KR102324076B1

KR102324076B1 - 엘라스틴 및 콜라겐 유도를 이용한 피부 주름 및 탄력 개선 효과 조성물

Info

Publication number: KR102324076B1
Application number: KR1020210067197A
Authority: KR
Inventors: 김현아
Original assignee: 김현아
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2021-11-08

Abstract

본 발명은 히알루론산, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide), 아미노산(L-라이신, L-글리신, L-프롤린, L-알라닌 및 L-세린), 식염수, 비타민 C 및 비타민 B12를 바람직한 비율로 혼합하여 조성물을 제조함으로써, 생체 안정성 및 적합성을 가지면서 우수한 엘라스틴 및 콜라겐 생성 유도 효과를 갖는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 함몰, 피부 처짐, 피부 겉면이 울퉁불퉁 해지는 부작용이 없고, 점도가 낮아 통증이 없어 피부 주름 제거 또는 개선용 주사제로 사용하기 적합하다.

Description

엘라스틴 및 콜라겐 유도를 이용한 피부 주름 및 탄력 개선 효과 조성물{Composition for improving skin wrinkles and elasticity through induction of elastin and collagen}

본 발명은 히알루론산, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide), 아미노산(L-라이신, L-글리신, L-프롤린, L-알라닌 및 L-세린), 식염수, 비타민 C 및 비타민 B12를 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물에 관한 것이다.

생명체는 태어나면서 부터 노화가 시작되며, 피부에 주름이 생기는 것은 생명 노화의 증상 중 하나이다. 피부노화의 원인은 크게 외재적 요인과 내재적 요인으로 나뉜다. 외재적 요인은 햇빛, 중력, 흡연 등이 있으며 내재적 요인은 유전적인 요인 등이 있다.

이러한 피부 노화를 보완하고, 젊은 외모를 갖기 위한 많은 시술들이 시행되고 있는데, 그 중에는 수술을 이용하여 주름을 없애는 방법, 보톡스, 그리고 필러(fiiler) 등이 있다. 수술의 경우에는 흉터가 남고, 시간이 오래 걸린다는 단점이 있으며, 보톡스는 신경 독소를 사용하기 때문에 부작용이 많이 발생한다. 반면 생체 내 존재하는 고분자를 이용한 필러(fiiler)의 경우에는 부작용이 적고 간편한 시술로 시간 절약이 가능하기 때문에 많이 이용되고 있다.

필러(fiiler)는 피부 내 진피(dermis) 층에 주입되어 주름을 개선하기 위해 쓰이며, 주로 팔자주름 개선, 입 위 세로 주름 개선, 입가주름 개선, 입술 윤곽, 여드름 흉터 등에 쓰인다. 이러한 필러 시술 받는 사람이 크게 늘면서 필러 시장 규모도 매년 10% 이상 성장하는 것으로 추정되며, 국내 시장 규모는 지난 2009년 600억 원에서 2010년 700억 원으로 20% 가까이 성장했으며 1000억 원까지 늘어날 전망이다.

필러(fiiler)는 1890년대에 자가 지방이식으로 시술한 것이 최초이며, 이 후 파라핀과 액상 실리콘이 쓰였으나 심각한 부작용 때문에 오늘날 미국과 우리나라를 비롯해 많은 나라에서 불법 의료 행위로 규정되어 있다. 그 후 콜라겐을 사용한 필러(fiiler)가 발명되었으며, Zyderm 과 Zyplast가 대표적 콜라겐 필러(fiiler)이다. 그러나 이러한 콜라겐 필러는, 동물 유래 콜라겐이 사용되므로 시술 한 달 전에 알러지 테스트를 해야 하며, 수명도 3~6개월 정도로 비교적 짧은 단점이 있다(Baumann, L, J Kaufman, and S Saghari, Collagen fillers Dermatologic therapy, 2006 19(3): p 134-140).

이를 보완하고자 히알루론산 계열의 필러(fiiler)가 개발되었는데, 대표적으로는 Hylaform과 Restylane/Perlane 등이 있으며, 수명이 콜라겐에 비해 6~12개월로 두 배 정도 길어졌으며 알러지 테스트가 없다는 장점이 있어 현재 많이 이용되고 있다.

히알루론산은 동물 등의 피부에 많이 존재하는 천연 고분자로 이 밖에 표피, 연골, 안구의 유리체액, 관절의 윤활액 등으로 생체 내에 존재한다. 수산화기가 많기 때문에 친수성 물질이며, 자체 무게의 1000배의 물을 함유할수 있다. 인체 내에 7~8g의 히알루론산이 존재하며, 피부의 구조를 유지하고 정상적 작용을 하는데 중요한 역할을 한다. 분자량의 높은 히알루론산은 점도가 높으며 이는 피부에 점탄성을 부여하여 충격 완화 및 윤활유 역할을 한다. 또한, 콜라겐 등 주요 물질 생성을 촉진하며 이들이 피부 조직을 유지하는데 도움을 준다.

상기와 같은 특징을 갖는 히알루론산은 우수한 생체적합성과 점탄성으로 인해 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 의료 소재 및 의료 용구나, 화장품의 용도 등으로 널리 사용되고 있다.

그러나 히알루론산 그 자체만으로는 생체 내(in vivo) 또는 산, 알칼리와 같은 조건에서 쉽게 분해되고, 주름 제거 효과가 충분하지 않다는 문제점이 있었다. 이에 히알루론산과 함께 보조적으로 포함되어 주름 제거 효과를 극대화시키는 추가 구성 성분을 발굴하고 그 함량에 대한 비율을 최적화한 신규한 히알루론산 계열의 필러 개발이 필요하였다.

한국등록특허 제10-1967153호 한국등록특허 제10-1764389호

본 발명은, 피부 탄력 증진 및 주름 제거에 도움을 줄 수 있는 히알루론산, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide), 아미노산(L-라이신, L-글리신, L-프롤린, L-알라닌 및 L-세린), 식염수, 비타민 C 및 비타민 B12를 포함함으로써 인체에 부작용이 없는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 히알루론산, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide), 아미노산(L-라이신, L-글리신, L-프롤린, L-알라닌 및 L-세린), 식염수, 비타민 C 및 비타민 B12를 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물을 제공하는 데 목적이 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 히알루론산, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide), 아미노산(L-라이신, L-글리신, L-프롤린, L-알라닌 및 L-세린), 식염수, 비타민 C 및 비타민 B12를 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 히알루론산, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide), 비타민 C, 비타민 B12 및 식염수를 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물을 제공한다.

상기 주사제 조성물은 L-라이신, L-글리신, L-프롤린, L-알라닌 및 L-세린으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 주사제 조성물은 펩타이드 VHHA, 상피세포 성장인자 EGF 및 섬유아세포 성장인자 FGF로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 주사제 조성물은 히알루론산 100 중량부를 기준으로, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 50 내지 100 중량부, 비타민 C 0.1 내지 10 중량부, 비타민 B12 0.1 내지 10 중량부 및 식염수 500 내지 1000 중량부를 포함할 수 있다.

상기 주사제 조성물은 히알루론산 100 중량부를 기준으로, L-라이신 0.1 내지 5 중량부, L-글리신 0.1 내지 5 중량부, L-프롤린 0.1 내지 8 중량부, L-알라닌 0.1 내지 4 중량부 및 L-세린 0.1 내지 3 중량부를 포함할 수 있다.

상기 주사제 조성물은 히알루론산 100 중량부를 기준으로, 펩타이드 VHHA 1 내지 50 중량부, 상피세포 성장인자 EGF 0.1 내지 10 중량부 및 섬유아세포 성장인자 FGF 0.1 내지 5 중량부를 포함할 수 있다.

상기 주사제 조성물은 1회 주사 용량이 0.1 내지 3.0 cc인 것일 수 있다.

상기 주사제 조성물은 0.001 내지 2cm로 투여하는 것일 수 있다.

본 발명은 각 히알루론산, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide), 아미노산(L-라이신, L-글리신, L-프롤린, L-알라닌 및 L-세린), 식염수, 비타민 C 및 비타민 B12를 바람직한 비율로 혼합하여 조성물을 제조함으로써, 생체 안정성 및 적합성을 가지면서 우수한 엘라스틴 및 콜라겐 생성 유도 효과를 갖는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 함몰, 피부 처짐, 피부 겉면이 울퉁불퉁 해지는 부작용이 없고, 점도가 낮아 통증이 없어 피부 주름 제거 또는 개선용 주사제로 사용하기 적합하다.

도 1은 광노화 마우스 모델에 제조예 4-5 주사제를 피하주사한 마우스 피부 조직(A)과 음성 대조군 피부 조직(B)을 나타낸 광학현미경 사진이다.
도 2는 팔자주름 제거 효과에 대한 임상 실험 수행 전(A)과 후(B)의 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 각 제조예 주사제와 비교예를 24h 또는 48h 보관한 후, 흡광도 350nm에서 탁도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명을 충분히 이해하기 위해서 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명한다. 본 발명의 실시예는 여러 가지 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상세히 설명하는 실시예로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 히알루론산(HA; Hyaluronic acid), 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide), 비타민 C, 비타민 B12 및 식염수를 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물을 제공한다.

상기 히알루론산은 동물 피부에 다량 존재하는 생체합성 천연 물질로 피부에서 보습 작용의 역할을 한다. 히알루론산은 콜라겐, 엘라스틴과 함께 진피를 구성하며 주름을 방지하고 탱탱한 피부를 유지시키는 중요한 물질이다.

상기 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 연어로부터 추출한 약리작용을 가진 DNA 단편으로 보습 기능뿐만 아니라 염증 제거 및 재생 효과를 나타낸다. 또한, 성장인자 분비를 촉진하여 콜라겐 합성에 시너지 효과를 내는 물질이다.

상기 비타민 C는 콜라겐 합성에 필수적인 비타민으로 피부 항노화, 주름개선, 미백 등의 효과를 가진다.

상기 비타민 B12는 세포의 DNA를 합성할 때 필요한 비타민으로 붉은 색을 띄는 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에서 본 발명의 조성물을 주사제로 제조하여 섬유아세포의 콜라겐 합성을 측정한 결과, 주사제의 PDRN농도가 증가함에 따라, 비타민 C 또는/및 B12를 포함함에 따라, 아미노산을 포함함에 따라 콜라겐의 합성이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 마우스 모델의 발바닥에 주사하여 안전성을 평가하였을 때, 조직 괴사 및 염증을 일으키지도 않음을 확인하였다(실시예 1 내지 2 참조).

상기 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물은 효과를 더욱 향상시키기 위하여, L-라이신, L-글리신, L-프롤린, L-알라닌 및 L-세린으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.

라이신, 글리신, 프롤린, 알라닌 및 세린은 피부 세포를 구성하는 주요한 아미노산으로, 콜라겐 합성 및 주름 제거 효과를 위해 적절한 아미노산 종류와 최적의 비율로 주입할 수 있다. 특히, 프롤린의 경우 주사제의 점도를 낮춰주는 효과가 있어 고통을 경감시켜주는 효과가 있다. 프롤린을 포함했을 때, 제형의 저장 안정성 및 점도가 크게 증가하였음을 실험예 4 및 5를 통해 확인할 수 있었다. 점도가 높은 주사제는 환자에게 투여 시 고통을 수반할 수 있는데, 프롤린이 추가된 제형의 경우 점도가 약 3.1cp 이하로, 프롤린이 첨가되지 않은 제형 대비 약 7.0cp 이상 점도가 감소하여 환자 편의성이 증대될 수 있다.

상기 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물은 효과를 더욱 향상시키기 위하여, 펩타이드 VHHA, 상피세포 성장인자 EGF 및 섬유아세포 성장인자 FGF로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 펩타이드 VHHA는 항산화 활성을 가지는 펩타이드 단편으로, 비타민C와 함께 작용하여 콜라겐 합성 및 주름 억제 효과에 시너지 효과를 줄 수 있다. 다른 펩타이드 단편들보다 그 시너지 효과가 우수하고, 비교적 짧아 경제성이 있다.

상기 상피세포 성장인자 EGF는 새로운 세포가 쌩성되도록 자극하고, 노화된 세포는 신속히 각질화시키므로 세포의 총량이 늘고 교원섬유와 탄성섬유가 재생되어 피부 탄력이 강화될 수 있다. 이에 따라, 콜라겐 합성 및 주름 개선 효과가 있다.

상기 섬유아세포 성장인자 FGF는 피부 재생에 도움이되는 성장인자로, 노화, 주름, 피부 재생에 효과적이다.

상기 주사제 조성물은 히알루론산 100 중량부를 기준으로, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 50 내지 100 중량부, 비타민 C 0.1 내지 10 중량부, 비타민 B12 0.1 내지 10 중량부 및 식염수 500 내지 1000 중량부로 포함될 수 있다.

상기 히알루론산 함량이 너무 낮은 경우, 주름 제거 효과가 미미할 수 있고, 히알루론산 함량이 너무 높은 경우 히알루론산 고농도의 주사제가 피부의 한 부위로 투여됨에 따라, 피부 굴곡이 울퉁불퉁해질 수 있어서 적절한 비율로 되어야 한다.

상기 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 각각 히알루론산 100 중량부를 기준으로 25, 50, \5, 100, 150 중량부로 포함하여 주사제를 제조하였다. 그 결과, 다량 포함할수록 콜라겐 합성 효과가 높은 것을 확인하였다. 다만, 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 포함할수록 제형 안정성이 떨어지는 것을 확인하여, 50 내지 100 중량부로 포함할 때 최적의 함량임을 확인하였다. 보다 바람직하게는 75 중량부를 포함할 수 있다.

상기 비타민 C와 비타민 B12는 히알루론산 100 중량부를 기준으로 0.1 내지 10 중량부로 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 1 내지 5 중량부로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 3 중량부로 포함할 수 있다.

상기 주사제 조성물은 히알루론산 100 중량부를 기준으로, L-라이신 0.1 내지 5 중량부, L-글리신 0.1 내지 5 중량부, L-프롤린 0.1 내지 8 중량부, L-알라닌 0.1 내지 4 중량부 및 L-세린 0.1 내지 3 중량부로 포함될 수 있다.

피부 내에 포함되는 아미노산 종류의 그 함량 비율을 최적화하여, 히알루론산 100 중량부를 기준으로 L-라이신과 L-글리신은 0.1 내지 5 중량부로 포함될 수 있다. 보다 바람직하게는 3 중량부로 포함될 수 있다.

상기 L-프롤린은 히알루론산 100 중량부를 기준으로 0.1 내지 8 중량부로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 5 중량부로 포함될 수 있다. 다른 아미노산 대비 점도를 낮춰주고 제형 안정성을 증가시키는 기능을 적절히 활용하기 위하여 조금 더 함량을 증가하여 투입하여 줄 수 있다.

상기 L-알라닌은 히알루론산 100 중량부를 기준으로 0.1 내지 4 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 2 중량부로 포함될 수 있다.

상기 L- 세린은 히알루론산 100 중량부를 기준으로 0.1 내지 3 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1.5 중량부로 포함될 수 있다.

상기 아미노산의 함량 비율은 피부 내 콜라겐 합성에 필요한 아미노산의 함량 비율을 토대로 L-라이신 : L-글리신 : L-프롤린 : L-알라닌 : L-세린 = 3 : 3 : 5 : 2 : 1.5의 함량 비율로 포함되는 것일 수 있다.

상기 주사제 조성물은 히알루론산 100 중량부를 기준으로, 펩타이드 VHHA 1 내지 50 중량부, 상피세포 성장인자 EGF 0.1 내지 10 중량부 및 섬유아세포 성장인자 FGF 0.1 내지 5 중량부로 포함될 수 있다.

상기 펩타이드 VHHA는 히알루론산 100 중량부를 기준으로 1 내지 50 중량부로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 25 중량부로 포함될 수 있다. 이보다 더 적게 포함되는 경우 적절한 콜라겐 합성이 이뤄지지 않으며, 보다 많이 포함될 경우 부작용 또는 경제성이 낮아질 수 있다.

상기 상피세포 성장인자 EGF는 히알루론산 100 중량부를 기준으로 0.1 내지 10 중량부로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 5 중량부로 포함될 수 있다. 이보다 더 적게 포함되는 경우 콜라겐 합성 효과가 미미할 수 있고, 보다 많이 포함될 경우 부작용이 있을 수 있거나, 경제성이 낮아질 수 있다.

상기 상피세포 성장인자 FGF는 히알루론산 100 중량부를 기준으로 0.1 내지 5 중량부로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 2.5 중량부로 포함될 수 있다. 이보다 더 적게 포함되는 경우 콜라겐 합성 효과가 미미할 수 있고, 보다 많이 포함될 경우 부작용이 있을 수 있거나, 경제성이 낮아질 수 있다.

본 발명의 실험예 1에서 보이는 바와 같이, 주사제의 PDRN 농도가 증가함에 따라, 비타민 C 또는/및 B12를 포함함에 따라, 아미노산을 포함함에 따라 콜라겐의 합성이 증가함을 알 수 있다. 특히, 펩타이드 VHHA를 포함하는 경우, 포함하지 않은 경우보다 콜라겐 합성량이 20 ng/2 ×10⁴ 이상 증가한 것으로 볼 때, 히알루론산과 PDRN처럼 중요한 콜라겐 합성 증진 요소임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 지방제거용 주사제 조성물의 투여량은 상이한 파라미터에 따라 조정될 수 있다. 이러 한 파라미터에는 투약 대상자의 유형, 투약 대상체의 체중 및 투약 대상체의 국소 지방 두께 및 면적이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 24시간 이내에 1 번, 여러 번 또는 지속적으로 투여될 수 있다. 이 때, 1회 주사 시 주사제 투여 용량은 0.1 내지 3.0 cc 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는 0.5 내지 2.0 cc, 가장 바람직하게는 1.0 내지 1.5 cc일 수 있다. 그 이상의 용량을 투여할 경우, 국소 부위에 다량의 주사제가 투여되어 부작용이 발생할 수 있으며, 그 이하의 용량을 투여할 경우, 효과가 미미할 수 있다.

본 발명의 주사제는 주 단위로 또는 월 단위로 여러 번 또는 지속적으로 투여될 수 있다.

투여 방법은 피하주사, 피내주사, 정맥주사, 근육주사, 복강주사, 피하 이식, 이식형 주입, 연고, 또는 패치에 의한 것일 수 있으며, 바람직하게는, 약물을 피부층과 피하층에 주사하는 메조테라피 방법으로 피부의 주름부위, 예를들어 팔자주름, 눈가주름, 눈 밑 주름, 이마 주름, 목 주름 등의 부위에 주사될 수 있으며, 얼굴 부위 외에도 턱, 팔뚝, 다리, 가슴 등 주름을 제거하고 탄력을 증진시키고자 하는 전신 부위에 주사할 수 있다.

상기 주사제 조성물은 0.001 내지 2.0 cm로 투여하는 것일 수 있다. 바람직하게는 0.01 내지 1.5 cm, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1.0 cm의 간격으로 투여될 수 있다.

간격을 너무 넓게하여 주사할 경우, 주사 효과가 넓고 고르게 퍼지지 않아 표면적이 울퉁불퉁하게 될 수 있다. 따라서, 2cm를 넘지 않는 선에서 부위별로 적절하게 투여가 필요하다. 예를들어 팔자주름의 경우, 0.1cm 내지 0.5cm 간격으로의 투여가 바람직할 수 있다.

본 발명의 주사제는 이외에도 필요에 따라 항세균제, 킬레이트제, 완충제, 보존제와 같은 보조제를 포함시킬 수도 있다. 상기 약제 학적으로 허용되는 담체로는 약제학적으로 순수하고, 실질적으로 무독성이며, 유효성분의 작용을 저해하지 않는 임의의 모든 보조제를 사용할 수 있다.

본 발명의 주사제는 주약과 기타 첨가제를 주사용 증류수에 용해하고 이 용액을 세균여과기로 여과하여 무균처리한 후 무균상태에서 바이알에 충전한 후 밀봉하는 것으로, 주사제를 제조할 때에는 잔량을 채우기 위해, 물 이외에 주사 용수를 사용할 수 있다. 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수일 수 있다.

이하 본 발명의 실시예에 따른 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물의 제조 방법에 대하여 자세히 설명한다.

<제조예>

하기 표 1 내지 4와 같이 주사제를 제조하였다.

성분	#1-1	#1-2	#1-3	#1-4
hyaluronic acid	100 중량부	100 중량부	100 중량부	100 중량부
PDRN	75 중량부	75 중량부	75 중량부	75 중량부
vitamin C	-	3 중량부	-	3 중량부
vitamin B12	-	-	3 중량부	3 중량부
생리 식염수	700 중량부	700 중량부	700 중량부	700 중량부
총 용량	2 cc	2 cc	2 cc	2 cc

성분	#2-1	#2-2	#2-3	#2-4
hyaluronic acid	100 중량부	100 중량부	100 중량부	100 중량부
PDRN	25 중량부	50 중량부	100 중량부	150 중량부
vitamin C	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부
vitamin B12	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부
생리 식염수	700 중량부	700 중량부	700 중량부	700 중량부
총 용량	2 cc	2 cc	2 cc	2 cc

성분	#3-1	#3-2	#3-3	#3-4	#3-5
hyaluronic acid	100 중량부	100 중량부	100 중량부	100 중량부	100 중량부
PDRN	75 중량부	75 중량부	75 중량부	75 중량부	75 중량부
vitamin C	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부
vitamin B12	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부
생리 식염수	700 중량부	700 중량부	700 중량부	700 중량부	700 중량부
L-라이신	3 중량부	3 중량부	3 중량부	-	3 중량부
L-글리신	3 중량부	3 중량부	3 중량부	-	3 중량부
L-프롤린	-	5 중량부	-	5 중량부	5 중량부
L-알라닌	-	-	2 중량부	2 중량부	2 중량부
L-세린	-	-	1.5 중량부	1.5 중량부	1.5 중량부
총 용량	2 cc	2 cc	2 cc	2 cc	2 cc

성분	#4-1	#4-2	#4-3	#4-4	#4-5
hyaluronic acid	100 중량부	100 중량부	100 중량부	100 중량부	100 중량부
PDRN	75 중량부	75 중량부	75 중량부	75 중량부	75 중량부
vitamin C	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부
vitamin B12	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부
생리 식염수	700 중량부	700 중량부	700 중량부	700 중량부	700 중량부
L-라이신	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부
L-글리신	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부	3 중량부
L-프롤린	5 중량부	5 중량부	5 중량부	5 중량부	5 중량부
L-알라닌	2 중량부	2 중량부	2 중량부	2 중량부	2 중량부
L-세린	1.5 중량부	1.5 중량부	1.5 중량부	1.5 중량부	1.5 중량부
펩타이드 VHHA	25 중량부	-	-	25 중량부	25 중량부
EGF	-	5 중량부	-	5 중량부	5 중량부
FGF	-	-	2.5 중량부	-	2.5 중량부
총 용량	2 cc	2 cc	2 cc	2 cc	2 cc

히알루론산(sigma, USA), PDRN(B&P KOREA, 한국), 비타민 C(대우제약), 비타민 B12(대우제약), L-라이신(sigma, USA), L-글리신(sigma, USA), L-프롤린(sigma, USA), L-알라닌(sigma, USA), L-세린(sigma, USA), EGF(thermofisher, USA) 및 FGF(thermofisher, USA)을 각 구매처에서 구입하였다. 펩타이드 VHHA는 펩트론(peptron)에 의뢰하여 제조하여 준비하였다. 그 후, 상기 표 1 내지 4에 제시된 함량대로 각각 고르게 혼합하고, 이를 생리 식염수에 용해하여 주사제 용액 조성물을 제조하였다.

<비교예>

하기 표 5와 같이 비교예를 제조하였다.

성분	비1	비2
hyaluronic acid	100 중량부	-
PDRN	-	75 중량부
생리 식염수	700 중량부	700 중량부
총 용량	2 cc	2 cc

히알루론산(sigma, USA) 및 PDRN(B&P KOREA, 한국)을 각 구매처에서 구입하여, 상기 표 5에 제시된 함량대로 각각 고르게 혼합하고, 이를 생리 식염수에 용해하여 주사제 용액 조성물을 제조하였다.

<실험예 1> in vitro 콜라겐 합성 효과 검증

인체 정상 섬유아세포(한국세포주은행)를 96-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 2 × 10⁴ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.　이어, 상기 제조한 주사제 10cc가 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 주사제가 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 48시간 동안 추가로 배양하였다.　배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 프로콜라겐 (Procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 키트 (Takara, 일본)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다.　PICP 양은 ng/2×10⁴ 세포로 환산하였으며, 그 결과는 하기 표 6에 나타나 있다.

구분	콜라겐 합성량	구분	콜라겐 합성량	구분	콜라겐 합성량	구분	콜라겐 합성량
대조군	102	비1	110	#3-1	165	#4-1	201
#1-1	141	#2-1	139	#3-2	166	#4-2	180
#1-2	143	#2-2	140	#3-3	171	#4-3	182
#1-3	149	#2-3	155	#3-4	170	#4-4	211
#1-4	150	#2-4	160	#3-5	175	#4-5	213

상기 표 6에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 주사제의 PDRN 농도가 증가함에 따라, 비타민 C 또는/및 B12를 포함함에 따라, 아미노산을 포함함에 따라 콜라겐의 합성이 증가함을 알 수 있다. 특히, 펩타이드 VHHA를 포함하는 경우, 포함하지 않은 경우보다 콜라겐 합성량이 20 ng/2 ×10⁴ 이상 증가한 것으로 볼 때, 히알루론산과 PDRN처럼 중요한 콜라겐 합성 증진 요소임을 확인할 수 있었다. 이에 본 발명의 주사제 조성물이 탁월한 콜라겐 합성 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.

<실험예 2-1> 마우스 모델을 통한 안전성 평가

상기 실시예 1에서 긍정적인 효과를 보인 제조예 1-4, 3-5, 4-1 또는 4-5 주사제 약물을 0.1mL씩 스프라그 돌리의 4주령 수컷(체중: 170~200g)의 뒷발 왼쪽 발바닥에 주사하였다. 약물 주사한 후, 1 시간 후 발바닥의 두께를 캘리퍼로 측정하였으며, 측정자는 실험의 순서나 목적을 모르는 상태(맹검 시험)로 시행했다.

두께 측정 결과 아래 표 7과 같다.

구분	0h	1h	음성 대조군	구분	0h	1h	음성 대조군
제조예 #1-4	0.213	0.216	0.215	제조예 #3-5	0.311	0.311	0.319
제조예 #4-1	0.245	0.255	0.244	제조예 #4-5	0.334	0.332	0.330

상기 표 7에 보이는 바와 같이, 뒷발 두께가 음성 대조군과 동일하거나, 눈에 띄는 부종이 관찰되지 않았다.

<실험예 2-2> 광노화 마우스 모델을 통한 주름 감소 효과 검증

실험동물은 4주령의 SKH-1hairless마우스(Charles-River,Japan)를 분양 받아 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 실험 전 기간 동안 사료와 물은 자유롭게 공급하였다. 마우스를 자외선 조사용 cage에 가둔 후 등 부위에 균등하게 120 mJ/cm²의 광량으로 격일 간격으로 1주일에 3회, 4 주 동안 조사하였다. 피부 거침과 주름형성을 촉진하기 위하여 Sq-OOH를 1일 2회, 주 6일, 4주 동안 매회 100㎕씩 도포하였다.

그 후 0시간, 24시간 뒤에 제조예 1-4, 3-5, 4-1 또는 4-5 주사제를 등 부위에 0.2 mL씩 피하주사 하였다. 약물주입을 완료한지 5일 후에, 마우스를 희생시켰다.

희생된 마우스에 피하주사를 한 부위를 육안으로 살펴보았다. 그 결과 육안으로 보기에 부분 함몰, 괴사 또는 종괴가 보이지 않았고, 만져봤을 때에도 딱딱하지 않았다.

희생된 마우스의 피부를 절개하고 신속하게 피부조직을 적출하여 10% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 담가 고정하였다. 고정한 다음 수세와 탈수과정을 거친 후 파라핀(paraffin) 용액으로 처리하여 파라핀 블락(paraffin block)을 만들고 4μm두께로 박절하여 헤마토시린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색한 뒤 광학현미경으로 관찰하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 식염수만을 주사한 음성 대조군에서는 자외선 조사로 인해 노화된 피부가 관찰되었다. 반면, 제조예 4-5 주사제 투여군의 피부조직의 경우 자외선 조사 전의 피부와 유사하게 상당부분 주름 감소 효과가 확인되었다. 도면으로 제시하지는 않았으나, 1-4, 3-5, 4-1 주사제에서도 모두 4-5 주사제와 유사하거나 조금 적게 주름 감소 효과가 관찰하였다. 염증 반응은 모든 실험군에서 관찰되지 않았다.

<실험예 3> 지방분해 효과 임상 검증

상기 제조예에서 제조된 제조예 4-5, 비교예 1을 각각 주사제를 팔자주름 부위에 2주 간격으로 2회 투약하였으며, 2회차 투여 후 2주 후 사진촬영하였다. 주사방법은 팔자주름 부위에 0.2cm마다 0.1 cc씩 좌우 각각 20 포인트에 주사하였다. 치료대상은 40대 성인 여성을 대상으로 하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 눈에 띄는 팔자주름 감소 효과를 확인할 수 있었다.

본 발명의 지방제거용 주사제 조성물에 포함된 각각의 유효성분들 간의 바람직한 함량비를 통해 시너지 효과가 부여되어 현저한 콜라겐 합성 및 주름 제거 효과를 기대할 수 있을 것으로 예상된다.

<실험예 4> 조성물의 저장 안정성 실험

상기 제조예 및 비교예를 40℃ 가혹 조건에서 각각 24시간, 48시간 방치 후, 그 탁도를 분광 광도계로 350nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 8 또는 도 3과 같다.

구분	24시간	48시간	구분	24시간	48시간
1-1	0.1651	0.1922	2-1	0.1003	0.1065
1-2	0.1489	0.1836	2-2	0.1022	0.1066
1-3	0.1336	0.1536	2-3	0.1543	0.1833
1-4	0.1434	0.1633	2-4	0.1201	0.1379
3-1	0.0958	0.1101	4-1	0.0615	0.0652
3-2	0.0845	0.0913	4-2	0.0501	0.0568
3-3	0.0523	0.0753	4-3	0.0409	0.0429
3-4	0.0574	0.0653	4-4	0.0421	0.0511
3-5	0.0410	0.0559	4-5	0.0351	0.0505
비1	0.2046	0.2244	비2	0.2086	0.2248

상기 표 8 및 도 3에 보이는 바와 같이 비교예 1 또는 2 보다, 실시예가 월등히 더 낮은 탁도를 보이고 있었다. 비타민, 아미노산 등의 추가 구성 물질을 다양하게 포함하는 경우 제형 안정성이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 프롤린을 포함하는 3-2, 3-4, 3-5, 4-1, 4-1, 4-2, 4-3, 4-4 및 4-5의 탁도는 0.0913 이하의 흡광도를 보였다.

이는, 본 발명의 조성물에 포함된 유효성분들이 바람직한 함량으로 혼합됨으로써 화학적 안정성을 가지고, 우수한 저장 안정성을 보임을 알 수 있었다.

<실험예 5> 조성물의 점도 측정 실험

상기 제조예 및 비교예를 40℃ 가혹 조건에서 각각 24시간, 48시간 방치 후, 그 점도를 점도 측정기로 측정하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.

구분	점도(cp)	구분	점도(cp)
제조예 #3-1	10.5	제조예 #4-1	ㄷ
제조예 #3-2	3.1	제조예 #4-2	2.5
제조예 #3-3	9.9	제조예 #4-3	2.6
제조예 #3-4	3.0	제조예 #4-4	2.6
제조예 #3-5	2.9	제조예 #4-5	2.5

가혹 조건에서 점도가 프롤린을 포함한 제형에서 3.1cp 이하의 점도로 점도가 낮게 유지됨을 알 수 있었다. 점도가 높을수록 주사를 맞는이로 하여금 고통스러울 수 있는데, 본 발명의 제형 조성은 점도가 낮으면서도 우수한 콜라겐 합성 및 주름 제거 효과가 있는 주사제 조성물을 제공하여 보다 효과적이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(a) 히알루론산(HA; Hyaluronic acid), 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide), 비타민 C, 비타민 B12 및 식염수;
(b) L-라이신, L-글리신, L-프롤린, L-알라닌 및 L-세린으로 이루어지는 아미노산; 및
(c) 펩타이드 VHHA, 상피세포 성장인자 EGF 및 섬유아세포 성장인자 FGF;를 포함하며,
히알루론산 100 중량부를 기준으로, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 50 내지 100 중량부, 비타민 C 0.1 내지 10 중량부, 비타민 B12 0.1 내지 10 중량부, 식염수 500 내지 1000 중량부, L-라이신 0.1 내지 5 중량부, L-글리신 0.1 내지 5 중량부, L-프롤린 0.1 내지 8 중량부, L-알라닌 0.1 내지 4 중량부, L-세린 0.1 내지 3 중량부, 펩타이드 VHHA 1 내지 50 중량부, 상피세포 성장인자 EGF 0.1 내지 10 중량부 및 섬유아세포 성장인자 FGF 0.1 내지 5 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 주사제 조성물은 1회 주사 용량이 0.1 내지 3.0 cc로 투여되는 것을 특징으로 하는 피부 주름 및 탄력 개선용 주사제 조성물.