 있는 64세의 임상 남성 환자는 난징시 구러우 병원에서 바늘 생검에 의해 방추세포육종이 확인되었다. 종양 절제 수술 후, 재차 조직에 대해 병리 분석을 한 결과, 종양세포 SMA(-), DES (-), MyoDl (-), FN(+), STAT6 (-), CD34 (-), S100 (-), CKpan (-), EMA (-), Vimentin (++)가 HE 절편과 결합된 것이 나타났고, 악성섬유조직세포종에 부합하였다.
그 후 정기 사후 관리 재검 CT에서 오른쪽 폐 상엽 연조직의 자리 차지가 발견되었고, 바늘 생검 병리에서 방추세포육종이 나타났다. 환자의 과거 치료 및 관련 검사에 따르면, 방추세포육종 수술 후 폐 전이 재발로 진단되었다.
2) 치료 방안
250ml 생리 식염수로 희석된 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 정맥을 통해 체내로 주입되었고, 투여량은 6.4×107CFU/m2였다. 매 회차 간격은 1주일이고, 모두 5회 정맥주사하였다.
3) 효능
3.1 종양 크기의 변화
치료 전의 흉부 CT 검사에 따르면 오른쪽 폐 상엽 병변의 크기가 약 18*10*10cm였다(도 4에 나타낸 바와 같음). 치료 4주 후, CT 검사에 따르면 오른쪽 폐 상엽 병변의 크기는 약 17*10*10cm였고(도 5에 나타낸 바와 같음), 치료 전과 비교하여 종양의 크기는 유의미한 변화가 없었다.
3.2 종양 내부의 변화
치료 전에, CT 사진은 폐 부분 병변 내부의 단편형태의 액화와 괴사를 보여주었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 흰 선에 의해 둘러싸인 병변 내부는 불균일한 색깔을 나타내고, 비교적 어두운 구역은 그곳의 세포가 이미 괴사했음을 나타내며, 비교적 밝은 구역은 살아 있는 세포를 나타낸다. 치료 4주 후, CT 사진은 병변 내부에 균일성을 보이는 구조를 나타내며(도 5에 나타낸 바와 같음), CT 값은 약 10HU이다. CT 값은 물질 밀도를 지시하고, CT 값이 20HU 보다 낮을 때 물질이 액체 상태임을 나타내며, 이 지역은 종양 세포가 대체적으로 괴사하여 액체 상태를 나타냄을 제시한다. 상기 결과는 VNP20009-M을 통한 치료 후, 육종 환자의 종양세포가 빠르게 괴사와 액화하였음을 설명한다. 그러나 병변은 체내에 있기 때문에, 액체를 추출할 방법이 없고, 따라서 병변의 축소는 관찰하지 못했다.
3.3 부작용
매회 치료 날에, 정맥주사 후 5-6시간에, 환자는 최고 39.6℃ 정도의 열이 났고, 물리적 냉각에 의해 정상 체온을 회복할 수 있었다. 그 외에는 다른 이상 불편 느낌은 없었다. 치료 기간 동안, 간 및 신장 기능의 다양한 지표를 검사하였고, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 검출 결과는 환자 신체의 다양한 지표가 치료 전과 비교하여 대체적으로 유사함을 보여주었다. 상기 결과는 VNP20009-M이 환자에 대해 추가 독성 및 부작용을 발생시키지 않음을 설명한다.
[표 1] 환자 신체의 다양한 지표 데이터
Figure 112019112200358-pct00001
상기 데이터는 VNP20009-M이 유효하게 악성 육종 세포를 죽일 수 있고, 종양 병변을 제거하며, 인체에 심각한 독성 및 부작용을 나타내지 않음을 증명한다.
상술한 실시예는 단지 예를 명확히 설명하기 위한 것이며, 실시예로 한정하려는 것이 아님이 자명하다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 상술한 설명에 기초하여 기타 다른 형식의 변화 또는 수정을 할 수 있다. 여기에서 모든 실시방식을 소진할 필요가 없고 방법도 없다. 그리고 이로부터 도출된 명백하고 쉬운 변화 또는 수정은 여전히 본 발명에 의해 생성된 보호 범위 내에 있다.
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Claims (10)

  1. 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M을 유효성분으로 포함하는 악성 육종 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 플라스미드를 함유하는 약독화 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) VNP20009이고, 상기 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 L-메티오니나제 유전자로 클로닝되고, 상기 플라스미드는 pSVSPORT 플라스미드, pTrc99A 플라스미드, pcDNA3.1 플라스미드, pBR322 플라스미드 또는 pET23a 플라스미드로 구성되는 군으로부터 선택되고; 및 상기 악성 육종은 방추세포육종 및 골육종으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 악성 육종은 방추세포육종(spindle cell sarcoma)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 악성 육종은 골육종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 제2항에 있어서, 상기 방추세포육종은 방추세포육종 수술 후 폐 부위로 전이된 종양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 6.4*107 CFU/m2의 최소 유효 투여량을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 박테리아 VNP20009-M은 하기 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물: 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 L-메티오니나제 유전자를 플라스미드 내로 서브클로닝하여 L-메티오니나제 발현 플라스미드를 얻는 단계 및 상기 L메티오니나제 발현 플라스미드를 약독화 살모넬라 티피뮤리움 VNP20009 내로 전기충격 형질전환하는 단계, 및 VNP20009-M을 얻는 단계.
  9. 삭제
  10. 삭제
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