KR102344116B1 - 총명탕 및 감초 복합물을 함유한 기억력 증진 기능성 강화 된장 조성물 - Google Patents

총명탕 및 감초 복합물을 함유한 기억력 증진 기능성 강화 된장 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102344116B1
KR102344116B1 KR1020200080469A KR20200080469A KR102344116B1 KR 102344116 B1 KR102344116 B1 KR 102344116B1 KR 1020200080469 A KR1020200080469 A KR 1020200080469A KR 20200080469 A KR20200080469 A KR 20200080469A KR 102344116 B1 KR102344116 B1 KR 102344116B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
soybean paste
licorice
memory
doenjang
activity
Prior art date
Application number
KR1020200080469A
Other languages
English (en)
Inventor
노성수
신미래
박해진
윤지영
Original Assignee
대구한의대학교산학협력단
(주)알알이푸드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대구한의대학교산학협력단, (주)알알이푸드 filed Critical 대구한의대학교산학협력단
Priority to KR1020200080469A priority Critical patent/KR102344116B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102344116B1 publication Critical patent/KR102344116B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/70—Germinated pulse products, e.g. from soy bean sprouts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2300/00—Processes
    • A23V2300/14—Extraction

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

기억력 향상을 위해 처방되는 총명탕 구성 세 약재의 최적 배합비를 설정하고 최적의 총명탕 추출물에 병원성 미생물의 생육을 억제할 수 있는 감초를 혼합한 기능성 된장(이하, '총명한 된장')을 제조하고자 항산화 및 기억력 향상과 관련된 인자를 분석하여 최적의 배합비를 선정한 후 총명한 된장을 제조하였고 스코폴라민 으로 유도된 기억력 손상 동물 모델에서 그 효과를 평가하고자 하였다. 본 발명은 원지, 석창포 및 백복신의 혼합 추출물과 감초의 복합물을 함유한 된장 조성물을 제공한다.

Description

총명탕 및 감초 복합물을 함유한 기억력 증진 기능성 강화 된장 조성물{Composition for soybean paste reinforcing memory enhancement function having composite of Chongmyungtang and licorice}
본 발명은 된장 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 기억력 증진 기능성 강화 된장 조성물에 관한 것이다.
우리나라의 대표적인 발효 식품인 된장은 고유한 풍미를 가지고 있으며 영양학적 면에서 우수할 뿐만 아니라 항산화 작용, 혈당 강하 작용, 항균 작용, 항암, 항돌연변이, 항비만 및 혈관질환 예방 등과 같은 다양한 생체의 조절 기능이 보고되어 기능성 식품으로 주목받고 있으며 이에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다(비특허문헌 1 내지 5 참조). 된장은 탄수화물 위주의 식생활에서 부족하기 쉬운 단백질을 보충해줄 수 있는 양질의 단백질 급원 식품으로 지방 성분은 대부분이 불포화 지방산 형태로 심혈관계 질환 등을 유발할 가능성이 낮다. 특히 리놀레인산(linolenic acid) 등은 체내에 콜레스테롤이 축적되는 것을 방지하여 혈액순환을 원활하게 해 준다(비특허문헌 6 및 7 참조). 최근에는 식생활 패턴의 변화와 핵가족화, 간편식과 같은 편리성을 추구하는 소비자의 요구로 인해 기호도에 따른 개량식 된장이 개발되고 있다(비특허문헌 8 참조). 즉 다시마, 고구마, 버섯류, 녹차, 유자즙, 보리된장 등의 다양한 재료를 첨가하여 맛을 향상시키고 기능성을 증가시킨 된장들이 이에 해당 된다(비특허문헌 9 내지 13 참조).
총명탕(聰明湯, Chongmyung-tang, CMT)은 기억력 감퇴로 인한 기억력 증진 및 건망 등의 치료를 위해 임상에서 다용되는 처방으로 허준의 동의보감(東醫寶鑑)에는 “다망”(”多忘”)을 치료하는 것으로 수록되어 있다(비특허문헌 14 참조). 총명탕은 원지(遠志), 석창포(石菖蒲), 백복신(白茯神) 등 세 가지 약재를 동일한 분량으로 섞어 한번에 12 g 씩 달여 먹거나 8 g 씩 찻물에 타서 하루에 3번 복용하는 것으로 되어 있다(비특허문헌 15 참조). 건망 유도 백서에서 총명탕 공급이 학습 및 기억력 증진 관련 유의성이 있음이 보고되었다(비특허문헌 16 참조). 원지는 머리를 맑게 하고 정신을 안정시키며 담을 제거하고 울결을 풀어주는 효능이 있다. 원지는 실험 연구를 통해 아포모르핀(apomorphine)으로 유발된 생쥐의 과행동 및 상동적 행동의 억제 효과, 뇌성상 세포에 작용하는 염증 유발 세포활성물질의 생성 억제, 진통, 해열, 이뇨, 지질과산화 억제 및 혈관성 치매의 학습 및 기억 장애 개선 등의 효과가 보고된 바 있다(비특허문헌 17 참조). 석창포는 기(氣)의 순환을 조절하고 혈(血)을 운행시키며 습(濕)을 제거하는 효능이 있다. 석창포의 실험 연구를 통해 국소 뇌 혈류량 증가, 뇌연막 동맥의 직경 확장, 경련 억제, MAO 억제 활성, 장관 운동의 이완, 혈중 콜레스테롤 감소, 잔틴산화효소(xanthineoxidase) 억제 활성 및 지질과산화 억제 효과가 보고된 바 있다(비특허문헌 16 참조). 백복신은 마음을 가라앉히고 물(水)을 배출시키며 심허(心虛) 경계, 건망증, 불면증 및 소변불리(小便不利)를 치료한다고 하였다(비특허문헌 18 참조). 동의보감 처방 중에는 정지환, 보심환, 성심산, 영지원, 상표초산, 장원환, 주자독서환, 정백환, 진사영지환, 천왕보시단과 같이 총명탕과 다른 약재를 배합하여 치료 효과를 증대하고자 하였으며 이 중 건망을 치료하는 데 사용되는 주자독사환은 총명탕에 감초가 함유되어 있다(비특허문헌 14 및 19 참조). 감초(甘草, licorice)는 약용이나 식품 분야에서 널리 이용되고 있으며 항산화 활성, 항균 작용 및 면역 증강 효과 등이 보고되고 있다(비특허문헌 20 및 21 참조).
스코폴라민(Scopolamine)은 시냅스의 무스카린 콜린성 수용체의 길항제로서 시냅스에서 유리되는 신경전달물질인 아세틸콜린과 무스카린 수용체간의 결합을 저해하여 정보전달을 방해함으로써 학습 또는 인지기능을 손상시킨다. 따라서 학습 및 기억력 개선 효과를 검증 시 기억력 손상 동물모델에 많이 이용되고 있다(비특허문헌 37 및 38 참조).
[비특허문헌]
1. Kim SH. New trends of studying on potential activities of doenjang. Korea Soybean Digest. 1998 ; 15 : 8-15.
2. Oh HJ, Kim CS. Antioxidant and nitrite scavenging ability of fermented soy foods (Chungkujang, Doenjang). J Korean Soc Food Sci Nutr. 2007 ; 36 : 1503-1510.
3. Jung KO, Park SY, Park KY. Longer aging time increases the anticancer and antimetastatic properties of doenjang. Nutrition. 2006 ; 22 : 539-545.
4. Lee JJ, Kim AR, Lee H, Kim CH, Chang HC, Lee MY. Effects of soybean, cheonggukjang and doenjang on serum cholesterol level and weight reduction in rats fed a high-fat/high cholesterol diet. Korean J Food Preserv. 2011 ; 18 : 226-235.
5. Cui CB, Lee EY, Lee DS, Ham SS. Antimutagenic and anticancer effects of ethanol extract from Korean traditional doenjang added sea tangle. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2002 ; 31 : 322-328.
6. Park KY, Moon SH, Baik Hs, Cheigh HS. Antimutagenic effect of Doenjang (korean fermented soy paste) toward aflatoxin. J Korean Soc Food Sci Nutr. 1990 ; 19 : 156-162.
7. Yang BK, Park JB, Ha SO, Kim KY, Kym KH, Park, KY, Yun JW, Song CH. Hypolipidemic Effect of Extracts of Syobean Paste Containing Mycelia of Mushrooms in Hyperlipidemic Rats. Kor J Appl Microbiol Biotechnol. 2000 ; 28 : 228-232.
8. Kim DH, Kim S. Effect of Meju Shapes and Strains on the Chemical Composition of Soybean Paste. J Korean Soc Food Sci Nutr. 1986 ; 15 : 1-9.
9. Bae JO, Lee KJ, Park JS, Choi DS. Preparation of sweet potato doenjang using colored sweet potato. Korean J Food Nutr. 2012 ; 25 : 529-537.
10. Lee SJ, Lee KJ, Rhee SH, Park KY. Physiological activity in doenjang added with various mushrooms. Korean J Food Cookery Sci. 2004 ; 20 : 365-370.
11. Park JH, Ha AW, Cho JS. Effects of green tea soybean paste on weights and serum lipid profiles in rats fed high fat diet. Korean J Food Sci Technol. 2005 ; 37 : 806-811.
12. Shin JH, Choi DJ, Kwen OC. Quality characteristics of doenjang prepared with Yuza juice. Korean J Food Cookery Sci. 2008 ; 24 : 198-205.
13. Oh SI, Sung JM, Lee KJ. Physicochemical Characteristics and Antioxidative Effects of Barley Soybean Paste (Doenjang) Containing Kelp Extracts. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2014 ; 43 : 1843-1851.
14. Hu Jun. Dong-Eu-Bo-Gam. Seoul : Namsandang publishing. 2014. 1-832.
15. Lee SH, Chang GT, Kim JH. Effects of Chongmyung-tang on Learning and Memory Performances in Mice. Korean J Orient Physiol & Pathol. 2006 ; 20 : 471-476.
16. Park EK, Shim ES, Jung HS, Sohn NW, Sohn YJ. Effects of Chongmyung-tang, Polygalae Radix and Acori Graminei Rhizoma on Aβ Toxicity and Memory Dysfunction in Mice. Korean J Orient Int. 2008 ; 29 : 608-620.
17. Wang L, Jin GF, Yu HH, Lu XH, Zou ZH, Liang JQ, Yang H. Protective Effects of Tenuifolin Isolated From Polygala Tenuifolia Willd Roots on Neuronal Apoptosis and Learning and Memory Deficits in Mice With Alzheimer's Disease. Food Funct. 2019 ; 10 : 7453-7460.
18. Korea Meat Trade Association. Official Website. from http://www.koreantk.com/ktkp2014/medicine/medicine-view.view?medCd=M0006005. (Retrieved Apr. 20, 2020).
19. Kwak TH. Quality Characteristics of Yanggaeng added with Chongmyungtang Powder. Myongji University. Graduate school. Seoul. 2015.
20. He J, Chen L, Heber D, Shi W, Lu Q. Antibacterial compounds from G. uralensis. J Nat Prod. 2006 ; 69 : 121.
21. Ha JH, Jeong YJ, Seong JS, Kim KM, Kim AY, Fu MM, Suh JY, Lee NH, Park JN, Park SN. Antioxidant and Antibacterial Activities of Glycyrrhiza uralensis Fisher (Jecheon, Korea) Extracts Obtained by various Extract Conditi. J Soc Cosmet Sci Korea. 2015 ; 41 : 361-373.
22. Hatano T, Yasuhara T, Yoshihara R, Agata I, Noro T, Okuda T. Effects of the interaction of tannins with co-existing substances. Ⅵ. Effects if tannins and related polyphenols on superoxide anion radical, and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Chem Pharm Bull. 1989 ; 37 : 2016-2021.
23. Re R, Pellegrini N, Proteggente A. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med. 1999 ; 26 : 1231-1237.
24. Lee KH, Cho SH. Effect of the Combined Fermentation with Aspergillus oryzae and Bacillus natto on the Quality Improvement of Doenjang Meju. J Agri Life Sci. 2003 ; 37 : 9-21.
25. Jeon HJ, Lee SH, Kim SS, Kim YS. Quality Characteristics of Modified Doenjang and Traditional Doenjang. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2016 ; 45 : 1001-1009.
26. Bae CR, Kwon DY, Cha YS. Anti-Obesity Effects of Salted and Unsalted Doenjang Supplementation in C57BL/6J Mice Fed with High Fat Diet. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2013 ; 42 : 1036-1042.
27. Lee SM, Chang HC. Growth-inhibitory Effect of the Solar Salt-Doenjang on Cancer Cells, AGS and HT-29. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2009 ; 38 : 1664-1671.
28. Lim SI, Song SM. Fermentation Properties of Low-Salted Doenjang Supplemented with Licorice, Mustard, and Chitosan. Korean J Food SCI Technol. 2010 ; 42 : 323-328.
29. Kim JR, Kim YK, Kim DH. Effects of Anti-Microbial Materials on Storages of Low Salted Doenjang. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2013 ; 42 : 1864-1871.
30. Jung BM, Roh SB. Physicochemical Quality Comparison of Commercial Doenjang and Traditional Green Tea Doenjang J Korean Soc Food Sci Nutr. 2004 ; 33 : 132-139.
31. Kim JH, Oh HJ, Oh YS, Lim SB. The Quality Properties Composition of Post-Daged Doenjang(Fermented Soybean Pastes) Added with Citrus Fruits, Green Tea and Cactus Powder. J East Asian Soc Dietary Life. 2010 ; 20 : 279-290.
32. Kwon YE. In silico Prediction and In vitro Screening of Biological Activities and Pharmacokinetics for the Major Compounds in Chong Myung Tang. Yakhak Hoeji. 2007 ; 51 : 463-468.
33. Park CH, Kim SH, Choi W, Lee YJ, Kim JS, Kang SS, Suh YH. Novel anticholinesterase and antiamnesic activities of dehydroevodiamine, a constituent of Evodia rutaecarpa. Planta Med. 1996 ; 62 : 405-409.
34. Choi SM. Inhibition studies of acetylcholinesterase by natural product. Wonkwang University Graduate school. Jellabuk-do. 2020.
35. Lee MR, Sun BS, Gu LJ, Wang CY, Fang ZM, Wang Z, Mo EK, Ly SY, Sung CK. Effects of the Deer Antler Extract on Scopolamine-induced Memory Impairment and Its Related Enzyme Activities. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2009 ; 38 : 409-414.
36. Kim YH, Paek JY, Kwon HJ, Lee JW. Antioxidant and antibacterial activities of ethyl acetate extract from Scutellaria baicalensis. Korean J Food Nutr. 2009 ; 22 : 367-376.
37. Tanabe F, Miyasaka N, Kubota T, Aso T. Estrogen and progesterone improve scopolamine-induced impairment of spartial memory. J Med Dent Sci. 2004 ; 51 : 89-98.
38. Kong HJ, Lee KE, Yang KM. Antioxidant Effect of Chungkukjang Supplementation against Memory Impairment induced by Scopolamine in Mice. J East Asian Soc Diet Life. 2016 ; 26 : 237-249.
39. Maeda-Yamamoto M, Saito T, Nesumi A, Tokuda Y, Ema K, Honma D, Ogino A, Monobe M, Murakami A, Murakami A, Tachibana H, Chemical analysis and acetylcholinesterase inhibitory effect of anthocyanin-rich red leaf tea(cv. Sunrouge). J Sci Food Agric. 2012 ; 92 : 2379-2386.
40. Schliebs, R. and T. Arendt, The significance of the cholinergic system in the brain during aging and in Alzheimer's disease. J Neural Transm(Vienna), 2006 ; 113 : 1625-1644.
41. Myhrer T.Neurotransmitter systems involved in learning and memory in the rat:a meta-analysis based on studies of four behavioraltasks. Brain　Res　Rev.　2003　;　41 :　268-287.
42. Kang SJ, Woo JH, Kim AJ. The Effects of Korean Ginseng on Memory Loss in a Rat Models. J Korean Soc Food Sci Nutri. 2013 ; 42 : 1190-1196.
43. Lee MR, Sun BS, Su LJ, Wang CY, Mo EK, Yang SA, Ly SY, Sung CK. Effects of white ginseng and red ginseng extract on learning performance and acetylcholinesterase activity inhibition. J Ginseng Res. 2008：32 : 341-346.
44. Kim DE, Han DY, Kim SH, Chung DK. Anti-amnesic and Antioxidant Effect of Yeongkyekamjotanggayonggolmoryo Aqueous Extracts on Scopolamine-induced Memory Impairment in Mice. J Oriental Neuropsychiatry. 2018 ; 29 : 121-134.
45. Mihara M, Uchiyama M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem. 1978 ; 86 : 271-278.
46. Satureja bachtiarica ameliorate beta-amyloid induced memory impairment, oxidative stress and cholinergic deficit in animal model of Alzheimer's disease.Soodi M, Saeidnia S, Sharifzadeh M, Hajimehdipoor H, Dashti A, Sepand MR, Moradi S. Metab Brain Dis. 2016 ; 31 : 395-404.
47. Jang YJ, Kim J, Shim J, Kim CY, Jang JH, Lee KW, Lee HJ. Decaffeinated coffee prevents scopolamine-induced memory impairment in rats. Behav Brain Res. 2013 ; 245 : 113-119.
48. Kim SJ, Kweon DH, Lee JH. Investigation of Antioxidative Activity and Stability of Ethanol Extracts of Licorice Root (Glycyrrhiza glabra). Korean J Food SCI Technol. 2006 ; 38 : 584-588.
49. Hae DH, Park YJ, Han DS. Antioxidant Effect of Polygalae Radix Extract on the Glioma Cells Damaged by Reactive Oxygen Species in Culture. J People Plants Environ. 2009 : 12 : 11-18.
50. Gu BS, Lee DU. Antioxdative Effect of the Essential Oil form the Rhizomes of Acorus gramineus. Korean J Life Sci. 2001 ; 11 : 503-508.
51. Jang YA, Lee JT. The Evaluation of Antioxidant, Anti-inflammatory, and Anti-aging of Extract Solvent and Poria cocos by Parts. Asian J Beauty Cosmetol. 2015 ; 13 : 377-383.
이에 본 발명은 기억력 향상을 위해 처방되는 총명탕 구성 세 약재의 최적 배합비를 설정하고 최적의 총명탕 추출물에 병원성 미생물의 생육을 억제할 수 있는 감초를 혼합한 기능성 된장(이하, '총명한 된장')을 제조하고자 항산화 및 기억력 향상과 관련된 인자를 분석하여 최적의 배합비를 선정한 후 총명한 된장을 제조하였고 스코폴라민 으로 유도된 기억력 손상 동물 모델에서 그 효과를 평가하고자 하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 원지, 석창포 및 백복신의 혼합 추출물과 감초의 복합물을 함유한 된장 조성물을 제공한다.
또한 상기 추출물은 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 된장 조성물을 제공한다.
또한 상기 혼합 추출물은 원지, 석창포 및 백복신의 중량비가 1.5 내지 2.5 : 0.5 내지 1.5 : 1.5 내지 2.5 이고, 상기 혼합 추출물 및 상기 감초의 중량비가 1 : 0.5 내지 1.5 인 것을 특징으로 하는 된장 조성물을 제공한다.
또한 상기 혼합 추출물과 감초의 복합물이 5 내지 30 중량% 포함된 것을 특징으로 하는 된장 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 총명탕을 구성하는 원지, 석창포 및 백복신의 최적 배합비 총명탕 추출물에 감초를 혼합한 된장 조성물로서, 특정 배합의 총명탕 추출물에서의 AChE 활성, DPPH 라디칼 소거 활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성 실험, 된장 조성물에서의 수중 미로 실험, 수동 회피 실험, ACh 함량 및 AChE 활성 실험에서 유의한 결과를 확인하였고, 따라서 본 발명에 따른 조성물은 기억력 증진을 위한 용도로 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실험예에서 CMT8 배합에 따른 총명탕 추출 여과액을 나타낸 사진,
도 2는 본 발명의 실험예에서 Morris water maze test의 원형수조를 나타낸 사진,
도 3은 본 발명의 실험예에서 수동 회피 시험 장치를 나타낸 사진,
도 4는 본 발명의 실험예에서 CMT 18종의 DPPH free radical 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프,
도 5는 본 발명의 실험예에서 CMT 18종의 ABTS free radical 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프,
도 6은 본 발명의 실험예에서 CMT 18종의 AChE 활성 저해 측정 결과를 나타낸 그래프,
도 7은 본 발명의 실험예에서 제조된 총명한 된장 샘플을 나타낸 사진,
도 8 및 도 9는 각각 본 발명의 실험예에서 Morris 수중 미로 실험 결과를 나타낸 그래프,
도 10은 본 발명의 실험예에서 수동 회피 시험 결과를 나타낸 그래프,
도 11은 본 발명의 실험예에서 뇌 MDA 측정 결과를 나타낸 그래프,
도 12는 본 발명의 실험예에서 ACh 함량 분석 결과를 나타낸 그래프,
도 13은 본 발명의 실험예에서 AChE 활성 분석 결과를 나타낸 그래프,
도 14는 본 발명의 실험예에서 간기능 분석 결과를 나타낸 그래프,
도 15는 본 발명의 실험예에서 신기능 분석 결과를 나타낸 그래프.
이하 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명에서는 총명탕을 구성하는 원지, 석창포 및 백복신의 최적 배합비 총명탕 추출물에 감초를 혼합한 된장 조성물로서, 특정 배합의 총명탕 추출물에서의 AChE 활성, DPPH 라디칼 소거 활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성 실험, 된장 조성물에서의 수중 미로 실험, 수동 회피 실험, ACh 함량 및 AChE 활성 실험에서 유의한 결과를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 원지, 석창포 및 백복신의 혼합 추출물과 감초의 복합물을 함유한 된장 조성물을 개시한다.
상기 혼합 추출물의 형태나 성상에는 제한이 없으며, 용액, 농축물일 수도 있고, 추출물 제조에 사용된 용매를 제거한 고형분 또는 분말일 수도 있다.
상기 혼합 추출물은 당 업계에 공지된 통상의 추출방법, 예를 들어 용매 추출법을 사용하여 제조될 수 있다. 용매 추출법을 이용한 추출물 제조 시 사용되는 추출 용매는 물, 탄소수가 1 내지 4인 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 또는 이들의 혼합물인 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 물 또는 에탄올이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에 따르면, 상기 물을 용매로 사용하여 상기 혼합 추출물을 제조하는 방법으로서, 건조된 원지, 석창포 및 백복신에 물을 2 내지 20배(v/w), 바람직하게는 5 내지 15배(v/w) 가하여 1 내지 5시간, 60 내지 90℃, 또는 70 내지 90℃, 또는 75 내지 85℃에서 열수 추출하여 복합 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명에서 AChE 활성 등 여러 인자의 유의성 검정을 통한 조성물의 기억력 증진 효능 구현 여부를 확인함에 있어 혼합 추출물의 배합과, 감초와의 복합 비율, 그리고 된장 조성물에서 혼합 추출물과 감초와의 복합물의 함량이 매우 중요한 요소임을 확인하였다.
따라서 본 발명의 일 예에 따르면, 상기 혼합 추출물은 원지, 석창포 및 백복신의 중량비가 1.5 내지 2.5 : 0.5 내지 1.5 : 1.5 내지 2.5 이고, 상기 혼합 추출물 및 상기 감초의 중량비가 1 : 0.5 내지 1.5 일 수 있다. 바람직하게는 상기 혼합 추출물은 원지, 석창포 및 백복신의 중량비가 1.8 내지 2.2 : 0.8 내지 1.2 : 1.8 내지 2.2 이고, 상기 혼합 추출물 및 상기 감초의 중량비가 1 : 0.8 내지 1.2 일 수 있다.
또한 본 발명의 일 예에 따르면, 된장 조성물에서 상기 복합물이 5 내지 30 중량% 포함될 수 있고, 바람직하게는 10 내지 20 중량% 포함될 수 있다.
이하, 구체적인 실험예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
실험 재료
(1) 약재
된장 발효에 사용된 황국균 중 Aspergillus oryzae은 수원발효연구소(수원, 대한민국)에서 구입하였다. 본 실험에 사용한 총명탕의 3 약재(원지, 석창포, 백복신) 및 감초는 옹기한약국(대구, 대한민국)에서 구입한 것을 생약규격집에 맞추어 관능검사하여 약전규격에 합격한 것만을 정선하여 사용하였다. 실험에 사용된 총명탕(CMT)의 제조는 원지, 석창포 및 백복신의 혼합 중량 대비 10배수의 증류수를 넣고 2시간 동안 80℃에서 열수 추출한 다음, 추출액을 여과하여 수행되었다. 적용된 배합비를 하기 표 1에 나타내었고, 그 중 CMT8 배합에 따른 총명탕 추출 여과액을 도 1에 나타내었다.
구분 원지 석창포 백복신
배합비(중량비)
CMT1 1 1 1
CMT2 2 1 1
CMT3 1 2 1
CMT4 2 2 1
CMT5 1 3 1
CMT6 2 3 1
CMT7 1 1 2
CMT8 2 1 2
CMT9 1 2 2
CMT10 2 2 2
CMT11 1 3 2
CMT12 2 3 2
CMT13 1 1 3
CMT14 2 1 3
CMT15 1 2 3
CMT16 2 2 3
CMT17 1 3 3
CMT18 2 3 3
(2) 시약
본 실험에 사용된 potassium persulfate, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS), 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 및 Scopolamine는 Sigma Aldrich(St Luis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
(3) 동물
실험동물은 대한바이오링크(음성, 한국)에서 제공받은 6주령의 수컷 ICR mouse(25 내지 30 g)을 사용하였다. 온도(22±2°C), 습도(50±20%), 조명시간 및 명암주기 12 h/day/night, 조도(150∼300 Lux)가 유지되는 사육실에서 일주일간 적응한 후 본 실험에 투입되었다. 또한, 대구한의대학교 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee : IACUC)의 승인(승인번호: DHU2019-069)을 받아 동물 실험을 진행하였다.
실험 방법
(1) DPPH 라디칼 소거 활성 측정
배합비를 달리한 CMT 18종의 free radical 소거능 분석을 위해 DPPH free radical 소거능을 활용하였다(비특허문헌 22 참조). 60 μM DPPH 용액 100 ㎕와 각 CMT 200 ㎍/㎖로 희석한 용액 100 ㎕를 잘 혼합하여 25℃ 실온의 암실에 30분간 두었다가 Microplate reader(Infinite M200 pro, Tecan, Switzerland)로 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 흡광도는 하기 수학식 1에 따라 계산하여 값을 구하였다.
[수학식 1]
Figure 112020067948202-pat00001
ODsample : Absorbance of sample
ODcontrol : Absorbance without sample
(2) ABTS 라디칼 소거 활성 측정
배합비를 달리한 CMT 18종의 free radical 소거능 분석을 위해 ABTS free radical 소거능을 활용하였다(비특허문헌 23 참조). 7 mM ABTS 용액과 2.45 mM Potassium persulfate를 잘 혼합하여 실온의 암실에 두었다가 약 16시간 이상 방치 하여 ABTS+를 형성시킨 후 파장 415 nm에서 0.70±0.02이 되게 에탄올로 희석하였다. 희석된 용액 95 ㎕에 각 CMT 5 ㎕를 가하여 15분간 방치한 후 Microplate reader(Infinite M200 pro, Tecan, Switzerland)로 흡광도를 측정하였으며, 흡광도는 하기 수학식 2에 따라 계산하여 값을 구하였다.
[수학식 2]
Figure 112020067948202-pat00002
ABTS radical scavenging activity (%)
ODsample : Absorbance of sample
ODcontrol : Absorbance without sample
(3) Acetylcholinesterase의 활성 저해 효과 측정
반응액 1 ㎖에 기질 acetylcholine(ACh)의 농도는 0.1 mM, coupling agent DTNB의 농도는 0.2 mM, 시료 검액은 0.1 mg(500 ㎕)으로 혼합하여 항온조에서 4분간 incubation한 후 효소액 (AChE 10 unit/10 ㎕)을 첨가하고 60초 동안 incubation한 후 412 nm에서 흡광도를 측정하였으며 Acetylcholineesterase의 활성 저해 효과는 대조군의 흡광도와 시료 검액을 넣어준 검액군의 흡광도를 이용하여 하기 수학식 3에 따라 계산하여 값을 구하였다.
[수학식 3]
Figure 112020067948202-pat00003
(4) 약물투여와 군 분리
실험군은 정상식이를 급여한 정상군(Normal), Scopolamine으로 기억력 손상을 유도 후 증류수를 경구 투여한 대조군(Control), Scopolamine으로 기억력 손상을 유도 후 Red Ginseng 200 mg/kg 투여군(RG200), Scopolamine으로 기억력 손상을 유도 후 된장(Doenjang) 1000 mg/kg 투여군(DJ1000), Scopolamine으로 기억력 손상을 유도 후 CMT Doenjang 500 mg/kg 투여군(CDJ500), Scopolamine으로 기억력 손상을 유도 후 CMT Doenjang 1000 mg/kg 투여군(CDJ1000)으로 총 6군으로 군 분리 하였으며, 마릿수는 각 10 마리였다. 각 약물을 매일 일정한 시간에 존대를 이용하여 4주간 경구 투여하였다.
(5) Morris water maze test 및 수동 회피 실험
기억력 손상을 유발하기 위해 마지막 경구 투여 30분 후 Scopolamine 1 mg/kg 용량으로 1 회 복강 내 투여하였으며 기억력 손상 유발 후 1시간 뒤에 행동실험, 즉 Morris water maze test와 수동 회피 실험 (Passive avoidance test)을 차례로 진행하였다.
1) Morris water maze test
Morris water maze test를 통한 공간학습 및 인지력 개선에 대한 실험은 원형수조(직경: 140 cm, 높이: 45 cm) 안에 19 내지 23℃의 미지근한 물을 약 70% 채우고 수중미로의 주변은 비디오카메라와 연결된 컴퓨터 시스템과 주위환경 등 공간단서들을 항상 일정하게 유지시킨다. 원형수조에 가상의 사분면을 만들고 한쪽 사분면 중앙에 platform(도피대, 높이: 72 mm, 지름: 50 mm)을 수면 아래 1 m에 위치하도록 물높이를 조절하고 탈지분유를 풀어 platform이 보이지 않도록 하였다(도 2 참조). 분면 중 platform이 없는 3개의 사분면에서 출발 위치를 매번 변경하며 동물을 수조에 넣어 platform을 찾아가도록 하고 그 시간(escape latency)을 video tracking system을 이용하여 측정한다. 시험 첫날은 platform 없이 수조 안에서 실험동물을 90초간 자유롭게 수영을 시킴으로써 maze에 대한 적응을 시켰고, 이후 2일째부터 5일째 되는 날까지 매일 출발하는 사분면을 달리하여 인지적응 훈련(training trial)을 수행한다. 동물을 90초 동안 platform의 위치를 찾도록 하고, platform에 도달하면 15초 동안 platform에 머물도록 하여 해당 위치를 기억하도록 하였고, 90초 안에 platform의 위치를 찾지 못하는 동물은 platform 위에 15초간 유지시켜 platform의 위치를 인식(test trial section) 할 수 있도록 하였다. 위와 같은 방법으로 인지 적응 훈련을 1일 2회씩 30초 간격으로 4일 동안 총 8회 실시하였다. 그 후 원형 수조의 platform을 제거한 후 30초 동안 동물이 platform이 있었던 사분면에 머무는 시간(탈출 잠복기)을 측정하였다.
2) 수동 회피 시험
시험물질의 기억력 손상 예방 효과를 알아보기 위하여 Scopolamine 투여 30분 후 수동회피시험을 실시한다. 설치류가 어두운 곳을 선호하는 성향을 이용하여 기억력을 측정하는 실험으로 수동회피 상자는 밝은 방과 어두운 방으로 구성하였다. 측정기기는 내부가 두 개의 방으로 구성된 아크릴 상자(shuttle box, 53 cm W × 44 cm H × 33 cm D)의 가운데에 guillotine door가 존재하며 바닥(grid floor) 전체에 전기쇼크(scrambled foot-shock)를 가할 수 있는 장치가 되어 있다(도 3 참조). 좌측 방은 전구가 켜져서 밝은 환경을 조성하고, 우측 방은 어두운 환경이지만 동물이 이동했을 경우 sensor가 작동하여 전기 자극(0.3 mA, 5 sec)을 준다. 동물을 좌측 방에 넣은 후 30초 동안 안정감을 준 뒤 밝은 방에 불을 켰다. 이어서 30초 후에 guillotine door가 열리면 밝은 방에 머무는 시간이 측정되며 동물이 우측 방으로 네 발이 다 들어가면 문이 닫히고 0.3 mA, 5초 조건의 전기 자극을 줘서 회피할 수 있게 인식(학습시험: training trial) 시킨다. 위와 같은 방법으로 동물이 우측 방으로 120초 동안 이동하지 않을 때까지 반복하였다. 1차 측정 24시간 후 문이 열려도 밝은 방에 머무는 시간, 즉 step-through latency time(머무름 시간, 체류 잠복기)을 최대 300초(cut-off time)까지 측정하였다.
(6) 간기능 분석
간기능 손상 지표인 Aspartate aminotransferase(AST) 및 alanine aminotransferase(ALT)는 assay kit(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka, Japan)의 프로토콜에 따라 측정하였다.
(7) 신기능 분석
신기능 손상 지표인 Blood urea nitrogen(BUN) 및 Creatinine는 assay kit(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka, Japan)의 프로토콜에 따라 측정하였다.
(8) 지질과산화 측정
혈청 지질과산화(Thiobarbituric acid reactive substances; TBARS)는 Mihara and Uchiyama의 방법을 사용하여 측정하였다(비특허문헌 45 참조). 복대정맥에서 채혈한 혈액을 5,000 × g(10분) 원심 분리하여 혈청을 얻었다. 흡광도는 UV 분광광도계(spectrophotometer)(Infinite M200, Tecan, Salzburg, Austria)로 540 nm에서 측정하였다.
(9) ACh 함량 분석
행동실험을 종료 후 마우스를 희생시켜 대뇌피질(cerebrum cortex) 및 해마(hippocampus) 부위를 적출하여 10배의 20 mM sodium phosphate buffer(pH 7.4)를 가하고 homogenizer로 균질화한 다음 12,000 × g에서 30분간 원심 분리한 후 상층액을 취하였다. ACh 함량의 측정을 위하여 invitorgen사의 Amplex Red Acetylcholine Assay Kit(Eugene, USA)를 이용하였다. 시료 100 ㎕를 형광 96 well plate에 분주한 다음 100 ㎕의 400 μM Amplex red reagent working solution을 가하여 실온에서 30분간 배양 뒤 544 nm excitation 및 590 nm emission의 파장에서 SPECTRA MAX GEMINI XS(Molecular Device, USA)로 형광을 측정하였다.
(10) AChE 활성 분석
AChE의 활성 측정을 위해 invitorgen사의 Amplex Red Acetylcholinesterase Assay Kit(Eugene, CA USA)를 이용하여 AchE 활성을 측정하였다. 미리 준비한 시료와 AChE 활성 측정에 사용되는 반응시약 (20 ㎕ Amplex red reagent, 10 ㎕ HRP stock solution, 10 ㎕ choline oxidase stock solution, 10 ㎕ acetylcholne stock solution, 950 ㎕ 1 × reaction buffer)을 각각 100 ㎕씩 형광 96 well plate 넣어준 후 실온에서 30분간 배양한 뒤 544 nm excitation 및 590 nm emission의 파장에서 SPECTRA MAX GEMINI XS(Molecular Device, USA)로 형광을 측정하였다.
(11) 통계분석
모든 수치는 mean±SD 및 mean±SEM으로 표시하였으며, SPSS program for windows version 25(SPSS Inc., Chicago, USA)를 사용하여 One-way analysis of variance(ANOVA)로 검정한 후 각 자료의 통계적 유의성은 Least Significant Difference(LSD) method로 검증하였고, 유의수준은 p<0.05에서 판정하였다.
실험 결과
(1) DPPH free radical 소거능 측정
본 발명에 따른 실험에 사용된 CMT 18종의 항산화 활성을 평가하기 위해 각 시료 200 ㎍/㎖ 처치 후 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 가장 뛰어난 라디칼 소거활성은 CMT4(93.07±1.14%)로 나타났으며, 그 다음은 CMT16(9.37±0.19%), CMT8(91.28±0.14%) 순 이었다(도 4 참조).
(2) ABTS free radical 소거능 측정
본 발명에 따른 실험에 사용된 CMT 18종의 항산화 활성을 평가하기 위해 각 시료 200 ㎍/㎖ 처치 후 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 가장 뛰어난 라디칼 소거활성은 CMT11(93.54±0.63%)로 나타났으며, 그 다음은 CMT10(87.24±0.14%), CMT12(86.60±0.44%) 순 이었다(도 5 참조).
(3) AChE 활성 저해 효과
CMT 18종의 AChE 활성 저해 측정 결과, CMT8(49.81±0.51%)이 가장 뛰어난 활성 저해 효과를 보였으며, 그 다음으로는 CMT18(41.20±0.53%), CMT17(33.36±0.45%) 순 이었다(도 6 참조).
(4) CMT의 최적 배합비 선정
본 발명에 따른 실험에 사용된 CMT 18종의 AChE assay, DPPH assay 및 ABTS assay를 종합적으로 비교 분석해 본 결과, CMT8이 CMT18보다 AChE assay에서 20.91배, DPPH assay는 98.13배의 우수한 억제능을 가지고 있었으나, ABTS assay에서는 CMT18이 CMT8보다 14.32배 우수하였다. 따라서 CMT의 최적 배합비는 CMT8 즉, (원지 2, 석창포 1, 백복신 2)로 결정되었다(하기 표 2 참조).
Figure 112020067948202-pat00004
(5) 총명한 된장 제조
국내산 대립종(大粒種)을 전용세척기에서 세척을 한 후 전기솥으로 2시간 동안 삶았다. 그리고 황국균 중 Aspergillus oryzae을 18 g/대두 150 kg 비율로 배합하였다. 황국균을 접종한 대두는 전용선반에 실리콘 포를 깔고 2 cm 두께로 담고 33°C 19시간 동안 발효시킨 후 건조기로 건조하였다. 총명탕 추출물(CMT8)과 감초를 1:1 중량비로 첨가한 소금물에 침지시키고(염도 17) 50일 후 된장으로 분리하였다. 이때, 총명탕 추출물(CMT8)과 감초의 복합물의 함량이 각각 10 중량%, 10 중량%, 20 중량% 및 30 중량%가 되도록 제조하였으며, 도 7에 각 제조된 샘플을 나타내었다.
상기 제조된 총명한 된장에 대해 무작위 맹검으로 맛을 평가한 결과, 총명탕 원액과 같은 맛은 보이지 않았으며, 다만 색도의 차이가 있는 것으로 보여진다. 복합물의 함량이 30 중량%인 총명한 된장에서도 한약재 특유의 향취와 맛은 나타나지 않았다. 이하, 복합물의 함량이 10 중량%인 총명한 된장에 대해 실험을 수행하였다.
(6) Morris 수중 미로 실험
실험동물이 platform에 도달하기까지의 소요시간을 측정하는 학습 시험에서 플랫폼에 도달하는 소요 시간은 정상군에 비해 대조군에서 유의하게 증가하였다 (p<0.001). 반면 홍삼 투여군, 된장(복합물 함량 0 중량%) 투여군 및 총명한 된장 투여군 모두에서 대조군과 비교하였을 때 소요시간이 유의하게 감소하였다(도 8 참조).
또한 platform을 제거한 후 30초 동안 동물이 platform이 있었던 사분면에 머무는 시간을 측정한 결과, 정상군(12.63±0.84 sec), 대조군(5.88±0.40 sec), RG200(8.00±0.27 sec), DJ1000(7.25±0.53 sec), CDJ500(7.63±0.53 sec), CDJ1000(8.13±0.40 sec)로 나타났다(도 9 참조). 결과적으로 대조군은 정상군과 비교하여 그 시간이 46.56% 줄었다. 대조군과 비교하여 RG200(136.05%), DJ1000(123.30%), CDJ500(129.76%), CDJ1000(138.27%)의 비율로 탈출 잠복기(Escape latency time) 변화는 유의하게 증가하였다. 즉 탈출 잠복기에 있어서 DJ 투여군보다는 CDJ 투여군에서 더 효과적인 것으로 나타났다(도 9 참조).
(7) 수동 회피 시험
체류 잠복기의 측정 결과, 정상군(246.13±8.87 sec), 대조군(91.25±6.08 sec), RG200(202.25±8.42 sec), DJ1000(173.38±6.1 sec), CDJ500(184±3.74 sec), CDJ1000(192.38±3.87 sec)로 나타났다(도 10 참조). 정상군과 비교하였을 때, 대조군은 체류 잠복기(step-through times)가 유의하게 감소하였다(p<0.001). 반면 RG200, DJ1000 및 CDJ 투여군 모두에서 대조군과 비교하였을 때 체류 잠복기가 유의하게 증가하였다(p<0.001). 특히 CDJ 투여군에서 체류 잠복기는 용량 의존적으로 증가하였다. 결과적으로 대조군은 정상군과 비교하여 그 시간이 37.07% 줄어들었다. 대조군과 비교하여 RG200(221.64%), DJ1000(190.01%), CDJ500(201.64%), CDJ1000(210.83%)의 비율로 체류 잠복기가 유의성 있게 증가하였다. 즉 체류 잠복기에 있어서 DJ보다는 CDJ에서 더 효과적인 것으로 나타났다.
(7) 뇌 MDA 측정
지질과산화 MDA 측정 결과, 정상군(1.51±0.09 nmol/㎖), 대조군(2.71±0.13 nmol/㎖), RG200(1.89±0.05 nmol/㎖), DJ1000(2.18±0.06 nmol/㎖), CDJ500(2.11±0.05 nmol/㎖), CDJ1000(1.84±0.05 nmol/㎖)로 나타났다. 정상군과 비교하였을 때, 대조군은 지질 과산화 MDA 수준이 유의하게 증가하였다 (p<0.001). 반면 RG200, DJ1000 및 CDJ 투여군 모두에서 대조군과 비교하였을 때 지질 과산화 MDA 수준이 유의하게 감소하였다(p<0.001). 특히 CDJ 투여군에서 지질 과산화 MDA 수준은 용량 의존적으로 감소하였다(도 11 참조). 결과적으로 대조군은 정상군과 비교하여 MDA 수준이 179.47% 증가하였다. 대조군과 비교하여 RG200(30.26%), DJ1000(19.56%), CDJ500(22.14%), CDJ1000(32.10%)의 비율로 MDA 수준이 유의하게 감소하였다. 즉 지질과산화에 있어서 DJ보다는 CDJ에서 더 효과적인 것으로 나타났다.
(8) ACh 함량 분석
ACh 함량은 정상군을 100으로 하였을 때의 비율로(% of Normal) 환산하였을 때 정상군(100.00±1.75), 대조군(50.30±1.36), RG200(73.58±2.32), DJ1000(61.95±1.44), CDJ500(65.03±3.12), CDJ1000(74.61±1.65)로 나타났다. 정상군과 비교해 대조군의 뇌조직의 ACh 함량은 유의하게 감소하였다(p<0.001). 반면 RG200, DJ1000 및 CDJ 투여군 모두에서 대조군과 비교하였을 때 ACh 함량은 유의하게 증가하였다(p<0.001). 특히 CDJ 투여군에서 ACh 함량은 용량 의존적으로 증가하였다(도 12 참조). 결과적으로 대조군은 정상군과 비교하여 ACh 함량이 50.3% 감소하였다. 대조군과 비교하여 RG200(146.28%), DJ1000(123.16%), CDJ500(129.28%), CDJ1000(148.22%)의 비율로 ACh 함량이 유의하게 증가하였다. 즉 ACh 함량에 있어서 DJ보다는 CDJ에서 더 효과적인 것으로 나타났다.
(9) AChE 활성 분석
AChE 함량은 정상군을 100으로 하였을 때의 비율로(% of Normal) 환산하였을 때 정상군(100±1.8), 대조군(166.4±2.0), RG200(119.8±4.0), DJ1000(127.6±5.6), DCJ500(121.6±3.4), CDJ1000(116.4±3.1)로 나타났다. 정상군과 비교해 대조군의 뇌조직의 AChE 함량은 유의하게 증가하였다(p<0.001). 반면 RG200, DJ1000 및 CDJ 투여군 모두에서 대조군과 비교하였을 때 AChE 함량은 유의하게 감소하였다(p<0.001). 특히 CDJ 투여군에서 AChE 함량은 용량 의존적으로 감소하였다(도 13 참조). 결과적으로 대조군은 정상군과 비교하여 AChE 함량이 50.3% 감소하였다. 대조군과 비교하여 RG200(72%), DJ1000(76.7%), CDJ500(73.1%), CDJ1000(70%)의 비율로 AChE 함량이 유의하게 감소하였다. 즉 AChE 함량에 있어서 DJ보다는 CDJ에서 더 효과적인 것으로 나타났다.
(10) 간기능 분석
간기능 지표인 AST의 수치(U/L)를 확인한 결과, 정상군(74.3±3.1)에 비하여 대조군(88.0±2.0)은 유의하게 증가하였고(p<0.001), DJ1000(79.8±4.8)를 제외한 약물군 RG200(74.7±2.4), CDJ500(78.3±2.6), CDJ1000(75.8±1.8)에서는 유의하게 감소하였다(p<0.01, p<0.05, p<0.01 repspectively). 또한 ALT의 수치(U/L)를 확인한 결과, 정상군(44.2±1.9)에 비하여 대조군(51.8±1.5)은 유의하게 증가하였지만 RG200(48.2±2.2), DJ1000(48.2±2.3), CDJ500(47.5±3.1) 및 CDJ1000(46.2±2.6)로 감소하는 경향을 보여주었다(도 14 참조).
(11) 신기능 분석
신기능 지표인 BUN의 수치(mg/㎗)를 확인한 결과, 정상군(15.7±0.6)에 비하여 대조군(19.6±0.7)은 유의하게 증가하였고(p<0.001), 유의한 감소를 보인 CDJ1000(17.0±0.5)(p<0.01)를 제외한 RG200(18.3±0.5), DJ1000(18.7±0.9) 및 CDJ500(17.8±0.5)에서는 감소하는 경향을 보였다. 또한 Creatinine의 수치 (mg/㎗)를 확인한 결과, 정상군(0.174±0.005)에 비하여 대조군(0.2±0.008)은 유의하게 증가하였다(p<0.05). CDJ500(0.178±0.006)와 CDJ1000(0.167±0.004)에서 용량 의존적 유의한 감소를 보였으나 RG200(0.182±0.006), DJ1000(0.18±0.011)에서는 감소하는 경향을 보여주었다(도 15 참조).
대두는 조직이 견고하여 소화하기 어렵기에 장류라는 가공 방식을 주로 이용하는데 이 중 된장은 우리나라 가정의 중요한 반찬과 조미료로서 식품영양학적 면에서 독보적인 위치를 차지하고 있다(비특허문헌 24 참조). 식품공전에 장류로 고시된 된장은 대두, 쌀, 밀, 보리 또는 탈지 대두 등을 주재료로 하여 누룩균 등을 배양한 후 식염을 첨가하여 발효 및 숙성시킨 것 또는 메주를 식염수에 담가 발효하고 그 여액을 분리하여 가공한 것으로 전통된장과 개량된장으로 구분한다. 전통된장은 곰팡이나 세균이 메주 발효과정에 관여하여 된장의 풍미와 관능적 품질에 상당한 영향을 미친다(비특허문헌 25 참조). 된장에는 isoflavon, globulin, trypsin inhibitor, 식이섬유, peptide, 비타민 E, 페놀산 등의 다양한 활성 성분을 함유하고 있어 각종 성인병 예방 및 치료에 적용되고 있다(비특허문헌 26 참조). 현재까지 보고된 기능성 관련 연구로는 항산화 효과, 항암 효과, 된장에서 분리한 peptide의 혈압강하 효과, 동맥경화 억제 효과, 항돌연변이 효과 등이 있다(비특허문헌 27 참조). 하지만 발효 시 사용되어지는 식염은 부패 미생물의 생육 억제 및 내염성의 발효 미생물의 선택적 성장을 조절하는 중요한 역할을 수행하나 한국의 평균 나트륨 섭취량의 약 73%가 장류 식품 중 발효식품에 기인한다고 보고하였다. 그런 이유로 저염 된장을 개발하려는 연구가 시도되고 있으나 식염 농도가 너무 낮을 시 숙성·저장 과정에서 미생물의 증식에 의한 이상 발효로 가스 발생 등 품질 저하의 원인이 되기에 알코올, 젖산, 겨자, 마늘, 키토산 및 감초 등과 같은 다양한 소재를 응용하여 미생물의 생육을 효과적으로 억제하고자 연구들이 활발히 진행되고 있다(비특허문헌 28 및 29 참조). 또한, 서구화된 식생활로 인한 각종 성인병의 예방을 위하여 된장의 기능성을 더욱 높이고자 각종 부재료를 첨가하여 제조한 기능성 된장 및 천연의 향미를 첨가하여 된장의 기호성을 향상시키고자 하는 다양한 연구가 활발히 진행되고 있다(비특허문헌 30 및 31 참조).
총명탕은 원지(Polygalae Radix), 석창포(Acori Graminei Rhizoma), 백복신(Hoelen) 세 약재로 구성되어 있는 비교적 처방이 간단한 방제로 원지는 심공(心孔; 마음의 구멍)의 담연(痰涎)을 없애주고 석창포는 심공을 활짝 열어주고 백복신은 심을 보함으로써 성냄·놀람 등을 진정시켜 마음을 평온하게 해주는 역할을 한다고 하여 고대 때부터 기억력 감퇴나 건망증 등의 치료에 활용되어 왔다. 현대 사회에서도 수험생에게서는 기억력 향상이나 학습능력 증진을 위해서 노인층에서는 치매예방을 위하여 주목되고 있는 방제여서 총명탕 제제로 시중에 유통되고 있는 실정이다(비특허문헌 32 참조). 뇌에서 인지 및 기억에 관여하는 신경계는 cholinergic 신경계, serotonergic 신경계, adrenergic 신경계, GABAergic 신경계, glutamatergic 신경계 등이 있으며, 이 중 cholinergic 신경계가 인지 장애, 학습 장애, 기억 감퇴, 판단력 소실 등과 밀접한 연관성이 있다고 알려져 있다(비특허문헌 40 참조). Acetylcholine(Ach)은 신경전달물질의 하나로 노화에 따라 감소하는데, 기억과 학습에 있어서 중요한 역할을 담당하는 cholinergic system의 심각한 손상에 의해 기억력 장애가 유발되게 된다(비특허문헌 33 참조). 주원인으로는 Ach를 생성하는 신경세포의 손상이나 신경 세포간 결합부위의 Ach을 acetate와 choline로 가수분해 시키는 acetylcholine esterase(AChE)의 활성이 증가하게 되었을 때이다. 신경근접합부 전막에 자극이 주어지면 신경접합부 틈새에서 Ach 방출을 유도하며, Ach은 신경근접합부 후막에서 확산되어 특정한 수용체들에 의해 결합되어진 다음, AChE에 의해 가수분해 되고 신경근접합부 후막의 편극화에 의해서 다시 저장 된다(비특허문헌 34 참조). 따라서 뇌조직의 기억력 감퇴는 choline계 활성 감소로 야기되어지는 것이기에 뇌 신경접합부의 콜린성 작용을 활성화시킬 수 있도록 cholinergic agonist나 AchE의 활성을 억제시키는 AChE 억제제 관련한 연구들이 기억력 향상을 위해 계속적으로 진행되고 있다(비특허문헌 35 참조). 특히 FDA에 의해 승인을 받은 tacrine는 AChE의 억제를 기전으로 하는 제제이나 일부 환자에게서 ALT 수치의 상승을 야기하는 부작용이 발견되어 사용이 제한되고 있다. 이러한 이유로 독성이 적은 한약재에서 안전하면서 부작용을 일으키지 않는 AChE 억제제 소재에 주목하고 있으며 이런 소재를 활용한 신약이나 건강기능성 식품을 개발하는 방법에 대해 관심이 높아지고 있다.
본 발명에서는 기억력 증진에 도움을 주는 총명탕과 감초가 배합된 기능성이 탁월한 된장을 제조하고자 총명탕을 구성하는 세 약재의 최적 배합비를 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능 및 AChE 억제능를 통해 도출하였으며 18가지 시료 중 최적의 배합비 한 개를 선정한 후 동량으로 감초를 배합하여 총명한 된장을 제조하였고 이는 추후 기억력 향상 및 관련 치료에 활용하는 데 기초 자료로 삼고자 하였다.
ACh은 모든 신경 세포에서 발견되는 신경전달물질로 뇌의 콜린성 시스템과 밀접한 관련성을 가지고 있다. AChE에 의해 acetate와 choline로 분해된 후 choline은 다시 신경접합부 전막으로 uptake되어 ACh 합성에 관여하게 된다. 따라서 신경접합부에 있는 ACh를 분해하는 AChE의 활성을 저해하여 ACh의 활성을 촉진하게 되면 기억력과 학습 개선에 효과적이라고 보고하였다(비특허문헌 35 참조). CMT 18종의 AChE 저해 활성 측정 결과, CMT8(49.81±0.51%)이 가장 뛰어난 활성 저해 효과를 보였으며, 그 다음으로는 CMT18(41.20±0.53%), CMT17(33.36±0.45%) 순 이었다.
활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 체내 생체 반응 동안 산소가 사용되면서 다양하게 생성되며 대표적으로 superoxide anion radical(O2 -), hydroxyl radical(OH·), hydrogen peroxide(H2O2), peroxyl radical(ROO·) 등이 있다. 이와 같은 활성 산소는 쌍을 이루지 않는 전자가 불안정한 상태로 돌아다니면서 세포막, 미토콘드리아, 단백질, 지질 등 해로운 영향을 주게 된다. 활성 산소가 약 2% 가량 생성되면 체내의 항산화 시스템을 통해서 제거시키거나 불활성화 시키지만 독성이 강하거나 과도하게 발생되었을 시 원활하게 조절되지 않아 노화, 암, 지질대사 이상, 돌연변이 등 각종 성인병 질환을 유도하게 된다. DPPH 라디칼 소거능에 사용되는 DPPH는 hydrazyl의 질소원자가 불안정한 상태로 존재함으로 쉽게 수소원자를 받아들이는 특성을 가지고 있어 항산화성 물질과 반응하게 되면 짙은 자색이 노란색으로 탈색되고 그 탈색 정도 즉 DPPH의 환원 정도를 통해 항산화능을 평가하는데 사용 된다(비특허문헌 36 참조). 본 발명에 사용된 CMT 18종의 항산화 활성을 평가하기 위해 각 시료 200 ㎍/㎖ 처치 후 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 가장 뛰어난 라디칼 소거활성은 CMT4(93.07±1.14%)로 나타났으며, 그 다음은 CMT16(9.37±0.19%), CMT8(91.28±0.14%) 순 이었다. ABTS 라디칼 소거능은 ABTS 라디칼이 항산화 물질과 반응하여 ABTS 라디칼 특유의 청록색이 탈색되어 감소되는 정도를 평가하여 항산화능을 측정한다. 본 발명에 사용된 CMT 18종의 항산화 활성을 평가하기 위해 각 시료 200 ㎍/㎖ 처치 후 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 가장 뛰어난 라디칼 소거활성은 CMT11(93.54±0.63%)로 나타났으며, 그 다음은 CMT10(87.24±0.14%), CMT12(86.60±0.44%) 순 이었다.
종합적으로 CMT 18종의 AChE assay, DPPH assay 및 ABTS assay를 비교 분석해 본 결과, CMT8이 CMT18보다 AChE assay에서 20.91배, DPPH assay는 98.13배의 우수한 억제능을 가지고 있었으나, ABTS assay에서는 CMT18이 CMT8보다 14.32배 우수하였다. 따라서 CMT의 최적 배합비는 CMT8(원지 2, 석창포 1, 백복신 2)로 결정되었다. 이 결과를 토대로 CMT8과 감초를 동량으로 배합하여 된장을 제조하였으며, 제조된 된장(총명한 된장)은 기억력과 학습 증진에 효과적일 것으로 사료되어진다. 이러한 총명한 된장의 기능성을 과학적으로 증명하기 위해 Scopolamine 유발 건망증 마우스 모델을 이용하여 평가하였다.
건망증은 기억력에 문제가 생기는 증상을 보이는 것으로 시간적, 공간적 맥락에서 과거와 현재를 잇는 기억 현상에 문제가 생긴 것으로 개선이 가능하다고 할 수 있다. 기억력 개선 및 인지 능력 향상에 사용되고 있는 실험으로는 Y-maze test, passive avoidance test, Morris water maze test, noble object recognition test 및 fear conditioning test 등이 있다. Scopolamine은 식물로부터 분리한 tropane alkaloid로 비선택적 무스카린 길항제로서 기억력 손상을 유발한다(비특허문헌 45 참조). Scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델에서 먼저 혈청 내 간기능 지표인 AST와 ALT, 신기능 지표인 BUN과 Creatinine의 변화를 관찰한 결과 정상군에 비해 대조군에서 유의적으로 상승하였으며 총명한 된장 1000 mg/kg 투여에 의해 AST, BUN, Creatinine이 유의하게 감소하였다. 이는 총명한 된장이 간과 신장 기능을 개선시켜 준 것으로 판단된다.
Morris 수중 미로 실험에서 platform을 찾아가기까지 결린 시간을 4일 동안 평가한 결과 정상군에 비해 대조군에서 유의하게 증가하였다(p<0.001). 반면 홍삼 투여군, 된장 투여군 및 총명한 된장 투여군 모두에서 대조군과 비교하였을 때 소요시간이 유의하게 감소하였다(도 8 참조). 양성대조군으로 사용된 홍삼은 추출물 및 triol계 사포닌 성분을 통해 정상동물의 기억 증진 및 기억부진 동물의 기억력 향상을 가져온다고 많은 연구가 보고되어 있다(비특허문헌 42 및 43 참조). 또한 마지막 날 platform을 미로에서 제거한 후 platform이 있는 사분면에 머문 시간인 탈출 잠복기를 측정한 결과, 대조군에서 탈출 잠복기가 정상군보다 현저히 높아 기억력 손상을 확실히 유발했다고 판단되어진다. 반면 총명한 된장 투여군에서는 상승된 탈출 잠복기가 현저히 감소함을 보여주었다.
수동 회피 실험은 실험동물이 어두운 곳으로 가려는 습성을 이용한 실험으로 주로 장기 기억력을 측정하기 위하여 실행된다(비특허문헌 41 참조). Scopolamine에 의해 기억력 감퇴가 유도된 모델에서는 전기 자극에 대한 체류 잠복기가 정상군보다 현저히 낮아져 기억력 손상을 확실히 유발했다고 보여 지며, 반면 총명한 된장 투여군에서는 체류 잠복기가 현저히 증가함을 보여주었다. 여기서 체류 잠복기가 길어졌다는 것은 콜린성 신경계에 작용하여 학습 및 기억력을 회복시켰다는 것을 의미한다고 볼 수 있다. 본 발명에서 Scopolamine으로 유발한 기억력 손상 모델에서의 Morris water maze test의 탈출 잠복기 감소 및 수동 회피 실험에서의 체류 잠복기 증가는 총명한 된장이 cholinergic 신경계에 작용하여 학습 및 기억력을 회복시켰음을 의미한다.
Malondialdehyde는 반응성이 높은 화합물로서 산화스트레스의 지표이다. 기억력 손상 모델에서의 MDA는 뇌조직에서의 지질과산화 수준을 갈음할 수 있으며 이는 Thiobarbituric acid reaction(TBARS) 비색 분석을 이용한다(비특허문헌 46 참조). Scopolamine으로 유발한 기억력 손상 모델에서 Scopolamine은 산화적 스트레스를 유도하고 지질과산화를 증가시킨다(비특허문헌 47 참조). 본 발명에서도 정상군과 비교하였을 때, 대조군은 지질 과산화 MDA 수준이 유의하게 증가하였고 총명한 된장 투여에 의해 유의하게 감소하였다. 이는 총명한 된장에 함유된 총명탕과 감초가 지니는 항산화 효과에 기인한 것으로 보인다(비특허문헌 48 내지 51 참조).
한편 생화학적 검사로 뇌의 ACh과 AChE 활성도의 변화를 관찰하였다. 총명한 된장이 ACh 생성에 어떠한 영향을 미치는지 정상군과 비교해 본 결과 대조군의 뇌의 ACh 함량은 정상군에 비해 유의하게 감소하였다. 반면 총명한 된장의 투여에 의해 유의하게 상승하였다. 또한 ACh의 합성과 분해에 관여하는 효소인 AChE의 억제는 ACh의 농도를 증가시키는 방법으로 이용되고 있다. 따라서 총명한 된장 투여 후 AChE의 활성을 측정해 본 결과, 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있는 증가를 보였고 총명한 된장의 투여로 유의적으로 감소함을 보여주었다. 이는 기억력 손상 치료에 있어서 AChE의 활성을 저해시켜 ACh 농도를 증가시킨다는 연구 결과와 일치하는 것으로 AChE의 활성이 감소한다는 것은 그만큼 신경전달이 원활하게 이루어진다는 것을 의미한다(비특허문헌 44 참조).
결과적으로 본 발명에 따른 총명한 된장은 산화적 스트레스로 야기될 수 있는 지질과산화를 억제하고 ACh을 분해를 야기할 수 있는 AChE의 활성을 억제하여 기억력 감퇴를 억제하는 것으로 판단된다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

Claims (4)

  1. 원지, 석창포 및 백복신의 혼합 추출물과 감초의 복합물을 함유한 된장 조성물로서,
    상기 추출물은 열수 추출물이고,
    상기 혼합 추출물은 원지, 석창포 및 백복신의 중량비가 1.8 내지 2.2 : 0.8 내지 1.2 : 1.8 내지 2.2 이고, 상기 혼합 추출물 및 상기 감초의 중량비가 1 : 0.8 내지 1.2 이고,
    상기 혼합 추출물과 감초의 복합물이 10 내지 20 중량% 포함된 것을 특징으로 하는 된장 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
KR1020200080469A 2020-06-30 2020-06-30 총명탕 및 감초 복합물을 함유한 기억력 증진 기능성 강화 된장 조성물 KR102344116B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200080469A KR102344116B1 (ko) 2020-06-30 2020-06-30 총명탕 및 감초 복합물을 함유한 기억력 증진 기능성 강화 된장 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200080469A KR102344116B1 (ko) 2020-06-30 2020-06-30 총명탕 및 감초 복합물을 함유한 기억력 증진 기능성 강화 된장 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102344116B1 true KR102344116B1 (ko) 2021-12-30

Family

ID=79178462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200080469A KR102344116B1 (ko) 2020-06-30 2020-06-30 총명탕 및 감초 복합물을 함유한 기억력 증진 기능성 강화 된장 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102344116B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110123936A (ko) * 2010-05-10 2011-11-16 경상남도 한약재를 이용한 기능성 물김치의 제조방법
KR20140097764A (ko) * 2013-01-30 2014-08-07 이훈희 한약재를 이용한 건강 기능성 된장 및 그 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110123936A (ko) * 2010-05-10 2011-11-16 경상남도 한약재를 이용한 기능성 물김치의 제조방법
KR20140097764A (ko) * 2013-01-30 2014-08-07 이훈희 한약재를 이용한 건강 기능성 된장 및 그 제조방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Almeida et al. Properties and applications of Morinda citrifolia (noni): A review
Dhyani et al. A review on nutritional value, functional properties and pharmacological application of perilla (Perilla frutescens L.)
KR101899443B1 (ko) 간 보호용 음료조성물
Roy et al. Evaluation of phytoconstituents and assessment of adaptogenic activity in vivo in various extracts of Rhododendron arboreum (leaves)
Pathaw et al. A comparative review on the anti-nutritional factors of herbal tea concoctions and their reduction strategies
Kozak et al. Health properties of selected herbal plants
Malík et al. Nootropic herbs, shrubs, and trees as potential cognitive enhancers
Abelti et al. Review on edible water lilies and lotus: Future food, nutrition and their health benefits
KR102344116B1 (ko) 총명탕 및 감초 복합물을 함유한 기억력 증진 기능성 강화 된장 조성물
RU2353105C1 (ru) Биологически активная добавка к пище
KR20140002918A (ko) 배를 활용한 한약재 배합 숙취 해소 음료 및 이의 제조방법
Lal et al. Traditional, medicinal and nutraceutical values of minor fruit: Longan
Cheung et al. Potential of Asian natural products for health in aging
KR101322279B1 (ko) 천마 엑기스를 함유하는 기능성 음료 및 그 제조방법
El-Hadidy et al. Omar. Protective Effect on Lipids Profile of Lion’s Foot (Alchemilla Vulgaris) Leaves against Ccl4 Toxicity and its Fortified to Guava and Mango Pulp
KR101476092B1 (ko) 숙취 해소 음료 및 그의 제조 방법
KR102050554B1 (ko) 숙취해소용 액상차 조성물 및 이의 제조 방법
Airaodion et al. Chemical Composition and Nutraceutical Potential of Velvet Tamarind (Dialium guineense wild) Fruit Pulp
Chen et al. Functional Evaluation of Loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) Flower Water Extracts and Its Potential Use in Tea
KR20200004941A (ko) 허브추출물을 유효성분으로 하는 숙취해소용 조성물 및 이를 함유하는 음료
CN104206556A (zh) 一种无防腐剂生态食用油
DE202014005062U1 (de) Elixier
KR102520686B1 (ko) 천마를 주성분으로 하는 건강음료
Khan NUTRITIONAL COMPOSITION, PHYTOCHEMICAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF STEM OF (Nymphaea nouchali) AND (Nymphaea rubra
Fuertes Recent Developments in Antioxidants from Natural Sources

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant