JP2023525856A

JP2023525856A - Ａｔｉ消化のための方法及び組成物

Info

Publication number: JP2023525856A
Application number: JP2022569213A
Authority: JP
Inventors: ミシェル，リサコルグレイヴ，; アンジェラジュハース，; グレゴリー，ジョンタナー，; エゼキエルペナ，
Original assignee: Glutagen Pty Ltd
Current assignee: Glutagen Pty Ltd
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2023-06-19
Also published as: WO2021226672A1; KR20230009464A; CA3178592A1; EP4149520A1; EP4149520A4; US20230173040A1; AU2021270054A1

Abstract

本発明は、一般的には、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）を消化する方法、並びにαアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防に関する。【選択図】図１８

Description

[1] 本発明は、一般的には、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）を消化する方法、並びにαアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防に関する。

[2] 過去数十年間において、新規な農業習慣の実施は、コムギベースの食物の大規模生産に関連するコストの低下に肯定的に寄与した。結果的に、より大量のパンとパスタの消費により、コムギに対する過敏化の予測可能な増加が引き起こされた。これらの障害のうち最も数が多いものとしては、パン職人喘息、並びにコムギ摂取に対する免疫反応、例えば、セリアック病（ＣＤ）、コムギアレルギー（ＷＡ）、及び非セリアックグルテン／コムギ過敏症（ＮＣＧＳ又はＮＣＷＳ）が挙げられる。

[3] ＣＤが、素因のある個体において適応免疫応答を誘導するグルテンペプチドによって誘発されてＴ細胞の活性化を生じる一方で、ＷＡにおいては、ＩｇＥ抗体がコムギタンパク質により誘導されて、最終的には免疫媒介因子の放出を刺激する。

[4] ＮＣＧＳは、自然免疫活性化と関連し、コムギタンパク質により刺激される可能性がある。ＮＣＧＳはまた、腸外症状、例えば、錯乱及び頭痛、慢性疲労、関節／筋肉の疼痛、並びに既存の神経疾患、精神疾患、又は（自己）免疫疾患の悪化を呈する。

[5] コムギタンパク質の構造的特性、化学的特性及び物理的特性に基づいて、コムギタンパク質は、アルブミン及びグロブリン（総タンパク質含量の１５％）、並びにグルテン（総タンパク質含量の８５％）として一般的には分類される。詳細には、グルテンがモノマーグリアジンとポリマーグルテニンとの複合混合物からなる一方で、アルブミン及びグロブリンは、いくつかのタンパク質ファミリー、例えば、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）、βアミラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂質輸送タンパク質、及びセリンプロテアーゼインヒビターを含む。自然免疫応答の開始を効果的に担うコムギ成分を同定する探究において、ＡＴＩが、骨髄系細胞の強力な活性化因子として実証された。詳細には、ＡＴＩは、ＴＬＲ４－ＭＤ２－ＣＤ１４複合体と直接結合し、核因子κＢ経路及びインターフェロン応答性因子３経路の両方を活性化して、成熟マーカーのアップレギュレーション及び炎症性の自然サイトカインの放出を生じる。ＴＬＲ４系の重要な地位は、ＴＬＲ４欠損性動物モデルが、ＡＴＩ１５で経口チャレンジした際に腸免疫応答及び全身免疫応答から保護されたので、さらに確認された。

[6] 他のタンパク質構成成分と比較して、ＡＴＩは、総コムギタンパク質の微量ではあるがなおかなりの部分（２～４％）を表し、平均して、成人は、１日当たり１ｇまでのＡＴＩに曝される。実際に、ＡＴＩは、市販のコムギベースの食物に存在して濃縮さえされており、ペプシン及びトリプシンによるタンパク質分解消化から逃れることができ、経口摂取の際の腸移行後にＴＬＲ４活性化能を保持する。

[7] 構造的に、コムギＡＴＩは、分子間ジスルフィド結合によって安定化され高い二次構造相同性を有する、ヒドロラーゼ耐性タンパク質のグループに属する。コムギＡＴＩは、モノマー形態並びに（非共有結合した）ダイマー形態及びテトラマー形態によって構成される、３つのサブグループにさらに分割されることができる。ＡＴＩは、植物種子の胚乳において見出され、ＡＴＩは、寄生生物及び昆虫に対する自然防御の一部、並びに種子の発達及び発芽中のデンプン代謝の調節分子を表す。コムギ以外の植物、例えばライムギ及びオオムギもまた、類似する二機能性インヒビターを含むが、ＴＬＲ４活性化活性を最小限しか示さないか又は全く示さない。

[8] インビボでのＴＬＲ４刺激活性と、多様なヒドロラーゼに対する強力な阻害活性に起因する胃腸でのタンパク質分解に対する耐性とが原因で、ＡＴＩは、炎症疾患、代謝疾患及び自己免疫疾患並びにＮＣＧＳにおける病原性の役割を果たす可能性がある。

[9] 現在、ＡＴＩにより媒介される疾患を処置するために有効な治療は、患者に対して厳格な回避食を課すこと以外は、利用可能ではない。そのようなタンパク質を含む食物は、現代の食事の主要成分である。さらに、ＡＴＩ含有コモディティ製品の広範な使用は、摂取した場合に消費者直接取引食品が危険をもたらすかどうかを確認する困難を有する患者を生じる可能性がある。従って、食物に対して重篤な反応を引き起こすのに十分なＡＴＩを含む食品の数は、多大であり、しばしば予測不能である。従って、ＡＴＩを厳格に排除した食事は、患者が実施するにはしばしば困難であり不便である。

[10] ＡＴＩ媒介性疾患の深刻で広範な性質並びにＡＴＩ媒介性疾患を予防及び処置することに関連する現在の困難性を考慮すると、これらの関連する状態の影響を処置、予防又は軽減する改善された方法を開発する必要性が、残っている。

[11] 文書、行為、材料、デバイス、論文などの議論は、本発明についての状況を提供することのみを目的として本明細書中に含まれる。これらの物事のいずれか又はすべてが先行技術の根拠の一部を形成したとも、これらの物事のいずれか又はすべてが、本出願の各請求項の優先日前に存在した本発明に関係する分野の技術常識であったとも、示唆も表現もされない。

[13] １つの態様において、本発明は、少なくとも１つのαアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）を消化するための方法であって、ＡＴＩを、１つ又は複数のパパイア（Ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａ）エンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量と接触させるステップを含む方法を提供する。

[14] １つの態様において、本発明は、αアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）含有食料品における少なくとも１つのＡＴＩを消化するための方法であって、前記ＡＴＩ含有食料品を、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量と接触させるステップを含む方法を提供する。

[15] １つの実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物が、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）からなる群から選択される１つ又は複数のプロテアーゼを含む、本明細書において記載される方法を提供する。

[16] 別の実施形態において、本発明は、前記αアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）を、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含む前記タンパク質分解調製物と、加水分解による前記ＡＴＩの消化を引き起こすのに十分な条件下で接触させる、本明細書において記載される方法を提供する。

[17] さらなる実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つのＡＴＩが、コムギ、オオムギ、ライムギ又はカラスムギの種に由来するＡＴＩである、本明細書において記載される方法を提供する。

[18] さらなる実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つのＡＴＩが、スペルトコムギ、ホラーサーンコムギ、エンマーコムギ、ヒトツブコムギ、及びライコムギの種に由来するＡＴＩである、本明細書において記載される方法を提供する。

[19] さらなる実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つのＡＴＩがコムギＡＴＩである、本明細書において記載される方法を提供する。

[20] さらなる実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つのＡＴＩの少なくとも１つのエピトープが消化される、本明細書において記載される方法を提供する。

[21] さらなる実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つのエピトープが、
ａ）
AASVPE
ADINNE
ALTGCR
AMVKLQ
AVLRDC
AYPDV
CQQLAD
CRAMVK
CVGSQV
CYGDWA
DCCQQL
ELGVRE
EVMKLT
GCRKEV
GDRAGV
GDWAAY
GKEVLP
GSQVPE
GVCYGD
GVREGK
INNEWC
KVPIPN
LPGCRK
LQCVGS
LRDCCQ
LRSVYQ
LSSMLR
LTAASV
MKLTAA
NEWCRC
PATGYK
PEAVLR
PEVCKV
PSGDRA
QLADIN
QVPEAV
RAGVCY
RCGDLS
REGKEV
RKEVMK
SGPWSW
SMLRSV
SVPEVC
SVYQEL
TGCRAM
TGYKVS
VCKVPI
VKLQCV
VSALTG
WAAYPD
WCRCGD
YKVSAL
YQELGV;
からなる群から選択されるαアミラーゼインヒビター前駆体（ＣＩＩＩ）（ＷＭＡＩ－１）Ｂ細胞エピトープ；
ｂ）PWSWCD、SWCDPA、及びSWCDPATGYKVSALTGCRAMVからなる群から選択される推定αアミラーゼインヒビターＢ細胞エピトープ；
ｃ）
DCCQQLAHISEWCR
EHGAQEGQAGTGAFPR
CGALYSMLDSMYK
LQCNGSQVPEAVLR
LPIVVDASGDGAYVCK
LTAASITAVCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPACRPL LR
DCCQQLADISEWCR
EHGVSEGQAGTGAFPSCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPGCRPL LK
ECCQQLADISEWCR
LTAASITAVCK
SGPWMCYPGYAFK
VPALPGCRPVLK;
からなる群から選択される、ＡＴＩエピトープを含むペプチド；
ｄ）
IETPGSPYLAK
SDPNSSVLK
ELYDASQHCR
EYVAQQTCGVGIVGSPVSTEPGN TPR
TSDPNSGVLK
VLVTPGHCNVMTVHNTPYCLGLD I
IEMPGPPYLAK
NYVEEQACR
QECCEQLANIPQQCR
SRPDQSGLMELPGCPR
YFMGPK
EVQMDFVR;
からなる群から選択されるＣＭ１６及び／又はＣＭ１７のＡＴＩエピトープ；
ｅ）
EVLPGCR
CGDLSSMLR
DCCQQLADINNEWCR
VSALTGCR
SVYQELGVR
SHNSGPWSWCDPATGYK
LTAASVPEVCK
LQCVGSQVPEAVLR
VPIPNPSGDR
SVYQEIGVR;
からなる群から選択されるモノマーＡＴＩエピトープ；
ｆ）
LPEWMTSASIYSPGKPYLAK
EMQWDFVR
LYCCQELAEISQQCR
DLPGCPR
LLVAPGQCNLATIHNVR
DYVLQQTCGTFTPGSK
YFIALPVPSQPVDPR
SGNVGESGLIDLPGCPR
LPEWMTSASIFSPMKPYLAK
LYCCQELAEIPQQCR
QMQWDFVR
TDLLPHCR;
からなる群から選択されるＣＭ３のＡＴＩエピトープ；
ｇ）
GPSLPMLVK
SDPNSSVLK
からなる群から選択されるＣＭＨａｇｅｒｍａｎ又はＣＭ１のＡＴＩエピトープ；並びに
ｈ）
EHGAQEGQAGTGAFPR
EFIAGIVGR
からなる群から選択されるダイマーＡＴＩエピトープ
から選択される、本明細書において記載される方法を提供する。

[22] さらなる実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイアオレオレジンに由来する、本明細書において記載される方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイアラテックスに由来する、本明細書において記載される方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記組成物が１つ又は複数の賦形剤をさらに含む、本明細書において記載される方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記方法がインビトロ又はインビボで実施される、本明細書において記載される方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記組成物がヒトに投与される、本明細書において記載される方法を提供する。

[23] １つの態様において、本発明は、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防のための方法であって、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防を必要とする対象に対して、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。

[24] １つの実施形態において、本発明は、前記状態がコムギαアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態である、本明細書において記載される方法を提供する。

[25] 別の実施形態において、本発明は、前記αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態がコムギアレルギー、非セリアックグルテン／コムギ過敏症、過敏性腸症候群又はパン職人喘息である、本明細書において記載される方法を提供する。

[26] さらなる実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）からなる群から選択される１つ又は複数のプロテアーゼを含む、本明細書において記載される方法を提供する。

[27] さらなる実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイアオレオレジンを含むか又はパパイアオレオレジンに由来する、本明細書において記載される方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイアラテックスを含むか又はパパイアラテックスに由来する、本明細書において記載される方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記組成物が１つ又は複数の薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、本明細書において記載される方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記組成物が経口投与される、本明細書において記載される方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記組成物が腸溶コーティングされている、本明細書において記載される方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記対象がヒト対象である、本明細書において記載される方法を提供する。

[28] １つの態様において、本発明は、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防のための医薬の製造における、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の使用を提供する。

[29] １つの実施形態において、本発明は、前記状態がコムギαアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態である、本明細書において記載される使用を提供する。

[30] 別の実施形態において、本発明は、前記αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態がコムギアレルギー、非セリアックグルテン／コムギ過敏症、過敏性腸症候群又はパン職人喘息である、本明細書において記載される使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）からなる群から選択される１つ又は複数のプロテアーゼを含む、本明細書において記載される使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイアオレオレジンに由来する、本明細書において記載される使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイアラテックスに由来する、本明細書において記載される使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記組成物が１つ又は複数の薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、本明細書において記載される使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記組成物が経口投与される、本明細書において記載される使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記組成物が腸溶コーティングされている、本明細書において記載される使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、前記対象がヒト対象である、本明細書において記載される使用を提供する。

[31] １つの態様において、本発明は、少なくとも１つのαアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）のエピトープを消化するための方法であって、前記エピトープを含むＡＴＩを、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量と接触させるステップを含む方法を提供する。

[32] １つの実施形態において、前記エピトープは、１つ若しくは複数のシステインアミノ酸であるか、又は１つ若しくは複数のシステインアミノ酸を含む。

[33] １つの実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つのエピトープが、
ａ）
AASVPE
ADINNE
ALTGCR
AMVKLQ
AVLRDC
AYPDV
CQQLAD
CRAMVK
CVGSQV
CYGDWA
DCCQQL
ELGVRE
EVMKLT
GCRKEV
GDRAGV
GDWAAY
GKEVLP
GSQVPE
GVCYGD
GVREGK
INNEWC
KVPIPN
LPGCRK
LQCVGS
LRDCCQ
LRSVYQ
LSSMLR
LTAASV
MKLTAA
NEWCRC
PATGYK
PEAVLR
PEVCKV
PSGDRA
QLADIN
QVPEAV
RAGVCY
RCGDLS
REGKEV
RKEVMK
SGPWSW
SMLRSV
SVPEVC
SVYQEL
TGCRAM
TGYKVS
VCKVPI
VKLQCV
VSALTG
WAAYPD
WCRCGD
YKVSAL
YQELGV;
からなる群から選択されるαアミラーゼインヒビター前駆体（ＣＩＩＩ）（ＷＭＡＩ－１）Ｂ細胞エピトープ；
ｂ）PWSWCD、SWCDPA、及びSWCDPATGYKVSALTGCRAMVからなる群から選択される推定αアミラーゼインヒビターＢ細胞エピトープ；
ｃ）
DCCQQLAHISEWCR
EHGAQEGQAGTGAFPR
CGALYSMLDSMYK
LQCNGSQVPEAVLR
LPIVVDASGDGAYVCK
LTAASITAVCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPACRPL LR
DCCQQLADISEWCR
EHGVSEGQAGTGAFPSCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPGCRPL LK
ECCQQLADISEWCR
LTAASITAVCK
SGPWMCYPGYAFK
VPALPGCRPVLK;
からなる群から選択される、ＡＴＩエピトープを含むペプチド；
ｄ）
IETPGSPYLAK
SDPNSSVLK
ELYDASQHCR
EYVAQQTCGVGIVGSPVSTEPGN TPR
TSDPNSGVLK
VLVTPGHCNVMTVHNTPYCLGLD I
IEMPGPPYLAK
NYVEEQACR
QECCEQLANIPQQCR
SRPDQSGLMELPGCPR
YFMGPK
EVQMDFVR;
からなる群から選択されるＣＭ１６及び／又はＣＭ１７のＡＴＩエピトープ；
ｅ）
EVLPGCR
CGDLSSMLR
DCCQQLADINNEWCR
VSALTGCR
SVYQELGVR
SHNSGPWSWCDPATGYK
LTAASVPEVCK
LQCVGSQVPEAVLR
VPIPNPSGDR
SVYQEIGVR;
からなる群から選択されるモノマーＡＴＩエピトープ；
ｆ）
LPEWMTSASIYSPGKPYLAK
EMQWDFVR
LYCCQELAEISQQCR
DLPGCPR
LLVAPGQCNLATIHNVR
DYVLQQTCGTFTPGSK
YFIALPVPSQPVDPR
SGNVGESGLIDLPGCPR
LPEWMTSASIFSPMKPYLAK
LYCCQELAEIPQQCR
QMQWDFVR
TDLLPHCR;
からなる群から選択されるＣＭ３のＡＴＩエピトープ；
ｇ）
GPSLPMLVK
SDPNSSVLKからなる群から選択されるＣＭＨａｇｅｒｍａｎ又はＣＭ１のＡＴＩエピトープ；並びに
ｈ）
EHGAQEGQAGTGAFPR
EFIAGIVGR
からなる群から選択されるダイマーＡＴＩエピトープ
から選択される、本明細書において記載される方法、請求項３５に記載の方法を提供する。

パパイアカリカインの一次アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ６６０６０）を示す図である。パパイアカリカインの一次アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ６９８７７）を示す図である。コムギからのアミラーゼ／トリプシンインヒビターの精製の模式図である。コムギ粉からのα－アミラーゼ／トリプシンインヒビターの精製を示す図である。明るい灰色で番号付けされたバンド（８、９、１０、１１、１２、１３、１４）は、ＭＳ／ＭＳタンパク質配列決定により、ＡＴＩタンパク質を含むと確認した（例えば、表１を参照のこと）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより試験した、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（酵素１；「Ｅｎｚ１」）によるコムギ粉アミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）の消化を示す図である。ＤＴＴ、ペプシン（ＰＥＰ）又はトリプシン（Ｔｒｙｐ）の添加は、すべての場合において完全であったパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物によるＡＴＩの消化と比較して何の効果も有しなかった。レーン４「ＡＴＩ＋ＰＥＰ」は、ＡＴＩ＋Ｅｎｚ１＋ＰＥＰを指し、レーン５「ＡＴＩ＋ＰＥＰ＋ＤＴＴ」は、ＡＴＩ＋Ｅｎｚ１＋Ｐｅｐ＋ＤＴＴを指す。（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより試験した、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（酵素１；「Ｅｎｚ１」）によるコムギ粉アミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）の消化、及びペプシン又はトリプシンを使用した消化に対するＡＴＩの耐性、並びに（Ｂ）パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物による精製ＡＴＩの消化の光散乱分析を示す、図である。高濃度のペプシン及びトリプシンと比較した、カリカインを含むタンパク質分解調製物を使用した種々の濃度のαアミラーゼ／トリプシンインヒビターのタンパク質分解からのＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドを示す図である。ｐＨ７又はｐＨ３の両方においてパパイアエンドペプチダーゼを含む調製物（Ｅｎｚ１）の存在下にてペプシンで処理した後にトリプシンで処理したＡＴＩのエピトープマッピング分析を示す図である。ｐＨ７又はｐＨ３の両方においてパパイアエンドペプチダーゼを含む調製物（Ｅｎｚ１）の非存在下にてペプシンで処理した後にトリプシンで処理したＡＴＩのエピトープマッピング分析を示す図である。ｐＨ７においてパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の存在下にてペプシンで処理した後にトリプシンで処理したＡＴＩのエピトープマッピング分析を示す図である。ｐＨ３においてパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の存在下にてペプシンで処理した後にトリプシンで処理したＡＴＩのエピトープマッピング分析を示す図である。図１２Ａは、トリプシン又はキモトリプシンにより消化されたＡＴＩの特徴付け、及び標的化分析のためのＭＲＭ法開発；「実験１」の図である。図１２Ｂは、トリプシン又はキモトリプシンと組合せてカリカインを含むタンパク質分解調製物を使用したＡＴＩタンパク質の時間経過消化分析を示す。カリカインを含むタンパク質分解調製物の切断特性を決定するためのアミノ酸分析設計を示す図である。切断部位に隣接するＰ１、Ｐ２、Ｐ３並びにＰ１’、Ｐ２’及びＰ３’残基を詳細に分析した。同定したＡＴＩ配列の系統解析を示す図である。ＡＴＩタイプ及び染色体位置を、配列アノテーション及びコムギゲノムに存在するＡＴＩ配列に対する配列アラインメントを使用して決定した。Ｂａｘｔｅｒ及びＬａｎｃｅｒ由来の同定されたＡＴＩ配列におけるエピトープマッピング分析を示す図である。Ｂａｘｔｅｒ又はＬａｎｃｅｒにおいて同定されたタンパク質は、タンパク質ＩＤで標識されている。セリアック病に関連するＴＬＲ４エピトープ（Ｃｕｃｃｉｏｌｏｎｉら、２０１７）がオレンジ色で強調されており、親和性レベルの中央値が１０００を超えるパン職人喘息に関連するエピトープ（Ｗａｌｓｈ１９９８）が暗緑色で強調されている一方で、親和性値の中央値が６００～８００を示すエピトープが水色で強調されている。品種ＢａｘｔｅｒのＩＤＡ結果を使用したＡＴＩサブタイプ特異的ペプチドセットの決定を示す図である。同定されたタンパク質から検出されたペプチドが列に示されている。発見段階で同定されたタンパク質が行に示されている。青色のブロックは、同定されたタンパク質に存在したペプチドを示す。ＡＴＩサブタイプ及び染色体位置が、アノテーションのために使用されている。品種Ｂａｘｔｅｒ中のペプチドＴＤＬＬＰＨＣＲについての変化する強度値の模式図を示す図である。Ｂａｘｔｅｒ及びＬａｎｃｅｒにおけるＡＴＩペプチド消化性の全体的傾向を示す図である。分析に含まれたすべてのペプチドのペプチドピーク面積値が、個別の複製物において示されており、消化分析中にモニターされる。ダイマーＡＴＩに特異的なペプチドの量の変化を示す図である。（Ａ）Ｂａｘｔｅｒにおいて同定された代表的ダイマーＡＴＩ配列。（Ｂ）このＡＴＩサブタイプに特異的なペプチドの定量的変化。（Ｃ）公知のパン職人喘息エピトープと重複するペプチド。ペプチド及びエピトープ中の重複領域が、青色で強調されている。モノマーＡＴＩに特徴的なペプチドのモニタリングを示す図である。（Ａ）Ｂａｘｔｅｒにおいて同定された代表的モノマーＡＴＩ配列。標的化分析において使用されたペプチドが緑色のブロックで標識されており、パン職人喘息に関連するエピトープもまた標識されている。（Ｂ）ペプチド量の変化。パン職人喘息エピトープと重複するペプチド領域が、青色で強調されている。検出されたＣＭ３特異的ペプチドの変化のモニタリングを示す図である。パネルＡは、両方の品種において検出されたＣＭ３ＡＴＩ配列を示す。標的化分析において使用されたペプチドが、緑色のブロックとして強調されている。ＴＬＲ４エピトープが黄色で強調されている。パネルＡにおいて青色で下線を付されているペプチドの定量的変化が、パネルＢにおいて示されている。公知のエピトープ（パネルＡにおいて赤色で下線を付されている）と重複するペプチドの定量の結果が、パネルＣにおいて示されている。エピトープと重複するペプチドフラグメントが、オレンジ色で強調されている。サンプルにおいて検出されたすべてのペプチドを考慮したＰ１－Ｐ１’切断パターンを示す図である。（Ａ）Ｐ１－Ｐ１’対の数。（Ｂ）観察されたＰ１－Ｐ１’アミノ酸特徴の頻度。濾液１由来のＡＴＩペプチドにおいて検出された最も濃縮されたＰ１及びＰ１’アミノ酸特徴を示す図である。（Ａ）Ｐ１－Ｐ１’対の数。（Ｂ）観察されたＰ１－Ｐ１’アミノ酸特徴の頻度。ＡＴＩエピトープＱＥＣＣＥＱＬＡＮＩＰＱＱＣＲに特異的なペプチドにおける定量的変化を示す図である。ＡＴＩエピトープＩＥＭＰＧＰＰＹＬＡＫに特異的なペプチドにおける定量的変化を示す図である。ＡＴＩエピトープＹＦＭＧＰＫに特異的なペプチドにおける定量的変化を示す図である。ＡＴＩエピトープＤＣＣＱＱＬＡＤＩＮＮＥＷＣＲに特異的なペプチドにおける定量的変化を示す図である。ＡＴＩエピトープＶＰＡＬＰＧＣＲＰＶＬＫに特異的なペプチドにおける定量的変化を示す図である。還元条件及び非還元条件で抽出されたＢａｘｔｅｒ粉サンプルから同定されたペプチドの特徴付けを示す図である。非還元条件でパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１／Ｃｃｎ）により消化されたトリプシン消化ＡＴＩペプチドの相対的量変化を示す図である。各実験は、その実験自体の０時点値に対して正規化した。ペプシンの存在下及び非存在下の両方におけるパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１／Ｃｃｎ）によるＡＴＩグループの有効な消化を示す、グループ特異的ペプチドの相対的変化を示す図である。ペプシンの非存在下及び存在下で非還元状態においてＡｎ－ＰＥＰにより消化されたトリプシン消化ＡＴＩペプチドの相対的量変化を示す図である。各実験は、その実験自体の０時点値に対して正規化した。Ａｎ－ＰＥＰがＡＴＩを消化するために適切ではないことを示す、グループ特異的ペプチドの相対的変化を示す図である。

[68] 詳細な説明
[69] ＡＴＩは、コムギにおいて見出されるアルブミンタンパク質であり、穀類における総タンパク質のうちの４％までを示す。ＡＴＩは、腸プロテアーゼ及び熱に対して非常に耐性であり、クローン病（ＣＤ）及び非セリアックグルテン過敏症（ＮＣＧＳ）の患者においてｔｏｌｌ様レセプター４の活性化を通じて単球、マクロファージ及び樹状細胞からの炎症性サイトカインの放出を誘導することができる。ＡＴＩは、パン職人喘息における主要なアレルゲンである。

[70] ＡＴＩは、自然免疫細胞の活性化及び腸炎症を誘発する。ＡＴＩは、ＣＤにおいてｔｏｌｌ様レセプター４に対する作用を通じて免疫系を活性化する。ＴＬＲ４を欠損しているマウスはＡＴＩの経口摂取中に腸及び全身の免疫応答から保護されることが、示されている。ＡＴＩは、単球、マクロファージ及び樹状細胞をインビトロで刺激して、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＴＮＦ、ＭＣＰ－１及びランテス（ＲＡＮＴＥＳ）を生成することもまた、公知である。ＡＴＩは、腸及び腸間膜のリンパ節骨髄系細胞を活性化することにより腸炎症を誘発することができる。従って、ＡＴＩは、低レベルの既存の小腸及び結腸の炎症において自然免疫細胞の活性化の一因となることができ、ＮＣＧＳの病態生理において役割を有することができる。ＮＣＧＳはまた、腸外症状、例えば錯乱及び頭痛、慢性疲労、関節／筋肉の疼痛、並びに既存の神経疾患、精神疾患、又は（自己）免疫疾患の悪化を呈する。

[71] 本発明者らは、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物が、免疫賦活性ＡＴＩをタンパク質分解により切断可能であることを、示した。例えば、実施例２は、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＡＴＩを完全に消化することを示す。実施例３及び４は、ＡＴＩがペプシン及びトリプシンによる分解に対して耐性であること、並びに１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がすべてのＡＴＩバンドを完全に消化したことを、示す。実施例５は、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物がＡＴＩのＢ細胞エピトープ及びＴＬＲ４エピトープを消化可能であることを示す。実施例７は、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物がモノマーＡＴＩ、ダイマーＡＴＩ及びＣＭＡＴＩを切断可能であることを示す。

[72] 従って、１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのαアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）を消化するための方法であって、ＡＴＩを、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量と接触させるステップを含む方法を提供する。

[73] 実施例８は、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がカリカイン、パパインの複数のアイソフォーム、キモパパイン及びパパイアプロテイナーゼ４を含むことを示す。本発明者らはまた、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がまた、グルタミンシクロトランスフェラーゼも含むこと（データは示さない）も、示した。

[74] 本明細書において使用される場合、用語「消化」とは、タンパク質をより小さいペプチドフラグメントへと分割又は分解するあらゆる手段、例えばタンパク質分解又はタンパク質分解消化を指し、切断という用語と互換可能に本明細書において使用される。１つの実施形態において、ＡＴＩの消化又は分解は、例えばグルテン含有食料品において、ＡＴＩペプチド又は免疫原性ＡＴＩエピトープの完全な除去を、例えばＡＴＩ含有食料品の摂取後又は食料品において、もたらす。別の実施形態において、ＡＴＩ含有食料品の「消化」又はＡＴＩ含有食料品を「処理すること」若しくはＡＴＩ含有食料品の「処理」は、ＡＴＩペプチド又は免疫原性ＡＴＩエピトープの少なくとも１０％減少を、例えばＡＴＩ含有食料品の摂取後又は食料品において、もたらす。他の実施形態において、ＡＴＩ含有食料品の「消化」又はＡＴＩ含有食料品を「処理すること」若しくはＡＴＩ含有食料品の「処理」は、ＡＴＩペプチド又は免疫原性ＡＴＩエピトープの少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％減少を、例えばＡＴＩ含有食料品の摂取後又は食料品において、もたらす。

[75] 本明細書において使用される場合、グルテン含有食料品に関する用語「処理すること」又は「処理」とは、前記食料品を分解又は消化して、前記食料品が対象によって後に摂取されさらに消化された場合の毒性グルテンオリゴペプチドの生成を減少させることを意味する。好ましくは、前記対象はヒトである。１つの実施形態において、グルテン含有食料品を「処理すること」又はグルテン含有食料品の「処理」は、前記食料品が対象によって後に摂取されさらに消化された場合の毒性グルテンオリゴペプチドの完全な除去をもたらす。別の実施形態において、グルテン含有食料品を「処理すること」又はグルテン含有食料品の「処理」は、前記食料品が対象によって後に摂取されさらに消化された場合の毒性グルテンオリゴペプチドの少なくとも１０％減少をもたらす。他の実施形態において、グルテン含有食料品を「処理すること」又はグルテン含有食料品の「処理」は、前記食料品が対象によって後に摂取されさらに消化された場合の毒性グルテンオリゴペプチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％減少さえもたらす。

[76] 本明細書において使用される場合、用語「αアミラーゼトリプシンインヒビター」（ＡＴＩ）は、アミラーゼトリプシンインヒビターと互換可能に使用され、自然免疫活性化の誘因として作用する、例えば食料品中でＴＬＲ４刺激活性を有する、植物中に存在する構造的及び機能的に関連する分子すべてを含む。前記用語は、モノマー形態並びに（非共有結合した）ダイマー形態及びテトラマー形態を含む。例示的なＡＴＩとしては、０．２８タンパク質としてもまた公知である１２ｋＤａモノマーインヒビター、０．１９タンパク質及び０．５３タンパク質としてもまた公知である２４ｋＤａホモダイマーインヒビター、並びに６０ｋＤａヘテロテトラマーインヒビターが挙げられる。この６０ｋＤａグループは、クロロホルム／メタノール（ＣＭ）混合物における比溶解度により特徴付けられるタンパク質を含み、この６０ｋＤａグループがいわゆるＣＭタンパク質タイプに属することを説明する。例示的なＣＭＡＴＩとしては、ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ３、ＣＭ１６及びＣＭ１７が挙げられる。

[77] 本明細書において使用される場合、エピトープという用語は、Ｂ細胞エピトープ及びＴＬＲ４エピトープを含む、ＡＴＩのエピトープを含む。例示的なＢ細胞エピトープが表２に記載されており、例示的なＢ細胞エピトープとしては
AASVPE
ADINNE
ALTGCR
AMVKLQ
AVLRDC
AYPDV
CQQLAD
CRAMVK
CVGSQV
CYGDWA
DCCQQL
ELGVRE
EVMKLT
GCRKEV
GDRAGV
GDWAAY
GKEVLP
GSQVPE
GVCYGD
GVREGK
INNEWC
KVPIPN
LPGCRK
LQCVGS
LRDCCQ
LRSVYQ
LSSMLR
LTAASV
MKLTAA
NEWCRC
PATGYK
PEAVLR
PEVCKV
PSGDRA
QLADIN
QVPEAV
RAGVCY
RCGDLS
REGKEV
RKEVMK
SGPWSW
SMLRSV
SVPEVC
SVYQEL
TGCRAM
TGYKVS
VCKVPI
VKLQCV
VSALTG
WAAYPD
WCRCGD
YKVSAL
YQELGV
PWSWCD
SWCDPA
SWCDPATGYKVSALTGCRAMV
DCCQQLAHISEWCR
EHGAQEGQAGTGAFPR
CGALYSMLDSMYK
LQCNGSQVPEAVLR
LPIVVDASGDGAYVCK
LTAASITAVCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPACRPLLR
DCCQQLADISEWCR
EHGVSEGQAGTGAFPSCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPGCRPLLK
ECCQQLADISEWCR
LTAASITAVCK
SGPWMCYPGYAFK
VPALPGCRPVLK
IETPGSPYLAK
SDPNSSVLK
ELYDASQHCR
EYVAQQTCGVGIVGSPVSTEPGN TPR
TSDPNSGVLK
VLVTPGHCNVMTVHNTPYCLGLD I
IEMPGPPYLAK
NYVEEQACR
QECCEQLANIPQQCR
SRPDQSGLMELPGCPR
YFMGPK
EVQMDFVR;
SVYQEIGVR;
GPSLPMLVK
SDPNSSVLK;
EHGAQEGQAGTGAFPR
EFIAGIVGR
が挙げられる。

[78] ＡＴＩの例示的なＴＬＲ４エピトープとしては、ＬＰＥＷＭＴＳＡＳ及びＳＧＮＶＧＥＳＧＬＩが挙げられる。

[79] １つの実施形態において、前記エピトープは、１つ若しくは複数のシステインアミノ酸であるか、又は１つ若しくは複数のシステインアミノ酸を含む。

[80] このＡＴＩの列挙は網羅的であることは意図されず、さらにこのＡＴＩの列挙のオリゴマー、生物活性フラグメント、バリアント及びアナログもまたこれらの例の一部として含まれると意図されることが、理解される。

[81] 本発明のいくつかの実施形態において、ＡＴＩは、穀類、例えば、コムギ、コムギ胚芽、ライムギ、オオムギ、ブルグル、クスクス、穀粉、グラハム粉、カムートマッツォー（ｋａｍｕｔｍａｔｚｏ）、セモリナ、スペルトコムギ、又はライコムギに由来する。

[82] 本明細書において使用される場合、用語「接触させる」とは、示された成分（例えば、本明細書において記載されるＡＴＩ又はＡＴＩエピトープと、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物と）を、インビトロ又はインビボで、一緒にさせることを指す。

[83] 本発明者らは、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）が、生理学的に適切なｐＨ（例えば、胃及び／又は小腸のｐＨ）にて、ペプシン及びトリプシンの存在下で、ＡＴＩを消化可能であることを、実施例において示した。本発明者らはまた、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がヒトへの投与後に酵素的に活性であること（データは示さない）も、示した。

[84] 本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物は、典型的には、有効量で投与される。本明細書において記載される用語「有効量」（例えば、「治療有効量」又は「薬学的有効量」）によって、少なくとも１つのＡＴＩの有効な消化又は処置に対する有効な応答を可能にする、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の量を指す。前記「有効量」は、個体の年齢及び全身状態に依存し、処置又は予防される特定の状態、処置の期間、以前の処置、並びに前記状態の性質及び前から存在する期間などの要因によって、対象ごとに変動する。

[85] 本明細書において使用される場合、用語「組成物」とは医薬組成物及び栄養補助食品などを含む。用語「医薬組成物」とは薬又は薬物を指し、一方、用語「栄養補助食品」とは、単一用量単位又は複数用量単位で包装されたヒトの食事の補充のための少量の有効成分を指す。本発明の栄養補助食品又は医薬組成物は、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む。「賦形剤」とは、賦形剤、キャリア、又は希釈剤を意味し、水、あらゆる起源のゼラチン、植物ガム、リグニンスルホネート、タルク、糖類、デンプン、セルロース、微結晶セルロース、アラビアゴム、植物油、ポリアルキレングリコール、矯味矯臭剤、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、滑沢剤、着色剤、湿潤剤、充填剤などが挙げられるが、これらに限定はされない。キャリア物質は、経口投与／非経口投与／注射可能投与のために適切である有機又は無機の不活性キャリア物質であることができる。本発明の栄養補助食品又は医薬組成物は、ヒトへ投与するために適切である任意のガレノス形態であることができるが、固体又は液体の経口形態が、例えば、固体形態では、例えば、食品用添加剤／サプリメント、錠剤、丸剤、顆粒剤、糖剤、カプセル剤、ゴム状処方物、並びに散剤及び錠剤などの発泡性処方物が、好ましい。前記食品組成物及び医薬組成物は、徐放性（遅延放出性）処方物の形態であることができる。

[86] 本発明の実施形態すべてにおいて、本発明の栄養補助食品又は医薬組成物は、好ましくは、錠剤、カプセル剤、分包、又は液体処方物を含む他の任意の投与形態の形態である。より好ましくは、本発明の栄養補助食品又は医薬組成物は錠剤又はカプセル剤の形態である。カプセル剤、錠剤又は分包又は他の投与形態は、任意の従来の形態を採ることができる容器中にあることができる。例えば、投与形態は、所定の量で、例えば３０日量、６０日量、９０日量又は望ましいどのような量でも含む、広口瓶、瓶、ブリキ箱、ポット、ディスペンサー、分包などで販売されることができる。追加的に、及び任意選択で、カプセル剤はブリスター包装中にあることができ、各ブリスターは、所定の数のカプセル剤、通常は単一用量（典型的には、１～４個のカプセル剤）を含む。ブリスター中のカプセル剤の数、単一ブリスター包装ストリップにおけるブリスターの数、及び集合単位で販売されるブリスター包装ストリップの数の配合は、任意の都合の良い量又は構成であることができる。

[87] 本発明の食品組成物又は医薬組成物は、保護的親水コロイド（例えば、ゴム質、タンパク質、加工デンプン）、結合剤、フィルム形成剤、カプセル化剤／物質、隔壁（ｗａｌｌ）／シェル材料、マトリックス化合物、コーティング剤、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ロウ、レシチンなど）、吸着剤、キャリア、充填剤、補助化合物（ｃｏ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動化剤、矯味剤、増量剤、ゲル化剤、ゲル形成剤、抗酸化剤及び抗菌剤をさらに含むことができる。

[88] 本発明の状況において、医薬組成物は処方箋あり又は処方箋なしで販売される一方で、栄養補助食品は処方箋なしで店頭にて販売されるべきであり食物と考えられるべきである。

[89] 本発明の組成物は、本明細書において上記されたように、医薬組成物の形態であることができ、医薬組成物の形態において、前記組成物は薬学的に許容できるキャリア、賦形剤、希釈剤及び／又はアジュバントをさらに含む。本発明の医薬組成物は、単独で使用されてもよく、又は治療化合物などの他の化合物と組合せて使用されてもよい。

[90] 本明細書において使用される場合、句「薬学的に許容できるキャリア」としては、薬学的投与と適合性である、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられるが、これらに限定はされない。補足的な活性化合物もまた、前記組成物に組み込むことができる。

[91] 医薬組成物は、医薬組成物の意図される投与経路と適合性であるように処方される。典型的には、投与経路は、経口（例えば、摂取、吸入）又は直腸を含む、非経口的である。非経口適用のために使用される溶液又は懸濁物は、以下の成分のうちの１つ又は複数を含むことができる：滅菌した希釈剤、例えば、注射用の水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、メチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、アセテート、シトレート又はホスフェート；及び浸透圧調整剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて、調整することができる。

[92] 一般的には、医薬組成物は、製造条件及び貯蔵条件下で安定であり、細菌及び真菌などの微生物の混入作用に対して保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、若しくは液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む、溶媒又は分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によってか、分散の場合に必要とされる粒径の維持によってか、又は界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの組込みによって、達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム又はマンニトール若しくはソルビトールなどのポリアルコールを組成物中に含めることが、好ましい。

[93] 経口組成物は、不活性希釈剤又は食用キャリアを一般的には含む。経口治療投与を目的として、活性化合物は、賦形剤と合わせて錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のために流体キャリアを使用して調製することもできる。薬学的に適合性である結合剤及び／又はアジュバント物質が、組成物の一部として含まれることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のうちのいずれか又は類似する性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば、微結晶セルロース、トラガカントゴム若しくはゼラチン；賦形剤、例えばデンプン若しくはラクトース；崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、若しくは加工トウモロコシデンプン；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム若しくは他のステアリン酸塩；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロース若しくはサッカリン；又は矯味矯臭剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、若しくは柑橘香料。

[94] １つの実施形態において、本発明の組成物は、身体からの迅速な排出に対して本発明の組成物を保護するキャリア、例えば、移植物及び微小カプセル化された送達系を含む、徐放性処方物を用いて調製される。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が、使用することができる。そのような処方物の調製のための方法は、当業者にとって明らかである。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を備えて、感染した細胞に対して標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容できるキャリアとして使用することができる。

[95] 経口組成物又は非経口組成物を、投与の容易性及び投与の均一性のために投与単位形態で処方することが、有利である。「投与単位形態」とは、本明細書において使用される場合、処置されるべき対象のための単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、望まれる治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を、必要とされる薬学的キャリアと組合せて含む。そのような化合物の毒性及び治療効力は、研究する化合物に依存して、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％に対して致死性である用量）及びＥＤ５０（集団のうちの５０％において治療上有効である用量）を決定するための、インビトロアッセイ、細胞培養又は実験動物を含む、標準的な薬学的手順によって、決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比として表すことができる。高い治療指標を示す化合物が、好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することがあるが、感染していない細胞に対する可能性のある損傷を最小限にすることにより副作用を減少させるために、そのような化合物を罹患組織部位へと標的化する送達系を設計するための注意が払われるべきである。

[96] インビトロ研究、細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定式化する際に使用することができる。投与量は、毒性がほとんどないか又は全くない状態でＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内に、好ましくはある。投与量は、使用される投与形態及び使用される投与経路に依存して、この範囲内で変動することができる。酵素の治療有効用量は、まずインビトロアッセイから、推定することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために利用することができる。

[97] 当業者は、用量レベルが、特定の酵素、症状の重症度及び副作用に対する対象の感受性の関数として変動することができることを、容易に認識する。いくつかの実施形態において、所定の酵素についての投与量は、種々の手段により当業者によって容易に決定可能である。例示的な手段は、症状を克服するために必要とされる所定の化合物の生物活性を測定することである。

[98] 当業者は、特定の要因が、対象を有効に処置するために必要とされる投与量及び時期に影響を及ぼすことができることを認識し、特定の要因としては、使用される特定の化合物の活性、対象の年齢、対象の体重、対象の全身の健康、対象の性別、及び対象の食事、投与の時期、投与経路、排出速度、あらゆる薬物の組合せ、調節されるべき発現又は活性の程度、グルテンに対する過敏症、以前の処置、並びに存在する他の疾患が挙げられる。

[99] 医薬組成物は、投与に関する指示書と一緒に、容器、パック、又はディスペンサー中に含まれることができる。

[100] 経口調製物について、本発明の組成物は、単独で、又は錠剤、散剤、顆粒剤若しくはカプセル剤を作製するために適切な添加剤と、例えば、従来の添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン若しくはジャガイモデンプンと；結合剤、例えば、結晶セルロース、セルロースバリアント、アラビアゴム、トウモロコシデンプン若しくはゼラチンと；崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムと；滑沢剤、例えばタルク若しくはステアリン酸マグネシウム；並びに望ましい場合には、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤及び矯味矯臭剤と組合せて、使用することができる。

[101] 本発明の１つの実施形態において、経口処方物は、活性物質が腸管へと送達されるように、腸溶コーティング剤を含む。腸溶処方物は、胃の強酸性内容物から活性成分を保護するために、しばしば使用される。そのような処方物は、固体投与形態を、酸性環境で不溶性であり塩基性環境で可溶性であるポリマーのフィルムでコーティングすることによって、作製することができる。例示的なフィルムは、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、メタクリレートコポリマー、酢酸フタル酸セルロース及びアクリルコーティング系、例えばＡｃｒｙｌ－Ｅａｓｅ（Ｃｏｌｏｒｃｏｎ）である。

[102] 他の腸溶処方物は、生物学的に腐食性のポリマーから構成された操作されたポリマー微粒子を含み、前記操作されたポリマー微粒子は、胃腸粘液及び細胞内壁との強力な付着性相互作用を示し、前記操作されたポリマー微粒子は、パイエル板のリンパ組織を覆う粘膜吸収上皮及び濾胞関連上皮の両方を横断できる。前記ポリマーは、腸上皮との接触を長時間維持し、実際に、細胞を通り細胞の間で腸上皮を貫通する（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ３８６（６６２３）：４１０～４１４を参照のこと。薬物送達系はまた、Ｄｏｒｋｏｏｓｈら（２００１）ＪＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ７１（３）：３０７～１８により記載されたように、超多孔性ヒドロゲル（ＳＰＨ）及びＳＰＨ複合体（ＳＰＨＣ）のコアも使用できる）。

[103] 本明細書において使用される場合、用語「１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物」とは、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）を含む酵素調製物を指すために、使用される。１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む、例示的な組成物は、本明細書において記載されるＥｎｚ１である。

[104] 実施例８は、本明細書に置いて記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）が、カリカイン、パパインの複数のアイソフォーム、キモパパイン及びパパイアプロテイナーゼ４を含むことを、示す。本発明者らはまた、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）が、グルタミンシクロトランスフェラーゼもまた含むこと（データは示さない）も、示した。

[105] 従って、１つの実施形態において、前記タンパク質分解調製物は、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）からなる群から選択される１つ又は複数のプロテアーゼを含む。

[106] １つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物は、本明細書において記載される手順のうちのいずれか１つ又は複数によって、ＡＴＩを分解する前記タンパク質分解調製物の能力について試験されることができる。１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を調製する方法は、パパイアラテックス又は任意の他の適切な供給源からパパイアエンドペプチダーゼを分離及び精製するステップを含むことができ、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を調製する方法は、分離されたペプチダーゼの少なくともいくらかの酵素活性がαアミラーゼ／トリプシンインヒビターを分解する方法並びにαアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防のための方法を提供するために保持されるようであることが、当業者によって理解される。当業者は、本明細書において記載されるように、少なくとも部分的に精製されたカリカインがＡＴＩ－ペプチドを分解する能力を、インビトロ又はインビボのいずれかで、定性的及び／又は定量的に測定するための多数の方法及び技術が存在することを、認識する。

[107] 本明細書においてパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）に関して使用される場合、用語「生物活性フラグメント」とは、グルテンペプチドをインビトロ又はインビボで無毒化する自身の能力を保持するフラグメントを典型的には指す。

[108] 目的のペプチダーゼフラグメントとしては、少なくとも約２０個連続するアミノ酸のフラグメント、より通常は少なくとも約５０個連続するアミノ酸のフラグメントが挙げられるがこれらに限定はされず、１００アミノ酸又はそれ以上を完全なタンパク質まで含むことができ、追加的配列を含むようにさらに伸長することができる。各々の場合において、重要な基準は、フラグメントが、グルテン不耐性から生じる状態の一因である毒性オリゴペプチドを改変する能力を保持するかどうかである。

[109] 本明細書において使用される場合、用語「ネイティブ」とは、天然に存在する（例えば、天然タンパク質）アミノ酸配列を有する、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）を好ましくは指す。そのような配列は、ペプチダーゼ活性を同定する際に当業者にとって周知である技術を使用して、一般的には同定することができる。

[110] 本明細書においてパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）に関して使用される場合、用語「アナログ」とは、天然に存在するパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチダーゼを典型的には示す。

[111] 本明細書においてアナログに関して使用される用語「実質的に同一」とは、生じたアナログが天然に存在する酵素の生物活性のうちの少なくともいくらかを有するような、１つ又は複数のアミノ酸の置換又は付加を典型的には示す。アナログは、対立遺伝子バリアント若しくはｍＲＮＡスプライスバリアントなど、天然に存在するものであってもよいし、又はアナログは、当業者が利用可能である合成技術若しくは組換え技術を使用して構築されてもよい。

[112] 本明細書においてパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）に関して使用される場合、用語「バリアント」とは、ネイティブ酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示す酵素を、典型的には示す。バリアントが、ネイティブ分子と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、任意選択で少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、任意選択で少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むか、任意選択で少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は任意選択で少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態もまた企図される。同一性パーセントは、目視検査及び／又は当業者にとって公知である方法による数学的計算によって、決定することができる。バリアントは、天然に存在するものであっても、合成であっても、又は組換えであってもよい。

[113] 本発明の１つの実施形態において、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）のバリアントは、酵素のネイティブ形態と実質的に相同であるがネイティブ形態のアミノ酸配列とは１つ又は複数の欠失、挿入若しくは置換が原因で異なるアミノ酸配列を有する、酵素を含む。特定の実施形態は、ネイティブ配列と比較した場合に、アミノ酸残基の１個～１０個の欠失、挿入又は置換を含むアミノ酸を含む。所定の配列は、例えば類似する物理化学的特徴を有する残基によって、置換することができる。１つの脂肪族残基から別の脂肪族残基へのそのような保存的置換の例、例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａから互いへの保存的置換；１つの極性残基から別の極性残基への、例えば、ＬｙｓとＡｒｇとの間、若しくはＧｌｕとＡｓｐとの間、若しくはＧｌｎとＡｓｎとの間の置換；又は１つの芳香族残基から芳香族残基への、例えば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ若しくはＴｙｒから互いへの置換。例えば類似する疎水性特徴を有する領域全体の置換を含む、他の保存的置換が、当該分野において周知である。バリアントはまた、ネイティブのペプチダーゼアミノ酸の短縮化により作製することもできる。本発明により含まれるさらなるバリアントとしては、脱グリコシル化したアミノ酸若しくはそのフラグメント、又はネイティブ酵素と比較した場合に増加したグリコシル化を示すアミノ酸が挙げられるが、これらに限定はされない。

[114] 「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を含む。従って、カリカインのアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で好ましくは置換される。好ましい実施形態において、変異は、例えば飽和変異誘発によって、酵素のコード配列のすべて又は部分に沿って無作為に導入することができる。生じた変異体は、ネイティブ酵素の生物活性のうちの少なくともいくらかを示すバリアントを同定するために、スクリーニングすることができる。変異誘発の後に、コードされるタンパク質は組換えにより発現されることができ、酵素の活性は、本明細書において記載される方法によって決定することができる。

[115] パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）のネイティブ形態の一次配列を変えない改変もまた想定され、タンパク質の化学的誘導体化（例えば、アセチル化又はカルボキシル化）、グリコシル化（例えば、タンパク質のグリコシル化パターンを、前記タンパク質の合成及びプロセシング中又はさらなる処理ステップ中に改変することにより生成されるグリコシル化）、並びにリン酸化したアミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホスレオニン）を有する配列が挙げられるが、これらに限定はされない。

[116] 分子生物学的技術及び／又は化学反応を使用して、タンパク質分解性分解に対する耐性及び／又は酸性状態、例えば胃において見出される酸性状態に対する耐性を改善し溶解度特性を最適化するように改変されたか、又は治療剤としてより適切になるように改変された、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）もまた、本発明の実施において有用である。そのようなタンパク質のアナログとしては、天然に存在するＬ－アミノ酸以外の残基（例えば、Ｄ－アミノ酸又は天然に存在しない合成アミノ酸）を含むアナログが挙げられる。

[117] 本発明のパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）酵素は、当該分野において公知である従来の方法を使用して、インビトロ合成によって調製することができる。種々の市販の合成装置、例えば、自動合成機（例えば、ＣＳ９３６ＸＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＣＳＢｉｏＣｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）が、利用可能である。そのような合成機を使用して、当業者は、天然に存在するアミノ酸を１つ又は複数の非天然アミノ酸で容易に置換できる。特定の配列及び調製の方法は、利便性、経済性、必要とされる純度などによって決定される。望ましい場合には、他の分子への結合又は表面への結合を可能にする種々の基を、合成中にタンパク質へ導入することができる。例えば、システインを使用してチオエーテルを生成することができ、金属イオン錯体への結合のためにヒスチジンを使用することができ、アミド又はエステルを形成するためにカルボキシル基を使用することができ、アミドを形成するためにアミノ基を使用することができるなどである。

[118] 本明細書において使用される場合、用語「その機能的等価物」とは、前記機能的等価物が機能的等価物であるところのものの配列に対して類似する機能を有する配列を指す。「類似する機能」によって、配列が、共通の機能を、例えば、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）、又はそれらの生物活性フラグメント、アナログ若しくはバリアントをコードすることにおいて共有することが、意味される。いくつかの実施形態において、機能的に等価な配列は、前記機能的に等価な配列が機能的等価物であるところのものの配列と配列同一性を示すことができる。機能的等価物と、前記機能的等価物が機能的等価物であるところのものの配列との間の配列同一性は、機能的等価物の長さにわたり少なくとも５０％であることができるか、機能的等価物の長さにわたり少なくとも６０％であることができるか、又は機能的等価物の長さにわたり７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％よりも大きいものであることができる。

[119] １つの実施形態において、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物は、前記タンパク質分解調製物の総重量のうち約５％ｗ／ｗ～約９５％ｗ／ｗのカリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、又はカリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）の生物活性フラグメント、アナログ若しくはバリアントを含む。

[120] １つの実施形態において、本発明は、本明細書において記載される組成物であって、前記組成物が、本明細書において記載される本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含み、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含む前記タンパク質分解調製物が、前記タンパク質分解調製物の総質量のうち約５％ｗ／ｗ～約９５％ｗ／ｗのカリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）又はカリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）の生物活性フラグメント、アナログ若しくはバリアントを含む、組成物を提供する。

[121] １つの実施形態において、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物は、前記タンパク質分解調製物の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１７．３、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％ｍ／ｍのカリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、又はカリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）の生物活性フラグメント、アナログ若しくはバリアントを含む。

[122] １つの実施形態において、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物は、パパイアラテックス又は可溶化された乾燥パパイアラテックスのいずれかを水中で濾過して濾液を生じることにより調製され、濾液が濃縮され滅菌濾過されて（例えば、０．４５ｕの濾過カートリッジを使用して濾過されて）濃縮物を形成し、濃縮物が離れて（ｓｔｒａｙ）乾燥され、篩分けされ（例えば、２００～３５０ｕのステンレス篩を使用して）、充填され包装される。

[123]特に、コムギ、オオムギ、又はライムギ（グルテン含有穀類）、及びいくつかの非グルテン含有主要産物で摂取されるＡＴＩの疾患を引き起こす能力は、胃腸管に限定はされず、他の腸外疾患への罹患に関係がある可能性もある（Ｃａｔａｓｓｉら、Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ７：４９６６～４９７７、２０１５；Ｆａｓａｎｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１４８：１１９５～１２０４、２０１５；Ｓｃｈｕｐｐａｎら、ＢｅｓｔＰｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＣｌｉｎｉｃａｌＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２９：４６９～７６、２０１５）。広範な証拠は、栄養性ＡＴＩが小腸、結腸、及び周囲の腸間膜リンパ節において低程度ではあるが顕著な炎症を誘導することを、示す。特に、栄養性ＡＴＩは、炎症性腸疾患のマウスモデル、多発性硬化症のマウスモデル、全身性エリトマトーデスのマウスモデル、非アルコール性脂肪性肝炎のマウスモデル、及びアレルギー喘息のマウスモデルにおいて示されるように、一般的に炎症性疾患を悪化させる。

[124] ＡＴＩは、高度に熱耐性であり食料品及び熱処理済み液体中に存在することが、示されている。従って、別の実施形態において、本発明は、αアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）含有食料品における少なくとも１つのＡＴＩを消化するための方法であって、前記ＡＴＩ含有食料品を、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量と接触させるステップを含む、方法を提供する。

[125] １つの実施形態において、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物を含む食料品が、本明細書において提供される。

[126] １つの実施形態において、前記食料品は、グルテンを含まない食料品又はグルテンが減少した食料品である。

[127] １つの実施形態において、グルテンを含まないＡＴＩ含有食料品におけるＡＴＩを分解するための方法であって、前記グルテンを含まないＡＴＩ含有食料品を、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量と接触させるステップを含む方法が、本明細書において提供される。

[128] 別の実施形態において、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量を用いる、ＡＴＩ含有食料品中のＡＴＩを分解するための方法が、本明細書において提供される。

[129] １つの実施形態において、ＡＴＩ含有食料品を、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効量と接触させるステップを含む、ＡＴＩを無毒化するための方法が、本明細書において提供される。

[130] １つの実施形態において、グルテン含有食料品を、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効量との混合物中に含む、グルテンを含まない食料品組成物が、本明細書において提供される。

[131] 記載される分解する方法の１つの実施形態において、前記食料品を、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物と接触させる前記ステップは、前記食料品（例えば、ＡＴＩ含有食料品）の消費前にインビトロで実施される。

[132] 記載される分解する方法の１つの実施形態において、前記食料品を、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物と接触させる前記ステップは、前記食料品（例えば、ＡＴＩ含有食料品）の消費と同時又は消費後にインビボで実施される。

[133] 記載される処置方法の１つの実施形態において、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の前記投与ステップは、前記ＡＴＩ含有食品若しくは前記ＡＴＩ含有食料品のそれぞれの消費と同時又は消費後にインビボで実施される。

[134] 記載される処置方法の１つの実施形態において、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の前記投与ステップは、前記ＡＴＩ含有食料品の消費前及び消費と同時又は後にも、インビトロで実施される。

[135] １つの実施形態において、本発明は、前記ＡＴＩを、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含む前記タンパク質分解調製物と、加水分解による前記ＡＴＩの消化を引き起こすのに十分な条件下で接触させる、本明細書において記載される方法を、提供する。

[136] １つの実施形態において、前記状態は、対象におけるＡＴＩの消化を引き起こすのに十分な条件下での、例えば、ＡＴＩ含有食料品を食べる前、食べると同時、又は食べた後の、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含む前記タンパク質分解調製物の投与後のインビボ状態である。

[137] 好ましい実施形態において、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含む前記タンパク質分解調製物は、食事の摂取の前又は後１時間以内に経口投与される。

[138] 本明細書において記載される方法の１つの実施形態において、前記少なくとも１つのＡＴＩは、コムギ、オオムギ、ライムギ又はカラスムギの種に由来するＡＴＩである。

[139] 本明細書において記載される方法の１つの実施形態において、前記少なくとも１つのＡＴＩは、スペルトコムギ、ホラーサーンコムギ、エンマーコムギ、ヒトツブコムギ、及びライコムギの種に由来するＡＴＩである。

[140] 本発明に記載の方法の好ましい実施形態において、前記少なくとも１つのＡＴＩはコムギＡＴＩである。

[141] 本明細書において記載される方法の１つの実施形態において、前記少なくとも１つのＡＴＩの少なくとも１つのエピトープが消化される。

[142] １つの実施形態において、前記少なくとも１つのエピトープは、
ａ）
AASVPE
ADINNE
ALTGCR
AMVKLQ
AVLRDC
AYPDV
CQQLAD
CRAMVK
CVGSQV
CYGDWA
DCCQQL
ELGVRE
EVMKLT
GCRKEV
GDRAGV
GDWAAY
GKEVLP
GSQVPE
GVCYGD
GVREGK
INNEWC
KVPIPN
LPGCRK
LQCVGS
LRDCCQ
LRSVYQ
LSSMLR
LTAASV
MKLTAA
NEWCRC
PATGYK
PEAVLR
PEVCKV
PSGDRA
QLADIN
QVPEAV
RAGVCY
RCGDLS
REGKEV
RKEVMK
SGPWSW
SMLRSV
SVPEVC
SVYQEL
TGCRAM
TGYKVS
VCKVPI
VKLQCV
VSALTG
WAAYPD
WCRCGD
YKVSAL
YQELGV;
からなる群から選択されるαアミラーゼインヒビター前駆体（ＣＩＩＩ）（ＷＭＡＩ－１）Ｂ細胞エピトープ；
ｂ）PWSWCD、SWCDPA、及びSWCDPATGYKVSALTGCRAMVからなる群から選択される推定αアミラーゼインヒビターＢ細胞エピトープ；
ｃ）
DCCQQLAHISEWCR
EHGAQEGQAGTGAFPR
CGALYSMLDSMYK
LQCNGSQVPEAVLR
LPIVVDASGDGAYVCK
LTAASITAVCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPACRPL LR
DCCQQLADISEWCR
EHGVSEGQAGTGAFPSCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPGCRPL LK
ECCQQLADISEWCR
LTAASITAVCK
SGPWMCYPGYAFK
VPALPGCRPVLK;
からなる群から選択される、ＡＴＩエピトープを含むペプチド；
ｄ）
IETPGSPYLAK
SDPNSSVLK
ELYDASQHCR
EYVAQQTCGVGIVGSPVSTEPGN TPR
TSDPNSGVLK
VLVTPGHCNVMTVHNTPYCLGLD I
IEMPGPPYLAK
NYVEEQACR
QECCEQLANIPQQCR
SRPDQSGLMELPGCPR
YFMGPK
EVQMDFVR;
からなる群から選択されるＣＭ１６及び／又はＣＭ１７のＡＴＩエピトープ；
ｅ）
EVLPGCR
CGDLSSMLR
DCCQQLADINNEWCR
VSALTGCR
SVYQELGVR
SHNSGPWSWCDPATGYK
LTAASVPEVCK
LQCVGSQVPEAVLR
VPIPNPSGDR
SVYQEIGVR;
からなる群から選択されるモノマーＡＴＩエピトープ；
ｆ）
LPEWMTSASIYSPGKPYLAK
EMQWDFVR
LYCCQELAEISQQCR
DLPGCPR
LLVAPGQCNLATIHNVR
DYVLQQTCGTFTPGSK
YFIALPVPSQPVDPR
SGNVGESGLIDLPGCPR
LPEWMTSASIFSPMKPYLAK
LYCCQELAEIPQQCR
QMQWDFVR
TDLLPHCR;
からなる群から選択されるＣＭ３のＡＴＩエピトープ；並びに
ｇ）
GPSLPMLVK
SDPNSSVLK
からなる群から選択されるＣＭＨａｇｅｒｍａｎ又はＣＭ１のＡＴＩエピトープ；並びに
ｈ）
EHGAQEGQAGTGAFPR
EFIAGIVGR
からなる群から選択されるダイマーＡＴＩエピトープ
から選択される。

[143] １つの実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイアオレオレジンに由来する、本明細書において記載される方法を提供する。

[144] 本発明の１つの実施形態において、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物は、天然供給源（例えば、パパイアラテックス）から少なくとも部分的に精製される。

[145] パパイア属（Ｃａｒｉｃａ）中のパパイアの木の果実であるパパイアは、ママオ、ツリーメロン、フルータボンバ、レチョサ又はパウパウとしても公知である。本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を天然供給源、例えばパパイアラテックスから分離するために有用な方法としては、固体－液体抽出、液体－液体抽出、固相抽出、膜濾過、限外濾過、透析、電気泳動、溶媒濃縮、遠心分離、超遠心分離、高圧を伴うか若しくは伴わない液体クロマトグラフィー又は高圧を伴うか若しくは伴わない気相クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる）、凍結乾燥、蒸発、種々の「キャリア」（例えば、抗体）を用いる沈殿、結晶化、及びそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定はされない。当業者は、精製手順全体を通して各連続画分を画分の活性に従うことにより本明細書において記載されるパパイアエンドペプチダーゼについて濃縮するために、どのようにそのような選択肢を連続的方法で使用するかを、理解する。本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物の活性は、ＡＴＩの消化に関連して本明細書において記載される方法を含む種々の方法を使用して、測定することができる。

[146] 固体－液体抽出としては、種々の溶媒、ボルテックス振盪機、超音波及び抽出を増大させるための他の手段の使用、並びに濾過、遠心分離、及び当該分野において記載されるような関連方法（例えば、ＣａｎｎｅｌｌＲＪＰ、ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＩｓｏｌａｔｉｏｎ、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、１９９８を参照のこと）による回収が挙げられるが、これらに限定はされない。使用することができる溶媒の例としては、炭化水素溶媒、塩素系溶媒、有機エステル、有機エーテル、アルコール、水、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定はされない。

[147] 液体－液体抽出としては、当該分野において公知である溶媒、例えば、炭化水素溶媒、塩素系溶媒、有機エステル、有機エーテル、アルコール、水、種々の水溶液、及びそれらの組合せの使用が挙げられるが、これらに限定はされない。液体－液体抽出は手作業で促進することができるか、又は液体－液体抽出は（完全に又は部分的に）自動化することができ、溶媒は、当該分野において標準的な技術によって、除去及び／又は濃縮することができる。

[148] 膜、逆浸透法及び限外濾過としては、当該分野において公知である種々のタイプの膜の使用、並びに圧力、減圧、遠心力、並びに／又は膜及び限外濾過プロセスにおいて利用することができる他の手段の使用が挙げられるが、これらに限定はされない。

[149] 透析は、サンプル中の本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼの相対的純度を増加させるために、天然供給源から種々の構成成分の除去のために選択的な分子量カットオフを有する膜の使用を、典型的には含む。本発明はまた、凍結乾燥及び結晶化が挙げられるがこれらに限定はされない当該分野において公知である種々の手段による、透析液又は残余分のいずれかからの精製された抽出物及び／又は分画された抽出物の回収も含んだ。

[150] クロマトグラフィーとしては、通常のカラムクロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、向流クロマトグラフィー（ＣＣＣ）、移動床式クロマトグラフィー、疑似移動床式クロマトグラフィー、エクスパンデットベッドクロマトグラフィー、及び平面クロマトグラフィーの使用が挙げられるが、これらに限定はされない。クロマトグラフィーにおいて使用することができる溶媒の例としては、シリカゲル、アルミナ、フルオリシル、セルロース及び改質セルロース、種々の改変されたシリカゲル、イオン交換樹脂、サイズ排除ゲル、化学的改変されたゲル、並びに当業者にとって公知である他の溶媒が挙げられるが、これらに限定はされない。本発明はまた、クロマトグラフィー法により本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼの分画及び／若しくは部分精製をもたらすための、２つ以上の塩勾配の使用も含む。水又は水相が使用される場合、水若しくは水相は、種々の量の無機塩若しくは有機塩を含むことができ、及び／又は、ｐＨは、分画及び／若しくは精製が増大されるように酸若しくは塩基で種々の値へと調整することができる。

[151] 本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを天然供給源から少なくとも部分的に精製するプロセスはまた、元の抽出物及び／若しくは分画された抽出物、並びに／又は精製された抽出物の溶媒除去による、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼの濃縮も含むことができる。溶媒除去の技術は、当業者にとって公知であり、溶媒除去の技術としては、回転蒸発、蒸留（常圧及び減圧）、遠心減圧蒸発（スピードバック（ｓｐｅｅｄ－ｖａｃ））、凍結乾燥並びにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定はされない。

[152] 本発明の１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼに言及する場合、用語「少なくとも部分的に精製された」とは、ペプチド、タンパク質又はアナログが精製されていない、例えばネイティブの状態若しくは環境では結合している他の成分（例えば、他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物）を、部分的に～完全に含まない組成物を、典型的には意味する。少なくとも部分的に精製されたペプチド及びタンパク質は、一般的には均一又はほぼ均一な状態であることができるが、少なくとも部分的に精製されたペプチド及びタンパク質は、乾燥状態又は水溶液中のいずれかにあることができる。純度及び均一性は、分析的化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを使用して、典型的には決定される。１つの実施形態において、前記１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼなどのペプチドは、慣用的方法及び周知の方法、例えば本明細書において記載される方法を使用して、さらに精製することができる。

[153] 本発明は、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含む組成物又はタンパク質分解調製物のＡＴＩ活性を決定するための例示的アッセイを、提供する。

[154] １つの実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイアラテックスに由来する、本明細書において記載される方法を提供する。

[155] １つの実施形態において、本発明は、前記組成物が１つ又は複数の賦形剤をさらに含む、本明細書において記載される方法を提供する。

[156] １つの実施形態において、本発明は、前記方法がインビトロ又はインビボで実施される、本明細書において記載される方法を提供する。

[157] 別の実施形態において、本発明はまた、薬としての使用のための、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む、栄養補助食品又は医薬組成物に関する。従って、本発明は、疾患の処置のための薬としての、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む、栄養補助食品又は医薬組成物の使用に関する。好ましくは、前記薬は、ＡＴＩ媒介性の疾患又は状態に罹患している患者の処置のためのものである。

[158] １つの実施形態において、本発明は、前記組成物がヒトに投与される、本明細書において記載される方法を提供する。

[159] ＡＴＩペプチド及び免疫原性ＡＴＩエピトープは、多数のヒト疾患、例えば、非セリアックコムギ過敏症（ＮＣＷＳ）、パン職人喘息、自己免疫疾患及び代謝障害の原因である。従って、ＡＴＩペプチド及び免疫原性ＡＴＩエピトープを減少させる能力、又はＡＴＩペプチド及び免疫原性ＡＴＩエピトープを完全に消化する能力は、ＡＴＩペプチド及び免疫原性ＡＴＩエピトープが、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効量を投与された対象の免疫系と相互作用するのを防ぐ。例えば、本発明者らは、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物が免疫賦活性ＡＴＩをタンパク質分解により切断可能であることを示した。例えば、実施例２は、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＡＴＩを完全に消化することを示す。実施例３及び４は、ＡＴＩがペプシン及びトリプシンによる分解に対して耐性であること、及び１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含む前記タンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がすべてのＡＴＩバンドを完全に消化したことを、示す。実施例５は、前記パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物がＡＴＩのＢ細胞エピトープ及びＴＬＲ４エピトープを消化可能であることを示す。実施例７は、パパイアエンドペプチダーゼを含む前記タンパク質分解調製物がモノマーＡＴＩ、ダイマーＡＴＩ及びＣＭＡＴＩを切断可能であることを示す。

[160] 従って、１つの実施形態において、本発明は、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防のための方法であって、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防を必要とする対象に対して、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。

[161] ＡＴＩは、非セリアック非アレルギー性コムギ過敏症の主に腸外症状の出現の原因である。ＡＴＩは、古典的ＩｇＥ媒介性アレルギーであるパン職人喘息における主要なアレルゲンである。腸において、ＡＴＩは、粘膜固有層及び腸間膜リンパ節に存在する免疫細胞を、ＴＬＲ４の結合及び刺激、並びに活性化した骨髄系細胞の遊出を通じて、刺激可能である。自然免疫レセプターＴＬＲ４は、グラム陰性細菌の外膜における主要成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）などの、ダメージ関連パターン及び病原体関連パターン（ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ）を認識する。刺激の際、前記レセプターは、ＮＦ－κＢ依存性カスケードを誘発して、炎症性サイトカインの放出をもたらす。重要なことに、ＡＴＩは、直接的相互作用によりＴＬＲ４を誘発することができ、自然免疫を誘発することができる。炎症性腸疾患のマウスモデルにおいて、ＡＴＩは、腸、粘膜固有層、及び特に腸間膜リンパ節のすべての部分において、活性化されたマクロファージ及び樹状細胞の数を増加させることによって、デキストラン硫酸ナトリウムにより誘導された腸炎症を増強した。ＡＴＩを濃縮した食事が、アレルゲンにより誘導された腸のアレルギー応答だけでなく肺のアレルギー応答もまた、ＩｇＥ及びＴＬＲ４依存性の方法で増強したこともまた、実験的気道炎症に関するマウス研究において示された。従って、ＡＴＩのアジュバント効果は、腸に限定はされないが、他の器官についても観察することができ、進行中の炎症を刺激する。

[162] １つの実施形態において、前記状態はコムギαアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態である。

[163] 別の実施形態において、前記αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態はコムギアレルギー、非セリアックグルテン／コムギ過敏症、過敏性腸症候群又はパン職人喘息である。

[164] 別の実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）からなる群から選択される１つ又は複数のプロテアーゼを含む、本明細書において記載される方法を提供する。１つの実施形態において、前記タンパク質分解調製物はパパイアオレオレジンを含むか又はパパイアオレオレジンに由来する。別の実施形態において、前記タンパク質分解調製物はパパイアラテックスを含むか又はパパイアラテックスに由来する。別の実施形態において、前記組成物は１つ又は複数の薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む。１つの実施形態において、前記組成物は経口投与される。別の実施形態において、前記組成物は腸溶コーティングされている。好ましい実施形態において、前記対象はヒト対象である。

[165] 別の態様において、本発明は、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防のための医薬の製造における、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の使用を提供する。１つの実施形態において、前記状態はコムギαアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態である。

[166] 別の実施形態において、前記αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態はコムギアレルギー、非セリアックグルテン／コムギ過敏症、過敏性腸症候群又はパン職人喘息である。

[167] １つの実施形態において、本発明は、前記タンパク質分解調製物がパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）からなる群から選択される１つ又は複数のプロテアーゼを含む、本明細書において記載される使用を提供する。１つの実施形態において、前記タンパク質分解調製物はパパイアオレオレジンを含むか又はパパイアオレオレジンに由来する。別の実施形態において、前記タンパク質分解調製物はパパイアラテックスを含むか又はパパイアラテックスに由来する。別の実施形態において、前記組成物は１つ又は複数の薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む。１つの実施形態において、前記組成物は経口投与される。別の実施形態において、前記組成物は腸溶コーティングされている。

[168] 当業者は、用量レベルが、特定の酵素、症状の重症度及び副作用に対する対象の感受性の関数として変動することができることを、容易に認識する。いくつかの実施形態において、所定の酵素についての投与量は、種々の手段により当業者によって容易に決定可能である。例示的な手段は、症状を克服するために必要とされる所定の化合物の生物活性を測定することである。

[169] １つの実施形態において、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含む前記タンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の用量は、ＡＴＩ含有食料品の摂取の前、摂取中、又は摂取後に対象に投与される３００ｍｇである。

[170] 当業者は、特定の要因が、対象を有効に処置するために必要とされる投与量及び時期に影響を及ぼすことができることを認識し、特定の要因としては、使用される特定の化合物の活性、対象の年齢、対象の体重、対象の全身の健康、対象の性別、及び対象の食事、投与の時期、投与経路、排出速度、あらゆる薬物の組合せ、調節されるべき発現又は活性の程度、グルテンに対する過敏症、以前の処置、並びに存在する他の疾患が挙げられる。

[171] 医薬組成物は、投与に関する指示書と一緒に、容器、パック、又はディスペンサー中に含まれることができる。

[172] 経口調製物について、本発明の組成物は、単独で、又は錠剤、散剤、顆粒剤若しくはカプセル剤を作製するために適切な添加剤と、例えば、従来の添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン若しくはジャガイモデンプンと；結合剤、例えば、結晶セルロース、セルロースバリアント、アラビアゴム、トウモロコシデンプン若しくはゼラチンと；崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムと；滑沢剤、例えばタルク若しくはステアリン酸マグネシウム；並びに望ましい場合には、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤及び矯味矯臭剤と組合せて、使用することができる。

[173] 本発明の１つの実施形態において、経口処方物は、活性物質が腸管へと送達されるように、腸溶コーティング剤を含む。腸溶処方物は、胃の強酸性内容物から活性成分を保護するために、しばしば使用される。そのような処方物は、固体投与形態を、酸性環境で不溶性であり塩基性環境で可溶性であるポリマーのフィルムと接触させることによって、作製することができる。例示的なフィルムは、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、メタクリレートコポリマー、酢酸フタル酸セルロース及びアクリルコーティング系、例えばＡｃｒｙｌ－Ｅａｓｅ（Ｃｏｌｏｒｃｏｎ）である。

[174] 他の腸溶処方物は、生物学的に腐食性のポリマーから構成された操作されたポリマー微粒子を含み、前記操作されたポリマー微粒子は、胃腸粘液及び細胞内壁との強力な付着性相互作用を示し、前記操作されたポリマー微粒子は、パイエル板のリンパ組織を覆う粘膜吸収上皮及び濾胞関連上皮の両方を横断できる。前記ポリマーは、腸上皮との接触を長時間維持し、実際に、細胞を通り細胞の間で腸上皮を貫通する（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ３８６（６６２３）：４１０～４１４を参照のこと。薬物送達系はまた、Ｄｏｒｋｏｏｓｈら（２００１）ＪＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ７１（３）：３０７～１８により記載されたように、超多孔性ヒドロゲル（ＳＰＨ）及びＳＰＨ複合体（ＳＰＨＣ）のコアも使用できる）。

[175] 別の態様において、本発明は、少なくとも１つのαアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）のエピトープを消化するための方法であって、前記エピトープを含むＡＴＩを、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量と接触させるステップを含む方法を提供する。

[176] 別の実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つのエピトープが、
ａ）
AASVPE
ADINNE
ALTGCR
AMVKLQ
AVLRDC
AYPDV
CQQLAD
CRAMVK
CVGSQV
CYGDWA
DCCQQL
ELGVRE
EVMKLT
GCRKEV
GDRAGV
GDWAAY
GKEVLP
GSQVPE
GVCYGD
GVREGK
INNEWC
KVPIPN
LPGCRK
LQCVGS
LRDCCQ
LRSVYQ
LSSMLR
LTAASV
MKLTAA
NEWCRC
PATGYK
PEAVLR
PEVCKV
PSGDRA
QLADIN
QVPEAV
RAGVCY
RCGDLS
REGKEV
RKEVMK
SGPWSW
SMLRSV
SVPEVC
SVYQEL
TGCRAM
TGYKVS
VCKVPI
VKLQCV
VSALTG
WAAYPD
WCRCGD
YKVSAL
YQELGV;
からなる群から選択されるαアミラーゼインヒビター前駆体（ＣＩＩＩ）（ＷＭＡＩ－１）Ｂ細胞エピトープ；
ｂ）PWSWCD、SWCDPA、及びSWCDPATGYKVSALTGCRAMVからなる群から選択される推定αアミラーゼインヒビターＢ細胞エピトープ；
ｃ）
DCCQQLAHISEWCR
EHGAQEGQAGTGAFPR
CGALYSMLDSMYK
LQCNGSQVPEAVLR
LPIVVDASGDGAYVCK
LTAASITAVCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPACRPL LR
DCCQQLADISEWCR
EHGVSEGQAGTGAFPSCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPGCRPL LK
ECCQQLADISEWCR
LTAASITAVCK
SGPWMCYPGYAFK
VPALPGCRPVLK;
からなる群から選択される、ＡＴＩエピトープを含むペプチド；
ｄ）
IETPGSPYLAK
SDPNSSVLK
ELYDASQHCR
EYVAQQTCGVGIVGSPVSTEPGN TPR
TSDPNSGVLK
VLVTPGHCNVMTVHNTPYCLGLD I
IEMPGPPYLAK
NYVEEQACR
QECCEQLANIPQQCR
SRPDQSGLMELPGCPR
YFMGPK
EVQMDFVR;
からなる群から選択されるＣＭ１６及び／又はＣＭ１７のＡＴＩエピトープ；
ｅ）
EVLPGCR
CGDLSSMLR
DCCQQLADINNEWCR
VSALTGCR
SVYQELGVR
SHNSGPWSWCDPATGYK
LTAASVPEVCK
LQCVGSQVPEAVLR
VPIPNPSGDR
SVYQEIGVR;
からなる群から選択されるモノマーＡＴＩエピトープ；
ｆ）
LPEWMTSASIYSPGKPYLAK
EMQWDFVR
LYCCQELAEISQQCR
DLPGCPR
LLVAPGQCNLATIHNVR
DYVLQQTCGTFTPGSK
YFIALPVPSQPVDPR
SGNVGESGLIDLPGCPR
LPEWMTSASIFSPMKPYLAK
LYCCQELAEIPQQCR
QMQWDFVR
TDLLPHCR;
からなる群から選択されるＣＭ３のＡＴＩエピトープ；
ｇ）
GPSLPMLVK
SDPNSSVLK
からなる群から選択されるＣＭＨａｇｅｒｍａｎ又はＣＭ１のＡＴＩエピトープ；並びに
ｈ）
EHGAQEGQAGTGAFPR
EFIAGIVGR
からなる群から選択されるダイマーＡＴＩエピトープ
から選択される、本明細書において記載される方法を提供する。

[177] 本発明の方法及び使用は、予防又は保護のため、並びに治療目的のために、使用することができる。従って、本明細書において使用される場合、処置などの用語は、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の既存の疾患、状態又は症状の重症度における何らかの減少、特に、疲労、慢性下痢、及び栄養分の吸収不全、体重減少、腹部膨満、喘息症状、アナフィラキシー及び貧血などであるがこれらに限定はされない症状の重症度によって測定されるような、何らかの減少を含む。本明細書において使用される場合、予防などの用語は、ＡＴＩ媒介性状態の疾患、状態又は症状の予防を指す。

[178] 本発明の方法から恩恵を受けることができる対象は、任意の年齢であることができ、成人及び子供を含むことができる。特に子供は、ＡＴＩペプチドに対する早期曝露の予防が疾患の初期発症を予防することができるので、予防的処置から恩恵を受ける。予防に適した子供は、素因についての遺伝的試験によって、例えば、ＨＬＡタイピングによって、家族歴によって、Ｔ細胞アッセイによって、又は当業者にとって公知である他の手段によって、同定することができる。

[179] 本発明に記載の方法はまた、それを必要とする対象に対して、組織トランスグルタミナーゼのインヒビター、抗炎症剤、抗潰瘍剤、肥満細胞安定化剤、及び／又はアレルギー剤を投与するステップが挙げられるがこれらに限定はされない、他の手段と組合せて実施することもできる。そのような薬剤の例としては、抗炎症特性を有するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼインヒビター、例えば、コンパクチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン及びアトルバスタチン；抗アレルギー性ヒスタミンＨ１レセプターアンタゴニスト、例えば、アクリバスチン、セチリジン、デスロラタジン、エバスチン、フェキソフェナジン、レボセチリジン、ロラタジン及びミゾラスチン；ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト、例えば、モンテルカスト及びザフィルルカスト；ＣＯＸ２インヒビター、例えば、セレコキシブ及びロフェコキシブ；ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビター、例えばＢＩＲＢ－７９６；並びに肥満細胞安定化剤、例えば、クロモグリク酸ナトリウム（クロモリン）、ペミロラスト、プロキシクロミル、レピリナスト、ドキサントラゾール、アンレキサノクス、ネドクロミル及びプロビクロミルが挙げられる。

[180] 投与のための種々の方法が、好ましくは経口投与を使用して、例えば食事とともに、使用することができる。治療処方物の投与量は、疾患の性質、投与の頻度、投与の方法、宿主から薬剤の排出などに依存して、広範に変動する。初期用量がより大用量であった後に、より少用量の維持用量が続くことができる。用量は、週１回若しくは隔週に１回としてまれに投与することができるか、又はよりしばしばより少用量に分割して、毎日１回、食事とともに、週２回、若しくは有効投与量レベルを維持するために必要とされる他の方法で、投与することができる。

[181] 治療効果は、臨床的結果に関して測定することができるか、又は免疫学的試験若しくは生化学的試験によって決定することができる。代替的に、疾患の症状の重症度の減少を探すことができる。

[182] 文書、行為、材料、デバイス、論文などの議論は、本発明についての状況を提供することのみを目的として本明細書中に含まれる。これらの物事のいずれか又はすべてが先行技術の根拠の一部を形成したとも、これらの物事のいずれか又はすべてが、本出願の各請求項の優先日前に存在した本発明に関係する分野の技術常識であったとも、示唆も表現もされない。

[183] 最後に、種々の他の改変及び／又は変更を、本明細書において概説されている本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができることが、理解されるべきである。

[184] 本発明の特定の実施形態が、以下の実施例において次に記載される。しかしながら、以下の記載は、説明するだけのものであり、いかなる方法でも上記の発明の一般性に対する限定としては受け取られるべきでないことが、理解されるべきである。

[186] 実施例１：ＡＴＩの分離及び精製
[187] コムギ品種（ｃｖ）ＢａｘｔｅｒのＡＴＩの粗調製物を、Ｚｅｖａｌｌｏｓ（２０１７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１５２、１１０３の方法に従って作製した（図３、図４）。

[188] 増加する濃度の硫酸アンモニウムを使用して、アミラーゼトリプシンインヒビターをコムギ品種Ｂａｘｔｅｒ粉から選択的に「塩析」した。最終濃縮物（ＡＴＩｃｏｎｃ）が同タンパク質と同じバンド形成パターンを４０～１００％飽和硫酸アンモニウムペレット（４０～１００％ＳＡＳＰ）において有することにより、すべてのタンパク質を効果的に濃縮したこと及び５ｋＤａフィルターを用いた遠心分離濃縮を使用した濃縮中で損失がなかったことを確認した。

[189] 同じバンド形成パターンが４０％飽和硫酸アンモニウム上清（４０ＳＡＳＳｎ）において認められるが４０％飽和硫酸アンモニウムペレット（４０ＳＡＳＰ）においては認められないことにより、タンパク質のサブセットを追加の硫酸アンモニウムにより濃縮中であったことを確認した。これらのタンパク質バンドは、粗抽出物（粗Ｓｎ）のほんの少量の成分であり、強（ａｇｇｒｅｓｉｖｅ）溶媒、８Ｍ尿素、１％ＤＴＴ、２０ｍＭトリエチルアミン緩衝液中にすべてのタンパク質を溶解することによって作製した総タンパク質抽出物（総タンパク質）において、認めることが困難である。

[190] これは、最終調製物が、ＡＴＩである正確な分子量の特定のバンドについて濃縮されたことを示した。これらのバンドを、ゲルから切断し、タンパク質配列決定によって同定した（表１）。バンド１～７にはＡＴＩは存在しなかった。種々のＡＴＩタイプをサンプル８～１４において検出した。種々のＡＴＩタイプがサンプル１０、１１、１２及び１３における上位１０～２０個の的中の中にあったことは、これらのゲルバンドにおける相対的ＡＴＩ濃度が高かったことを示した。

[191]

[192] ＡＴＩ種による切り出したタンパク質バンドのかなりの相互混入が存在するように見える（例えば、ＣＭ３が９．０～２２．７ｋＤａから切断したすべてのバンドに存在する）。これは、電気泳動前のＤＴＴによる還元に対して耐性である内部－Ｓ－Ｓ－結合による種々の種の架橋が原因である。

[193] パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を、実施例において使用した。実施例8において示されるように、パパイアエンドペプチダーゼを含むＥｎｚ１調製物は、酵素カリカイン、パパインの複数のアイソフォーム、キモパパイン及びパパイアプロテイナーゼ４を含む。

[194] 実施例２：パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物によるＡＴＩ消化。
[195] （１×濃度の）パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物を、ペプシン又はトリプシンの存在下で、ＤＴＴ追加あり又なしのＡＴＩ濃縮物に添加した。重要なことに、すべてのＡＴＩバンドは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物によって完全に溶解した（図５）。

[196] １００ｍＬの胃中の約１０ｇのコムギに対応するＡＴＩタンパク質（９６４μｇ）を、１．１×濃度のカリカインを含むタンパク質分解調製物（酵素１；「Ｅｎｚ１」）（すなわち、１００ｍＬの胃中１×３００ｍｇ丸剤のＥｎｚ１タンパク質分解調製物）で消化した。カリカインを含むタンパク質分解調製物を添加したどの画分も、すべての推定ＡＴＩタンパク質バンドを完全に消化した。ＤＴＴ、ペプシン又はトリプシンの添加は、すべての場合において消化が完全であったので、何の効果も有しなかった。コントロールレーン（ＡＴＩ、レーン６及び１２、しかしレーン１ではない）もまた、いくらかの加水分解を示す。これはまた、後のいくつかの実験においても認められ、おそらく少量の非常に活性な酵素１組成物が電気泳動中にゲルの隣接レーンから移動したことが原因である。すべての酵素の酵素活性は、光散乱によって確認した（図６Ｂを参照のこと）。

[197] 実施例３：パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）によるＡＴＩ消化、並びにペプシン及びトリプシンによる消化に対するＡＴＩの耐性。

[198] 種々の濃度（１．１×、０．１１×、及び０．０１１×）のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（「酵素１」又は「Ｅｎｚ１」）によるＡＴＩの加水分解を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）追加あり又なしの、ペプシン及びトリプシンによる消化／加水分解と比較した。すべてのバンドが酵素１により消化されたが、ペプシン又はトリプシンによってバンドはほとんど消化されなかった。これは、ペプシン又はトリプシンによって消化されなかったバンドが、これらのプロテアーゼに対して耐性であるＡＴＩタンパク質であったことを示した（図６）。

[199] 還元剤であるＤＴＴを、いくつかの反応に対して添加した。ＤＴＴは、ＡＴＩにおいて多数ありタンパク質分解耐性をＡＴＩタンパク質に付与する緊密な立体構造を保持する、ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を切断する。ＤＴＴが推定ＡＴＩバンドのタンパク質分解を加速しなかったことにより、ペプシン／トリプシン耐性を確認した。

[200] 酵素活性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）又は光散乱（Ｂ）によって追跡した。カリカインを含むタンパク質分解調製物を、最終アッセイにおける酵素タンパク質量０．２４μｇ、２．４μｇ及び２４μｇにそれぞれ対応する、１０倍ずつ増加する濃度で０．０１１×から始めて０．１１×及び１．１１×で添加した。これらの濃度は、すべての推定ＡＴＩバンドを完全に加水分解した。約１，０００μｇのＡＴＩタンパク質で、これが、完全消化のために通常添加されるプロテアーゼ：タンパク質の量（１：１００）よりもかなり低い１：１０，０００の酵素１：タンパク質（ＡＴＩ）比に対応することにより、酵素１調製物の効率的活性を確認する。他方では、ペプシン及びトリプシンは、１：１００の比で添加された場合でさえ、バンド１も、２も、３も、４も、７も又は８も消化しなかった。ＤＴＴの添加は、ペプシン／トリプシン消化を加速しなかった。

[201] この実験及び続くすべての実験において確認された光散乱は、酵素１、ペプシン及びトリプシンが、光散乱によってアッセイした場合に、活性でありグリアジンを加水分解可能であった（図６Ｂ）ことを、示した。簡単に言うと、グリアジンは、水性緩衝液に添加した場合に沈殿する。タンパク質分解が生じる場合、グリアジンが小さい可溶性フラグメントへと加水分解されるので、溶液が澄む。このプロセスは、減少した光散乱により生じる吸光度の減少をモニタリングすることによって、追跡することができる。酵素１、ペプシン及びトリプシンで処理したグリアジンの吸光度はすべて減少することにより、酵素活性を確認するが、ｐＨ３及びｐＨ７のコントロールの吸光度は減少しない。

[202] 実施例４：パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物によるＡＴＩ消化
[203] 不十分なペプシン及びトリプシンを以前の消化物に添加したかどうかを評価するために、より大量のペプシン及びトリプシンの効果を試験した。種々の量のカリカインを含むタンパク質分解調製物（１反応当たり２４、２．４、０．２４μｇ）による加水分解を、種々の量のペプシン及びトリプシン（５００、５０、５μｇ）の加水分解と比較した（図７）。すべてのバンドは、最低濃度であってさえ、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（「Ｅｎｚ１」）により消化されたが、ペプシン及びトリプシンは、Ｅｎｚ１よりも１０倍高い濃度である５ｕｇの濃度でさえ、重要なバンドを消化しなかった。重要なバンドの消化が５０ｕｇ及び５００ｕｇのペプシン又はトリプシンで認められなかったことは、２，０００倍過剰のこれらのプロテアーゼが効果のなかったことを示した。

[204] パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）を１０分の１量へと減少する量で２４μｇから始めて２．４μｇ又は０．２４μｇ使用した約１，０００μｇのＡＴＩに対する消化を、減少する量のペプシン又はトリプシン（５００、５０又は０．５μｇ）を使用したＡＴＩの消化と比較した。ＡＴＩ調製物におけるすべてのバンドは、最低濃度であってさえ、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）により消化されたが、ペプシン及びトリプシンは、酵素１調製物よりも１０倍高い濃度である５ｕｇで重要なバンドを消化しなかった。重要なＡＴＩバンドの消化が５０ｕｇ及び５００ｕｇのペプシン又はトリプシンで認められなかったことは、２，０００倍過剰のこれらのプロテアーゼが、カリカインを含むタンパク質分解調製物と比較して効果のなかったことを示した。レーン４におけるＡＴＩ単独標準物は、隣接レーンからの混入が原因でいくらかのタンパク質分解を示したが、レーン１１における「ＡＴＩ単独」標準物が隣接レーンにおける活性酵素の不在が原因で活性を示さなかったことによって、この仮説を確認した。

[205] 実施例５：パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物によるＡＴＩ消化。
[206] パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物がＡＴＩのＢ細胞エピトープ及びＴＬＲ４エピトープを消化する能力を、試験した。

[207] 簡単に言うと、ＡＴＩを、ｐＨ７又はｐＨ３の両方において、パパイアエンドペプチダーゼを含む調製物の存在下又は非存在下にてペプシンで処理した後にトリプシン（約５０ｍｇ／ｍｌ）で処理した。生じたペプチドを、サンプルにおいて同定されたＡＴＩタンパク質に対してマッピングした。特に、生じたペプチドをＡＴＩタンパク質に対してマッピングし、パン職人喘息に関連するＢ細胞エピトープとの重複（図８、表２）を試験して、免疫原性エピトープが酵素による消化後に残っていたかどうかを決定した。

[208] 図９は、ｐＨ７においてパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の非存在下にてペプシンを使用した後にトリプシンを使用した消化物から検出されたペプチドが、ＡＴＩのＢ細胞エピトープと重複することを示す。重要なことに、ｐＨ７においてパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の存在下にてペプシンを使用した後にトリプシンを使用した消化物からペプチドが検出されなかったことは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の存在下におけるペプシン及びトリプシンによる消化の後に、ＡＴＩの免疫原性Ｂ細胞エピトープが完全に消化されることを示した。これは、胃腸管におけるペプシン及びトリプシンによる消化の後に、ＡＴＩの免疫原性エピトープが完全に残り、従って、腸の症状及び腸外症状を誘導するために利用可能であることを、示す。

[209] 特に、表２の免疫原性エピトープを含むペプチドは、後に検出されなかった
[210]

[211] 図１０は、ｐＨ７においてパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の存在下にてペプシンを使用した後にトリプシンを使用した消化物からペプチドがほとんど検出されなかったことを示し、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の存在下におけるペプシン及びトリプシンによる消化の後に、ＡＴＩのほぼすべての免疫原性Ｂ細胞エピトープが消化されることを示す。

[212] 図１１は、ｐＨ３においてパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の存在下にてペプシンを使用した後にトリプシンを使用した消化物からペプチドがほとんど検出されなかったことを示し、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の存在下におけるペプシン及びトリプシンによる消化の後に、ＡＴＩのほぼすべての免疫原性Ｂ細胞エピトープが消化されることを示す。

[213] 実施例６：パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物によるＡＴＩ消化。
[214] パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物がＡＴＩのエピトープを消化する能力を、試験した。

[215] 簡単に言うと、２つの市販のコムギ品種であるＢａｘｔｅｒ及びＬａｎｃｅｒを、分析に使用した。穀物サンプルを、粉砕して微細粉末にし、ｎ－ペンタンを使用して脱脂した。パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を、９ｍｌのｐＨ３に緩衝化した炭酸水素アンモニウム（ＡｍＢｉｃ）溶液中に溶解した。懸濁物を遠心分離し、最終酵素濃度０．１１×を使用してさらに希釈した。タンパク質を、２％ＤＴＴの存在下でイソプロパノール（ＩＰＡ）を使用して抽出した。タンパク質抽出物（１００ｕｌ）を、３ｋＤａＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に適用し、１：５０のタンパク質対酵素比の修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、配列決定グレード）若しくはキモトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、配列決定グレード）、０．１１×カリカイン（パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物）又は以下の実験設計に従う酵素の組合せのいずれかを使用して、フィルター消化した。

[216] 実験１の模式図を図１２Ａに示す。実験１において、１００ｕｌのＩＰＡ／ＤＴＴ抽出物を、フィルターに適用し、５０ｍＭヨードアセトアミドを使用してアルキル化し、その後、配列決定グレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はキモトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して一晩消化した。消化したペプチドを、ＡｍＢｉｃで洗浄し、遠心分離し、凍結乾燥した。サンプルを、１００ｕｌの１％ギ酸に再懸濁し、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ６６００ＭＳ（ＳＣＩＥＸ）機器に連結したＥｋｓｐｅｒｔｎａｎｏＬＣ４１５（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ）を使用する情報依存型データ取得（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄａｔａａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）（ＩＤＡ）に供した。ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェアｖ．５．０．３及びＰａｒａｇｏｎアルゴリズム（ＳＣＩＥＸ）を、タンパク質同定のために使用した。得られたスペクトルライブラリーを、コムギ連（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）の種の高分解能ゲノム配列決定データ（Ｅｎｓｅｍｂｌｐｌａｎｔｓ）から得られた翻訳遺伝子モデルを付加したＵｎｉｐｒｏｔデータベース（２０１９年５月バージョン）から収集されたコムギ連タンパク質の、インシリコで開発されたトリプシン又はキモトリプシンによる消化スペクトルライブラリーに対して検索した。ＡＴＩタンパク質を、保存タンパク質ドメイン情報を使用して正確に同定し、手作業で配列しサブタイプアノテーションのために分析した。十分にトリプシン又はキモトリプシン消化された高強度のＡＴＩペプチドを使用して、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）方法を開発した。ＭＲＭトランジションを、ＩＤＡ分析から得られた前駆体イオン及びフラグメントイオンのｍ／ｚ値を使用して、各ペプチドについて決定した。トリプシン消化物又はキモトリプシン消化物のプールしたサンプルを、ＥｘｉｏｎＬＣシステム（ＳＣＩＥＸ）にて分離し、６５００ＱＴＲＡＰＭＳ機器（ＳＣＩＥＸ）にて分析した。少なくとも３つのペプチド及び４つのトランジションを、各タンパク質について考慮した。これらから、一致するピーク形状及び保持時間値を有する３つの高強度のトランジションを、予定したＭＲＭ分析のために選択した。ピークを、Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェアパッケージ（Ｐｉｎｏら、２０１７）を使用して、積分した。同じペプチドから得られたトランジションのピーク面積を合計し、複製値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８を使用する統計分析に供した。

[217] 実験２の模式図を、図１２Ｂに示す。実験２において、２段階消化を使用した。まず、タンパク質抽出物を、３ｋＤａフィルターに適用し、上記の溶液を使用してパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物で消化した。アリコートを、消化の５、１５、３０、４５又は６０分間後に取得し、サンプルを遠心分離し、濾液１を消化特異性分析のために収集した。残留タンパク質を、緩衝液交換（ｐＨ８．５へ）の後にトリプシンによりさらに消化し、その後、還元ステップ及びアルキル化ステップを続けた。一晩消化ステップの後、ペプチドを、遠心分離により収集し、ＡｍＢｉｃで洗浄し、凍結乾燥した。サンプルを、１％ＦＡに再構築し、予定したＭＲＭ分析に供した。

[218] パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物の消化特異性を、濾液１ペプチドの結果を使用する詳細な配列分析によって、決定した。５～６０分間のサンプルを使用してＢａｘｔｅｒ抽出物及びＬａｎｃｅｒ抽出物の組合せ検索から得られた最初のペプチド配列を、一緒に分析した。最初の３つ（Ｐ’１、Ｐ’２及びＰ’３）並びに最後の３つ（Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１）のアミノ酸残基（図１３）を、各ペプチドについて決定し、Ｐ’１－Ｐ１対及びＰ’２Ｐ１’－Ｐ１Ｐ２対の頻度を計算した。アミノ酸を、アミノ酸の物理化学的特徴（脂肪族、芳香族、酸性、塩基性、ヒドロキシ性、含硫及びアミド性）に基づいてグループ分けし、頻度計算を、アミノ酸のグループレベル及び個別のアミノ酸対レベルの両方で実施した。

[219] ２つのコムギ品種であるＢａｘｔｅｒ及びＬａｎｃｅｒを、実験１に示される分析において使用した。全部で２６５個のタンパク質をＢａｘｔｅｒにおいて同定し、１８５個のタンパク質をＬａｎｃｅｒにおいて同定した。これらのタンパク質から、２２個の配列が、ＢａｘｔｅｒにおけるＡＴＩに対応し、１９個のＡＴＩを、Ｌａｎｃｅｒにおいて同定した。両方の遺伝子型から検出された、６つの共有されるＡＴＩタンパク質配列が存在した。タンパク質配列を比較することによって、３つの主要なＡＴＩタイプ（ＣＭ－ＡＴＩ、ダイマーＡＴＩ及びモノマーＡＴＩ）を同定し、両方の品種において９個のサブタイプ（ＣＭＡＴＩの６個のサブタイプ及びダイマーＡＴＩの２つのサブタイプ）に区別した。配列をコムギゲノムデータと比較した場合、パン職人喘息に関連することが主に公知であるダイマーＡＴＩが３番染色体にマッピングされ、一方、セリアック病に関連するＣＭ３－ＡＴＩを含むＣＭタンパク質の大部分が例外なく４番染色体に位置した。モノマーＡＴＩは６番染色体にマッピングされた（図１４）。

[220] エピトープマッピング分析により、ＣＭ３ＡＴＩサブタイプにおけるセリアック病に関連するＴＬＲ４エピトープの存在並びにダイマーＡＴＩ配列及びモノマーＡＴＩ配列におけるパン職人喘息に関連するＢ細胞エピトープの存在を、確認した（図１５）。ＩＤＡ発見分析の結果及び同定したＡＴＩ配列を、標的化した方法の開発のために使用した。Ｂａｘｔｅｒ及びＬａｎｃｅｒから同定した全部で６９個のＡＴＩペプチドを、分析に含めた。１００％配列同一性を用いたペプチドマッピングを使用して、以下の主要なＡＴＩタイプ：ダイマーＡＴＩ、０．１９ダイマーＡＴＩ、モノマーＡＴＩ、ＣＭ３、ＣＭ１６－ＣＭ１７ＡＴＩ及びＣＭ１ＡＴＩに特異的なペプチドセット（図１６）を、同定した。公開されたセリアック病に関連するエピトープ（Ｃｕｃｃｉｏｌｏｎｉら、２０１７）又はパン職人喘息に関連するエピトープ（Ｗａｌｓｈ１９９８）と重複するペプチドを、分析に含めた。

[221] 実施例7：パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物によるコムギＡＴＩエピトープ消化。
[222] 標的化プロテオミクスアプローチを使用して、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物による５、１５、３０、４５及び６０分間の消化に続きトリプシン又はキモトリプシンを使用した一晩消化の後の、十分にトリプシン又はキモトリプシン消化されたＡＴＩペプチド量の相対的変化を、定量した。ピーク強度値を、Ｂａｘｔｅｒサンプル及びＬａｎｃｅｒサンプルにおける各トランジションについて測定し、ペプチド量の値を、個別のトランジションの曲線下面積値の合計として計算した（図１７）。

[223] このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＡＴＩエピトープを効率的に切断できることを示す。特に、このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＴＤＬＬＰＨＣＲを効率的に切断できることを示す。

[224] ０分で測定された初期ペプチド量レベルは、ペプチドピーク面積値１０３～１０８を生じる、２つの品種の間における顕著な量的変動を示す。モノマーＡＴＩから同定されたペプチド、例えば、ＳＶＹＱＥＬＧＶＲ、ＳＨＮＳＧＰＷＳＷＣＤＰＡＴＧＹＫ又はＬＱＣＶＧＳＱＶＰＥＡＶＬＲは、Ｌａｎｃｅｒにおいて少量検出された（ピーク面積＜１００００）一方で、同じペプチドは、Ｂａｘｔｅｒにおいて３９，０００倍高い量を示す。反対の傾向がダイマーＡＴＩペプチドにおいて観察され、より高い量の値がＬａｎｃｅｒにおいて検出された。全体的ＡＴＩ量レベルを、０～６０分間の時点にわたって２つの品種において比較した場合、量レベルの顕著な減少が、５分間の消化後に検出された（図１８）。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がモノマーＡＴＩエピトープを効率的に切断できることを示す。特に、このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＳＶＹＱＥＬＧＶＲ、ＳＨＮＳＧＰＷＳＷＣＤＰＡＴＧＹＫ及びＬＱＣＶＧＳＱＶＰＥＡＶＬＲを効率的に切断できることを示す。

[225] 重要なことに、切断されるＳＨＮＳＧＰＷＳＷＣＤＰＡＴＧＹＫ及びＬＱＣＶＧＳＱＶＰＥＡＶＬＲは、パン職人喘息に関連する。

[226] 本発明者らはまた、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＤＣＣＱＱＬＡＤＩＮＮＥＷＣＲを効率的に切断できることを示した（図２７）。

[227] エピトープＥＶＬＰＧＣＲ、ＣＧＤＬＳＳＭＬＲ、ＶＳＡＬＴＧＣＲ、ＬＴＡＡＳＶＰＥＶＣＫ、及びＶＰＩＰＮＰＳＧＤＲの切断もまた、試験する。

[228] 全部で６個のダイマーＡＴＩアイソフォームをＬａｎｃｅｒにおいて検出し、８個のアイソフォームをＢａｘｔｅｒにおいて検出し、それらのアイソフォームのうち、１－１配列がセリアック病に関連するダイマー０．１９ＡＴＩサブタイプに属す。前記タンパク質の大部分は、パン職人喘息に関連するエピトープ（Ｗｅｌｓｈ１９９８）を含む。同定されたタンパク質配列及び測定されたペプチド量値は、２つの品種の間における顕著な変動を示し（図１９）、ダイマーＡＴＩがＬａｎｃｅｒにおいてより豊富であることを示す。消化分析により、前記ペプチドすべてが５分間の消化の後に切断されることを確認する。

[229] ０．１９ダイマーＡＴＩは、アイソフォームＱ５ＵＨＨ６及びＱ５ＵＨＨ８により表される。このサブタイプに特異的な１つのペプチドＥＣＣＱＱＬＡＤＩＳＥＷＣＲを同定したが、ペプチドＳＧＰＷＭＣＹＰＧＹＡＦＫ及びＬＴＡＡＳＩＴＡＶＣＫは、０．１９ダイマーＡＴＩと０．５３ダイマーＡＴＩとの間で共有される。興味深いことに、ＥＣＣＱＱＬＡＤＩＳＥＷＣＲペプチドが０分にＢａｘｔｅｒにおいてのみ測定することができたがＬａｎｃｅｒにおいては測定できなかった一方で、他の２つのペプチドはＬａｎｃｅｒにおいて顕著により高い量で存在して５分間後に切断された。

[230] このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がダイマーＡＴＩエピトープを効率的に切断できることを示す。特に、このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＳＧＰＷＭＣＹＰＧＱＡＦＱＶＰＡＬＰＧＣＲＰＬＬＫ、ＥＨＧＶＳＥＧＱＡＧＴＧＡＦＰＳＣＲ、ＬＴＡＡＳＩＴＡＶＣＲ、ＬＰＩＶＶＤＡＳＧＤＧＡＹＶＣＫ、ＬＱＣＮＧＳＱＶＰＥＡＶＬＲ、及びＤＣＣＱＱＬＡＨＩＳＥＷＣＲを効率的に切断できることを示す。このデータはまた、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＥＣＣＱＱＬＡＤＩＳＥＷＣＲ、ＳＧＰＷＭＣＹＰＧＹＡＦＫ、ＬＴＡＡＳＩＴＡＶＣＫ及びＥＣＣＱＱＬＡＤＩＳＥＷＣＲを効率的に切断できることを示す。

[231] 本発明者らはまた、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＶＰＡＬＰＧＣＲＰＶＬＫを効率的に切断できることを示した（図２８）。

[232] エピトープＤＣＣＱＱＬＡＨＩＳＥＷＣＲ、ＥＨＧＡＱＥＧＱＡＧＴＧＡＦＰＲ、ＣＧＡＬＹＳＭＬＤＳＭＹＫ、ＳＧＰＷＭＣＹＰＧＱＡＦＱＶＰＡＬＰＡＣＲＰＬＬＲ及びＶＰＡＬＰＧＣＲＰＶＬＫの切断もまた、試験する。

[233] モノマーＡＴＩは、パン職人喘息における免疫応答を誘発するペプチド領域において高度に濃縮されている。Ｂａｘｔｅｒにおいて、モノマーＡＴＩの４つのアイソフォームを同定したが、Ｌａｎｃｅｒにはモノマーサブタイプは存在しなかった。モニターしたペプチド配列はすべて、ペプチド量レベルの顕著な低下を示す（図２０）。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がモノマーＡＴＩエピトープを効率的に切断できることを示す。特に、このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＳＨＮＳＧＰＷＳＷＣＤＰＡＴＧＹＫ、ＶＳＡＬＴＧＣＲ、ＬＱＣＶＧＳＱＶＰＥＡＶＬＲ、ＤＣＣＱＱＬＡＤＩＮＮＥＷＣＲ、ＳＶＹＱＥＬＧＶＲ、及びＬＴＡＡＳＶＰＥＶＣＫを効率的に切断できることを示す。本発明者らはまた、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＤＣＣＱＱＬＡＤＩＮＮＥＷＣＲを効率的に切断できることを示した（図２７）。

[234] Ｂａｘｔｅｒ及びＬａｎｃｅｒの両方において検出されたタンパク質配列がわずかに異なる、２つのＣＭ３ＡＴＩタンパク質アイソフォーム（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｐ１７３１４及びＡ０Ａ３Ｂ６ＪＲ２０）が存在した。両方のタンパク質はＴＬＲ４エピトープ（Ｃｕｃｃｉｏｌｏｎｉら、２０１７）を含み、これらのＴＬＲ４エピトープと重複する十分にトリプシン消化されたペプチドもまた、同定した（図１０Ａ）。Ａ０Ａ３Ｂ６ＪＲ２０アイソフォームはＢａｘｔｅｒにおいてより高い量で存在するが、Ｐ１７３１４アイソフォームは、Ｌａｎｃｅｒにおいての方がわずかに高い量で検出された。ＣＭ３ペプチドはすべて、消化の５分間後にＣＭ３ペプチド量の顕著な減少を示す。前記エピトープと重複するペプチドをモニタリングすることにより、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在する酵素がこれらのエピトープを効率的に切断できることを確認する（図２１Ｃ）。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＣＭ３ＡＴＩエピトープを効率的に切断できることを示す。特に、このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＴＤＬＬＰＨＣＲ、ＬＹＣＣＱＥＬＡＥＩＳＱＱＣＲ、ＬＹＣＣＱＥＬＡＥＩＰＱＱＣＲ、ＱＭＱＷＤＦＶＲ、並びにＴＬＲ４エピトープＬＰＥＷＭＴＳＡＳＩＹＳＰＧＫＰＹＬＡＫ、ＬＰＥＷＭＴＳＡＳＩＦＳＰＭＫＰＹＬＡＫ、及びＳＧＮＶＧＥＳＧＬＩＤＬＰＧＣＰＲ、特にＬＰＥＷＭＴＳＡＳ及びＳＧＮＶＧＥＳＧＬＩを効率的に切断できることを示す。

[235] エピトープＥＭＱＷＤＦＶＲ、ＤＬＰＧＣＰＲ、ＬＬＶＡＰＧＱＣＮＬＡＴＩＨＮＶＲ、ＤＹＶＬＱＱＴＣＧＴＦＴＰＧＳＫ、及びＹＦＩＡＬＰＶＰＳＱＰＶＤＰＲの切断もまた、試験する。

[236] ＣＭ１６ＡＴＩエピトープ及びＣＭ１７ＡＴＩエピトープを、試験した。前記エピトープと重複するペプチドをモニタリングすることにより、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在する酵素がエピトープＩＥＭＰＧＰＰＹＬＡＫ（図２５）、ＱＥＣＣＥＱＬＡＮＩＰＱＱＣＲ（図２４）、及びＹＦＭＧＰＫ（図２６）を効率的に切断できることを確認する。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＣＭ３ＡＴＩエピトープを効率的に切断できることを示す。特に、このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープＩＥＭＰＧＰＰＹＬＡＫ（図２５）、ＱＥＣＣＥＱＬＡＮＩＰＱＱＣＲ（図２４）、及びＹＦＭＧＰＫ（図２６）を効率的に切断できることを示す。

[237] 実施例８：パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）の消化特異性分析
[238] パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在するタンパク質の同定に集中するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、カリカイン、パパインの複数のアイソフォーム、キモパパイン及びパパイアプロテイナーゼ４を含む、少なくとも４つの異なる酵素が存在することを示す。本発明者らはまた、本明細書において記載される１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がグルタミンシクロトランスフェラーゼもまた含むこと（データは示さない）も、質量分析を使用して示した。

[239] Ｆ１濾液において検出されたペプチド配列を使用して、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在する酵素の切断特異性を決定した。図１３において示されるように、検出されたペプチドのＰ３、Ｐ２、Ｐ１及びＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’位置に存在するアミノ酸残基の組合せを、まずＡＴＩ配列についてフィルタリングすることなく分析し、その後にＡＴＩ特異的分析を行った。ＡＴＩ特異的分析の場合、Ｆ１濾液から検出されたペプチド配列を、１００％配列同一性を有する配列に対してマッピングし、両方の方向に３アミノ酸の隣接領域を含む伸長したペプチドを、抽出し、さらに分析した。

[240] 位置Ｐ１及びＰ１’を、グリアジンなどの他のタンパク質タイプに由来するペプチドもまた含む検出されたペプチドすべてについて同定した場合、最も頻度の高いＰ１－Ｐ１’対はＱ－Ｑ；Ｑ－Ｖ及びＭ－Ｉであった（図２２Ａ）。これらは、位置Ｐ１’における脂肪族残基、アミド性残基又は含硫残基と組合せた、位置Ｐ１におけるアミド性残基を主に表した（図２２Ｂ）。

[241] 隣接する残基もまた考慮した場合、最も頻度の高い組合せは、配列が、Ｐ３における脂肪族残基、Ｐ２におけるヒドロキシ性残基及びＰ１における含硫残基の後の切断と組合せて、すべてＰ１’、Ｐ２’及びＰ３’位置における脂肪族アミノ酸の前で切断された場合であった。これらのうち、最も頻度の高いアミノ酸の組合せは、Ｐ１＝Ｍ；Ｐ２＝Ｔ及びＰ３＝Ｐと組合せた、Ｐ１’＝Ｉ；Ｐ２’＝Ａ；Ｐ３’＝Ｌであった。

[242] ＡＴＩ特異的パターンにより、Ｐ１’及びＰ１位置の両方における脂肪族残基の重要性を確認する（図２３Ｂ）。詳細な分析により、Ｐ１及びＰ１’位置における最も頻度の高いアミノ酸残基対がＳ及びＲであり、Ｓ－Ｓ及びＡ－Ａ対がそれに続くことを確認する（図２３Ａ）。観察された特徴に基づいて、脂肪族残基、塩基性残基又はヒドロキシ性残基のいずれかを組合せたヒドロキシ性残基の後の切断は、切断パターンのうちの３６％超を説明する。

[243] 実施例９：パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物による非還元コムギＡＴＩエピトープ消化。

[244] 本発明者らは、ＡＴＩを、グルテンタンパク質を濃縮するために主に使用される希釈したエタノール抽出緩衝液において濃縮できることを示した。このサンプル調製方法は、還元剤（ＤＴＴ）の使用及びアルキル化（ヨードアセトアミドを使用する）を回避して、ヒト消化管における状態を模倣する。

[245] 従って、αアミラーゼ／トリプシンインヒビター特異的トリプシン消化ペプチドの標的化分析を実施して、コムギにおけるグルテンタンパク質に対するパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物及びＡｎ－ＰＥＰ消化サプリメントの消化効率を調査した。簡単に言うと、タンパク質を、７０％エタノールを使用して四連で２０ｍｇの粉から抽出した。パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物及びＡｎ－ＰＥＰ消化サプリメントを、上記のように調製し、２０μＬの０．１×溶液を、時間経過実験のために最終反応容積２００μＬで使用して、最終サプリメント濃度０．０１×を生じた。本発明者らは、４つの別個の実験を実施して、ＡＴＩに対するパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）及びＡｎ－ＰＥＰの消化効率を、ペプシンの存在下及び非存在下でモニターした。４つの実験の条件及びデータ収集は、上記の通りであった。

[246] モニターしたＡＴＩ特異的ペプチドセット
[247] 同じ十分にトリプシン消化されたペプチドトランジションを使用して、上記のようにＡＴＩをモニターした。リストは、コムギ品種Ｂａｘｔｅｒに特徴的な合計６９個のペプチドから構成され、前記６９個のペプチドのうち４７個は、還元状態で検出された非常に高強度のペプチドとして以前のＡＴＩ分析において報告された。非ＤＴＴ実験において、検出された４２個のペプチドが存在し、前記４２個のペプチドのうち２２個の十分にトリプシン消化されたペプチドが高強度であり、前記２２個の十分にトリプシン消化されたペプチドを分析で維持した。これらのペプチドは、ＡＴＩのＣＭサブクラス（ＣＭ１、ＣＭ３、ＣＭ１６及びＣＭ１７）を主に表すが、モノマーＡＴＩ特異的ペプチド及びダイマーＡＴＩ特異的ペプチドは提示不足であった（図２９）。良好な強度を示すペプチドのほとんどは、ペプチドの配列中にシステイン残基を欠くペプチドであった。システイン含有ペプチドのほとんどは、ほとんど検出されず、すなわち、閾値強度未満であった。タンパク質消化ワークフローが還元／アルキル化ステップを組み込まなかったので、Ｃｙｓ含有ペプチドは、Ｃｙｓ含有ペプチドの検出／同定を妨げたであろうジスルフィド結合を含むことができる。

[248] ペプチドピーク量値を、４つすべての実験（Ｃｃｎ、Ｃｃｎ＋Ｐｅｐ、Ａｎ－ＰＥＰ及びＡｎ－ＰＥＰ＋Ｐｅｐ）における０時点サンプルに対して個別に正規化した。下のヒートマップは、これらの０に正規化した量の結果を示し、１００％が薄い灰色で標識されているが、相対的量の減少が青色の目盛りで標識されており、増加が赤色の目盛りで標識されている（図３０－パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）を使用した消化物及び図３２－Ａｎ－ＰＥＰ消化物）。

[249] 図３０は、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）が非還元条件においてＡＴＩエピトープを効率的に切断できることを示す。特に、このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がエピトープ
GPSLPMLVK
SDPNSSVLK
IETPGSPYLAK
EVQMDFVR
SRPDQSGLMELPGCPR
YFMGPK
IEMPGPPYLAK
LPEWMTSASIFSPMKPYLAK
LPEWMTSASIYSPGKPYLAK
DYVLQQTCGTFTPGSK
QMQWDFVR
YFIALPVPSQPVDPR
EMQWDFVR
TDLLPHCR
EHGAQEGQAGTGAFPR
EFIAGIVGR
SHNSGPWSWCDPATGYK
SVYQEIGVR
SVYQELGVR
VPIPNPSGDR
を効率的に切断できることを示す。

[250] ＣＭ１６ペプチドすべてが、消化後にＣＭ１６ペプチド量の顕著な減少を示す。前記エピトープと重複するペプチドのモニタリングによって、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在する酵素が非還元条件においてこれらのエピトープを効率的に切断できることを確認する（図３０）。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＣＭ１６ＡＴＩエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを示す。

[251] ＣＭ１７ペプチド及びＣＭＨａｇｅｒｍａｎペプチドは、消化後にＣＭ１７ペプチド及びＣＭＨａｇｅｒｍａｎペプチドの量の顕著な減少を示す。前記エピトープと重複するペプチドのモニタリングによって、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在する酵素がこれらのエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを確認する（図３０）。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＣＭ１７及びＣＭＨａｇｅｒｍａｎのＡＴＩエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを示す。

[252] ＣＭ１６ペプチド及びＣＭ１７ペプチドすべてが、消化後にＣＭ１６ペプチド及びＣＭ１７ペプチドの量の顕著な減少を示す。前記エピトープと重複するペプチドのモニタリングによって、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在する酵素がこれらのエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを確認する（図３０）。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＣＭ１６及びＣＭ１７のＡＴＩエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを示す。

[253] ＣＭ３ペプチドすべてが、消化後にＣＭ３ペプチドの量の顕著な減少を示す。前記エピトープと重複するペプチドのモニタリングによって、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在する酵素がこれらのエピトープを非還元条件において効率的に切断できること確認する（図３０）。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＣＭ３のＡＴＩエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを示す。

[254] ダイマーペプチドすべてが、消化後にダイマーペプチドの量の顕著な減少を示す。前記エピトープと重複するペプチドのモニタリングによって、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在する酵素がこれらのエピトープを非還元条件において効率的に切断できること確認する（図３０）。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がダイマーＡＴＩエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを示す。

[255] モノマーペプチドすべてが、消化後にモノマーペプチドの量の顕著な減少を示す。前記エピトープと重複するペプチドのモニタリングによって、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）に存在する酵素がこれらのエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを確認する（図３０）。このデータは、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がモノマーＡＴＩエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを示す。

[256] ペプチド量の相対的変化の平均を、各ＡＴＩ特異的ペプチドグループについて別個に計算した（図３１）。量の最大減少（＞８０％）がダイマーＡＴＩ及びＣＭ３－ＡＴＩペプチドにおいて測定された一方で、ＣＭ１６、ＣＭ１７及びモノマーグループに特異的なペプチドは、４０～５０％しか減少しなかった。ペプシンの存在は、ペプチド消化性には顕著には影響を及ぼさなかった。

[257] 図３１は、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）がＣＭＨａｇｅｒｍａｎ、ダイマー、モノマー、ＣＭ１６、ＣＭ１７、及びＣＭ３のＡＴＩエピトープを非還元条件において効率的に切断できることを示す。

[258] 実施例１０：非還元コムギＡＴＩエピトープは、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来のプロリルエンドプロテアーゼであるＡｎ－ＰＥＰにより消化されない。

[259] 図３２は、ペプシンの存在下及び非存在下におけるＡｎ－ＰＥＰによる消化により、Ａｎ－ＰＥＰがＡＴＩを効果的に消化不可能であることを確認したことを示し、図３３は、グループ特異的ペプチドの相対的変化を示し、Ａｎ－ＰＥＰがＡＴＩを消化するために適していないことを示す。

[260] Ａｎ－ＰＥＰは、クロコウジカビ由来のプロリルエンドプロテアーゼ（ＡＮ－ＰＥＰ）であり、胃内に注入される食事に添加された場合に健常対象においてグルテンを分化することが以前に示されている。

[261] サイズが＜１０ｋＤａのペプチドを示す濾液１サンプルを、グリアジン実験報告において上記に示されたように、４つの実験すべてから収集した。信頼レベル＞９５％である独特な濾液１ペプチドを、マッピング分析のために使用した。ペプチドを、Ｂａｘｔｅｒにおいて同定されたＡＴＩタンパク質に対して、１００％配列同一性を用いてマッピングした。興味深いことに、ＣＭ３ＡＴＩ及びモノマーＡＴＩにおいて特徴的である２つのペプチド（ＱＰＶＤＰＲＳＧＮＶＧＥＳＧＬ及びＶＥＹＧＡＲＳＨ）だけが、濾液１の６０分サンプルから検出できた。ＶＥＹＧＡＲＳＨが前記タンパク質のＮ末端に位置する一方で、ＱＰＶＤＰＲＳＧＮＶＧＥＳＧＬは同タンパク質のＣ末端側に位置する。両方のペプチドは、この分析においてモニターする十分にトリプシン消化されたペプチドと重複し、これはカリカインによるＡＴＩの消化の変動する性質、すなわち、トリプシンと比較して低い消化特異性を示す。

[262] 実施例９及び１０は、パパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物（Ｅｎｚ１）はまた種々のＡＴＩタンパク質を非還元条件下でも消化可能であるが、Ａｎ－ＰＥＰはＡＴＩに対して有効ではないことを、示す。ペプシンの存在は、消化性に顕著には影響を及ぼさない。還元条件及び非還元条件における高強度のペプチドの検出における差は、内部ジスルフィド架橋により固定されたＡＴＩの緊密な球状構造が原因で埋没しているタンパク質領域が、カリカイン消化の傾向が小さいことを示す。

Claims

少なくとも１つのαアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）を消化するための方法であって、ＡＴＩを、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量と接触させるステップ
を含む方法。
αアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）含有食料品における少なくとも１つのＡＴＩを消化するための方法であって、
前記ＡＴＩ含有食料品を、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量と接触させるステップ
を含む方法。
前記タンパク質分解調製物が、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）からなる群から選択される１つ又は複数のプロテアーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記αアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）を、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含む前記タンパク質分解調製物と、加水分解による前記ＡＴＩの消化を引き起こすのに十分な条件下で接触させる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つのＡＴＩが、コムギ、オオムギ、ライムギ又はカラスムギの種に由来するＡＴＩである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つのＡＴＩが、スペルトコムギ、ホラーサーンコムギ、エンマーコムギ、ヒトツブコムギ、及びライコムギの種に由来するＡＴＩである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つのＡＴＩがコムギＡＴＩである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つのＡＴＩの少なくとも１つのエピトープが消化される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つのエピトープが、
ａ）
AASVPE
ADINNE
ALTGCR
AMVKLQ
AVLRDC
AYPDV
CQQLAD
CRAMVK
CVGSQV
CYGDWA
DCCQQL
ELGVRE
EVMKLT
GCRKEV
GDRAGV
GDWAAY
GKEVLP
GSQVPE
GVCYGD
GVREGK
INNEWC
KVPIPN
LPGCRK
LQCVGS
LRDCCQ
LRSVYQ
LSSMLR
LTAASV
MKLTAA
NEWCRC
PATGYK
PEAVLR
PEVCKV
PSGDRA
QLADIN
QVPEAV
RAGVCY
RCGDLS
REGKEV
RKEVMK
SGPWSW
SMLRSV
SVPEVC
SVYQEL
TGCRAM
TGYKVS
VCKVPI
VKLQCV
VSALTG
WAAYPD
WCRCGD
YKVSAL
YQELGV;
からなる群から選択されるαアミラーゼインヒビター前駆体（ＣＩＩＩ）（ＷＭＡＩ－１）Ｂ細胞エピトープ；
ｂ）PWSWCD、SWCDPA、及びSWCDPATGYKVSALTGCRAMVからなる群から選択される推定αアミラーゼインヒビターＢ細胞エピトープ；
ｃ）
DCCQQLAHISEWCR
EHGAQEGQAGTGAFPR
CGALYSMLDSMYK
LQCNGSQVPEAVLR
LPIVVDASGDGAYVCK
LTAASITAVCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPACRPL LR
DCCQQLADISEWCR
EHGVSEGQAGTGAFPSCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPGCRPL LK
ECCQQLADISEWCR
LTAASITAVCK
SGPWMCYPGYAFK
VPALPGCRPVLK;
からなる群から選択される、ＡＴＩエピトープを含むペプチド；
ｄ）
IETPGSPYLAK
SDPNSSVLK
ELYDASQHCR
EYVAQQTCGVGIVGSPVSTEPGN TPR
TSDPNSGVLK
VLVTPGHCNVMTVHNTPYCLGLD I
IEMPGPPYLAK
NYVEEQACR
QECCEQLANIPQQCR
SRPDQSGLMELPGCPR
YFMGPK
EVQMDFVR;
からなる群から選択されるＣＭ１６及び／又はＣＭ１７のＡＴＩエピトープ；
ｅ）
EVLPGCR
CGDLSSMLR
DCCQQLADINNEWCR
VSALTGCR
SVYQELGVR
SHNSGPWSWCDPATGYK
LTAASVPEVCK
LQCVGSQVPEAVLR
VPIPNPSGDR
SVYQEIGVR;
からなる群から選択されるモノマーＡＴＩエピトープ；
ｆ）
LPEWMTSASIYSPGKPYLAK
EMQWDFVR
LYCCQELAEISQQCR
DLPGCPR
LLVAPGQCNLATIHNVR
DYVLQQTCGTFTPGSK
YFIALPVPSQPVDPR
SGNVGESGLIDLPGCPR
LPEWMTSASIFSPMKPYLAK
LYCCQELAEIPQQCR
QMQWDFVR
TDLLPHCR;
からなる群から選択されるＣＭ３のＡＴＩエピトープ；
ｇ）
GPSLPMLVK
SDPNSSVLK；
からなる群から選択されるＣＭＨａｇｅｒｍａｎ又はＣＭ１のＡＴＩエピトープ；並びに
ｈ）
EHGAQEGQAGTGAFPR
EFIAGIVGR
からなる群から選択されるダイマーＡＴＩエピトープ
から選択される、請求項８に記載の方法。
前記タンパク質分解調製物がパパイアオレオレジンに由来する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
前記タンパク質分解調製物がパパイアラテックスに由来する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物が１つ又は複数の賦形剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
インビトロ又はインビボで実施される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物がヒトに投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防のための方法であって、
αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防を必要とする対象に対して、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効量を投与するステップ
を含む方法。
前記状態がコムギαアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態である、請求項１５に記載の方法。
前記αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態がコムギアレルギー、非セリアックグルテン／コムギ過敏症、過敏性腸症候群又はパン職人喘息である、請求項１５又は１６に記載の方法。
前記タンパク質分解調製物が、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）からなる群から選択される１つ又は複数のプロテアーゼを含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
前記タンパク質分解調製物がパパイアオレオレジンを含むか又はパパイアオレオレジンに由来する、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
前記タンパク質分解調製物がパパイアラテックスを含むか又はパパイアラテックスに由来する、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物が１つ又は複数の薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物が経口投与される、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物が腸溶コーティングされている、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の方法。
前記対象がヒト対象である、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の方法。
αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態の処置及び／又は予防のための医薬の製造における、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の使用。
前記状態がコムギαアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態である、請求項２５に記載の使用。
前記αアミラーゼ／トリプシンインヒビター（ＡＴＩ）媒介性状態がコムギアレルギー、非セリアックグルテン／コムギ過敏症、過敏性腸症候群又はパン職人喘息である、請求項２５又は２６に記載の使用。
前記タンパク質分解調製物がパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、パパイアプロテイナーゼ４（ＥＣ３．４．２２．２５）、及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．５）からなる群から選択される１つ又は複数のプロテアーゼを含む、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の使用。
前記タンパク質分解調製物がパパイアオレオレジンに由来する、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の使用。
前記タンパク質分解調製物がパパイアラテックスに由来する、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の使用。
前記組成物が１つ又は複数の薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の使用。
前記組成物が経口投与される、請求項２５～３１のいずれか１項に記載の使用。
前記組成物が腸溶コーティングされている、請求項２５～３２のいずれか１項に記載の使用。
前記対象がヒト対象である、請求項２５～３３のいずれか１項に記載の使用。
少なくとも１つのαアミラーゼトリプシンインヒビター（ＡＴＩ）のエピトープを消化するための方法であって、
前記エピトープを含むＡＴＩと、１つ又は複数のパパイアエンドペプチダーゼを含むタンパク質分解調製物を含む組成物の有効用量とを接触させるステップ
を含む、方法。
前記少なくとも１つのエピトープが、
ａ）
AASVPE
ADINNE
ALTGCR
AMVKLQ
AVLRDC
AYPDV
CQQLAD
CRAMVK
CVGSQV
CYGDWA
DCCQQL
ELGVRE
EVMKLT
GCRKEV
GDRAGV
GDWAAY
GKEVLP
GSQVPE
GVCYGD
GVREGK
INNEWC
KVPIPN
LPGCRK
LQCVGS
LRDCCQ
LRSVYQ
LSSMLR
LTAASV
MKLTAA
NEWCRC
PATGYK
PEAVLR
PEVCKV
PSGDRA
QLADIN
QVPEAV
RAGVCY
RCGDLS
REGKEV
RKEVMK
SGPWSW
SMLRSV
SVPEVC
SVYQEL
TGCRAM
TGYKVS
VCKVPI
VKLQCV
VSALTG
WAAYPD
WCRCGD
YKVSAL
YQELGV;
からなる群から選択されるαアミラーゼインヒビター前駆体（ＣＩＩＩ）（ＷＭＡＩ－１）Ｂ細胞エピトープ；
ｂ）PWSWCD、SWCDPA、及びSWCDPATGYKVSALTGCRAMVからなる群から選択される推定αアミラーゼインヒビターＢ細胞エピトープ；
ｃ）
DCCQQLAHISEWCR
EHGAQEGQAGTGAFPR
CGALYSMLDSMYK
LQCNGSQVPEAVLR
LPIVVDASGDGAYVCK
LTAASITAVCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPACRPL LR
DCCQQLADISEWCR
EHGVSEGQAGTGAFPSCR
SGPWMCYPGQAFQVPALPGCRPL LK
ECCQQLADISEWCR
LTAASITAVCK
SGPWMCYPGYAFK
VPALPGCRPVLK;
からなる群から選択される、ＡＴＩエピトープを含むペプチド；
ｄ）
IETPGSPYLAK
SDPNSSVLK
ELYDASQHCR
EYVAQQTCGVGIVGSPVSTEPGN TPR
TSDPNSGVLK
VLVTPGHCNVMTVHNTPYCLGLD I
IEMPGPPYLAK
NYVEEQACR
QECCEQLANIPQQCR
SRPDQSGLMELPGCPR
YFMGPK
EVQMDFVR;
からなる群から選択されるＣＭ１６及び／又はＣＭ１７のＡＴＩエピトープ；
ｅ）
EVLPGCR
CGDLSSMLR
DCCQQLADINNEWCR
VSALTGCR
SVYQELGVR
SHNSGPWSWCDPATGYK
LTAASVPEVCK
LQCVGSQVPEAVLR
VPIPNPSGDR
SVYQEIGVR;
からなる群から選択されるモノマーＡＴＩエピトープ；
ｆ）
LPEWMTSASIYSPGKPYLAK
EMQWDFVR
LYCCQELAEISQQCR
DLPGCPR
LLVAPGQCNLATIHNVR
DYVLQQTCGTFTPGSK
YFIALPVPSQPVDPR
SGNVGESGLIDLPGCPR
LPEWMTSASIFSPMKPYLAK
LYCCQELAEIPQQCR
QMQWDFVR
TDLLPHCR
からなる群から選択されるＣＭ３のＡＴＩエピトープ；
ｇ）
GPSLPMLVK
SDPNSSVLK
からなる群から選択されるＣＭＨａｇｅｒｍａｎ又はＣＭ１のＡＴＩエピトープ；並びに
ｈ）
EHGAQEGQAGTGAFPR
EFIAGIVGR
からなる群から選択されるダイマーＡＴＩエピトープ
から選択される、請求項３５に記載の方法。