KR102341353B1 - 선천성 면역 반응 질환을 치료하기 위한 약제 및 방법 - Google Patents

선천성 면역 반응 질환을 치료하기 위한 약제 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 식품 알레르겐(allergen), 더욱 특히 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 가수분해할 수 있는 아스페르길러스 니거(Aspergillus niger) 아스페르길로글루타민산 펩티다아제(aspergilloglutamic peptidase)를 포함하여, 인간에서 선천성 면역 반응에 기인한 질환을 치료하고/하거나 이러한 질환의 발병을 지연시킬 수 있는 약제 또는 식이 보충제에 관한 것이다. 본 발명은 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 밀 및 관련 곡물에 존재하는 알파-아밀라아제/트립신 저해제(이러한 저해제는 선천성 면역 반응의 강한 유도자임)를 가수분해할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 포함하는 식품 소비용 조성물을 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제와 함께 항온처리하는 단계를 포함하고, 여기서 저해제가 가수분해되는, 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 가수분해하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 및 추가적인 효소를 포함하는 효소 조성물, 및 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 포함하는 식료품에 관한 것이다.

Description

선천성 면역 반응 질환을 치료하기 위한 약제 및 방법{MEDICAMENT AND METHOD FOR TREATING INNATE IMMUNE RESPONSE DISEASES}
본 발명은 식물 식품 알레르겐(allergen), 더욱 특히 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 가수분해할 수 있는 아스페르길러스 니거(Aspergillus niger) 아스페르길로글루타민산 펩티다아제(aspergilloglutamic peptidase)를 포함하여, 인간에서 선천성 면역 반응에 기인한 질환을 치료하고/하거나 이러한 질환의 발병을 지연시킬 수 있는 약제 또는 식이 보충제에 관한 것이다. 본 발명은 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 밀 및 관련 곡물에 존재하는 알파-아밀라아제/트립신 저해제(이러한 저해제는 선천성 면역 반응의 강한 유도자임)를 가수분해할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 포함하는 식품 소비용 조성물을 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제와 함께 항온처리하는 단계를 포함하고, 여기서 저해제가 가수분해되는, 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 가수분해하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 및 추가적인 효소를 포함하는 효소 조성물, 및 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 포함하는 식료품에 관한 것이다.
식물 식품 알레르겐은 커핀(cupin) 및 프롤라민(prolamin) 상위계열 뿐만 아니라 식물 방어 시스템의 단백질성 분자를 포함하는 식물 단백질의 광범위한 그룹이다. 프롤라민 상위계열은 콩류, 견과류, 곡물, 과일 및 식물의 수 개의 중요한 유형의 알레르겐, 및 곡물성 알파-아밀라아제 및 프로테아제 저해제를 포함한다. 곡물성 프롤라민은 곡물 알곡 내배유의 주요 저장 단백질이고, 밀에서는 글루테닌(glutenin) 및 글리아딘(gliadin)으로, 호밀에서는 세칼린(secalin)으로, 보리에서는 호르데인(hordein)으로 명명된다. 단백질성 알파-아밀라아제 저해제는 비-글루텐 단백질이다. 구조적 유사성에 기초하여, 식물 기원의 단백질성 알파-아밀라아제 저해제는 렉틴(lectin)-유사 계열, 노틴(knottin)-유사 계열, CM-단백질, 쿠니츠(Kunitz)-유사 계열, c-푸로티오닌(purothionin)-유사 계열, 및 타우마틴(thaumatin)-유사 계열을 비롯한 6개의 계열로 대체적으로 분류된다[리차드선(Richardson), 1990]. CM(클로로포름-메탄올)-단백질은 120 내지 160개 아미노산 잔기 및 5개의 디설파이드 결합을 함유하는 곡물 종자로부터의 큰 단백질 계열이다. 이들은 전형적인 양두형(double-headed) 알파-아밀라아제/트립신 영역을 나타낸다. 이러한 특징은 이들이 알파-아밀라아제 및 트립신-유사 효소의 활성을 저해할 수 있도록 만든다. 알파-아밀라아제 저해제 0.19는 이러한 계열중 가장 연구된 저해제중 하나이고; 이는 광범위한 특이성을 갖고, 곤충, 조류 및 포유동물로부터의 알파-아밀라아제를 저해한다.
더욱이, 식물 방어 단백질은 또한 프로테아제 저해제를 포함한다. 대부분의 식물 저장 기관, 예컨대 종자 및 괴경(tuber)은 상이한 유형의 프로테아제를 저해하는 상이한 생화학적 및 구조적 특성을 갖는 프로테아제 저해제로서 이들의 총 단백질의 1 내지 10%를 함유한다. 단백질 저해제는 이들이 저해하는 효소의 유형에 기초하여 세린 프로테아제 저해제, 시스테인 프로테아제 저해제, 아스파르트산 프로테아제 저해제, 또는 메탈로카복시-프로테아제 저해제로 분류된다.
국제특허출원공개 제WO 2011/137322호는 최근에 밀 및 관련된 곡물에 함유된 비-글루텐 알파-아밀라아제/트립신 저해제 계열의 구성원이 인간의 장에서 선천성 면역 반응의 강한 유도자이고, 이에 따라 셀리악병(celiac disease)과 같은 질환에 기여함을 개시하였다. 게다가, 알파-아밀라아제/트립신 저해제는 또한 글루텐 과민증, 과민성 장 증후군, 염증성 장 질환, 뿐만 아니라 장 이외의 염증과 같은 질환 또는 증상에 대한 핵심 기여 인자이다.
복강증후군(celiac sprue), 글루텐-과민성 장증, 또는 글루텐 불내증으로도 공지된 셀리악병은 전세계적으로 가장 빈번한 식품 과민증중 하나이고, 유럽, 북아메리카 및 남아메리카, 및 오스트레일리아에서 유병률이 가장 높다. 셀리악병은 밀, 보리, 호밀 및 이들의 교차-관련된 변종의 섭취에 의해 기폭되어 흡수불량 증후를 유도하는 유전적으로 취약한 사람에서의 상부 소장의 염증성 질환이다.
글루텐은 밀, 보리, 호밀 및 이들의 교차-관련된 변종에 존재하는 공통의 식이 단백질이다. 글루텐은 글루타민- 및 프롤린-풍부 글루테닌 및 프롤라민 분자의 복합 혼합물이고, 이는 과민성 인간 개체에서 셀리악병 유도에 책임이 있는 인자로 사료된다. 높은 프롤린 및 글루타민 함량을 갖는 이들의 특이한 구조로 인해, 글루텐 단백질은 장 효소에 부분적으로 내성이고, 이는 장 면역 시스템에 의해 감지될 수 있는 몇몇의 분해되지 않은 면역원성 펩타이드를 유도한다. 과민성 개체에 의한 이러한 단백질의 섭취는, 펩타이드 및 다른 영양분의 효율적이고 광범위한 마지막 소화에 책임이 있는 것으로 공지된 소장의 정상적으로 화려한 러그-모양의 상피 내벽을 평탄화(flattening)시킨다. 복강증후군의 임상적 증후로는 피로, 만성 설사, 영양분의 흡수불량, 체중 감소, 복부 팽만, 빈혈, 뿐만 아니라 골다공증 및 장 악성종양(림프종 및 암종)의 발전에 대한 실질적으로 증진된 위험이 포함된다. 이러한 질환은 유럽 및 북아메리카 인구에서 200명중 대략 1명의 발생률을 갖는다.
글루텐 불내증에 대한 현행되는 필수적인 치료는 식사시 글루텐을 영구적으로 엄격히 제한하는 것인데, 이는 유지되기 어렵다. 그러나, 질병이 소화관에서 효소 작용에 의해 어떻게 영향받는지를 이해하기 위해 두개의 카테고리의 글루텐 불내증을 정의하는 것은 중요하다. 복강증후군은 소장의 유전적 염증성 질병인 자가면역 증상이다. 글루텐 단백질이 소화 동안 파쇄될 경우, 이들은 단편화된다. 이들 단백질 단편은 펩타이드로 지칭된다. 셀리악병 환자에서, 소장에서의 적절치 않은 면역 시스템 반응은 한가지 유형의 펩타이드에 의해 개시되고, 장 세포는 손상된다.
두 번째 유형의 글루텐 불내증은 소화관이 셀리악병 이외의 것(예를 들면, 장 효소의 감소를 초래하여 결국 불량한 글루텐 소화를 유도하는 세균 또는 효모 감염의 부정적 영향)에 의해 손상될 경우 초래된다. 효소에 의한 개체의 보충이 셀리악병 환자에게 유리할 수 있지만, 이들은 미량의 글루텐이 소화되지 않고 남아있는 경우 가능한 강도의 자가면역 반응 때문에 엄격히 글루텐이 없는 식이를 유지해야만 한다.
보충제로서 특이적 효소를 사용하는 것은, 글루텐 과민성 개체의 경우, 글루텐 불내증이 발전될 위험에 있는 개체에 대해 글루텐이 없는 식이에 대한 필요성을 최소화하거나, 글루텐 불내증이 소화관 손상에 기인하는 경우 효과적일 수 있다.
글루텐 해독작용을 위한 외래성 단백질분해 효소의 사용은 셀리악병 처치를 위한 가장 유망한 전략중 하나였다. 이러한 효소는 글루텐 함유 곡물가루의 예비처리에서, 및 보충제로서 사용되고 있다. 프롤릴-엔도펩티다아제(prolyl-endopeptidase)는 글리아딘 펩타이드를 소화시키는 것으로 제안된 공지된 글루텐-소화 효소이다(국제특허출원공개 제WO 2002/45524호 및 제WO 2002/46381호).
국제특허출원공개 제WO 2011/137322호는 셀리악병 환자를 치료하기 위한 알파-아밀라아제 CM3에 대한 항체 및 식품 조성물의 사용을 개시하였고, 대체물로서 프로테아제의 사용을 고려한다. 그러나, 이는 위장관에서 또는 밀, 보리, 호밀 및 이들의 교차-관련된 변종으로부터 유래된 식료품의 예비처리시 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 효율적으로 가수분해하는 특이적 효소 처리에 관하여는 언급하지 않고 있다.
인돌린 및 푸로티오닌은 몇몇 벼과의 배유에 존재하는 황-다량함유 염기성 저분자량 단백질의 그룹을 포함한다. 예를 들면, 밀, 호밀 및 보리로부터의 알파-푸로티오닌의 서열 동일성은 80% 초과이다. 푸로티오닌은 세계 보건 기구-면역 학회 국제 연합(World Health Organization-International Union of Immunological Societies)에 의해 "Tri a 37"로서 지정된 알레르기 계열의 일원이고, 밀-유도된 아나필락시스(anaphylaxis)의 증가된 위험에 대한 진단 마커를 대표할 수 있다[파르(Pahr) 등의 문헌 "J Allergy Cin Immunol., 132 (4), pp 1000-1003"].
식물 알레르겐, 더욱 구체적으로 알파-아밀라아제/트립신 저해제, 예컨대 CM3 및 0.19로의 소화관의 노출을 감소시킴으로써, 셀리악병을 치료하거나, 셀리악 또는 비-셀리악 글루텐 과민성 개체에서 위장의 편안함을 증진시키거나, 비-셀리악 글루텐 과민증의 건강한 개체에서 위장의 불편함의 발병을 지연시키기 위해, 위장관에서 뿐만 아니라 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 포함하는 식품 조성물에서 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 분해하기 위한 안전하고, 효과적이며 비용 경쟁적인 방식을 제공하는 것이 요망될 것이다. 본 발명에 따른 용도는 글루텐 과민증/알레르기의 문제를 해결할 뿐만 아니라, 맥주중의 아밀라아제 트립신 저해제를 분해하기 위해 사용될 경우 거품의 안정화를 허용한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 효소 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 식물 알레르겐, 예컨대 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 개체의 위장 시스템에서 뿐만 아니라 이러한 저해제가 포함된 식품 매트릭스(food matrix)에서 가수분해할 큰 가능성을 갖고, 이에 따라 약제 및 식이 보충제로서, 식품 예비처리시 또는 베이크드 제품(baked product)을 제조하는 과정에서 사용될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제, 프롤릴-엔도펩티다아제, 및 약학적으로 또는 식이용으로 허용가능한 부형제를 포함하는 식이 보충제 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 아스페르길러스 니거 변종 매크로스포러스(macrosporus)(EC 3.4.23.19)로부터 단리된, 이전에 아스페르길로펩신(aspergillopepsin) II로 지칭되던 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제(AGP)는 펩티다아제 계열 A4에 속하는 특유의 프로테아제이다. 이러한 효소는 전형적인 펩신-유형 산 프로테아제인 계열 A1의 펩티다아제에 속하는 아스파르트산 프로테아제와 상동성이 아니고, 이에 따라 이들의 특이적 저해제, 예컨대 펩스타틴 A에 불감성이다. 따라서, 이러한 효소는 또한 '펩스타틴-불감성' 산 프로테이나제(proteinase)로서 분류되었다. 이제까지 공지된 글루타민산 펩티다아제들 중에서, AGP는 유일한 2-쇄 효소임을 특징으로 한다. 이 효소의 아미노산 서열은 전형적인 아스파르트산 프로테이나제의 서열과 상동성을 갖지 않는다.
본 발명에 따른 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제라는 용어는 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제[유니프로트(UniProt)KB/스위스프로트(SwissProt) 식별자 P24665]의 아미노산 서열에 적어도 70%의 동일성을 갖는 효소, 예를 들어 P24665에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 효소를 포함한다. 본 발명에 따른 가장 바람직한 상동성 효소는 사이탈리디움 리그니콜룸(Scytalidium lignicolum)으로부터의 사이탈리도글루타미스(scytalidoglutamis) 펩티다아제, 크라이포넥트리아 파라시티카(Crypphonectria parasitica)로부터의 산 펩티다아제 B 및 C, 및 스클레로티나 스클레로티오룸(Sclerotina sclerotiorum)으로부터의 산 프로테아제이다.
본원에 개시된 바와 같은 식이 보충제 또는 약학 조성물에서 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 순수한 형태로, 또는 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 포함하는 제제로서 존재할 수 있고, 여기서 프로테아제 활성의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상은 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제로부터 유래되고, 이때 활성은 HPU(히스티딘 프로테아제 단위)로 표시되고; 1 HPU는 1분 당 일정량의 헤모글로빈을 가수분해하는 효소의 양으로, 0.1 몰/ℓ의 HCl 용액에서 1 ㎖ 당 1 ㎍의 L-티로신이 포함된 용액의 광학 밀도와 동일한 275 nm에서의 광학 밀도를 갖는 용액을 제공한다. 시험 조건은 다음과 같다: pH 1.75, 온도 40℃, 항온처리 동안 헤모글로빈 농도 16.7 g/ℓ.
활성(HPU/㎖) = (OD샘플 - OD블랭크 / S) × 11/30
상기 식에서,
OD샘플은 샘플 여액의 광학 밀도(275 nm)이고;
OD블랭크는 샘플 블랭크 여액의 광학 밀도(275 nm)이고;
S는 1.1 ㎍/㎖의 L-티로신 표준 용액의 OD(㎖/㎍)이고;
30은 항온처리 시간(분)이고;
11은 총 부피 반응 혼합물(㎖)이다.
본 발명에 따른 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 문헌[Handbook of Proteolytic Enzyme, A.J. Barret, N.D. Rawlings, and J.F. Woessner eds.: Academic Press]; 또는 제PCT/EP2013/066899호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다.
용어 "약학 조성물"은 약제 또는 약물을 지칭하고, 용어 "식이 보충제"는 단일 또는 다중용량 단위에 포장된 인간 식이의 보충을 위한 소량의 활성 성분을 지칭한다. 식이 보충제는 일반적으로 그다지 많은 칼로리를 제공하지 않지만, 미네랄 또는 비타민과 같은 다른 미량영양소를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 식이 보충제 또는 약학 조성물은 추가로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. "부형제"는 부형제, 담체, 또는 희석제를 의미하고, 예컨대 제한되지 않지만, 물, 임의의 기원의 젤라틴, 식물성 고무질, 리그닌설포네이트, 활석, 설탕, 전분, 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 아라비아 고무, 식물성 기름, 폴리알킬렌 글리콜, 착향료, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 윤활제, 착색제, 습윤제, 충전제 등을 포함한다. 담체 물질은 경구/비경구/주사용 투여에 적합한 유기 또는 무기 불활성 담체 물질일 수 있다.
본 발명에서, 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 식이 보충제 또는 약학 조성물은 1회 섭취시 1 내지 100 HPU, 바람직하게는 10 내지 50 HPU의 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 제공한다.
더욱이, 본 발명에 따른 식이 보충제 또는 약학 조성물은 추가로 프롤릴-엔도펩티다아제를 포함한다. 포유동물의 프롤릴-엔도펩티다아제는 세린 펩티다아제의 별개의 부류에 속하는 큰 시토졸 효소이다. 이는 Pro-Phe 결합에서 노나펩타이드 브래디키닌(bradykinin)을 분해하는 올리고펩티다아제로서 토끼 뇌의 시토졸에서 최초로 발견되었다. 이 효소는 펩타이드 호르몬 및 신경펩타이드, 예컨대 알파-멜라닌세포-자극 호르몬, 황체형성 호르몬-방출 호르몬(LH-RH), 갑상선 자극 호르몬-방출 호르몬, 안지오텐신(angiotensin), 뉴로텐신(neurotensin), 옥시토신(oxytocin), 물질 P 및 바소프레신(vasopressin)의 성숙 및 분해에 연관된다. 프롤릴-올리고펩티다아제는 펩타이드 결합을 프롤린 잔기의 C-말단에서 절단한다. 이의 활성은 10 kD 미만의 올리고펩타이드에 대해 작용하도록 제한되고, 이는 프롤린에 앞선 펩타이드 결합의 트랜스-입체배좌를 위한 절대적 요건을 갖는다.
본 발명에 따른 가장 바람직한 프롤릴-엔도펩티다아제는 진균류 아스페르길러스 니거 프롤릴-엔도펩티다아제 효소(AN-PEP)이다. AN-PEP는 디에스엠 푸드 스페셜티즈(DSM Food Specialties)(네덜란드 델프트 소재)로부터 입수될 수 있다. 두 AN-PEP 및 AGP의 조합은 위장관에서 알파-아밀라아제/트립신 저해제 및 글루텐 에피토프 둘 다의 가수분해를 위한 효소를 제공함으로써 단일 식이 보충제 또는 약학 조성물에서 글루텐 불내증/과민증 모두를 다룰 수 있도록 한다. 이러한 경우, 식이 보충제 또는 약학 조성물은 10,000 내지 100,000 프로테아제 피코몰 국제 단위의 프롤릴-엔도펩티다아제 효소를 제공한다. 프롤린 프로테아제 단위(PPU)는 37℃하에 시트레이트/인산 이나트륨 완충제(pH 4.6)중에서 0.37 mM Z-Gly-Pro-pNA[바켐(Bachem), 스위스 부덴도르프 소재]를 기질로서 사용하여 1분 당 1 마이크로몰의 p-니트로아닐리드를 방출하는 효소의 양으로서 정의된다.
본 발명에 따른 식이 보충제 또는 약학 조성물은 또한 추가로 아스페르길로펩신 I을 포함할 수 있다. 아스페르길러스 산 프로테아제로도 지칭되는 아스페르길로펩신 I(EC 3.4.23.18)은 넓은 특이성을 갖고 단백질의 가수분해를 촉매화한다. 이는 일반적으로 P1 및 P1'에서 소수성 잔기를 선호할 뿐만 아니라, P1에서 Lys을 받아들이고, 이는 트립시노겐의 활성화를 유도한다. 본 발명의 모든 실시태양을 위해 적합한 아스페르길로펩신 I은 아스페르길러스 니거, 아스페르길러스 사이토이(Aspergillus saitoi) 및 트리코데르마 리세이(Tricoderma reesei)로부터 단리될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 아스페르길로펩신 I은 아스페르길러스 니거로부터 단리된다. 이러한 경우에, 식이 보충제 또는 약학 조성물은 1회 섭취시 1 내지 1000 HPU 단위, 더욱 바람직하게는 1 내지 100 HPU 단위의 아스페르길로펩신 I 효소를 제공한다.
본 발명에 따른 식이 보충제 또는 약학 조성물은 인간에 투여되기에 적합한 임의의 생약 형태일 수 있지만, 고체 또는 액체 경구 형태가 바람직하고, 예를 들어 고체 형태, 예컨대 식품을 위한 첨가제/보충제, 정제, 환제, 과립, 당의정, 캡슐, 고무질 제형, 및 발포성 제형, 예컨대 분말 및 정제로 존재한다. 식이 및 약학 조성물은 제어된(지연된) 방출 제형의 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 모든 실시태양에서, 본 발명에 따른 식이 보충제 또는 약학 조성물은 바람직하게는 정제, 캡슐, 향낭, 또는 액체 제형을 비롯한 임의의 다른 투여 형태로 존재할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 이는 정제 또는 캡슐의 형태로 존재할 수 있다. 캡슐, 정제 또는 향냥, 또는 다른 투여 형태는 임의의 전통적 형태를 취할 수 있는 용기중에 존재할 수 있다. 예를 들면 투여 형태는 단지, 병, 주석 박스, 도자기, 디스펜서(dispenser), 향낭 등에 담겨져 시판될 수 있고, 이는 투여 형태를 예정된 양으로, 예컨대 30-일 공급량, 60-일 공급량, 90-일 공급량으로, 또는 원하는 어떠한 양으로도 함유한다. 추가적으로 및 임의적으로, 캡슐은 블리스터 팩(blister pack) 내에 존재할 수 있고, 여기서 각각의 블리스터는 캡슐의 예정된 수, 대체적으로 단일 용량(전형적으로 1 내지 4개의 캡슐)을 함유한다. 블리스터 중의 캡슐의 수, 단일 블리스터 팩 스트립 상의 블리스터의 수, 및 하나의 묶음으로 시판되는 블리스터 팩 스트립의 수는 임의의 편리한 양 또는 형태로 준비될 수 있다.
본 발명에 따른 식이 또는 약학 조성물은 보호용 하이드로콜로이드(예컨대 고무, 단백질, 변성 전분), 결합제, 필름 형성제, 캡슐화제/캡슐화 물질, 벽/외피 물질, 매트릭스 화합물, 코팅제, 유화제, 표면 활성제, 가용화제(오일, 지방, 왁스, 레시틴 등), 흡착제, 담체, 충전제, 공동-화합물(co-compound), 분산제, 습윤제, 가공 보조제(용매), 유동제, 맛 차폐제, 증량제, 겔화제, 겔 형성제, 산화방지제 및 항미생물제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 약학 조성물은 처방을 받거나 받지 않고 판매되지만, 식이 보충제는 의학적 처방없이 계산대에서 판매되고 식품으로 고려된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 포함하는 식이 보충제 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 이와 같이 본 발명은 질병 치료용 약제로서 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 포함하는 식이 보충제 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 약제는 장에서 선천성 면역 반응을 앓는 환자의 치료를 위한 것이다. 더욱 더 바람직하게는, 약제는 셀리악병, 비-셀리악 글루텐 불내증, 글루텐 과민증, 과민성 장 증후군, 또는 염증성 장 질환의 치료를 위한 것이다. 가장 바람직하게는, 약제는 글루텐 과민성 개체에서 위장의 편안함을 유지 또는 증가시키거나, 셀리악 또는 비-셀리악 글루텐 과민성 개체에서 위장의 불편함의 발병을 지연시킬 뿐만 아니라, 건강한 개체에서 알파-아밀라아제/트립신 저해제 노출을 감소시켜 소화를 돕기 위한 식이 보충제이다. 본 조성물에 의해 분해되는 알파-아밀라아제/트립신 저해제는, 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제에 의한 이들의 신속한 분해에 기초하여, 식물 알레르겐 CM2, CM3, CM16, 및 0.19이고, 더욱 바람직하게는 CM3 및 0.19이다. CM3 아미노산 서열 식별자는 스위스프로트 P01083인 반면, 0.19 아미노산 서열 식별자는 스위스프로트 P01085이다.
본 발명에 따른 약제 또는 식이 보충제는, 식물 단백질에 대한 식품 알레르기를 일으킬 위험, 및 복강증후군, 뿐만 아니라 비-셀리악 글루텐 불내증과 관련된 위장의 불편한 경험을 감소시키고자 하는 개체가 사용하기 위한 것이다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 약제는 식사를 섭취하기 전 또는 후 1시간 이내에 경구적으로 투여된다.
"위장의 편안함"은 삶의 품질에 중심이 된다. 위장 소화의 편안함을 촉진시킴은 위장관을 통한 체류 시간을 조절하고 소화 및 연관된 질병과 관련된 통증을 완화시킴을 포함한다.
"비-셀리악 글루텐 과민증" - 비-셀리악 글루텐 과민증은 셀리악병을 앓는 환자와 유사한 증후를 경험하고 글루텐을 용인할 수 없지만 셀리악병에서 볼 수 있는 것과 동일한 항체 및 장 손상이 없는 개체를 설명하기 위해 만들어진 말이다. 비-셀리악 글루텐 과민증은 글루텐 불내증의 또 다른 형태이고, 여기서 면역 반응은 덜 특징적이다. 비-셀리악 글루텐 과민증은 셀리악병과 많은 증후들을 공유한다. 그러나, 사포네(Sapone) 등(2012)에 따르면, 비-셀리악 글루텐 과민증을 앓는 개체는 장 바깥 또는 비-위장 증후, 예컨대 두통, "포기 마인드(foggy mind)", 관절통, 및 다리, 팔 또는 손가락의 마비가 우세하다. 증후는 전형적으로 비-셀리악 글루텐 과민증과 같은 선천성 면역 증상에 전형적인 반응으로 글루텐이 소화된지 수 시간 또는 수 일 후에 나타난다.
"건강한 개체" - 본 발명과 관련하여 사용될 경우, 건강한 개체는 셀리악병을 앓는 것으로 진단되지 않았다.
"발병을 지연시킴"은 증상의 개선, 증후의 위중성의 감소, 초기 개입, 및 질환의 발병 이전의 기간을 연장시킴을 포함하고자 하고, 환자가 위장의 불편함에 대한 임의의 증후를 경험할 수 없는 상황으로 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 용도를 위해, 약제 또는 식이 보충제는 식사 전 또는 후 1 시간 이내에 경구적으로 투여된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 식물 알레르겐을 함유하는 식품 조성물을 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제와 함께 식물 알레르겐을 가수분해하기에 충분한 시간 동안 항온처리하는 단계를 포함하는, 식품 조성물에서 식물 알레르겐을 분해하는 방법에 관한 것이다. 당분야의 숙련가라면 식품에 첨가되는 효소의 양, 및 식품 알레르겐을 분해하는데 필요한 시간을 처리될 식품 조성물에 의존하여 추정할 것이다. 식품 알레르겐의 검출은 특이적 항체의 사용에 의해 또는 질량 분광법에 의해 당분야에 공지된 방법에 따라 효율적으로 수행될 수 있다. 맥주 매트릭스의 경우, 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 맥주 1 헥토리터 당 50 내지 2000 HPU, 바람직하게는 맥주 1 헥토리터 당 100 내지 1000 HPU로 첨가된다. 베이킹 조성물(baking composition) 매트릭스의 경우, 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 조성물 1 kg 당 10 내지 5000 HPU로 첨가될 수 있다. 적합한 베이킹 조성물 매트릭스로는 제한없이 베이킹 조성물이 포함된다.
놀랍게도, 맥주 가공시 0.5 내지 500 mg/hℓ, 바람직하게는 1 내지 50 mg/hℓ, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 mg/hℓ로 구성된 낮은 농도로 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 사용하는 경우, 맥주 거품의 안정화가 발생한다.
아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제에 의해 분해되는 식물 알레르겐은, 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제에 의한 이들의 신속한 분해에 기초하여, 바람직하게는 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 이들의 교차-관련된 변종에서 특이적으로 발견되는 것들, 예컨대 알파-아밀라아제/ 트립신 저해제이고, 더욱 바람직하게는 식물 알레르겐은 CM2, CM3, CM16, 및 0.19이고, 더욱 더 바람직하게는 CM3 및 0.19이다. CM3 아미노산 서열 식별자는 스위스프로트 P01083인 반면, 0.19 아미노산 서열 식별자는 스위스프로트 P01085이다.
본 실시태양에서, 식품 조성물은 밀, 보리, 호밀, 귀리 및/또는 이들의 교차-관련된 변종을 포함하는 식품이다. 바람직한 식품 조성물은 맥주, 맥주 생산에 관여된 다양한 가공 단계, 베이킹 조성물, 도우(dough), 사워 도우(sour dough) 또는 베이크드 제품, 예컨대 빵이다.
본 방법에서, 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 유리하게는 글루텐 에피토프를 또한 분해하기 위해 프롤릴-엔도펩티다아제, 바람직하게는 아스페르길러스 니거 프롤릴-엔도펩티다아제에 의해 보완되고, 임의적으로 또한 아스페르길로펩신 I 효소에 의해 보완될 수 있다.
상기 방법에서 식품 조성물에 첨가되는 효소의 바람직한 양은 식품 매트릭스, 및 글루텐과 알파-아밀라아제/트립신 저해제의 추정된 양에 의존한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 식물 알레르겐을 함유한 식품 조성물을 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제와 함께 식물 알레르겐을 가수분해하기에 충분한 시간 동안 항온처리하는 단계를 포함하는, 식품에서 식물 알레르겐을 분해하기 위한 상기 방법에 의해 제조되는 식료품에 관한 것으로, 상기 식품 조성물은 분해된 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 포함한다. 바람직한 식품은 베이크드 제품, 예컨대 빵, 도우, 맥주이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 포함하는 베이킹 조성물, 및 효소 조성물 또는 도우에 관한 것이다. 이는 추가로 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 적어도 하나의 도우 구성성분에 첨가하는 단계를 포함하는 도우를 제조하는 방법에 관한 것이다.
베이크드 제품은 종종 글루텐이 포함된 곡물가루를 사용하여 제조된다. 베이크드 제품은 따라서 글루텐 과민성 개체와 관련될 수 있는 식품 제품을 제공한다. 본 발명에 따른 베이킹 조성물은, 바람직하게는 가루 형태의 밀, 보리, 호밀, 귀리 및/또는 이들의 교차-관련된 변종, 및 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 포함한다. 베이킹 조성물은 곡물가루 1 kg 당 10 내지 5000 HPU의 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 베이킹 조성물은 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 곡물가루 1 kg 당 20 내지 3000 HPU의 양으로, 하나의 양태에서 곡물가루 1 kg 당 30 내지 1000 HPU의 양으로, 곡물가루 1 kg 당 40 내지 500 HPU의 양으로, 곡물가루 1 kg 당 50 내지 250 HPU의 양으로 포함한다. 하나의 양태에서, 베이킹 조성물은 약 1000 내지 50000 HPU/g 범위의 활성을 갖는 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 1 ppm 내지 2000 ppm 포함한다.
하나의 양태에서, 베이킹 조성물은 약 1000 내지 50000 HPU/g 범위의 활성을 갖는 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 10 내지 200 ppm 포함한다.
본 발명에 따른 베이킹 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 효소를 포함할 수 있다.
"추가적인 효소" - 본원에서 추가적인 효소라는 용어는 제한없이 아밀라아제, 예컨대 알파-아밀라아제, 베타-아밀라아제, 말토게닉(maltogenic) 아밀라아제; 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(glucanotransferase); 프로테아제, 펩티다아제, 예컨대 프롤릴-엔도펩티다아제, 바람직하게는 아스페르길러스 니거 프롤릴-엔도펩티다아제(글루텐 에피토프를 분해하기 위함), 및 임의적으로 또한 아스페르길로펩신 I 효소; 트랜스글루타미나제(transglutaminase); 리파아제, 예컨대 트리아실 글리세롤 리파아제, 갈락토리파아제, 포스포리파아제; 셀룰로오스; 헤미셀룰라아제, 특히 펜토사나아제(pentosanase), 예컨대 자일라나아제(xylanase); 단백질 디설파이드 이소머라아제, 예를 들어 단백질 디설파이드 이소머라아제(국제특허출원공개 제WO 95/00636호에 개시됨); 글리코실전달효소, 과산화효소; 라카아제(laccase); 또는 산화효소, 예컨대 6탄당 산화효소, 글루코스 산화효소, 알도스 산화효소, 피라노스 산화효소, 리폭시게나아제(lipoxygenase) 또는 L-아미노산 산화효소; 또는 G4 형성 아밀라아제를 포함한다.
본 발명에 따른 효소 조성물의 하나의 실시태양에서, 추가적인 효소는 지질분해 효소, 바람직하게는 포스포리파아제, 갈락토리파아제, 또는 포스포리파아제 및 갈락토리파아제 활성 둘 다를 갖는 효소이다.
본 발명에 따른 효소 조성물의 하나의 실시태양에서, 추가적인 효소는 국제특허출원공개 제WO 2009/106575호에 기재된 바와 같은, DSM으로부터의 파나모어(Panamore: 등록상표)이다. 적합한 지질분해 효소는 노보자임스(Novozymes)로부터의 리포판(Lipopan: 등록상표) F, 리포판(등록상표) 50 및 리포판(등록상표)을 포함할 수 있다.
본 발명의 효소 조성물의 하나의 실시태양에서, 추가적인 효소는 국제특허출원공개 제WO 98/26057호에 기재된 바와 같은 효소, 또는 US 제RE38.507호에 기재된 바와 같은 효소, 또는 국제특허출원공개 제WO 99/43794호에 기재된 바와 같은 효소, 특히 EP 제1058724B1호에 기재된 바와 같은 효소이다.
본 발명에 따른 효소 조성물의 하나의 양태에서, 추가적인 효소는 미국 특허 제8,426,182호에 기재된 바와 같은 아밀라아제이다.
추가적인 효소는 G4 형성 아밀라아제를 포함할 수 있다. G4 형성 아밀라아제는 특히 전분의 분해를 촉매화할 수 있는 효소이다. 특히, 이는 전분에서 α-D-(1→4) O-글리코시드 결합을 절단할 수 있다. 이는 글루칸 1,4-알파-말토테트라오하이드롤라아제(maltotetraohydrolase)(EC 3.2.1.60)로서 지칭될 수 있다. 이는 또한 말토테트라오하이드롤라아제로서 지칭될 수 있다. 적합한 G4 형성 아밀라아제는 국제특허출원공개 제WO 99/50399호, 제WO 2005/007818호, 제WO 2004/111217호, 제WO 2005/003339호, 제WO 2005/007818호, WO 2005/007867호, 제WO 2006/003461호, 제WO 2007/007053호, 제WO 2007/148224호, 제WO 2009/083592호, 제WO 2009/088465호중 임의의 하나에 기재된 G4 형성 아밀라아제일 수 있다.
식품 제품의 예는 베이크드 제품이다.
"베이크드 제품" - 용어 베이크드 제품은 도우로부터 제조된 베이킹된 식품 제품을 지칭한다. 본 발명에 의해 유리하게 생산될 수 있는 베이크드 제품의 예로는, 백색, 갈색 또는 통밀 유형과 무관하게, 전형적으로 덩어리 또는 롤 형태의 빵(특히 흰빵, 통밀 또는 호밀 빵), 프랑스 바게뜨형 빵, 패스트리, 크로아상, 브리오슈(brioche), 파네토네(panettone), 파스타, 누들(삶거나 (볶음)튀겨짐), 피타(pita) 빵 및 다른 편평한 빵, 토르티야, 타코, 케이크, 팬케이크, 쿠키, 특히 비스킷, 도우넛, 예컨대 효모 발효된 도우넛, 베이글, 파이 크러스트, 찐빵, 귀리빵, 브라우니, 쉬이트 케이크(sheet cake), 스낵 푸드(예를 들어, 프레첼, 토르티야 칩, 성형 스낵, 성형 감자칩)이 포함된다. 용어 베이크드 제품은 2 내지 30 중량%의 설탕이 함유된 빵, 과일 함유 빵, 아침식사용 시리얼, 시리얼 바, 무계란 케이크, 소프트 롤(soft roll) 및 글루텐이 없는 빵을 포함한다. 본원에서 글루텐이 없는 빵은 기껏해야 20 ppm의 글루텐을 함유하는 빵이다. 몇몇 곡류 및 전분 원료는 글루텐이 없는 식이에 허용가능한 것으로 고려된다. 자주 사용되는 원료는 감자, 쌀 및 타피오카[카사바(cassava)로부터 유래됨]이다. 베이크드 제품으로는, 제한없이 틀구이 빵(tin bread), 덩어리 빵, 트위스트(twist), 번(bun), 예컨대 햄버거 번 또는 스팀드 번(steamed bun), 차파티(chapati), 러스크(rusk), 건조된 스팀 번 슬라이스, 빵가루, 무교병(matzo), 포카치아(focaccia), 멜바(melba) 토스트, 제백(zwieback), 크루통(crouton), 연질 프레첼, 연질 및 경질 빵, 빵 스틱, 효모 팽창 및 화학적-팽창 빵, 층상화 도우 제품, 예컨대 데니쉬 패스트리(Danish pastry), 크로와상 또는 퍼프(puff) 패스트리 제품, 머핀, 데니쉬, 베이글, 사탕과자 코팅물, 크래커, 웨이퍼(wafer), 피자 크러스트, 토르티야, 파스타 제품, 크레페, 와플, 부분베이크드 제품, 및 냉장 및 냉동 도우 제품이 포함된다. 본원에서 케이크로는 제한없이 쇼트닝 케이크(shortened cake), 예컨대 파운드 케이크 및 버터 케이크, 및 폼(foam) 케이크, 예컨대 머랭(meringue), 스폰지 케이크, 비스킷 케이크, 룰라드(roulade), 제누아즈(genoise) 및 쉬폰(chiffon) 케이크가 포함된다.
부분베이크드 제품의 예로는, 제한없이, 짧은 베이킹 과정에 의해 판매 또는 소비 시점에 완료되는 부분적으로 베이킹된 빵이 포함된다. 이러한 빵은 흰색 또는 갈색 식빵일 수 있고; 이러한 빵은 예를 들면 소위 미국식 스폰지 및 도우 방법(Sponge and Dough method) 또는 미국식 직접적 방법(Direct method)에 의해 제조될 수 있다.
"도우" - 용어 도우는 곡물가루 및 다른 구성성분들, 특히 도우 구성성분들의 혼합물로서 본원에 정의된다. 하나의 양태에서, 도우는 반죽되거나 롤링되기에 충분히 단단하다. 도우는 신선하거나, 동결되거나, 조제되거나, 부분베이킹될 수 있다. 동결된 도우의 제조는 컬프(Kulp) 및 로렌즈(Lorenz)에 의해 문헌 "냉동 및 냉장 도우 및 반죽(Frozen and Refrigerated Doughs and Batters)"에 기재되어 있다. 본원에서 용어 도우는 반죽을 포함한다. 반죽은 액체, 예컨대 케이크를 비롯한 다양한 식품을 제조하기 위해 사용되는 물, 우유 또는 달걀과 배합된 1종 이상의 곡물가루의 반-액체 혼합물로서, 스푼에서 떨어지거나 스푼으로 부을 수 있기에 충분히 묽다.
"도우 구성성분" - 도우 구성성분은 곡물가루, 달걀, 물, 소금, 설탕, 풍미제, 지방(버터, 마가린, 오일 및 쇼트닝 포함), 빵 효모, 화학적 팽창 시스템, 우유, 산화제(아스코르브산, 브로메이트 및 아조디카본아미드(ADA) 포함), 환원제(L-시스테인 포함) 유화제(모노/디글리세라이드, 모노글리세라이드, 예컨대 글리세롤 모노스테아레이트(GMS), 나트륨 스테아로일 락틸레이트(SSL), 칼슘 스테아로일 락틸레이트(CSL), 지방산의 폴리글리세롤 에스테르(PGE) 및 모노- 및 디글리세라이드의 디아세틸 타르타르산 에스테르(DATEM) 포함), 고무(구아고무 및 잔탄고무 포함), 산(시트르산, 프로피온산 포함), 전분, 변성 전분, 글루텐, 보습제(글리세롤 포함) 및 보존제로부터 선택된 임의의 성분을 포함한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 및 적어도 하나의 추가적인 효소를 포함하는 효소 조성물에 관한 것이다. 효소 조성물은 조성물 1 kg 당 10 내지 5000 HPU의 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 효소 조성물은 약 1000 내지 50000 HPU/g 범위의 활성을 갖는 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 1 ppm 내지 2000 ppm을 포함한다. 하나의 양태에서, 효소 조성물은 약 1000 내지 50000 HPU/g 범위의 활성을 갖는 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 10 내지 200 ppm을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 효소 조성물은 건조한 형태로 제공되어 반죽 또는 적어도 하나의 반죽 구성성분에 쉽게 첨가될 수 있도록 하지만, 액체 형태 또한 가능하다.
도우를 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법은 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 적어도 하나의 도우 구성성분에 첨가하는 단계를 포함한다. 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 도우 제조의 임의의 단계에 첨가될 수 있고, 1개, 2개 또는 그 이상의 단계에 첨가될 수 있다.
하나 이상의 추가적인 효소가 존재해야 한다면, 이들 효소는 별도로 또는 본 발명에 따른 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제와 함께, 예를 들면 본 발명에 따른 효소 조성물로서 첨가될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 도우를 베이킹하는 단계를 포함하는 베이크드 제품의 생산 방법에 관한 것이다. 베이크드 제품을 생산하는 방법에 대한 하나의 실시태양에서, 베이크드 제품은 빵 또는 케이크이다.
당분야의 숙련가라면 도우, 또는 도우 구성성분들로부터 출발된 베이크드 제품을 어떻게 제조하는지를 알 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 베이크드 제품의 생산 방법에 의해 수득가능한 베이크드 제품에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 베이크드 제품의 생산에 있어서의 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제의 용도에 관한 것이다.
도 1: 모의된 위 조건하에 밀 알파 아밀라아제 저해제와 함께 상이한 프로테아제 + 펩신의 다양한 항온처리에 대한 4 내지 12%의 SDS-PAGE(4 내지 12%의 비스-트리스 겔) 분석. 추가적인 효소없이 펩신 처리된 2개의 대조군이 포함된다. 화살표는 알파 아밀라아제 제조시 존재하는 3개의 주요 단백질 생성물의 위치를 지시한다.
- 분자량 마커: 레인 1, 2 및 15
- 아스페르길러스 니거 프롤린-특이적 엔도프로테아제 처리: t=0에서, 레인 3: t=90분에서, 레인 4
- 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제: t=0에서, 레인 5; t=90분에서, 레인 6
- 펩신: t=0에서, 레인 7; t=90분에서, 레인 8
- 파파인(papain): t=0에서, 레인 9; t=90분에서, 레인 10
- 멀티펙트(Multifect) PR15L: t=0에서, 레인 11; t=90분에서, 레인 12
- 아스페르길로펩신 I: t=0에서, 레인 13: t=90분에서, 레인 14
- 펩신: t=0에서, 레인 16; t=90분에서 레인 17.
도 2: 밴드 B1 내지 G1에 존재하는 가장 풍부한 단백질의 성질을 식별하기 위한 밀 알파 아밀라아제 저해제의 조제용 SDS-PAGE.
도 3: 모의된 위 조건하에 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제(AGP) 농도의 증가와 함께 표준화된 양의 밀 글루텐의 다양한 항온처리에 대한 4 내지 12%의 SDS-PAGE(4 내지 12%의 비스-트리스 겔) 분석. 화살표는 밀 알파 아밀라아제 저해제 0.19, CM2 및 CM16의 위치를 지시한다(실시예 1 참조).
- 분자량 마커[마크(Mark) 12(상표명) 언스테인드 스탠다드(Unstained Standard), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)]: 레인 13.
- 정제된 알파 아밀라아제/프로테아제 저해제: 레인 14.
- 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 첨가되지 않음: 레인 1=0, 레인 2=60분
- 0.09 mg/㎖의 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 첨가됨: 레인 3=0, 레인 4=60분
- 0.19 mg/㎖의 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 첨가됨: 레인 5=0, 레인 6=60분
- 0.28 mg/㎖의 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 첨가됨: 레인 7=0, 레인 8=60분
- 0.37 mg/㎖의 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 첨가됨: 레인 9=0, 레인 10=60분
- 0.47 mg/㎖의 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 첨가됨: 레인 11 =0, 레인 12=60분
도 4: 모의된 위 조건하에 밀 유래된 푸로티오닌과 함께 상이한 프로테아제 + 펩신의 다양한 항온처리에 대한 4 내지 12%의 SDS-PAGE(4 내지 12%의 비스-트리스 겔) 분석. 화살표는 정제된 푸로티오닌의 위치를 지시한다.
- 분자량 마커: 레인 1, 2, 9 및 10
- 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제: t=0에서, 레인 3; t=90분에서, 레인 4
- 아스페르길러스 니거 프롤린-특이적 엔도프로테아제: t=0에서, 레인 5; t=90분에서, 레인 6
- 멀티펙트 PR15L[트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei)로부터의 아스페르길로펩신 I-유사 프로테아제]: t=0에서, 레인 7; t=90분에서, 레인 8.
도 5: 모의된 위 조건하에 밀 유래된 푸로티오닌과 함께 상이한 프로테아제 + 펩신의 다양한 항온처리에 대한 4 내지 12%의 SDS-PAGE(4 내지 12%의 비스-트리스 겔) 분석. 화살표는 정제된 푸로티오닌의 위치를 지시한다.
- 분자량 마커: 레인 1
- 정제된 밀 푸로티오닌: 레인 2
- 멀티펙트 PR15L(트리코데르마 리세이로부터의 아스페르길로펩신 I-유사 프로테아제; http//biosciences.dupont.com): t=0에서, 레인 3; t=90분에서, 레인 4
- 90%(중량/중량)(존재하는 효소 단백질) 멀티펙트 PR15L 및 10% 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제의 혼합물: t=0에서, 레인 5; t=90분에서, 레인 6
- 프록타아제(Proctase)(대략 85%의 아스페르길로펩신 I을 포함하는, 아스페르길러스 니거에 의해 분비된 프로테아제의 비-GMO 혼합물): t=0에서, 레인 7; t=90분에서, 레인 8.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1: 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 모의된 위 조건하에 밀 유래된 알파 아밀라아제 /트립신 저해제를 효율적으로 절단하지만, 다른 산성 엔도프로테아제는 효율적이지 않다.
재료 및 방법
아스페르길러스 니거로부터 아스페르길로펩신 I의 생산
예컨대 국제특허출원공개 제WO 98/46772호에 기재된 방법을 사용하여, 아스페르길러스 니거로부터의 아스페르길로펩신 I을 위한 유전자(pepA; An14g04710)를 아스페르길러스 니거 숙주에서 과발현시켰다. 국제특허출원공개 제WO 98/46772호는 아세트아미드를 함유하는 한천 플레이트 상에서 형질전환체를 선택하는 방법 및 표적화된 다중복사물 구성부분을 선택하는 방법을 개시한다. 발현 카세트(cassett)의 다중복사물이 함유된 아스페르길러스 니거 형질전환체를 샘플 물질의 추가의 생성을 위해 선택하였다. 형질전환된 아스페르길러스 니거 균주를 변형된 CSM-발효 배지(pH 6.2)[40 g/ℓ의 말토오스, 30 g/ℓ의 박토-소이톤(Bacto-soytone), 70 g/ℓ의 시트르산 나트륨 3염기 2수화물, 15 g/ℓ의 (NH4)2S04, 1 g/ℓ의 NaH2P04*2H20, 1 g/ℓ의 MgS04*7H20, 1 g/ℓ의 L-Arg, 0.25 ㎖/ℓ의 클레롤(Clerol) 소포제]에서 발효시켰다. 수득된 배양액을 여과하고, 멸균 여과하고, 이어서 한외여과하여 농축시켰다. 효소를 50 밀리몰/ℓ의 아세트산 나트륨(pH 5.6) 중에서 Q-세파로즈 XK 26/10 칼럼에 적용한 후 염 구배로 용출시킴으로써 크로마토그래피를 수행하였다. 다양한 분획에서 아스페르길로펩신 I 단백질의 존재를, 4 내지 12% SDS-PAGE[누파게(NuPAGE) 비스-트리스 겔, 인비트로겐(Invitrogen)] 이후 착색된 단백질 밴드의 강도를 판단함으로써 정량화하였다.
효소 검정
항온처리를 50 밀리몰/ℓ의 시트르산 나트륨중에서 pH 4.0하에 90분 동안 37℃에서 수행하였다. 모든 관련 항온처리에서, 펩신은 0.2 mg/㎖의 효소 단백질 농도로 존재하였다. 프롤린-특이적 엔도프로테이나제를 1 ㎖ 당 0.5 mg의 효소 단백질 농도로 시험하고, 다른 산 엔도프로테이나제를 1 ㎖ 당 0.05 mg의 효소 단백질 농도로 시험하였다. 아밀라아제 저해제를 마지막으로 첨가하였고, 2 mg/㎖의 농도로 존재하였다.
t=0에서, 100 ㎕의 반응 혼합물을 400 ㎕의 25% TCA로 옮겼다. 37℃에서 90분 동안 항온처리한 후, 또 다른 100 ㎕를 400 ㎕의 신선한 TCA 용액으로 옮겼다. 4℃에서 2시간 후, 샘플을 10분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 65 ㎕의 인산염 완충제(pH 7), 25 ㎕의 리튬 도데실 설페이트(LiDS) 및 10 ㎕의 샘플 환원제를 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 하룻밤 동안 저장한 후, 인비트로겐 프로토콜에 따라 SDS-PAGE를 위해 준비하였다(인비트로겐, www.lifetechnologies.com).
아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 활성( HPU )의 결정
소 혈액으로부터의 20.0 g의 헤모글로빈[시그마(Sigma) 제품 H2625]을 10분 동안 실온에서 교반함으로써 대략 700 ㎖의 물에 현탁시켰다. 3.73 g의 염화 칼륨(KCl)을 첨가한 후, pH를 0.5 몰/ℓ의 염산에 의해 1.75로 조정하였다. 헤모글로빈 현탁액의 부피를 물에 의해 1 ℓ로 조정하였다. pH를 다시 검사하고 pH 1.75 로 조정하였다.
상기 개시된 바와 같이 생산된 정제된 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 2.0 몰/ℓ의 HCl에 의해 pH 1.75로 조정된 3.73 g/ℓ의 KCl이 함유된 KCl/HCl 완충제에 용해시킴으로써 효소 용액을 제조하였다. 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 활성을 시험하기 위해, 5 ㎖의 헤모글로빈 용액을 40℃로 가열하고, 후속적으로 5 내지 25 히스티딘 프로테아제 단위 활성(HPU/㎖)을 갖는 1 ㎖ 효소 용액을 첨가하여 반응을 개시시켰다. 30분 후, 5 ㎖의 트리클로로 아세트산 용액(140 g/ℓ)을 첨가함으로써 반응을 중단시켜 더 큰 펩타이드 단편을 침전시켰다. 5 ㎖의 헤모글로빈 용액 및 5 ㎖의 트리클로로아세트산 용액의 혼합물에 1.0 ㎖의 효소 샘플을 첨가함으로써 블랭크 측정을 실행하였다. 튜브를 40℃에서 30분 동안 항온처리하여 침전을 완료시켰다. 원심분리 후, 작은 펩타이드가 함유된 투명한 상청액의 광학 밀도를 275 nm에서 측정하였다. 결과를 1 ㎍/㎖의 L-티로신 용액과 비교하였다.
1 HPU는 1분 당 일정량의 헤모글로빈을 가수분해하는 효소의 양이고, 0.1 몰/ℓ의 HCl 용액중 1 ㎖ 당 1 ㎍의 L-티로신이 함유된 용액의 광학 밀도와 동일한 275 nm에서의 광학 밀도를 갖는 용액을 제공한다. 시험 조건은 다음과 같다: pH 1.75, 온도 40℃, 항온처리 동안의 헤모글로빈 농도 16.7 g/ℓ.
활성(HPU/㎖) = (OD샘플 - OD블랭크 / S) × 11/30
상기 식에서,
OD샘플은 샘플 여액의 광학 밀도(275 nm)이고;
OD블랭크는 샘플 블랭크 여액의 광학 밀도(275 nm)이고;
S는 1.1 ㎍/㎖의 L-티로신 표준 용액의 OD(㎖/㎍)이고;
30은 항온처리 시간(분)이고;
11은 총 부피 반응 혼합물(㎖)이다.
LC-MS/MS 분석
시험관내 소화
샘플을 밀리큐(MilliQ) 워터중에 1 mg/㎖로 용해시켰다. 용액을 100 mM NH4HCO3(pH 7.8)에서 10배 희석시켰다. DTT(5 mM)를 첨가하고 30분 동안 실온에서 항온처리하여 샘플을 환원시키고, 요오도아세트아미드(IAA)(5.5 mM)를 첨가하고 30분 동안 실온하에 암실에서 항온처리하여 알킬화시켰다. 트립신에 의한 소화를 37℃에서 하룻밤 동안 수행하였다.
겔에서의 소화
엑스퀘스트 스폿 커터(ExQuest spot cutter)[바이오래드(Biorad), 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재]를 사용하여 겔로부터 겔 밴드를 잘라내고, lo-단백질 바인드 MTP[에펜도르프(Eppendorf), 독일 함부르크 소재]로 옮겼다. 팽윤을 위해 75 ㎕의 50mM NH4HC03을, 수축을 위해 75 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하여 겔 조각을 총 3회 세척하였다. 세척된 겔 조각을 트립신에 의해 소화시키고, 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리하여 소화를 수행하였다. 샘플을 1분 동안 초음파처리하고, 상청액을 주사-바이알 내로 수집하였다.
LC-MS/MS 분석
샘플을 1% 포름산으로 산성화시키고 악셀라-LTQ-벨로스(Accela-LTQ-Velos)[써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재] 상에서 분석하였다. 이동상으로서 (A) 0.1% 포름산이 함유된 LC-MS 등급의 물 및 (B) 0.1% 포름산 용액이 함유된 LC-MS 등급의 아세토니트릴[바이오솔브 비브이(Biosolve BV), 네덜란드 소재]에 의한 구배 용출을 사용하여, 2.1 × 100 mm의, 1.8 ㎛ 입자 크기 및 80Å 기공 크기를 갖는 C-18 에클립스(Eclipse) XDB 조르백스(Zorbax) 칼럼[아길렌트(Agilent), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재]에 의해 크로마토그래피 분리를 달성하였다. 구배는 83분 내에 5%로부터 40%로의 B였다. 25 ㎕의 주입 부피를 사용하여 유속을 0.4 ㎖/분으로 유지시키고 칼럼 온도를 50℃로 설정하였다. 동적 배제(dynamic exclusion)를 사용하고 단지 2 및 3의 하전 상태를 포함하여, 400 내지 2000 m/z의 질량 범위를 갖는 상위 10개 데이터-의존성 획득에 의해 MS 데이터 획득을 수행하였다. MS/MS 실험을 3.0에서 설정된 단리 폭으로 수행하고, 정규화된 충돌 에너지를 35로 설정하였다. 트립신을 바람직한 효소로 사용하면서, 소서러(Sorcerer) 2[소서러(상표)-세퀘스트(SEQUEST: 등록상표)] 조사 엔진 및 트랜스 프로테오메 파이프라인(TPP: Trans Proteome Pipeline)에 의해 데이터베이스를 조사하였다. 90% 초과의 신뢰도를 갖는 것으로 확인된 단백질만을 고려하였다. 데이터를 스위스프로트 데이터베이스에 대해 조사하였다.
결과
본 실시예에서, 본 발명자들은, 모의된 위 조건하에, 다수의 산성 엔도프로테이나제들중에서 단지 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제만이 다양한 밀 알파 아밀라아제 저해제(밀 종자로부터의 알파 아밀라아제 저해제, 유형 1, 시그마)를 포함한 정제된 조제물을 효율적으로 분해할 수 있음을 입증하였다(도 1 참조). 본 실험에서, 하기 효소들의 효능을 펩신의 존재하에 비교하였다(대조군):
- 펩신(돼지 위 점막, 시그마),
- 아스페르길러스 니거로부터의 프롤린-특이적 엔도프로테이나제[막시프로(MaxiPro) PSP, 디에스엠 푸드 스페셜티즈, 네덜란드 델프트 소재],
- 파파인[콜루풀린(Collupuline), 디에스엠 푸드 스페셜티즈, 네덜란드 델프트 소재],
- 아스페르길로펩신 II로도 지칭되는 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제(막시프로 HSP, 디에스엠 푸드 스페셜티즈, 네덜란드 델프트 소재),
- 아스페르길로펩신 I(재료 및 방법 참조),
- 멀티펙트 PR15L(트리코데르마 리세이로부터의 아스페르길로펩신 I-유사 프로테아제; http//biosciences. dupont.com).
결과(도 1 참조)는 정제된 밀 글루텐 알파 아밀라아제 저해제 조제물이 대략 12 kDa 크기를 갖는 3가지 주요 단백질 밴드를 포함함을 보여준다(화살표 참조). 이들 데이터는 또한 모의된 위 조건하에, 및 펩신 및 동량의 다양한 프로테이나제의 존재하에 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 알파 아밀라아제 저해제의 정제된 조제물에 존재하는 이들 3가지 주요 밴드를 분해하는데에 가장 효과적임을 보여준다.
이들 밴드 각각에 존재하는 상이한 단백질의 성질을 확인하기 위해서, 겔 밴드의 샘플을 절단하고, 추출하고, 존재하는 단백질을 상기 "재료 및 방법"에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS 분석에 의해 식별하였다.
이러한 경우, 10 mg/㎖의 시그마 알파 아밀라아제 저해제 용액을 물로 10배 희석하였다. 이어서, 65 ㎕의 상기 용액을 25 ㎕의 LiDS 샘플 완충제 및 10 ㎕의 샘플 환원제와 혼합하고, 10분 동안 70℃에서 가열하고, 이후 인비트로겐 프로토콜에 따라 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이어서, 겔을 1 시간 동안 50% 메탄올/7% 아세트산으로 고정시키고, 탈이온수로 2회 세척하고, 사이프로 루비(Sypro Ruby)에 의해 하룻밤 동안 염색하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 3가지의 아마도 알파 아밀라아제 저해제 밴드로 이루어진 겔 샘플을 수득하였다. 추출된 단백질로부터 수득된 LC-MS/MS 데이터에 따라서, 밴드 C1 및 B1에 존재하는 가장 풍부한 단백질은 스위스프로트 수탁 번호 P17314(CM3) 및 P16159(CM16)를 갖는 밀 알파 아밀라아제 저해제이고, 밴드 E1 및 D1에서는 밀 알파 아밀라아제 저해제 P01085(0.19), P16851(CM2) 및 P16159(CM16)이고, 밴드 G1 및 F1에서는 P01083(CM3)이다.
이러한 데이터로부터 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 놀랍게도 위 조건하에 밀 유래된 알파 아밀라아제 저해제를 분해하는데에 가장 효과적이고, 가장 주목할만하게는 밀 알파 아밀라아제 저해제는 CM2, CM3, CM16, 및 0.19임을 알 수 있다.
실시예 2: 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 맥주에서 알파 아밀라아제 /트립신 저해제를 절단하고 거품을 안정화시킨다.
아미노산 서열에 따라서, 보리는 밀에 존재하는 알파 아밀라아제 저해제와 매우 유사한 알파 아밀라아제 저해제를 포함한다. 따라서, 맥주는 글루텐 과민성 개체와 관련될 수 있는 식품 제품을 제공한다. 맥주에서, 다른 식품 제품에서와 같이, 알파 아밀라아제 저해제는 면역 반응을 유도하기에 충분히 큰 온전한 분자 또는 펩타이드로서 존재한다. 예를 들면, 16종의 상이한 맥주에 대한 LC-MS/MS 분석에서, 본 발명자들은 알파 아밀라아제 저해제에 기여하는 서열에 의해 9개의 아미노산보다 더 큰 상이한 펩타이드 약 3300종을 식별하였다. 이러한 발견은 글루텐 과민성 개체의 경우 알파 아밀라아제 저해제의 강력한 관련성, 및 이에 따른 맥주 생산에 대한 아스페르길로글루타민산 펩티다아제의 관련성을 나타낸다.
맥주 발효 상 동안 또는 그 이후의 프로테아제의 사용은 소위 한랭 혼탁(chill haze)을 방지하기 위해 꽤 흔한 일이다. 역사적으로 프록타아제 또는 파파인과 같이 광범위한 특이성을 갖는 산 프로테아제가 이러한 목적을 위해 사용되었지만, 요즘은 브루어스 클라렉스(Brewers Clarex)로 지칭되는 프롤린-특이적 엔도프로테아제가 바람직한 선택사항을 제공한다. 이러한 광범위한 특이성을 갖는 효소로부터 매우 특이적인 브루어스 클라렉스 제품으로 전이되는 주된 이유는, 광범위한 특이성을 갖는 효소가 불량한 발포 능력을 갖는 맥주를 생성하는 경향이 있기 때문이다. 따라서, 맥주 거품에 대한 임의의 부정적 영향은 맥주 생산 동안 단백질분해 처리의 허용을 위한 전제조건이다. 맥주 거품 형성에 미치는 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제의 영향을 시험하기 위해, 하기 실험을 수행하였다.
큰 국제적 브랜드의 병맥주를 지역 수퍼마켓에서 구입하였다. 병을 조심스럽게 열고, 관련 효소를 첨가하고, 즉시 새로운 크라운 코르크(crown cork)로 병을 다시 닫았다. 주의깊게 혼합한 후, 병을 20℃에서 저장하였다. 상기 실시예 1에 제공된 데이터로부터, 알파 아밀라아제 저해제를 분해하는데 필요한 아스페르길로글루타민산 펩티다아제의 농도는 프롤린 특이적 엔도프로테아제 농도에 비해 적어도 10배 더 낮음을 알 수 있다. 상업용 프롤린-특이적 브루어스 클라렉스 제품의 전형적인 산업적 사용 수준은 맥주 1 hℓ 당 3 g이고, 이는 맥주 1 hℓ 당 순수한 효소 단백질 150 mg에 상응한다. 본 실험에서, 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 또한 상기 농도로 첨가하지만, 나머지 2가지 프로테아제를 맥주 1 hℓ 당 순수한 효소 단백질 15 mg만의 농도로 첨가하였다. 1주 동안 항온처리한 후, 모든 맥주의 거품 안정성을 어낼리티카(Analytica)-EBC 방법 9.42에 따라 하프만스(Haffmans) 장비[거품 안정성 테스터 니벰 TPH(Foam Stability Tester Nibem TPH)와 조합된 인팩(Inpack) 2000 샘플러, 하프만스 비브이(Haffmans BV), 네덜란드 벤로 소재]에 의해 측정하였다. 항온처리당 2개의 중복물의 평균 거품 값은 표 1에 제시된다.
예상된 바와 같이, 한랭 혼탁 방지에 적합한 농도(즉, 150 mg/hℓ)로 첨가된 프롤린-특이적 엔도프로테아제와 함께 항온처리된 맥주의 거품 안정성은 기준 제품(프로테아제가 첨가되지 않은 시판 맥주)에 대해 수득된 데이터와 필적할만 하다. 낮은 농도의 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 또는 아스페르길로펩신 I-유사 효소의 첨가시, 맥주 거품의 안정성은, 이것이 산업적으로 사용되는 수준의 프롤린-특이적 엔도프로테아제와 함께 적용되는 경우 조차도 상당히 증가함이 놀랍게도 관찰되었다. 이러한 결과는, 예를 들면 알파 아밀라아제 저해제의 큰 펩타이드를 파괴할 의도로 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 첨가하는 것이 바람직한 부수적 영향으로서 맥주 거품 안정화를 일으킴을 보여준다.
다양한 효소와 함께 항온처리된 맥주의 거품 안정성
첨가된 효소 거품(초)
기준 252
프롤린-특이적 엔도프로테아제(150 mg/hℓ) 250
프롤린-특이적 엔도프로테아제(15 mg/hℓ) 252
아스페르길로글루타민산 펩티다아제(15 mg/hℓ) 280
멀티펙트 15L(15 mg/hℓ) 255
실시예 3: 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제는 용량 의존적 방식으로 알파 아밀라아제 /트립신 저해제를 절단한다.
본 실시예에서, 본 발명자들은 모의된 위 조건하에 밀 글루텐 1 g에 존재하는 알파 아밀라아제/프로테아제 저해제를 가수분해하는데 필요한 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 효소 단백질의 양을 결정하였다. 이를 위해, 밀로부터의 글루텐(시그마)을 50 밀리몰/ℓ의 시트르산(pH 4.0)에 9.35 mg/㎖의 농도로 용해시켰다. 철저히 교반된 이러한 혼합물에 펩신 효소 단백질을 첨가하여 0.2 mg/㎖의 최종 농도에 도달시키고, 6개의 1 ㎖의 샘플을 채취하였다. 이들 6개의 샘플에 순수한 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 효소를 양을 증가시키면서 첨가하였다. 샘플 1: AGP가 첨가되지 않음, 샘플 2: 0.09 mg 첨가, 샘플 3: 0.19 mg 첨가, 샘플 4: 0.28 mg 첨가, 샘플 5: 0.37 mg 첨가, 및 샘플 6: 0.47 mg 첨가. 이어서, 다양한 샘플을 60분 동안 37℃에서 항온처리하고 각각의 샘플로부터 SDS-PAGE 분석을 위한 분취량을 t=0분 및 t=60분에 채취하였다. SDS-PAGE 분석을 인비트로겐 프로토콜에 따라 실행하였다.
그 결과(도 3 참조)는, 0.28 mg의 순수한 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제의 첨가에 의해 9.35 mg의 밀 글루텐에 존재하는 알파 아밀라아제/프로테아제 저해제가 1 시간의 기간 이내에 가수분해될 수 있음을 보여준다. 이는 30 mg의 순수한 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제(15000 HPU와 상응함)가 이러한 모의된 위 조건하에 1 g의 밀 글루텐에 대응할 수 있음을 암시한다. 이와 같이, 경구적 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 제제에 의한 알파 아밀라아제/프로테아제 저해제의 부분적 단편화 이후, 새롭게 생성된 저해제 펩타이드는 위를 통과하는 동안 펩신에 의해, 십이지장으로 진입한 후 췌장 프로테아제, 예컨대 트립신 및 카이모트립신(chymotrypsin)에 의해 비-면역원성 올리고-펩타이드로 추가로 분해될 것이다.
실시예 4: 트리코데르마 리세이로부터의 아스페르길로펩신 I 동족체는 위 조건하에 밀 유래된 푸로티오닌을 절단한다.
재료 및 방법
푸로티오닌을 일부 변형된 오타니(Ohtani) 등(J. Biochem. 82, 753-767 (1977))에 의해 기재된 방법에 의해 단리하였다. 20 밀리몰/ℓ의 인산 나트륨(pH 7.2)으로 평형화되고 동일한 완충제중에서 0에서 1.0 몰/ℓ로의 NaCl의 선형 구배로 용출되는 SP 세파로즈 6 FF[애머샴(Amersham)]상에서 밀 상청액을 크로마토그래피하였다. 다양한 분획에서 대략 5 KDa의 분자량을 갖는 순수한 푸로티오닌의 존재를 SDS-PAGE에 의해 수행하였다. 단일 단백질 밴드를 나타내는 분획을 모으고, 아미콘 3 kDa 막을 사용하여 농축시킨 다음 동결 건조하였다. 유니프로트/스위스프로트 데이터베이스를 사용하여 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS 분석에 의해 단리된 단백질의 동일성 및 순도를 확인하였다.
효소적 검정
정제된 푸로티오닌과 다양한 프로테아제의 항온처리를 본원의 실시예 1에 구체화된 조건과 유사하게 50 밀리몰/ℓ의 시트르산 나트륨중에서 pH 4.0하에 90분 동안 37℃에서 실행하였다. 모든 관련된 항온처리에서, 펩신은 0.2 mg/㎖의 효소 단백질 농도로 존재하였다. 아스페르길로글루타민산 펩티다아제, 프롤린-특이적 엔도프로테이나제 및 멀티펙트 PR15L을 1 ㎖ 당 0.11 mg의 효소 단백질 농도로 시험하였다. 밀 푸로티오닌을 마지막으로 첨가하였고, 1 ㎖ 당 0.44 mg의 농도로 존재하였다.
결과
본 실험에서, 하기 효소의 효능을 펩신의 존재하에 비교하였다:
- 아스페르길로펩신 II로도 지칭되는 아스페르길러스 니거 아스페르길로글루타민산 펩티다아제(막시프로 HSP, 디에스엠 푸드 스페셜티즈, 네덜란드 델프트 소재),
- 아스페르길러스 니거로부터의 프롤린-특이적 엔도프로테이나제(막시프로 PSP, 디에스엠 푸드 스페셜티즈, 네덜란드 델프트 소재)
- 멀티펙트 PR15L(트리코데르마 리세이로부터의 아스페르길로펩신 I-유사 프로테아제; http//biosciences.dupont.com).
수득된 결과(도 4 참조)는 모의된 위 조건 및 동량의 다양한 프로테이나제 하에, 트리코데르마 리세이로부터의 아스페르길로펩신 I-유사 프로테아제가 밀 유래된 푸로티오닌을 효과적으로 분해함을 보여준다.
실시예 5: 위 조건하에서의 밀 유래된 푸로티오닌의 절단
재료 및 방법
푸로티오닌을 실시예 4에 기재된 바와 같이 밀로부터 단리하였다. 프로테아제를 메이지(Meiji)(일본 도쿄 소재)로부터 수득하였다.
결과
도 5에서 밀 푸로티오닌의 소화 생성물에 의해 예시된 바와 같이, 아스페르길러스 니거로부터의 아스페르길로펩신 I 또는 트리코데르마 리세이로부터의 그의 동족체를 포함한 효소 생성물은 모의된 위 조건하에 밀 푸로티오닌을 가수분해할 수 있다.
실시예 6: 아스페르길로글루타민산 펩티다아제 및 아스페르길로펩신 I-유사 효소는 이들의 효과적인 투여량에서 맥주 거품에 해로운 영향을 미치지 않는다.
맥주는 밀에 존재하는 알레르겐성 알파-아밀라아제/트립신 저해제에 매우 상동성인 것으로 공지된 보리 유래된 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 포함한다[오카다(Okada) 등의 문헌 "J. Agric. Food Chem. 2008,56, 1458-1464"]. 본원의 실시예 1에 제시된 결과는 아스페르길로글루타민산 펩티다아제가 다양한 알파-아밀라아제/트립신 저해제를 효과적으로 가수분해할 수 있음을 보여준다. 따라서, 아스페르길로글루타민산 펩티다아제를 맥주에 첨가하면, 또한 보리로부터의 알파-아밀라아제/트립신 저해제가 가수분해될 것으로 예상될 수 있다. 실시예 2에서, 본 발명자들은 관련된 산 프로테아제를 첨가함이 맥주 거품의 품질에 부정적인 영향을 주지 않음을 보여준다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 알파-아밀라아제/트립신 저해제 및 단백질 Z[가르시아-카사도(Garcia-Casado) 등의 문헌 "J Allergy Clin Immunol, 108(4), pp 647-649"]와 유사한 공지된 맥주 알레르겐을 가수분해하는데 필요한 아스페르길로글루타민산 펩티다아제, 아스페르길로펩신 I 및 트리코데르마 리세이의 아스페르길로펩신 I 동족체의 효소 투여량이, 한랭 혼탁을 방지하기 위해 필요한 양의 프롤린-특이적 엔도프로테아제(막시프로 PSP, 디에스엠 푸드 스페셜티즈, 네덜란드 델프트 소재)와 조합되지 않은 경우 조차도, 맥주 거품 안정성에 해로운 영향을 미치지 않음을 보여준다.
큰 국제적 브랜드의 병맥주를 지역 수퍼마켓에서 구입하였다. 병을 조심스럽게 열고, 관련 효소를 첨가하고, 즉시 새로운 크라운 코르크로 병을 다시 닫았다. 주의깊게 혼합한 후, 병을 20℃에서 1주일 동안 저장하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 거품 안정성을 측정하고 항온처리당 2개의 중복물의 평균 거품 값을 표 2에 제시하였다. 수득된 데이터는 높은 투여량의 첨가된 다양한 산 프로테아제가 형성된 거품에 해로운 영향을 미치지 않음을 명백히 입증한다.
다양한 단백질분해 효소와 함께 항온처리된 맥주의 거품 안정성
첨가된 효소 거품[초]
프롤린-특이적 엔도프로테아제(150 mg/hℓ) 250
프롤린-특이적 엔도프로테아제(50 mg/hℓ) 247
프롤린-특이적 엔도프로테아제(15 mg/hℓ) 259
아스페르길로글루타민산 프로테아제(150 mg/hℓ) 268
아스페르길로글루타민산 프로테아제(50 mg/hℓ) 273
아스페르길로글루타민산 프로테아제(15 mg/hℓ) 280
멀티펙트 PR15L(150 mg/hℓ) 270
멀티펙트 PR15L(50 mg/hℓ) 276
멀티펙트 PR15L(15 mg/hℓ) 255
아스페르길로펩신 I(150 mg/hℓ) 284
아스페르길로펩신 I(50 mg/hℓ) 267
아스페르길로펩신 I(15 mg/hℓ) 266
프롤린-특이적 엔도프로테아제(150 mg/hℓ) +
아스페르길로펩신 I(15 mg/hℓ)		 264
프롤린-특이적 엔도프로테아제(150 mg/hℓ) +
멀티펙트 PR15L(15 mg/hℓ) 		266
프롤린-특이적 엔도프로테아제(150 mg/hℓ) +
아스페르길로펩신 I(15 mg/hℓ)		 265
기준 맥주 252
기준 맥주 + 0.75 ㎖ H20 259

Claims (17)

  1. 글루텐 과민성 개체에서 위장의 편안함을 유지 또는 증가시키거나, 셀리악 또는 비-셀리악 글루텐 과민성 개체에서 위장의 불편함의 발병을 지연시커나, 또는 건강한 개체에서 알파-아밀라아제 트립신 저해제 노출을 감소시키기 위한, 아스페르길러스 니거(Aspergillus niger)로부터 단리된 아스페르길로펩신(aspergillopepsin) Ⅱ 및 식이용으로 허용가능한 부형제를 포함하는 식이 보충제.
  2. 제1항에 있어서,
    아스페르길로펩신(aspergillopepsin) I을 추가로 포함하는 식이 보충제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    정제, 캡슐 또는 액체 제형의 형태로 존재하는 식이 보충제.
  4. 장에서 선천성 면역 반응을 겪는 환자를 치료하거나; 셀리악병(celiac disease), 비-셀리악 글루텐 불내증, 글루텐 과민증, 과민성 장 증후군, 또는 염증성 장 질환을 치료하거나; 글루텐 과민성 개체에서 위장의 편안함을 유지 또는 증가시키거나; 셀리악 또는 비-셀리악 글루텐 과민성 개체에서 위장의 불편함의 발병을 지연시키기 위한, 아스페르길러스 니거로부터 단리된 아스페르길로펩신 Ⅱ 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    프롤릴-엔도펩티다아제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    아스페르길로펩신 I을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    장에서 선천성 면역 반응을 겪는 환자를 치료하기 위한 약학 조성물.
  8. 제4항에 있어서,
    셀리악병(celiac disease), 비-셀리악 글루텐 불내증, 글루텐 과민증, 과민성 장 증후군, 또는 염증성 장 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
  9. 제4항에 있어서,
    글루텐 과민성 개체에서 위장의 편안함을 유지 또는 증가시키거나, 셀리악 또는 비-셀리악 글루텐 과민성 개체에서 위장의 불편함의 발병을 지연시키기 위한 약학 조성물.
  10. 제4항에 있어서,
    식사 전 또는 후 1 시간 이내에 경구적으로 투여되는 약학 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 아스페르길러스 니거로부터 단리된 아스페르길로펩신 Ⅱ 및 하나 이상의 추가적인 효소를 포함하는, 식품 조성물 중 알파-아밀라아제 트립신 저해제(alpha-amylase trypsin inhibitor)를 분해하기 위한 효소 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    프롤릴-엔도펩티다아제를 추가로 포함하는 식이 보충제.
  17. 제4항에 있어서,
    정제, 캡슐 또는 액체 제형의 형태인 약학 조성물.
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