JP2020510056A - 遺伝子工学菌ｖｎｐ２０００９−ｍの悪性肉腫予防・治療薬の製造にお ける応用 - Google Patents

Abstract

遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの悪性肉腫予防・治療薬の製造における応用を提供する。

Description

本発明は、遺伝子工学薬物の技術分野に属し、具体的には、遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの悪性肉腫予防・治療薬の製造における新しい応用に関する。

癌は、人間の死亡を引き起こす重要な原因となっており、２００５年から２０１５年まで、癌発症率が３３％増加した。世界保健機関（ＷＨＯ）により発表された『世界癌レポート２０１４』は、世界の癌症例が２０１２年の１４００万人から２０２５年の１９００万人、２０３５年の２４００万人まで、益々急速に成長する傾向があると予測している。

肉腫（Ｓａｒｃｏｍａ）は、間葉組織（結合組織及び筋肉を含む）に由来する悪性腫瘍であり、脂肪、筋膜、筋肉、繊維、リンパ及び血管、骨膜及び長骨の両端に多く発生する。各肉腫はいずれも異なる組織学、生物学的特性及び異なる局所浸潤、血行及びリンパ遷移傾向があり、そのうち、肉腫の肺転移が一般的である。

肉腫の臨床表現は腫瘍塊であり、腫瘍塊が周囲組織を圧迫すると、症状が生じる。肉腫の発症率は低く、年発症率は２．４〜５例/１０万人であり、成人悪性腫瘍の約１％を占め、小児悪性腫瘍の１５％を占めるが、全ての癌に関する死亡率の２％を占める。肉腫亜型は多く、生物学的挙動は多種多様であるため、診断は困難であり、病状の発見は遅れ、約１/３−１/２の患者は肉腫再発及び転移で死ぬ。従来の医療手段は、後期肉腫の治療が停滞して前進しなく、化学療法は依然として標準的な治療方法であり、例えば、ドキソルビシンを含む治療は標準的な案であり、治療した患者の総生存期間は約１２-１６ヶ月しかない。総じて、早期患者の５年間の生存率は約６０％-８０％であり、後期患者の５年間の生存率は２０％未満であった。

従来技術から明らかなように、メチオニン依存性がほとんどの腫瘍細胞の特性であり、腫瘍細胞が過量のメチオニンを必要とし、メチオニンを除去したまたはその前駆体であるホモシステインでメチオニンを置換した培地で培養すると、細胞増殖が阻害されるが、メチオニンが存在した環境では正常に増殖すると表現しており、そのうち、前立腺癌、乳癌、肺癌、及びその他の１０種類以上の悪性細胞などが含まれる。しかし、正常細胞にはメチオニン依存性がない。メチオニン欠乏を引き起こす方法として、主に食べ物におけるメチオニンを除去するか、メチオニナーゼでメチオニンを分解することがある。しかし、食べ物からのメチオニンの摂取を制限することによるメチオニンレベル低下の効果には限りがある一方、メチオニン摂取を長期的に制限すると体の栄養失調や代謝障害を引き起こす恐れがある。食べ物によりメチオニンを制限する場合に比べて、メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）を使用した方が過度の代謝問題を引き起こさないとともに、抗腫瘍効果を有する。

サルモネラ菌属は、人間や動物の腸に寄生するグラム陰性の侵襲性細胞内通性嫌気性菌のグループである。そのうち、ＶＮＰ２０００９菌株が高い腫瘍標的性及び安全性を有するとともに、抗腫瘍効果を果たす担体であることが知られている。ＶＮＰ２０００９菌株は、悪性黒色腫や肺癌などのさまざまなマウス固形腫瘍モデルに対して顕著な腫瘍成長阻害効果がある。米国で実施された２つの第Ｉ相臨床研究から、安全的にヒトに使用できることが確認されたが、抗腫瘍効果は認められなかった。

このため、本発明が解決しようとする技術的課題は、遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの肉腫予防・治療薬の製造における新しい応用を提供することである。

上記技術的課題を解決するために、本発明は、前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの悪性肉腫予防・治療薬の製造における応用を開示する。

さらに、前記肉腫は、結合組織や筋肉等の間葉組織に由来する悪性肉腫である。

さらに、前記肉腫は、脂肪、筋膜、筋肉、繊維、リンパ及び血管、骨膜及び長骨の両端に生じる肉腫を含む。

さらに、前記肉腫は、軟部組織肉腫及び骨肉腫を含む

既存の軟部組織肉腫の患者において、未分化多形性肉腫（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ ｓａｒｃｏｍａ、ＵＰＳ）が最も一般的であり、２５-３５％を占め、次に、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ、ＬＰＳ）が２５-３０％を占め、平滑筋肉腫（ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ、ＬＭＳ）が１２％を占め、滑膜肉腫（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ、ＳＳ）が１０％を占め、悪性末梢神経鞘腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｎｅｒｖｅ ｓｈｅａｔｈ ｔｕｍｏｒ、ＭＰＮＳＴ）が６％を占める。

骨肉腫は、骨形成性肉腫とも呼ばれ、２０歳以下の青少年又は小児に多く発生する。骨肉腫は、間質細胞系から進んできたのであり、腫瘍が軟骨の段階を経て直接または間接的に腫瘍骨様組織および骨組織となって腫瘍を速やかに成長させる。骨肉腫は小児骨悪性腫瘍において最も一般的であり、約小児の腫瘍の５％である。

前記肉腫は、原発性肉腫、術後再発肉腫及び術後他の部位へ転移した肉腫を含む。

さらに、前記肉腫は、悪性肉腫の術後、肺へ転移した腫瘍である。

好ましくは、前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの最小有効投与量は、６．４×１０⁷ＣＦＵ／Ｍ²である。

上記腫瘍予防・治療の投与方式としては、複数種の手段で投与することができ、経口投与、局所投与、注射投与（静脈内投与、腹膜投与、皮下投与、筋肉投与、腫瘍内投与を含むが、これらに制限されない）などを含むが、これらに制限されない。

従来技術から明らかなように、本発明に係る上記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、既知の菌株であり、その性能、形状、構築方法がすべて中国特許ＣＮ１０５９８３１０３Ａに記載されている。

前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、Ｌ−メチオニナーゼ遺伝子がクローニングされた弱毒ネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９である。

さらに、前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、Ｌ−メチオニナーゼ遺伝子がクローニングされたプラスミドを有する弱毒ネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９でる。

前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、Ｌ−メチオニナーゼ遺伝子をプラスミドにサブクローニングして、Ｌ−メチオニナーゼ発現プラスミドを得て、Ｌ−メチオニナーゼ発現プラスミドを弱毒ネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９に電気的形質転換する方法によって構築される。

前記プラスミドは、ｐＳＶＳＰＯＲＴプラスミド、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド、ｐＢＲ３２２プラスミド又はｐＥＴ２３ａプラスミドを含むが、これらに制限されない。

最も好ましくは、遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの構築過程において、ｐＳＶＳＰＯＲＴプラスミドを用いる場合、Ｌ−メチオニナーゼ遺伝子をプラスミドにサブクローニングして、Ｌ−メチオニナーゼ発現プラスミドを得て、次に、Ｌ−メチオニナーゼ発現プラスミドを弱毒ネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９に電気的形質転換して、遺伝子工学菌を得る。

そのうち、前記電気的形質転換条件は、電圧２４００Ｖ、抵抗４００Ω、電気容量２５μＦ、放電時間４ｍｓである。

本発明は、前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍのメチオニナーゼ製剤の製造における応用を開示する。

本発明は、従来の用途に基づいて悪性肉腫を治療するための遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの新しい応用を開示し、前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、腫瘍細胞を効果的に殺滅し、腫瘍病巣を消すことができ、原発性肉腫、術後再発腫瘍及び悪性肉腫術後から他の部位へ転移した腫瘍細胞に対して、優れた殺傷効果及び良好な治療効果を果たし、特に、軟部組織肉腫の術後、肺へ転移した腫瘍細胞に対して、優れた殺傷効果を果たし、さらに、前記遺伝子工学菌は、人体に明らかな毒性と副作用がなく、悪性肉腫を安全で効果的に治療するために新しい手段を提供する。

本発明の内容を容易で明確に理解できるように、以下、本発明の特定実施例にて図面を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明する。
プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴ−Ｌ−メチオニナーゼに対する酵素消化同定による１％アガロースゲル電気泳動像である。 本発明におけるウエスターブロット同定によるメチオニナーゼ発現結果図である。 本発明によるサルモネラ菌におけるメチオニナーゼ活性検出結果図である。 実施例２における患者の治療前の胸部での病巣状況のＣＴ検査結果図である。 実施例２における患者の４週間治療後の胸部でのＣＴ検査結果図である。

実施例１ 遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの構築

本発明の前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの構築方法及び過程は、中国特許ＣＮ１０５９８３１０３Ａにおける実施例に記載されている。

（１）Ｌ−メチオニナーゼ遺伝子を発現させたプラスミドの構築

まず、Ｌ−メチオニナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ４３１３３．１）遺伝子を合成してｐＵＣ５７プラスミド（ジェンスクリプト社）にサブクローニングし、次に、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ酵素消化位点を介してｐＳＶＳＰＯＲＴプラスミド（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、ｐＳＶＳＰＯＲＴ−Ｌ−メチオニナーゼ発現プラスミドを得た。構築過程は、具体的には、以下のとおりである。

ｐＳＶＳＰＯＲＴプラスミドをＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素消化し、酵素消化系は、プラスミドＤＮＡ ２μｇ、１０ｘｂｕｆｆｅｒ ３μＬ、ＫｐｎＩ酵素１．５μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素１．５μＬに、ｄｄＨ２Ｏを体積３０μＬになるまで加えて、３７℃の温浴で３ｈ処理したものである。次に、酵素消化系を１％アガロースゲルにおいて電気泳動分離し、サイズ４．１ｋｂのＤＮＡバンドを切り出し、ゲル回収精製試薬キットでＤＮＡを精製した。

全遺伝子合成を利用してＬ−メチオニナーゼコーディング領域ＤＮＡ断片を得てｐＵＣ５７プラスミド（ジェンスクリプト社）にサブクローニングし、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素消化し、酵素消化系は、プラスミドＤＮＡ ３μｇ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ３μＬ、ＫｐｎＩ酵素１．５μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素１．５μＬに、ｄｄＨ２Ｏを体積３０μＬになるまで加えて、３７℃の温浴で３ｈ処理したものである。次に、酵素消化系を１％のアガロースゲルにおいて電気泳動分離し、サイズ１．２ｋｂのＤＮＡバンドを切り出し、ゲル回収精製試薬キットでＤＮＡを精製した。

ｐＳＶＳＰＯＲＴ（ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）及びＬ−メチオニナーゼコーディング領域ＤＮＡ断片（ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）をライゲーションし、ライゲーション反応においてベクター２μＬ、挿入断片６μＬ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＬを加えて、１６℃の温浴で１６ｈ処理した。

ライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ）のコンピテント細胞に形質転換した。５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞１本を氷に置き、溶けた後、それに上記ライゲーション産物５μＬを加えて、軽くフリックして均一に混合し、次に氷において３０ｍｉｎインキュベートし、４２℃で６０ｓ熱ショックした後、氷において２ｍｉｎ静置して、耐性のないＬＢ液体培地５００μＬを加え、３７℃で１ｈ振とう培養した後、アンピシリン耐性を有するＬＢ培地プレートに塗布し、一晩培養した。

クローンが成長した後、モノクローナルコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培養液３ｍＬに取り、３７℃で１６ｈ振とう培養して、プラスミドＤＮＡを抽出し、Ｋｐｎｌ及びＨｉｎｄｌｌｌ酵素消化により同定したところ、図１に示すように、陽性クローンには４．１ｋｂ、１．２ｋｂの２本のＤＮＡバンドが認められた。さらにシーケンシングしたところ、陽性クローンの配列が完全に正確であることが確認された。

（２）プラスミドを有するＶＮＰ２０００９菌及びＬ−メチオニナーゼ遺伝子がクローニングされたプラスミドを有するＶＮＰ２０００９菌の構築

ｐＳＶＳＰＯＲＴ及びｐＳＶＳＰＯＲＴ−Ｌ−メチオニナーゼ発現プラスミドをそれぞれＶＮ２０００９菌株（ＹＳ１６４６、ＡＴＣＣ番号２０２１６５）に電気的形質転換して、それぞれＶＮＰ２０００９−Ｖ及びＶＮＰ２０００９−Ｍと命名した。構築過程は、具体的には、以下のとおりである。

コンピテント細菌ＶＮＰ２０００９を氷に置き、溶けた後、予備冷却電気的形質転換カップに移し、それにプラスミド２μＬを加えて、軽くフリックして均一に混合し、氷において１分インキュベートした。電気的形質転換カップを電気的形質転換機器に入れて、条件として、電圧２４００Ｖ、抵抗４００Ω、電気容量２５μＦ、放電時間４ｍｓと設定した。電気ショックした直後、ＳＯＣ培地１ｍＬを加えて、軽く均一に混合した。３７℃で１ｈ振とう培養し、ピペットを用いて細胞沈殿をピペッティングした後、アンピシリン耐性ＬＢ−Ｏ培地プレートに塗布した。次に、プレートを３７℃のインキュベータに入れて１６ｈ培養した。ＶＮＰ２０００９−Ｖ及びＶＮＰ２０００９−ＭをＬＢ−Oで培養した後、プラスミドを抽出し、酵素消化で同定したところ、正確であった。

１×１０⁸サルモネラ菌についてタンパク質溶解液でタンパク質を抽出し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、次に、電圧を安定化させながら氷浴でＰＶＤＦ膜に電気的形質転換し、ＢＳＡを用いて室温で１ｈブロックした後、ＴＢＳＴで３×５ｍｉｎリンスし、ウサギ抗Ｌ−メチオニナーゼ抗体（１：１０００）を加えて、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回リンスし、５ｍｉｎごとにＨＲＰ標識抗ウサギ二次抗体（１：１００００）を加えて、室温で１ｈインキュベートし、ＴＢＳＴで５ｍｉｎずつ３回リンスし、ＥＣＬ化学発光法により現像させた。その結果、図２に示すように、約４３ｋＤの分子量では特異的バンドが認められ、それは、ＶＮＰ２０００９、ＶＮＰ２０００９−Ｖに比べて、ＶＮＰ２０００９−ＭのＬ−メチオニナーゼ発現量が明らかに向上したことを示した。

Ｌ−メチオニンとピリドキサールをそれぞれＶＮＰ２０００９−Ｖ及びＶＮＰ２０００９−Ｍ菌体と混合し、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートした後、５０％トリクロロ酢酸で停止して、遠心分離して上澄を得て、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン−ヒドラゾン塩酸塩水和合（ＭＢＴＨ）と均一になるまで十分に混合し、５０℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、３２０ｎｍでの吸光値を測定し、１分間にケト酪酸を触媒変換する触媒の量を１酵素活性ユニットとして定義した。その結果（図３参照）、サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍのメチオニナーゼ活性は、ＶＮＰ２０００９−Ｖよりも１０倍高かった。

以上から分かるように、構築された遺伝子工学菌であるサルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、高いメチオニナーゼ活性を有するため、メチオニナーゼ製剤製造用として有用であった。

実施例２ 遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの軟部組織肉腫の治療効果

１）、過去の病歴及び診断

臨床で、６４歳の男性患者は、左脚の腫瘍塊は南京市鼓楼病院で穿刺生検により紡錘状細胞肉腫であると同定された。その後、腫瘍切除術を受けて、再度組織をとって病理を分析し、腫瘍細胞は、ＳＭＡ（−）、ＤＥＳ（−）、ＭｙｏＤ１（−）、ＣＤ３４（−）、ＥＭＡ（−）、ＣＫｐａｎ（−）、ＥＭＡ（−）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（−）を示し、ＨＥセクションと組み合わせると、悪性線維性組織球腫であった。

定期的なフォローアップから、ＣＴで右肺での葉軟部組織占拠性病変を発見した、生検の病理学により紡錘細胞肉腫が示された。患者の以前の治療および関連検査によると、紡錘状細胞肉腫が肺に転移した後の再発と診断された。

２）治療計画

２５０ｍｌ生理食塩水で希釈された遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは静脈投与で体内に注入し、投与量は６．４×１０⁷ＣＦＵ／ｍ²であった。１週間間隔で５回の点滴の投与を行った。

３）治療効果

３．１ 腫瘍の大きさの変化

治療前の胸部ＣＴ検査により、肺右上葉の病巣が約１８×１０×１０ｃｍであることが示されました（図４参照）。４週間の治療後、ＣＴ検査により、肺右上葉の病巣サイズは約１７×１０×１０ｃｍであった、（図５参照）、治療前と比較して腫瘍サイズに顕著な変化はなかった。

治療前に、ＣＴ画像では、肺病巣内のフレーク状液化壊死を呈した、図４に示すように、白い線で囲んでいる病巣の内部は不均一な色を呈してた、暗い領域はここの細胞が壊死したことを示めた。明るい領域は生細胞を示めた。４週間の治療後、ＣＴ画像では、病巣内部に均一な構造を呈すことが示しされた（図５参照）、ＣＴ値は約１０ＨＵでした。ＣＴ値は物質の密度を示し、２０ＨＵ未満の場合、物質は液体であった、この領域の腫瘍細胞は基本的に壊死した、液体を呈した。これから分かるように、肉腫患者の腫瘍細胞がＶＮＰ２０００９-Ｍでの治療後に急速に壊死し、液化した。しかし、病巣は体内にあるため、液体を抽出することができず、病巣の縮小は観察されなかった。

３．２ 副作用

毎回治療の当日、注射５−６時間後で、患者の発熱が最大で約３９．６度まであり、物理的手段で降温すると体温を正常に回復することができる。当日には、約１０分間、吐き気や嘔吐を伴った。それ以外は、他の異常な感覚はなかった。治療中、肝機能及び腎機能の指標を検査して、結果を以下の表１に示した。結果から分かるように、患者の肝機能及び腎機能の各指標が正常範囲にあった。以上の結果から分かるように、ＶＮＰ２０００９−Ｍには人体に対する明らかな毒性がなかった。

以上のデータから、本発明に係る前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、悪性肉腫細胞を効果的に殺滅して、腫瘍病巣を消すことができ、しかも人体に明らかな毒性や副作用がないことが確認された。

勿論、上記実施例は、明確に説明するために挙げられた例に過ぎず、実施形態を限定するものではない。当業者であれば、上記説明に基づいて様々な形態の他の変化または変更を行うことができる。ここで、すべての実施例を挙げる必要はなく、且つこのような方法もない。それから生じた明らかな変化または変更も本発明の保護範囲に属する。

Claims (10)

1. 遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの悪性肉腫予防・治療薬の製造における応用。
2. 前記肉腫は、結合組織や筋肉等の間葉組織に由来する悪性肉腫であることを特徴とする請求項１に記載の応用。
3. 前記肉腫は、脂肪、筋膜、筋肉、繊維、リンパ及び血管、骨膜及び長骨の両端に生じる肉腫を含むことを特徴とする請求項２に記載の応用。
4. 前記肉腫は、軟部組織肉腫及び骨肉腫を含むことを特徴とする請求項３に記載の応用。
   前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの予防・治療薬の製造における応用を開示する。
5. 前記肉腫は、原発性肉腫、術後再発肉腫及び術後他の部位へ転移した肉腫を含むことを特徴とする請求項１−４のいずれか１項に記載の応用。
6. 前記肉腫は、悪性肉腫の術後、肺へ転移した肉腫であることを特徴とする請求項５に記載の応用。
7. 前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの最小有効投与量は、６．４×１０⁷ＣＦＵ／Ｍ²であることを特徴とする請求項１−６のいずれか１項に記載の応用。
8. 前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、Ｌ−メチオニナーゼ遺伝子がクローニングされた弱毒ネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９であることを特徴とする請求項１−７のいずれか１項に記載の応用。
9. 前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、Ｌ−メチオニナーゼ遺伝子がクローニングされたプラスミドを有する弱毒ネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９であることを特徴とする請求項８に記載の応用。
10. 前記遺伝子工学菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、Ｌ−メチオニナーゼ遺伝子をプラスミドにサブクローニングして、Ｌ−メチオニナーゼ発現プラスミドを得て、Ｌ−メチオニナーゼ発現プラスミドを弱毒ネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９に電気的形質転換する方法によって構築されることを特徴とする請求項８−９のいずれか１項に記載の応用。