KR102321320B1 - 항-보체 인자 ｃ１ｑ 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-C1q 항체 및 이의 사용방법을 제공한다.

Description

항-보체 인자 Ｃ１Ｑ 항체 및 이의 용도 {ANTI-COMPLEMENT FACTOR Ｃ１Ｑ ANTIBODIES AND USES THEREOF}
관련 출원에의 상호참조
본원은 각각의 전문이 본원에 참조로 도입된, 2013년 7월 9일자로 출원된 미국 가특허원 제61/844,369호 및 2013년 8월 29일자로 출원된 미국 가특허원 제61/871,813호를 우선권으로 주장한다.
서열 리스트의 ASCII 텍스트 파일로의 제출
다음의 ASCII 텍스트 파일로 제출된 내용은 전문이 본원에 참조로 도입된다: 서열 리스트의 컴퓨터 판독가능 형태(CRF)(전체 명칭: 717192000640SeqList.txt, 기록일: 2014년 7월 9일, 크기: 21KB).
배경
1. 분야
본원은 항-C1q 항체 및 이의 사용방법에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
과도한 보체 활성화(complement activation)는 다수의 염증성 및 자가면역 질환을 포함한 다양한 질환 상태와 관련되어 왔다. 보다 최근에는, 보체 시스템이 또한 신경퇴행성 질환 병리학에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, C1q와 같은 보체 인자는 신경 시냅스에서 발현되고 제거를 위해 이러한 시냅스를 표시하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 미국 특허공보 제2012/0195880호 및 제2012/328601호 참조). 선택적 시냅스 소실이 정상 뇌 발달("시냅스 가지치기(synaptic pruning)")의 필수 측면인 반면, 특히 성숙 또는 노화 뇌에서의 과도한 시냅스 소실은 신경퇴행성 및 인지 저하를 야기한다. 상승된 시냅스 보체 발현은 정상 노화 및 신경퇴행성 질환 진행에서의 시냅스 소실에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 반대로, 신경 보체 발현의 저하는 신경보호작용인 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견을 기초로, C1q와 같은 보체 인자의 활성의 중화가 시냅스 소실을 방지하고 신경퇴행성 질환의 진행 뿐만 아니라 정상 노화에서의 인지 저하를 느리게 하는 유망한 치료 전략으로서 간주된다.
시냅스 소실과 관련되고 C1q와 같은 보체 인자의 중화를 겨냥한 치료에 순응할 것으로 간주되는 신경퇴행성 질환은 알쯔하이머병, 근위축측삭경화증, 다발성 경화증, 녹내장, 근긴장성 이영양증, 다운증후군, 파킨슨병, 헌팅톤병 등을 포함한다.
제한된 수의 보체 중화 항체만이 지금까지 공지되어 있다(예를 들어, Klos A. et al., Mol Immunol. 2009, 46(14), 2753-2766; Carroll S. & Georgiou G., Immunobiology 2013, 218(8), 1041-1048; Tuzun et al., J. Neuroimmunol. 2007, 182, 167-176; Nelson et al., J. Clin. Invest. 2006, 116:2892-2900; Heinz et al., J. Immunol. 1984, 133, 400-404; Jiang et al., J. Immunol. 1991, 146, 2324-2330; Trinder et al., Scand. J. Immunol. 1999, 50, 635-641; Hwang et al., Mol. Immunol. 2008, 45, 2570-2580 참조). 말단 보체 활성화 경로의 억제제인 C5 중화 항체 에쿨리주맙(Eculizumab) 만이 지금까지 규제 승인을 받았고, 에쿨리주맙은 발작성 야간 혈색소뇨증의 치료를 위해 시판중이다(PNH; Hillmen et al., N Engl J Med. 2006, 355(12):1233-43).
따라서, C1q와 같은 보체 인자에 특이적으로 결합되고 이의 생물학적 활성을 중화시키는 추가의 항체를 개발할 필요성이 있다.
특허원 및 공보를 포함한 본원에 언급된 모든 참조문헌들은 그 전문이 참조로 본원에 도입된다.
간단한 개요
본원은 항-C1q 항체 및 항-C1q 항체의 사용방법을 제공한다.
특정 측면에서, 본원은 경쇄 가변 도메인(light chain variable domain)과 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain)을 포함하는 분리된 항-C1q 항체를 제공하는데, 여기서 상기 경쇄 가변 도메인은 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 수탁된 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손(progeny)에 의해 생산된 단일클론 항체 M1의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고/하거나, 상기 중쇄 가변 도메인은 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 수탁된 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손에 의해 생산된 단일클론 항체 M1의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함한다.
특정 측면에서, 본원은 C1q 단백질에 특이적으로 결합되는 분리된 항체를 제공하는데, 여기서 상기 항체는 서열번호(SEQUENCE ID NO) 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 HVR을 포함하고/하거나, 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 HVR을 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하고/하거나, 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 4와 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 8과 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 본원은 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 수탁된 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손에 의해 생산된 분리된 생쥐(murine) 항-사람 C1q 단일클론 항체 M1을 제공한다.
상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q 둘 다에 특이적으로 결합된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 래트 C1q에 특이적으로 결합된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q, 마우스 C1q 및 래트 C1q에 특이적으로 결합된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 30nM 미만에서 약 100pM 미만의 범위이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 30nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 20nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 10nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 5nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 1nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 100pM 미만 또는 약 100pM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 C1q에 특이적으로 결합되고 C1q의 생물학적 활성을 중화시킨다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 생물학적 활성은 (1) 자가항체에 대한 C1q 결합, (2) C1r에 대한 C1q 결합, (3) C1s에 대한 C1q 결합, (4) 포스파티딜세린에 대한 C1q 결합, (5) 펜트락신-3에 대한 C1q 결합, (6) C-반응성 단백질(CRP)에 대한 C1q 결합, (7) 구형(globular) C1q 수용체(gC1qR)에 대한 C1q 결합, (8) 보체 수용체 1(CR1)에 대한 C1q 결합, (9) 베타-아밀로이드에 대한 C1q 결합, 또는 (10) 칼레티쿨린(calreticulin)에 대한 C1q 결합이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 생물학적 활성은 (1) 고전적인 보체 활성화 경로의 활성화, (2) 항체 및 보체 의존적 세포독성의 활성화, (3) CH50 용혈(hemolysis), (4) 시냅스 소실(synapse loss), (5) B-세포 항체 생산, (6) 수지상 세포(dentritic cell) 성숙, (7) T-세포 증식, (8) 사이토카인 생산, (9) 미세아교세포 활성화, (10) 아르투스(Arthus) 반응, (11) 시냅스 또는 신경종말의 포식작용, 또는 (12) 보체 수용체 3(CR3)/C3 발현 세포의 활성화이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, CH50 용혈은 사람, 마우스 및/또는 래트 CH50 용혈을 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 CH50 용혈의 50% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상을 중화시킬 수 있다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 200ng/ml 미만, 100ng/ml 미만, 50ng/ml 미만 또는 20ng/ml 미만의 용량으로 CH50 용혈의 50% 이상을 중화시킬 수 있다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 생쥐 항체이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 인간화(humanized) 항체 또는 키메라(chimeric) 항체이다.
특정 측면에서, 본원은 필수적으로 ATCC 수탁번호 PTA-120399의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체 M1과 동일한 C1q 에피토프에 결합하는 분리된 항-C1q 항체 또는 이의 항-C1q 결합 단편(fragment)을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 4와 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 8과 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본원은 C1q 단백질에 결합되고, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기 내의 상기 C1q 단백질의 아미노산 중 하나 이상에 결합되는 분리된 항-C1q 항체를 제공한다: i. 서열번호 1의 아미노산 잔기 196-226(서열번호 16), 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 196-226(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHI)(서열번호 16)에 상응하는 C1q 단백질 쇄 A(C1qA)의 아미노산 잔기; ii. 서열번호 1의 아미노산 잔기 196-221(서열번호 17), 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 196-221(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(서열번호 17)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; iii. 서열번호 1의 아미노산 잔기 202-221(서열번호 18), 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 202-221(SGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(서열번호 18)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; iv. 서열번호 1의 아미노산 잔기 202-219(서열번호 19), 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 202-219(SGGMVLQLQQGDQVWVEK)(서열번호 19)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; 및 v. 서열번호 1의 아미노산 잔기 Lys 219 및/또는 Ser 202, 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 Lys 219 및/또는 Ser 202에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기 내의 상기 C1q 단백질의 아미노산 중 하나 이상에 추가로 결합된다: (a) 서열번호 3의 아미노산 잔기 218-240(서열번호 20), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 218-240(WLAVNDYYDMVGI QGSDSVFSGF)(서열번호 20)에 상응하는 C1q 단백질 쇄 C(C1qC)의 아미노산 잔기; (b) 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-240(서열번호 21), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-240(YDMVGI QGSDSVFSGF)(서열번호 21)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (c) 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-232(서열번호 22), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-232(YDMVGIQG)(서열번호 22)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (d) 서열번호 3의 아미노산 잔기 Tyr 225, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 Tyr 225에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (e) 서열번호 3의 아미노산 잔기 174-196(서열번호 23), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(서열번호 23)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (f) 서열번호 3의 아미노산 잔기 184-192(서열번호 24), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 184-192(RSGVKVVTF)(서열번호 24)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (g) 서열번호 3의 아미노산 잔기 185-187, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 185-187(SGV)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; 및 (h) 서열번호 3의 아미노산 잔기 Ser 185, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 Ser 185에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 인간화 항체, 키메라 항체 또는 사람 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 1에 나타낸 사람 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219 및 Ser 202, 또는 서열번호 1에 나타낸 Lys 219 및 Ser 202에 상응하는 사람 C1qA의 아미노산 잔기, 및 서열번호 3에 나타낸 사람 C1qC의 아미노산 잔기 Tyr 225, 또는 서열번호 3에 나타낸 Tyr 225에 상응하는 사람 C1qC의 아미노산 잔기에 결합된다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 1에 나타낸 사람 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219, 또는 서열번호 1에 나타낸 Lys 219에 상응하는 사람 C1qA의 아미노산 잔기, 및 서열번호 3에 나타낸 사람 C1qC의 아미노산 잔기 Ser 185, 또는 서열번호 3에 나타낸 Ser 185에 상응하는 사람 C1qC의 아미노산 잔기에 결합된다.
특정 측면에서, 본원은 C1q 단백질에 결합되고 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기 내의 상기 C1q 단백질의 아미노산 중 하나 이상에 결합되는 분리된 항-C1q 항체를 제공한다: (a) 서열번호 3의 아미노산 잔기 218-240(서열번호 20), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 218-240(WLAVNDYYDMVGI QGSDSVFSGF)(서열번호 20)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (b) 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-240(서열번호 21), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-240(YDMVGI QGSDSVFSGF)(서열번호 21)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (c) 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-232(서열번호 22), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-232(YDMVGIQG)(서열번호 22)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (d) 서열번호 3의 아미노산 잔기 Tyr 225, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 Tyr 225에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (e) 서열번호 3의 아미노산 잔기 174-196(서열번호 23), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(서열번호 23)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (f) 서열번호 3의 아미노산 잔기 184-192(서열번호 24), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 184-192(RSGVKVVTF)(서열번호 24)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (g) 서열번호 3의 아미노산 잔기 185-187, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 185-187(SGV)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; 및 (h) 서열번호 3의 아미노산 잔기 Ser 185, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 Ser 185에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 인간화 항체, 키메라 항체 또는 사람 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 1에 나타낸 사람 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219 및 Ser 202, 또는 서열번호 1에 나타낸 Lys 219 및 Ser 202에 상응하는 사람 C1qA의 아미노산 잔기, 및 서열번호 3에 나타낸 사람 C1qC의 아미노산 잔기 Tyr 225, 또는 서열번호 3에 나타낸 Tyr 225에 상응하는 사람 C1qC의 아미노산 잔기에 결합된다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 1에 나타낸 사람 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219, 또는 서열번호 1에 나타낸 Lys 219에 상응하는 사람 C1qA의 아미노산 잔기, 및 서열번호 3에 나타낸 사람 C1qC의 아미노산 잔기 Ser 185, 또는 서열번호 3에 나타낸 Ser 185에 상응하는 사람 C1qC의 아미노산 잔기에 결합된다.
상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 인간화 항체, 키메라 항체 또는 사람 항체이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q 둘 다에 특이적으로 결합된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 래트 C1q에 특이적으로 결합된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q, 마우스 C1q 및 래트 C1q에 특이적으로 결합된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 30nM 미만에서 약 100pM 미만의 범위이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 30nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 20nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 10nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 5nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 약 1nM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 사람 C1q와 마우스 C1q에 대한 해리상수(KD)가 100pM 미만 또는 약 100pM 미만이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 C1q에 특이적으로 결합되고 C1q의 생물학적 활성을 중화시킨다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 생물학적 활성은 (1) 자가항체에 대한 C1q 결합, (2) C1r에 대한 C1q 결합, (3) C1s에 대한 C1q 결합, (4) 포스파티딜세린에 대한 C1q 결합, (5) 펜트락신-3에 대한 C1q 결합, (6) C-반응성 단백질(CRP)에 대한 C1q 결합, (7) 구형 C1q 수용체(gC1qR)에 대한 C1q 결합, (8) 보체 수용체 1(CR1)에 대한 C1q 결합, (9) 베타-아밀로이드에 대한 C1q 결합, 또는 (10) 칼레티쿨린에 대한 C1q 결합이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 생물학적 활성은 (1) 전형적 보체 활성화 경로의 활성화, (2) 항체 및 보체 의존적 세포독성의 활성화, (3) CH50 용혈, (4) 시냅스 소실, (5) B-세포 항체 생산, (6) 수지상 세포 성숙, (7) T-세포 증식, (8) 사이토카인 생산, (9) 미세아교세포 활성화, (10) 아르투스 반응, (11) 시냅스 또는 신경종말의 포식작용, 또는 (12) 보체 수용체 3(CR3)/C3 발현 세포의 활성화이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, CH50 용혈은 사람, 마우스 및/또는 래트 CH50 용혈을 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 CH50 용혈의 50% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상을 중화시킬 수 있다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 200ng/ml 미만, 100ng/ml 미만, 50ng/ml 미만 또는 20ng/ml 미만의 용량으로 CH50 용혈의 50% 이상을 중화시킬 수 있다.
상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 이중특이(bispecific) 항체이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 뇌 투과를 증가시키도록 만들어졌다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 제1 항원 및 제2 항원을 인지하는 이중특이 항체이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 제1 항원은 C1q 단백질이고 상기 제2 항원은 혈액-뇌-장벽을 통과하는 수송을 용이하게 하는 항원이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 제2 항원은 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGFR), 저밀도 지단백질 수용체 관련된 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), 디프테리아 독소 수용체, CRM197, 라마 단일 도메인 항체, TMEM 30(A), 단백질 도입 도메인, TAT, Syn-B, 페너트라틴(penetratin), 폴리-아르기닌 펩타이드, 안지오펩(angiopep) 펩타이드 및 ANG1005로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 IgG 급(class)의 항체이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입(isotype)을 갖는다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 항체 단편이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 Fab, F(ab')2 또는 Fab' 단편이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체 단편은 C1q에 특이적으로 결합되고 C1q의 생물학적 활성을 중화시킨다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체 단편은 이의 상응하는 전장(full-length) 항체에 비해 뇌 투과가 더 우수하다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체 단편은 이의 상응하는 전장 항체에 비해 반감기가 더 짧다.
특정 측면에서, 본원은 본원에 기재된 항체를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특정 측면에서, 본원은 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특정 측면에서, 본원은 본원에 기재된 핵산 서열을 포함하는 분리된 숙주 세포를 제공한다. 특정 측면에서, 본원은 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 수탁된 하이브리도마 세포 또는 이의 자손을 제공한다. 특정 측면에서, 본원은 본원에 기재된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 측면에서, 본원은 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
특정 측면에서, 본원은 본원에 기재된 항체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 개체에서의 보체 활성화와 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본원은 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 개체에서의 보체 활성화와 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 치료가 필요한 개체에서의 보체 활성화와 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 치료가 필요한 개체에서의 보체 활성화와 관련된 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체의 용도를 제공한다.
상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 보체 활성화와 관련된 질환은 신경퇴행성 장애이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 시냅스 소실 또는 신경 연결 소실과 관련된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 보체 수용체 3(CR3)/C3 또는 보체 수용체 CR1에 의존적인 시냅스 소실과 관련된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 병리학적 활성-의존적 시냅스 가지치기와 관련된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 미세아교세포에 의한 시냅스 포식작용과 관련된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병, 근위축측삭경화증, 다발성 경화증, 녹내장, 근긴장성 이영양증, 다운증후군, 파킨슨병 또는 헌팅톤병이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 보체 활성화와 관련된 질환은 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 대사 장애이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 대사 장애는 당뇨병, 비만, 류마티스성 관절염(RA), 급성 호흡곤란증후군(ARDS), 허혈 및 재관류 후 원격 조직 손상, 심폐우회술 동안의 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 루푸스신염 및 이로 인한 사구체신염과 혈관염, 심폐우회술, 심장마비-유도된 심장 내피 부전, 타입 II 막증식 사구체신염, IgA 신장병, 급성 신부전, 저온글로불린증, 항인지질증후군, 황반변성질환, 연령 관련 황반변성(AMD), 맥락막혈관신생(CNV), 포도막염, 당뇨망막병증, 허혈 관련 망막병증, 안구내염, 안구내 혈관신생질환, 당뇨황반부종, 병리학적 근시, 폰히펠-린다우병(von Hippel-Lindau disease), 눈의 히스토플라스마증, 시신경 척수염(NMO), 망막중심정맥폐쇄(CRVO), 각막혈관신생, 망막혈관신생, 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 천식 또는 흡인폐렴이다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 보체 활성화와 관련된 질환은 중증근육무력증, 당뇨병 타입 1, 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 애디슨병(Addision's disease), 셀리악병(coeliac disease), 크론병, 악성빈혈, 심상성 천포창(Pemphigus vulgaris), 백반증, 자가면역 용혈빈혈, 부종양증후군, 혈관염, 류마티스성 다발성근육통, 관자동맥염(temporal arteritis) 및 베게너 육아종(Wegener's granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자가면역 질환이다.
특정 측면에서, 본원은 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체와, 상기 항체를 치료가 필요한 개체에 있어 보체 활성화와 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용하다는 지시를 포함하는 피키지 인서트(package insert)를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 보체 활성화와 관련된 질환은 신경퇴행성 장애이다. 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 시냅스 소실 또는 신경 연결 소실과 관련된다. 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 보체 수용체 3(CR3)/C3 또는 보체 수용체 CR1에 의존적인 시냅스 소실과 관련된다. 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 병리학적 활성-의존적 시냅스 가지치기와 관련된다. 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 미세아교세포에 의한 시냅스 포식작용과 관련된다. 특정 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병, 근위축측삭경화증, 다발성 경화증, 녹내장, 근긴장성 이영양증, 다운증후군, 파킨슨병 및 헌팅톤병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 보체 활성화와 관련된 질환은 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 대사 장애이다. 특정 실시양태에서, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 대사 장애는 당뇨병, 비만, 류마티스성 관절염(RA), 급성 호흡곤란증후군(ARDS), 허혈 및 재관류 후 원격 조직 손상, 심폐우회술 동안의 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 루푸스신염 및 이로 인한 사구체신염과 혈관염, 심폐우회술, 심장마비-유도된 심장 내피 부전, 타입 II 막증식 사구체신염, IgA 신장병, 급성 신부전, 저온글로불린증, 항인지질증후군, 황반변성질환, 연령 관련 황반변성(AMD), 맥락막혈관신생(CNV), 포도막염, 당뇨망막병증, 허혈 관련 망막병증, 안구내염, 안구내 혈관신생질환, 당뇨황반부종, 병리학적 근시, 폰히펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 시신경 척수염(NMO), 망막중심정맥폐쇄(CRVO), 각막혈관신생, 망막혈관신생, 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 천식 및 흡인폐렴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 보체 활성화와 관련된 질환은 중증근육무력증, 당뇨병 타입 1, 하시모토 갑상선염, 애디슨병, 셀리악병, 크론병, 악성빈혈, 심상성 천포창, 백반증, 자가면역 용혈빈혈, 부종양증후군, 혈관염, 류마티스성 다발성근육통, 관자동맥염 및 베게너 육아종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자가면역 질환이다.
특정 측면에서, 본원은 본원에 기재된 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 특정 측면에서, 본원은 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 진단용 또는 치료용 키트가 본원에 기재된 대로 사용된다.
특정 측면에서, 본원은 a) 본원에 기재된 항체를 개체에게 투여하고; b) 시냅스에 결합된 항체를 탐지함으로써 상기 개체에서의 시냅스를 탐지함을 포함하는, 신경퇴행성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는 개체에서의 시냅스의 탐지방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 a) 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체를 개체에게 투여하고; b) 시냅스에 결합된 항체를 탐지함으로써 상기 개체에서의 시냅스를 탐지함을 포함하는, 개체에서의 시냅스의 탐지방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 개체에서의 시냅스를 탐지하는데 사용하기 위한 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 개체에서의 시냅스를 탐지하는데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체의 용도를 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 시냅스에 결합된 항체를 양전자방출단층촬영(PET), X-선 컴퓨터 단층촬영, 단일광자방출단층촬영(SPECT), 컴퓨터 단층촬영(CT) 및 컴퓨터 축 단층촬영(CAT)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 영상 기술을 사용하여 탐지한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 시냅스에 결합된 항체의 탐지는 개체에서의 시냅스의 수의 정량적 척도를 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 개체는 신경퇴행성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 개체에서의 시냅스의 수는 일정 기간에 걸쳐 반복적으로 측정되고 시간이 지남에 따라 상기 개체에서의 시냅스의 소실이 탐지된다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 시간이 지남에 따른 시냅스의 소실은 신경퇴행성 질환 또는 자가면역 질환에 대한 치료 효능의 척도이다.
특정 측면에서, 본원은 a) 본원에 기재된 항체를 생물학적 샘플과 접촉시키고; b) 시냅스에 결합된 항체를 탐지함으로써 상기 생물학적 샘플에서의 시냅스를 탐지함을 포함하는, 생물학적 샘플에서의 시냅스의 탐지방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본원은 a) 본원에 기재된 항체를 생물학적 샘플과 접촉시키고; b) 시냅스에 결합된 항체를 탐지함으로써 상기 생물학적 샘플에서의 시냅스를 탐지함을 포함하는, 생물학적 샘플에서의 시냅스의 탐지방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 a) 상기 실시양태 중 임의의 항-C1q 항체를 생물학적 샘플과 접촉시키고; b) 시냅스에 결합된 항체를 탐지함으로써 상기 생물학적 샘플에서의 시냅스를 탐지함을 포함하는, 생물학적 샘플에서의 시냅스의 탐지방법을 제공한다.
상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 방법은 단계 a)전에 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 생물학적 샘플은 생검 시료, 조직 또는 세포를 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 상기 항체는 면역형광 현미경검사, 면역세포화학, 면역조직화학, ELISA, FACS 분석 또는 면역침전반응에 의해 탐지된다.
본원에 기재된 다양한 실시양태의 특성 중 하나, 몇몇 또는 전부가 조합되어 본원에 제공된 조성물 및 방법의 다른 실시양태를 형성할 수 있다. 본원에 제공된 조성물 및 방법의 이러한 측면 및 다른 측면은 당해 분야의 숙련가에게는 명백할 것이다.
도 1은 사람 C1q에 특이적으로 결합되는 항체에 대한 ELISA 스크린의 결과를 도시한 것이다. 항-C1q 항체 1C7, 2A1, 3A2 또는 5A3을 각각 함유하는 하이브리도마 상청액을 시험하였다. 왼쪽 컬럼(회색)은 사람 C1q 단백질로의 항-C1q 항체 결합에 대한 신호를 나타내고, 오른쪽 컬럼(검정색)은 사람 트랜스페린(HT)으로의 항-C1q 항체 결합에 대한 신호를 나타낸다.
도 2는 단일 용량 포맷의 사람 CH50 용혈 검정에서의 항-C1q 항체 1C7, 2A1, 3A2 및 5A3의 C1q 중화 활성을 도시한 것이다.
도 3은 단일 용량 포맷의 사람 CH50 용혈 검정에서의 항-C1q 항체 1C7, 3A2 및 4A4B11의 C1q 중화 활성을 도시한 것이다.
도 4는 용량-반응 포맷의 사람, 마우스 및 래트 CH50 용혈 검정에서의 항-C1q 항체 M1 및 4A4B11의 C1q 중화 활성을 도시한 것이다. 도 4A는 사람 CH50 용혈 검정으로부터의 결과를 도시한 것이다. 도 4B는 마우스 CH50 용혈 검정으로부터의 결과를 도시한 것이다. 도 4C는 래트 CH50 용혈 검정으로부터의 결과를 도시한 것이다.
도 5는 C1q 항체 복합체의 질량 분광분석 특징을 도시한 것이다. 도 5A는 ANN-001(4A4B11)과 C1q의 혼합물을 나타낸 것으로, ANN-001 단량체는 ~ 150kDa의 예상 질량을, C1q 단량체는 ~ 460kDa의 예상 질량을, C1q/ANN-001 1:1 복합체는 ~ 600kDa의 예상 질량을 나타낸다. 도 5B는 ANN-005(M1)과 C1q의 혼합물을 나타낸 것으로, ANN-005 단량체는 ~ 150kDa의 예상 질량을, C1q 단량체는 ~ 460kDa의 예상 질량을, C1q/ANN-005 1:1 복합체는 ~ 600kDa의 예상 질량을 나타낸다.
도 6은 단일클론 항체 ANN-005(M1)로의 결합에 대해 무손상 C1q와 경쟁하지 않는 C1q 펩타이드를 도시한 것이다. 도 6A는 등몰 농도로 혼합되고 C1q 펩타이드 혼합물의 부재하에 배양된 C1q 및 ANN-005를 도시한 것이다. 도 6B는 등몰 농도로 혼합되고 C1q의 펩신 소화(pepsin digestion)에 의해 생성된 C1q 펩타이드의 혼합물의 존재하에 배양되고 질량 분광분석에 의해 분석된 C1q 및 ANN-005를 도시한 것이다. 각각의 경우, 비결합된 항체 및 항원 부분(ANN-005 및 C1q)은 단량체들에 대해 예상된 질량(각각 ~ 150kDa 및 ~ 460kDa)에서 확인될 수 있고 1:1 복합체는 ~ 615kDa의 질량에서 존재한다.
일반적 기술
본원에 기재되거나 언급된 기술 및 방법은 당해 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 잘 이해되고 통상적으로 종래 방법을 사용하여 이용되는데, 예를 들면, 다음 문헌들에 기재된 널리 이용되는 방법들이다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
정의
본원에 사용된 용어 "예방"은 개체에서의 특정 질환, 장애 또는 병태의 발생 또는 재발에 대한 예방의 제공을 포함한다. 개체는 특정 질환, 장애 또는 병태의 경향이 있을 수 있거나 걸리기 쉬울 수 있거나 이러한 질환, 장애 또는 병태가 전개될 위험에 있을 수 있으나 아직 그 질환, 장애 또는 병태로 진단받지는 않은 상태이다.
본원에 사용된, 특정 질환, 장애 또는 병태의 "위험이 있는" 개체는 탐지가능한 질환 또는 질환의 증상을 갖거나 갖지 않을 수 있고, 본원에 기재된 치료 방법 이전에 탐지가능한 질환 또는 질환의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. "위험이 있는"은 개체가 당해 분야에 공지된 바와 같은, 특정 질환, 장애 또는 병태의 전개와 관련된 측정가능한 매개변수인 하나 이상의 위험 요인을 갖고 있음을 나타낸다. 이러한 하나 이상의 위험 요인을 갖는 개체는 이러한 하나 이상의 위험 요인을 갖지 않는 개체에 비해 특정 질환, 장애 또는 병태가 전개될 가능성이 더 높다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 임상 병리 과정 동안 치료되는 개체의 자연적 과정을 바꾸도록 계획된 임상적 중재를 지칭한다. 치료의 목적한 효과는 진행의 감속, 병리 상태의 개선 또는 완화, 및 특정 질환, 장애 또는 병태의 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 예를 들어, 특정 질환, 장애 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 없어지면 개체는 성공적으로 "치료된" 것이다.
"유효량"은 필요한 기간 동안 투여량으로 치료적 또는 예방적 결과를 얻기에 효과적인 양 이상을 말한다. 유효량은 1회 이상의 투여로 제공된다.
"치료학적 유효량"은 특정 질환, 장애 또는 병태의 측정가능한 개선에 영향을 주는데 필요한 최소 농도 이상이다. 본원의 치료학적 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에 있어 목적한 반응을 끌어내기 위한 항-C1q 항체의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 항-C1q 항체의 치료학적으로 유리한 효과가 이의 어떠한 독성 또는 유해 효과도 능가하는 양이다.
"만성" 투여는 연장된 기간 동안 초기 치료학적 효과(활성)가 유지되도록 급성 형태와는 반대로 연속적으로 약제(들)를 투여하는 것을 지칭한다. "간헐적(intermittent)" 투여는 중단없이 연속적으로 수행되는 것은 아닌, 사실상 주기적인 치료를 말한다.
본원에 사용된 다른 화합물 또는 조성물과의 "공동" 투여는 동시 투여 및/또는 다른 시점에서의 투여를 포함한다. 공동 투여는 또한 상이한 투여 빈도 또는 간격으로 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 사용한, 공동-제형으로서의 투여 또는 분리된 조성물로서의 투여도 포함한다.
위험의 치료, 예방 또는 경감을 위한 "개체"는 사람, 가축, 농경용 가축, 및 동물원, 스포츠 및 애완 동물을 포함한 포유동물로 분류되는 임의의 동물, 예를 들어, 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 게르빌루스쥐, 마우스, 흰담비, 래트, 고양이 등을 말한다. 특정 실시양태에서, 상기 개체는 사람이다.
본원에 사용된 "자가항체"는 숙주 항원을 인지하는 임의의 항체를 의미한다.
용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서는 "항체"와 교환적으로 사용된다. 본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 범위로 사용되고, 목적한 생물학적 활성을 나타내는 한, 구체적으로 2개 이상의 무손상 항체로부터 생성된 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이 항체(예를 들어, 이중특이(bispecific) 항체) 및 항체 단편을 커버한다.
기본 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경(L)쇄와 2개의 동일한 중(H)쇄로 이루어진 헤테로테트라머(heterotetrameric) 당단백이다. VH 와 VL 쌍은 함께 단일 항원-결합 위치를 형성한다. 상이한 급의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어, "Basic and Clinical Immunology, 8th Ed., Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6"을 참조한다.
임의의 척추동물로부터의 L쇄는 이들의 불면 도메인(constant domain)의 아미노산 서열을 기초로 카파("κ") 및 람다("λ")로 불리는 2개의 명백히 뚜렷한 타입 중 하나로 정해질 수 있다. 이들의 중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린이 상이한 급 또는 아이소타입으로 정해질 수 있다. 면역글로불린에는 각각 알파("α"), 델타("δ"), 엡실론("ε"), 감마("γ") 및 뮤("μ")로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 급이 있다. γ 및 α 급은 추가로 CH 서열 및 기능의 비교적 소수의 상이점을 기초로 아급(아이소타입)으로 나뉘는데, 예를 들어, 사람은 다음 아급을 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2. 면역글로불린의 상이한 급의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 널리 공지되어 있고, 일반적으로, 예를 들어, "Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders Co., 2000)"에 기재되어 있다.
"네이티브(native) 항체"는 보통 2개의 동일한 경(L)쇄와 2개의 동일한 중(H)쇄로 이루어진 150,000달톤의 헤테로테트라머 당단백이다. 각각의 경쇄는 하나의 다이설파이드 공유결합에 의해 하나의 중쇄에 연결되어 있는 반면, 다이설파이드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄들 중에서 변한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 다이설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)을 갖고 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL)을 갖고 다른 말단에 불변 도메인을 갖는데, 상기 경쇄의 불변 도메인은 상기 중쇄의 첫 번째 불변 도메인에 맞춰 조정되고, 상기 경쇄의 가변 도메인은 상기 중쇄의 가변 도메인에 맞춰 조정된다. 특정한 아미노산 잔기가 상기 경쇄 가변 도메인과 상기 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 "분리된" 항체는 이의 생산 환경의 성분으로부터 (예를 들어, 자연적으로 또는 재조합적으로) 동정, 분리 및/또는 회수된 항체이다. 특정 실시양태에서, 분리된 폴리펩타이드는 이의 생산 환경으로부터의 모든 기타 오염 성분들과 무관하다. 이의 생산 환경으로부터의 오염 성분들, 예를 들어, 재조합 감염된 세포로부터의 것들은 통상 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료를 방해할 수 있는 물질로서 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 (1) 예를 들어, 로우리법(Lowry method)으로 측정한 바 항체 95중량% 이상, 특정 실시양태에서는 99중량% 이상으로, (2) 회전 컵 배열분석장치(spinning cup sequenator)의 사용에 의한 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 비환원 또는 환원 조건하에 쿠마시블루 또는 실버 염색을 사용한 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 분리된 항체는 상기 항체의 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 T-세포내에 동일 반응계 항체를 포함한다. 그러나, 대개는 하나 이상의 정제 단계에 의해 분리된 폴리펩타이드 또는 항체가 제조될 것이다.
본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 (동일 부류의 다른 항체에 비해) 상기 항체의 가장 가변적 부분이며 항원 결합 위치를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체 중에서 서열상 광범위하게 상이한 사실을 말한다. V 도메인은 항원 결합을 중재하고 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 한정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 전체 스팬(span)에 걸쳐 골고루 분포되지 않는다. 대신, 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역(hypervariable region: HVR)이라 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 골조 영역(frame region: FR)이라 불린다. 네이티브 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이들은 주로 베타-시트(beta-sheet) 구조를 취하고 3개의 HVR에 연결되어 있으며 고리 결합(loops connecting)을 형성하고, 몇몇 경우에는 상기 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄에서의 HVR은 FR 영역 옆에 서로 근접하게 붙어 있고, 다른 쇄로부터의 HVR과는 항체의 항원 결합 위치를 형성하는 데 기여한다(Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991) 참조). 불변 도메인은 항원으로의 항체의 결합에 직접 관여하지 않으나, 항체-의존적 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 실행 기능(effector function)을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 사실상 균질 항체 집락으로부터 수득된, 본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체를 말하는데, 즉 상기 집락에 포함된 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예를 들어, 이성체와, 아미드화)을 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 위치에 가까이 향해져 있다. 상이한 결정인자(에피토프)에 향해져 있는 상이한 항체를 통상 포함하는 다클론 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원의 단일 결정인자에 향해져 있다. 단일클론 항체는 그의 특이성 이외에도, 하이브리도마 배지에 의해 합성되고 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론"은 사실상 균질 항체 집락으로부터 수득된 바와 같은 항체의 특징을 가리키고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것으로 이해되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는, 예를 들어, 하이브리도마법(예를 들어, Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3):253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2d ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호), 파지-디스플레이(phage-display) 기술(참조: Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 101(34):12467-472 (2004), 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004) 참조), 및 사람 면역글로불린 좌위(locus)의 일부 또는 전체를 갖거나 사람 면역글로불린 서열을 코드화하는 유전자를 갖는 동물에서의 사람 또는 사람-유사 항체를 생산하는 기술(예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995) 참조)을 포함한 다수의 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 또는 "전항체(whole antibody)"는 항체 단편과는 반대의 의미로 실제로 무손상 형태의 본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체를 지칭하는데 교환적으로 사용된다. 구체적으로 전항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 포함한다. 불변 도메인은 네이티브 서열 불변 도메인(예를 들어, 사람 네이티브 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변종을 가질 수 있다. 몇몇 경우, 무손상 항체는 하나 이상의 실행 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 항원 결합 및/또는 무손상 항체의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 FV 단편; 이중체(diabody); 선형 항체(미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995) 참조); 단쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 생성된 다중특이(multispecific) 항체를 포함한다.
본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체의 파파인 소화는 쉽게 결정체를 이룰 수 있는 능력을 반영한 명칭인, "Fab" 단편 및 잔여 "Fc" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산한다. Fab 단편은 H쇄의 가변 영역 도메인(VH)과 함께 전체 L쇄 및 하나의 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)으로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가인데, 즉 단일 항원 결합 위치를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원-결합 활성을 갖는 2개의 다이설파이드 결합된 Fab 단편에 대략 상응하고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 단일 대형 F(ab')2 단편을 제공한다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇몇 추가 잔기를 갖는다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 함유하는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 Fab' 단편쌍-이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는다-으로 생산되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 다이설파이드에 의해 함께 붙어있는 양 H쇄의 카복시 말단 부분을 포함한다. 항체의 실행 기능은 특정 종류의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해서도 인지되는 Fc 영역에서의 서열에 의해 측정된다.
"FV"는 완전한 항원 인지 및 결합 위치를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 하나의 중쇄 가변 영역 도메인과 하나의 경쇄 가변 영역 도메인이 단단한 비공유 결합으로 연결된 다이머로 이루어져 있다. 이들 2개의 도메인의 폴딩(folding)으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 서열을 제공하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 수여하는 6개의 초가변 고리(H쇄와 L쇄로부터 각각 3개의 고리가 생성됨)가 나온다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 HVR을 포함하는 FV의 반)조차도 전체 결합 위치보다는 낮은 친화도로도 항원을 인지하고 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단쇄 FV"는 단일 폴리펩타이드쇄에 연결된 VH 및 VL 항체를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시양태에서, sFv 폴리펩타이드는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함함으로써 sFv가 항원 결합을 위해 목적한 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 검토를 위해 "Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)"을 참조한다.
본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체의 "기능성 단편"은 무손상 항체의 일부를 포함하는데, 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역이나 개질된 FcR 결합능을 갖거나 유지하는 항체의 F 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 생성된 다중특이 항체를 포함한다.
용어 "이중체"는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 짧은 링커(약 5 내지 10개의 잔기)를 갖는 sFv 단편을 만듦으로써 제조되어, V 도메인의 쇄내(intra-chain)가 아닌 쇄간(inter-chain) 쌍이 수득되고 이에 의해 2가 단편, 즉 2개의 항원 결합 위치를 갖는 단편이 제공되는, 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이 이중체는 2개의 "교차형(crossover)" sFv 단편의 헤테로다이머로서, 2개의 항체의 VH 도메인과 VL 도메인이 상이한 폴리펩타이드쇄 상에 존재한다. 이중체는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; "Hollinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)"에 보다 상세히 기재되어 있다.
본원에 사용된 "키메라 항체"는 본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체(면역글로불린)를 지칭하는 것으로, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유도된 항체 또는 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 반면, 상기 쇄(들)의 잔여부는 다른 종으로부터 유도된 항체 또는 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 뿐만 아니라, 목적한 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동이다(미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:6851-55 (1984)). 본원에서 관심있는 키메라 항체는 항체의 항원-결합 영역이, 예를 들어, 짧은 꼬리 원숭이를 관심 항원으로 면역시킴으로써 생산된 항체로부터 유도된 PRIMATIZED® 항체를 포함한다. 본원에 사용된 "인간화 항체"는 "키메라 항체"의 하위 부류로 사용된다.
본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 비-사람(예를 들어, 생쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비-사람 면역글로부로린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 목적한 특이성, 친화도 및/또는 수용 능력을 갖는 비-사람종, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 비-사람 영장류의 HVR로부터의 잔기에 의해 대체된 사람 면역글로불린(수용자 항체)이다. 몇몇 경우, 사람 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-사람 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 결합 친화도와 같은 항체 성능을 추가로 개선시키기 위해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 사실상 1개 이상, 통상적으로 2개가 전부인 가변 도메인을 포함하는데, 여기서 모든 또는 사실상 전부의 초가변 고리는 비-사람 면역글로불린 서열의 고리에 상응하고, FR 영역이 결합 친화도, 이성체화, 면역원성 등과 같은 항체 성능을 개선시키는 하나 이상의 개별 FR 잔기를 포함할 수 있어도, 모든 또는 사실상 전부의 FR 영역은 사람 면역글로불린 서열의 영역이다. FR 내의 이러한 아미노산 치환의 수는 통상 H쇄에서는 6 이하이고 L쇄에서는 3 이하이다. 인간화 항체는 임의로 또한 통상적으로 사람 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 일부 이상을 포함할 수 있다. 보다 상세한 것은, 예를 들어, "Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)"을 참조한다. 또한, 예를 들어, "Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)", 및 미국 특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호도 참조한다.
"사람 항체"는 사람에 의해 제조된, 본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 기재된 사람 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 것이다. 사람 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-사람 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다. 사람 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함한, 당해 분야에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산할 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). 또한, 사람 단일클론 항체의 제조에 유용한 것은 "Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)"에 기재된 방법이다. 또한, "van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001)"을 참조한다. 사람 항체는, 항원 시험(antigenic challenge)에 대한 반응으로 이러한 항체를 생산하도록 개질되었으나 내인성 좌위에 손상을 입은 형질변환 동물, 예를 들어, 면역력을 갖게 된 제노마우스(xenomouse)에게 항원을 투여함으로써 제조할 수 있다(예를 들어, XENOMOUSETM 기술에 대한 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조). 또한, 예를 들어, 사람 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 사람 항체에 관한 "Li et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)"도 참조한다.
본원에 사용된 경우, 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열면에서 초가변적이고/이거나 구조적으로 한정된 고리를 생성하는, 본원에 기재된 항-C1q 항체의 것과 같은 항체-가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR을 포함하는데, VH에 3개(H1, H2 H3), VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 네이티브 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중 최고의 다양성을 나타내고, H3은 특히 항체에 미세한 특이성을 부여하는데 독특한 역할을 하는 것으로 여겨진다(예를 들어, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003) 참조). 사실, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 낙타과 항체는 경쇄의 부재하에 기능적이고 안정하다(예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 및 Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996) 참조).
다수의 HVR 설명이 본원에 사용되고 포함된다. 카밧(Kabat) 상보성 결정 영역(CDR)인 HVR은 서열 가변성을 기초로 하고 가장 통상적으로 사용된다(Kabat et al., supra). 코티아(Chothia)는 대신에 구조적 고리의 위치를 언급한다(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카밧 CDR과 코티아 구조적 고리 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘러 AbM 항체-모델링 소프트웨어(Oxford Molecular's AbM antibody-modeling software)에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용할 수 있는 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기는 다음에 기재한다.
Figure 112016011187739-pct00001
HVR은 "연장된 HVR"을 포함할 수 있고, 이는 다음과 같다: VL에 24-36 또는 24-34(L1), 46-56 또는 50-56(L2), 및 89-97 또는 89-96(L3), 및 VH에 26-35(H1), 50-65 또는 49-65(H2), 및 93-102, 94-102 또는 95-102(H3). 가변 도메인 잔기는 이들 연장된 HVR 정의 각각에 대해 카밧(Kabat et al., supra)에 따라 넘버링된다.
"골조 영역(framework)" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
구 "카밧에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카밧에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이의 변형 표현은 문헌(Kabat et al., supra)에서 항체의 컴필레이션(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축화, 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 보다 소수의 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입물(카밧에 따른 잔기 52a)을, 중쇄 FR 잔기 82 이후에 삽입된 잔기(예를 들어, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 항체 서열의 상동관계의 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열을 맞춤으로써 제시된 항체에 대해 결정될 수 있다.
일반적으로 카밧 넘버링 시스템은 가변 영역에서의 잔기(대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭하는 경우 사용된다(예를 들어, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 보통 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서의 잔기를 지칭하는 경우 사용된다(예를 들어, Kabat et al., supra에 보고된 EU 인덱스). "카밧에서와 같은 EU 인덱스"는 사람 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 영역에서의 잔기 번호의 언급은 카밧 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 영역에서의 잔기 번호의 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다(예를 들어, 미국 특허공보 제2010-280227호 참조).
본원에 사용된 "수용체 사람 골조 영역(acceptor human framework)"은 사람 면역글로불린 골조 영역 또는 사람 공통(consensus) 골조 영역으로부터 유도된 VL 또는 VH 골조 영역의 아미노산 서열을 포함하는 골조 영역이다. 사람 면역글로불린 골조 영역 또는 사람 공통 골조 영역"으로부터 유도된" 수용체 사람 골조 영역은 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 또는 기존의(pre-existing) 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 기존의 아미노산 서열 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하 또는 2 이하이다. 몇몇 실시양태에서, 기존의 아미노산 서열 변화가 VH에 존재하면, 이러한 변화는 71H, 73H 및 78H 위치에서만, 또는 이들 중 2개 또는 하나에서만 일어날 수 있는데, 예를 들어, 상기 위치에서의 아미노산 서열은 71A, 73T 및/또는 78A에 의할 수 있다. 한 실시양태에서, VL 수용체 사람 골조 영역은 VL 사람 면역글로불린 골조 영역 서열 또는 사람 공통 골조 영역 서열과 서열상 동일하다.
"사람 공통 골조 영역"은 사람 면역글로불린 VL 또는 VH 골조 영역 서열의 선택에서 가장 통상적으로 존재하는 아미노산 서열을 나타낸다. 일반적으로, 사람 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 아그룹으로부터 한다. 일반적으로, 상기 서열의 아그룹은 "Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)"에서와 같은 아그룹이다. VL의 경우, 아그룹은 문헌(Kabat et al., supra)에서와 같은 아그룹 카파 I, 카파 II, 카파 III 또는 카파 IV일 수 있다. 추가로, VH의 경우, 아그룹은 문헌(Kabat et al., supra)에서와 같은 아그룹 I, 아그룹 II 또는 아그룹 III일 수 있다.
예를 들어 본원에 기재된 항-C1q 항체의 특정 위치에서의 "아미노산 개질"은 특정 잔기의 치환 또는 제거, 또는 특정 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 말한다. 특정 잔기에 "인접한" 삽입은 이의 1개 내지 2개의 잔기 내의 삽입을 의미한다. 상기 삽입은 특정 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 아미노산 개질은 치환이다.
본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 "친화도-성숙된(affinity-matured)" 항체는 이의 하나 이상의 HVR이 하나 이상 변경된 것으로 이렇게 변경되지 않은 모 항체에 비해 항원에 대한 항체 친화도가 개선된다. 한 실시양태에서, 친화도-성숙된 항체는 표준 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도-성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 방법으로 생산된다. 예를 들어, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)은 VH- 및 VL-도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙을 기재하고 있다. HVR의 랜덤 돌연변이 및/또는 골조 영역 잔기는, 예를 들어, "Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)"에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 인지되는" 또는 "특이적으로 결합되는"은 본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체와 표적간의 끌어 당김 또는 결합과 같은 측정가능하고 재생가능한 상호작용을 말하고, 생물학적 분자를 포함한 분자의 이종 집락의 존재하에서의 표적의 존재의 결정적 요인이다. 예를 들어, 표적 또는 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체는 이 표적 또는 에피토프에 보다 큰 친화도, 결합력으로 보다 쉽게 및/또는 다른 표적이나 이러한 표적의 다른 에피토프에 결합하는 것 보다 긴 기간으로 걸합하는 항체이다. 또한 이러한 정의에 의해, 예를 들어, 첫 번째 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 잔기)는 두 번째 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 하지 않을 수 있다. 이와 같이 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 (포함할 수는 있으나) 독점적 결합을 반드시 필요로 하지는 않는다. 표적에 특이적 결합하는 항체의 결합상수는 약 103M-1 이상 또는 104M-1 이상일 수 있고, 종종 약 105M-1 또는 106M-1일 수 있고, 기타의 경우 약 106M-1 또는 107M-1, 약 108M-1 내지 109M-1, 또는 약 1010M-1일 내지 1011M-1, 또는 그 이상일 수 있다. 다양한 면역검정 포맷이 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 고형상 ELISA 면역검정은 통상적으로 단백질과 특별히 면역반응성인 단일클론 항체를 선택하는 데 사용된다. 예를 들어, 특정 면역반응성을 측정하는 데 사용할 수 있는 면역검정 포맷 및 조건의 기재에 대해 "Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York"을 참조한다.
본원에 사용된, 보체 인자 C1q와 같은 보체 단백질과 두 번째 단백질간의 "상호작용"은 단백질-단백질 상호작용, 물리적 상호작용, 화학적 상호작용, 결합, 공유결합 및 이온결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 사용된, 항체가 두 단백질간의 "상호작용을 방해"한다는 것은 상기 항체가 상기 두 단백질간의 상호작용을 방해하거나 감소시키거나 완전히 제거하는 경우를 말한다. 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편은 상기 항체 또는 이의 단편이 하나 이상의 단백질에 결합한 경우 두 단백질간의 "상호작용을 방해"한다.
"차단" 항체, "길항" 항체, "억제" 항체 또는 "중화" 항체는 이들 항체가 결합하는 항원의 하나 이상의 생물학적 활성, 예를 들어, 하나 이상의 단백질과의 상호작용을 억제하거나 감소시키는 본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 차단 항체, 길항 항체, 억제 항체 또는 "중화" 항체는 항원의 하나 이상의 생물학적 활성 또는 상호작용을 거의 또는 완전히 억제한다.
항체 "실행 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 말하고 항체 아이소타입에 따라 변한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 네이티브-서열 Fc 영역 및 변종 Fc 영역을 포함한, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 변할 수 있으나, 사람 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산에서 이의 카복실 말단까지를 정의한다. Fc 영역의 C-말단 리신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 코드화하는 핵산을 재조합적으로 만듦으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 K447 잔기가 제거된 항체 집락, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집락, 및 K447 잔기가 제거되지 않은 항체와 K447 잔기가 제거된 항체의 혼합물을 갖는 항체 집락 모두를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체로 사용하기에 적합한 네이티브-서열 Fc 영역은 사람 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
"네이티브 서열 Fc 영역"은 자연 발생 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 네이티브 서열 사람 Fc 영역은 네이티브 서열 사람 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 알로타입(allotype)), 네이티브 서열 사람 IgG2 Fc 영역, 네이티브 서열 사람 IgG3 Fc 영역 및 네이티브 서열 사람 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 이의 자연 발생 변종을 포함한다.
"가변 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 개질때문에 네이티브 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 가변 Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 치환에 대해 상이하다. 몇몇 실시양태에서, 가변 Fc 영역은 네이티브 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교해 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 네이티브 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드에서의 약 1 내지 약 10의 아미노산 치환, 및 몇몇 실시양태에서는 약 1 내지 약 5의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 가변 Fc 영역은 몇몇 실시양태에서 네이티브 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 상동관계를 가질 것이고, 몇몇 실시양태에서는 상기한 영역과 약 90% 이상, 몇몇 실시양태에서는 상기한 영역과 약 95% 이상의 상동관계를 가질 것이다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 말한다. 몇몇 실시양태에서, FcR은 네이티브 서열 사람 FcR이다. 또한, 몇몇 실시양태에서, FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고 이들 수용체의 대립변종(allelic variant) 및 다르게는 이들 수용체를 이은(spliced) 형태를 포함한, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 아급 수용체를 포함하는 것이고, FcγRII는 주로 그의 세포질 도메인이 상이한, 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")을 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기초한 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기초한 억제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM)를 함유한다(예를 들어, M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) 참조). FcR은 "Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)"에 검토되어 있다. 추후 확인될 것들을 포함한 기타 FcR은 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. FcR은 또한 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
생체내 FcRn으로의 결합 및 사람 FcRn 고친화도 결합 폴리펩타이드의 혈청 반감기는, 예를 들어, 형질변환 마우스 또는 사람 FcRn을 발현하는 형질감염 사람 세포주, 또는 가변 Fc 영역을 갖는 폴리펩타이드가 투여된 영장류로 검정할 수 있다. WO 2004/42072(Presta)는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 약해진 항체 변종을 기재한다. 또한, 예를 들어, "Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)"을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "kon"은 항원으로의 항체 결합에 대한 속도 상수를 지칭하기 위함이다.
본원에 사용된 용어 "koff"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 속도 상수를 지칭하기 위함이다.
본원에 사용된 용어 "kD"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리상수를 지칭하기 위함이다.
본원에 사용된, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 서열에 대한 "아미노산 서열 동질성 퍼센트(%)" 및 "상동성"은 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 정렬하고, 필요한 경우 갭을 도입하여 최대%의 서열 동질성을 성취하고 서열 동질성의 일부로서 어떠한 보존적 치환(conservative substitution)도 고려하지 않은 후의 상기 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열상의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 퍼센트를 말한다. 아미노산 서열 동질성 퍼센트의 측정을 위한 정렬은 당해 분야의 기술내에서 다양한 방법으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGNTM (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수득할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 비교할 서열의 전장에 대해 최대 정렬을 수득하는데 필요한 당해 분야에 공지된 임의의 알고리즘을 포함한, 정렬 측정을 위한 적합한 매개변수를 측정할 수 있다.
"분리된" 분자 또는 세포는 보통 생성되었던 환경과 관련된 하나 이상의 오염 분자 또는 세포로부터 확인되고 분리된 분자 또는 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 분리된 분자 또는 세포는 생성 환경과 관련된 모든 성분들과 관련이 없다. 분리된 분자 또는 세포는 자연 발생 형태나 환경 이외의 형태이다. 따라서, 분리된 분자는 세포에 천연으로 존재하는 분자와 구별되고, 분리된 세포는 조직, 기관 또는 개체에 천연으로 존재하는 세포와 구별된다. 몇몇 실시양태에서, 분리된 분자는 본원에 기재된 항-C1q 항체이다. 다른 실시양태에서, 분리된 세포는 본원에 기재된 항-C1q 항체를 생산하는 숙주 세포 또는 하이브리도마 세포이다.
본원에 기재된 항-C1q 항체와 같은 항체를 코드화하는 "분리된" 핵산 분자는 보통 생성되었던 환경과 관련된 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 몇몇 실시양태에서, 분리된 핵산 분자는 생성 환경과 관련된 모든 성분들과 관련이 없다. 본원의 폴리펩타이드 및 항체를 코드화하는 분리된 핵산 분자는 자연 발생 형태나 환경 이외의 형태이다. 따라서, 분리된 핵산 분자는 세포에 천연으로 존재하는 폴리펩타이드 및 항체를 코드화하는 핵산과 구별된다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 결합된 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위함이다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드(plasmid)"로서, 이는 원형 이중가닥 DNA를 말하고 그 안에 추가의 DNA 분획이 묶일 수 있다. 벡터의 다른 유형은 파지 벡터(phage vector)이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터로서, 바이러스 게놈 내에 추가의 DNA 분획이 묶일 수 있다. 특정 벡터들은 이들이 도입된 숙주 세포내에서 자율 증식할 수 있다(예를 들어, 세균 기원 증식을 갖는 세균 벡터 또는 유전자부체(episomal) 포유동물 벡터). 기타 벡터들(예를 들어, 비-유전자부체 포유동물 벡터)은 숙주 세포에 도입될 때 숙주 세포의 게놈 안으로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 세포와 함께 증식된다. 또한, 특정 벡터들은 이들이 협동적으로 결합된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서는 "재조합 발현 벡터" 또는 간단히 "발현 벡터"로 일컫는다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 개질된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체로 도입될 수 있는 임의의 기질을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이의 유사체와 같은 개질된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 개질은 상기 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 표지(label)로의 접합과 같은 합성 후의 개질을 포함할 수 있다. 다른 유형의 개질은, 예를 들어, "캡(cap)", 하나 이상의 천연으로 존재하는 뉴클레오타이드의 유사체로의 치환, 인터뉴클레오타이드 개질, 예를 들어, 비하전된 결합(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 결합(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 잔기, 예를 들어, 단백질을 함유하는 것(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 플리-L-리신 등), 삽입제(intercalator)를 갖는 것(예: 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터를 갖는 것(예: 금속, 방사능 금속, 붕소, 산화성 금속 등), 알킬화제를 갖는 것, 개질된 결합을 갖는 것(예: 알파 아노머 핵산 등) 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드의 비개질된 형태를 포함한다. 추가로, 당에 흔히 존재하는 임의의 하이드록실 그룹이, 예를 들어, 포스포네이트 그룹, 포스페이트 그룹에 의해 대체되거나, 표준 보호 그룹에 의해 보호되거나, 활성화되어 추가의 뉴클레오타이드로의 추가 결합을 제조하거나, 고형 또는 반고형 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 포스포릴화되거나 아민 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핑 그룹 잔기로 치환될 수 있다. 기타 하이드록실은 또한 표준 보호 그룹으로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 당해 분야에 일반적으로 알려져 있는, 예를 들어, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-O-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당(예: 아라비노즈, 자일로즈 또는 릭소오즈), 피라노즈 당, 푸라노즈 당, 세도헵툴로즈 당, 비사이클릭 유사체 및 염기성 뉴클레오사이드 유사체(예: 메틸 리보사이드)를 포함한, 리보즈 또는 데옥시리보즈 당의 유사 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합이 선택적 결합 그룹에 의해 대체될 수 있다. 이들 선택적 결합 그룹은 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2(포름아세탈)에 의해 대체된 양태(여기서, R 및 R'는 각각 독립적으로 H, 또는 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알릴을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환 알킬(C1-20)이다)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드의 모든 결합이 동일해야 하는 것은 아니다. 상기 기재는 DNA 및 RNA를 포함한, 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입물의 도입을 위한 벡터(들)의 수용체일 수 있거나 수용체였던 개별 세포 또는 세포 배지를 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 상기 자손은 자연, 돌발 또는 의도적 돌연변이로 인해 원래의 모 세포와 (형태 또는 게놈 DNA 보완면에서) 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(들)로 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.
본원에 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 첨가제 또는 안정화제를 포함한다. 종종 약리학적으로 허용되는 담체는 pH 완충된 수용액이다. 약리학적으로 허용되는 담체의 예는 완충제(예: 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산), 아스코르브산을 포함하는 항산화제, 저분자량(약 10개의 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질(예: 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글루불린), 친수성 중합체(예: 폴리비닐피롤리돈), 아미노산(예: 글리신, 글루타민, 아스파라딘, 아르기닌 또는 리신), 단당류, 이당류, 및 포도당, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물, 킬레이트화제(예: EDTA), 당 알콜(예: 만니툴 또는 소르비톨), 염-형성 카운터이온(예: 나트륨) 및/또는 비이온성 계면활성제(예: TWEENTM, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICSTM)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 당해 기술분야의 숙련가에게 익히 알려진 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 말한다. 본원의 "약" 어떤 값 또는 매개변수에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수 자체에 대한 양태를 포함(하고 개시)한다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수형은 달리 명확리 지시되지 않는 한 복수도 포함한다. 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 몰(molar) 양과 같은 하나 내지 다수의 항체를 말하는 것이고, 당해 분야의 숙련가에게 알려진 등가물 등을 포함한다.
본원에 기재된 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함"하고, 측면 및 실시양태로 "이루어지고", 측면 및 실시양태로 "필수적으로 이루어짐"을 포함하는 것으로 이해된다.
개요
본원은 항-C1q 항체 및 이의 사용방법을 제공한다. 본원의 항-C1q 항체는 본원의 C1q 단백질에 특이적으로 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1q 중화 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체는 C1 복합체에 결합할 수 있다.
특정 측면에서, 본원은 마우스 하이브리도마 C1q-M1 7788-1(M) 051613으로 지칭되는 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고 2013년 6월 6일자로 ATCC에 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 기탁된 생쥐 단일클론 항체 M1을 제공한다.
특정 측면에서, 본원은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-C1q 항체를 제공하고, 여기서 상기 경쇄 가변 도메인은 항체 M1의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하고/하거나, 상기 중쇄는 항체 M1의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본원은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-C1q 항체를 제공하고, 여기서 상기 경쇄 가변 도메인은 ATCC에 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 기탁된 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손에 의해 생산된 단일클론 항체 M1의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고/하거나, 상기 중쇄 가변 도메인은 ATCC에 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 기탁된 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손에 의해 생산된 단일클론 항체 M1의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함한다.
특정 측면에서, 본원은 (1) 2013년 6월 6일자로 ATCC에 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 기탁된 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손, (2) 항체 M1의 항원 결합 단편 또는 (3) 항체 M1의 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 항체와 동일한 C1q 에피토프를 필수적으로 결합시키는 항-C1q 항체를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체는 C1q의 생물학적 활성을 중화시킨다. 항-C1q 항체에 대한 용도는, 예를 들어, 보체 인자 1(CF1)-의존적 병리학적 시냅스 소실과 관련된 신경퇴행성 장애를 갖는 개체에서의 보체 인자 C1q의 탐지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 비제한적 용도는, 예를 들어, NMO-특이적 자가항체와 같은 자가항체에 의해 고전적인 보체 경로가 활성화되는 경우와 같은, 보체 활성화의 고전적 경로의 억제를 포함한다. 항-C1q 항체에 대한 추가의 비제한적 용도는 C1q와 같은 보체 인자의 개선된 발현과 관련되거나 보체 경로의 활성화와 관련된 장애의 진단 및 치료를 포함한다. 이러한 장애는 자가면역 장애, 염증성 장애, 및 시냅스 소실과 관련된 신경퇴행성 장애를 포함한 신경퇴행성 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 측면에서, 본원은 본원의 항체를 코드화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본원은 또한 본원의 항체를 코드화하는 핵산 분자를 함유하는 분리된 숙주 세포를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 중화 단일클론 생쥐 항체 M1을 생산하는 분리된 숙주 세포주가 제공된다. 이 분리된 숙주 세포주는 ATCC에 기탁되었고 ATCC 수탁번호 PTA-120399를 갖는다.
추가로, 본원의 C1q 중화 항체와 같은 항-C1q 항체를 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본원은 또한 본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 항-C1q 항체를 함유하는 키트를 제공한다.
본원은 추가로 치료가 필요한 개체에서의 신경퇴행성 질환 또는 자가면역 질환을 치료하거나 예방하고, 신경퇴행성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는 개체에서 시냅스를 탐지하고, 생물학적 샘플에서 시냅스를 탐지하기 위한 본원의 C1q 항체(예를 들어, 본원의 C1q 중화 항체)의 사용방법을 제공한다. 본원은 또한 본원의 C1q 항체(예를 들어, 본원의 C1q 중화 항체)를 함유하는 키트를 제공한다.
보체 단백질
본원의 항체는 특이적으로 보체 인자 C1q 및/또는 고전적인 보체 활성화 경로의 C1 복합체 중의 C1q를 인지한다. 인지된 보체 인자는 사람, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 암소, 말, 낙타, 양, 염소 또는 돼지와 같은 임의의 포유동물 유기체를 포함한, 보체 시스템을 갖는 임의 유기체로부터 유도될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다,
본원에 사용된 "C1 복합체"는 하나의 C1q 단백질, 2개의 C1r 단백질 및 2개의 C1s 단백질(예를 들어, C1qr2s2)을 포함하나, 이제 한정되지 않는 단백질 복합체를 지칭한다.
본원에 사용된 "보체 인자 C1q"는 야생형 서열 및 자연 발생 변종 서열 둘 다를 지칭한다.
본 발명의 항체에 의해 인지되는 보체 인자 C1q의 비제한적 예는 다음의 3개의 폴리펩타이드쇄 A, B 및 C를 포함한, 사람 C1q이다:
C1q, 쇄 A(호모사피엔스): 수탁번호 단백질 데이터 베이스: NP_057075.1; GenBank No.: NM_015991:
>gi|7705753|ref|NP_057075.1| 보체 C1q 아성분 서브유닛 A 전구체 [호모사피엔스]
MEGPRGWLVLCVLAISLASMVTEDLCRAPDGKKGEAGRPGRRGRPGLKGEQGEPGAPGIRTGIQGLKGDQGEPGPSGNPGKVGYPGPSGPLGARGIPGIKGTKGSPGNIKDQPRPAFSAIRRNPPMGGNVVIFDTVITNQEEPYQNHSGRFVCTVPGYYYFTFQVLSQWEICLSIVSSSRGQVRRSLGFCDTTNKGLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHIYQGSEADSVFSGFLIFPSA (서열번호 1)
C1q, 쇄 B(호모사피엔스): 수탁번호 단백질 데이터 베이스: NP_000482.3; GenBank No.: NM_000491.3:
>gi|87298828|ref|NP_000482.3| 보체 C1q 아성분 서브유닛 B 전구체 [호모사피엔스]
MMMKIPWGSIPVLMLLLLLGLIDISQAQLSCTGPPAIPGIPGIPGTPGPDGQPGTPGIKGEKGLPGLAGDHGEFGEKGDPGIPGNPGKVGPKGPMGPKGGPGAPGAPGPKGESGDYKATQKIAFSATRTINVPLRRDQTIRFDHVITNMNNNYEPRSGKFTCKVPGLYYFTYHASSRGNLCVNLMRGRERAQKVVTFCDYAYNTFQVTTGGMVLKLEQGENVFLQATDKNSLLGMEGANSIFSGFLLFPDMEA (서열번호 2)
C1q, 쇄 C(호모사피엔스): 수탁번호 단백질 데이터 베이스: NP_001107573.1; GenBank No.: NM_001114101.1:
>gi|166235903|ref|NP_001107573.1| 보체 C1q 아성분 서브유닛 C 전구체 [호모사피엔스]
MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLPLRGQANTGCYGIPGMPGLPGAPGKDGYDGLPGPKGEPGIPAIPGIRGPKGQKGEPGLPGHPGKNGPMGPPGMPGVPGPMGIPGEPGEEGRYKQKFQSVFTVTRQTHQPPAPNSLIRFNAVLTNPQGDYDTSTGKFTCKVPGLYYFVYHASHTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHTSKTNQVNSGGVLLRLQVGEEVWLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGFLLFPD (서열번호 3)
따라서, 본원의 항-C1q 항체는 C1q 단백질의 폴리펩타이드쇄 A, 폴리펩타이드쇄 B 및/또는 폴리펩타이드쇄 C에 결합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체는 사람 C1q 또는 이의 동족체, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 암소, 말, 낙타, 양, 염소 또는 돼지 C1q의 폴리펩타이드쇄 A, 폴리펩타이드쇄 B 및/또는 폴리펩타이드쇄 C에 결합될 수 있다.
항-C1q 항체
본원의 항체는 특이적으로 보체 인자 C1q 및/또는 고전적인 보체 경로의 C1 복합체 중의 C1q에 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 특이적으로 사람 C1q에 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 특이적으로 사람 및 마우스 C1q에 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 특이적으로 래트 C1q에 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 특이적으로 사람 C1q, 마우스 C1q 및 래트 C1q에 결합된다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체는 보체 인자 C1q의 생물학적 활성을 중화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 보체 인자 C1q와, C1r 또는 C1s와 같은 기타 보체 인자간의, 또는 C1q와 자가항체와 같은 항체간의 상호작용을 억제한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본원의 자가항체는 숙주 항원을 인지하고 보체 활성화의 고전적 경로를 활성화하는 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이 활성화 과정의 첫 번째 단계에서, 보체 인자 C1q는 자가항체-자가항원-면역 복합체에 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 보체 인자 C1q와 비-보체 인자간의 상호작용을 억제한다. 비-보체 인자는 포스파티딜세린, 펜트락신-3, C-반응성 단백질(CRP), 구형 C1q 수용체(gC1qR), 보체 수용체 1(CR1), β-아밀로이드 및 칼레티쿨린을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 고전적인 보체 활성화 경로를 억제한다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 대안적 경로를 추가로 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 자가항체- 및 보체-의존적 세포 독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC)을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 보체-의존적 세포-중재된 세포 독성(complement-dependent cell-mediated cytotoxicity: CDCC)을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 B-세포 항체 생산, 수지상 세포 성숙, T-세포 증식, 사이토카인 생산 또는 미세아교세포 활성화를 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 아르투스 반응을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 시냅스 또는 신경종말의 포식작용을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 보체 수용체 3(CR3)/C3 발현 세포의 활성화를 억제한다.
본 발명 항체의 기능적 특성, 예를 들어, 항원에 대한 해리상수, 단백질-단백질 상호작용(예를 들어, C1q-자가항체 상호작용), 자가항체-의존적 및 보체-의존적 세포 독성(CDC)의 억제, 보체-의존적 세포-중재된 세포 독성(CDCC)의 억제 또는 병변 생성은 시험관내, 생체외 또는 생체내 실험으로 측정할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
C1q에 대한 항-C1q 항체의 해리상수(KD)는 100nM 미만, 90nM 미만, 80nM 미만, 70nM 미만, 60nM 미만, 50nM 미만, 40nM 미만, 30nM 미만, 20nM 미만, 10nM 미만, 9nM 미만, 8nM 미만, 7nM 미만, 6nM 미만, 5nM 미만, 4nM 미만, 3nM 미만, 2nM 미만, 1nM 미만, 0.5nM 미만, 0.1nM 미만, 0.05nM 미만, 0.01nM 미만 또는 0.005nM 미만일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 해리상수는 약 30nM 미만에서 약 100pM 미만의 범위이다. 몇몇 실시양태에서, 해리상수는 약 30nM 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 해리상수는 약 20nM 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 해리상수는 약 10nM 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 해리상수는 약 5nM 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 해리상수는 약 1nM 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 해리상수는 100pM 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-C1q 항체의 해리상수는 사람 C1q에 대해 약 30nM 미만에서 약 100pM 미만의 범위이고, 마우스 C1q에 대해 약 30nM 미만에서 약 100pM 미만의 범위이다. 특정 실시양태에서, 항-C1q 항체의 해리상수는 사람 C1q에 대해 약 30nM 미만이고 마우스 C1q에 대해 약 30nM 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-C1q 항체의 해리상수는 사람 C1q에 대해 약 20nM 미만이고 마우스 C1q에 대해 약 20nM 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-C1q 항체의 해리상수는 사람 C1q에 대해 약 10nM 미만이고 마우스 C1q에 대해 약 10nM 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-C1q 항체의 해리상수는 사람 C1q에 대해 약 5nM 미만이고 마우스 C1q에 대해 약 5nM 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-C1q 항체의 해리상수는 사람 C1q에 대해 약 1nM 미만이고 마우스 C1q에 대해 약 1nM 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-C1q 항체의 해리상수는 사람 C1q에 대해 약 100pM 미만이고 마우스 C1q에 대해 약 100pM 미만이다. C1q 이외의 항원에 대한 항체 해리상수는 C1q에 대한 해리상수보다 5배 이상, 10배 이상, 100배 이상, 1,000배 이상, 10,000 이상 또는 100,000배 이상 높을 수 있다. 예를 들어, 본원의 C1q 항체의 해리상수는 C1q에 대해서보다 C1s에 대해 1,000배 이상 높을 수 있다. 해리상수는 ELISA, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR), 바이오-층 간섭법(bio-layer interferometry)(예를 들어, ForteBio의 Octet System 참조), 등온 적정 열량측정법(isothermal titration calorimetry: ITC), 시차주사열량측정법(differential scanning calorimetry: DSC), 원편광 이색성 분광분석(circular dichroism: CD), 스톱-플로우 분석(stopped-flow analysis), 및 열량측정 또는 형광 단백질 용융 분석과 같은 임의의 생화학적 또는 생물물리학적 기술을 포함한 임의의 분석적 기술을 통해 측정할 수 있다. C1q에 대한 항-C1q 항체의 해리상수(KD)는, 예를 들어, 전장 항체 또는 Fab 단편과 같은 항체 단편을 사용하여 측정할 수 있다.
C1q에 대한 항체의 결합 친화도를 측정하는 방법의 한 예는 상기 항체의 단일기능적 Fab 단편의 결합 친화도를 측정하는 것이다. 단일기능적 Fab 단편을 수득하기 위해, 항체(예를 들어, IgG)를 파파인으로 분리하거나 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 항체의 Fab 단편의 친화도는 HBS-EP 러닝 버퍼(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20)를 사용하여 예비-부동화 스트렙타비딘 센서 칩(SA)이 장착된 표면 플라스몬 공명(Biacore3000TM 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템, Biacore.TM., INC, Piscataway N.J.)으로 측정할 수 있다. 바이오티닐화 사람 C1q(또는 기타 임의의 C1q)를 HBS-EP 버퍼에 0.5㎍/mL의 농도로 희석하고 다양한 접촉 시간을 사용하여 개별 칩 채널을 가로질러 주입하여 상세한 키네틱 연구용의 50-200 반응 유닛(RU) 및 선별 검정용의 800-1,000RU의 2개 범위의 항원 밀도를 수득할 수 있다. 재생 연구로 25%v/v 에탄올 중의 25mM NaOH가 200회 이상의 주입 동안 상기 칩에 대해 C1q의 활성을 유지시킨 채 결합된 Fab를 효과적으로 제거하는 것으로 밝혀졌다. 전형적으로, 정제된 Fab 샘플의 연속 희석액(0.1 내지 10배의 스패닝 농도. 예상 KD)을 100μL/분으로 1분 동안 주입하고 2시간 이하의 해리 시간이 허용된다. Fab 단백질의 농도를 표준으로서 공지된 농도(아미노산 분석으로 측정)의 Fab를 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동으로 측정한다. 키네틱 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)가, 데이터를 BIA 평가 프로그램을 사용한 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)에 국제적으로 맞춤으로써 동시에 수득된다. 평형 해리 상수(KD) 값은 koff/kon으로서 계산된다. 이 프로토콜은 사람 C1q, 기타 포유동물의 C1q(예를 들어, 마우스 C1q, 래트 C1q, 영장류 C1q) 뿐만 아니라 상이한 형태의 C1q를 포함한, 임의의 C1q에 대한 항체의 결합 친화도를 측정하는 데 사용하기에 적합하다. 항체의 결합 친화도는 일반적으로 25℃에서 측정하나, 37℃에서도 측정할 수 있다.
본원의 항체는 사람, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 암소, 말, 낙타, 양, 염소 또는 돼지와 같은 임의의 포유동물 유기체를 포함한, 보체 시스템을 갖는 임의의 유기체로부터 유도된 C1q 항원에 결합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 사람 C1q 상의 에피토프에 특이적으로 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 사람 및 마우스 C1q 상의 에피토프에 특이적으로 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 사람, 마우스 및 래트 C1q 상의 에피토프에 특이적으로 결합된다.
몇몇 실시양태에서, 본원은 본원의 다른 항체에 의해 결합된 C1q 에피토프와 동일하거나 겹치는 C1q의 에피토프에 결합된 항-C1q 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원은 항-C1q 항체 M1에 의해 결합된 C1q 에피토프와 동일하거나 겹치는 C1q의 에피토프에 결합된 항-C1q 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1q로의 결합에 대해 본원의 다른 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1q로의 결합에 대해 항-C1q 항체 M1 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁한다.
동일하거나 겹치는 에피토프에 항-C1q 항체의 어느 C1q 에피토프가 결합되는지를 측정하거나 2개의 항체가 상기 에피토프에 결합하는지의 여부를 측정하는데 사용될 수 있는 방법은 X-선 결정학, NMR 분광학, 알라닌 스캐닝 돌연변이, 겹치 는 C1q 서열을 갖는 C1q-유도된 펩타이드를 포함하는 펩타이드 라이브러리의 선별, 및 경쟁 검정을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 경쟁 검정은 2개의 항체가 동일하거나 입체적으로 겹치는 에피토프를 인지함으로써 동일한 에피토프에 결합하는지의 여부 또는 하나의 항체가 항원으로의 다른 항체의 결합을 완전히 억제하는지의 여부를 측정하는데 특히 유용하다. 이러한 검정은 당해 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 항원 또는 항원 발현 세포는 다중-웰 플레이트 상에서 부동화되고 표지된(labeled) 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력이 측정된다. 이러한 경쟁 검정을 위한 통상의 표지는 방사능표지이거나 효소 표지이다.
본원에 포함된 경쟁 항체는 1μM 이하에서 본원의 임의의 항-C1q 항체(예를 들어, M1 또는 M1의 항원-결합 단편)의 C1q로의 결합을 억제(즉, 대조군과 비교해 예방하거나 방해)하거나 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 및 95% 이상 감소시키는 항체이다. 예를 들어, 경쟁 검정에서 경쟁 항체의 농도는 항체 M1 또는 M1의 항원-결합 단편의 KD 이하일 수 있다. 결합원들간의 경쟁은, 예를 들어, ELISA를 사용하여 및/또는 용액 중 C1q와 항체와의 상호작용을 모니터링함으로써 생체내에서 쉽게 검정할 수 있다. 상기 분석을 수행하기 위한 정확한 수단은 중요하지 않다. C1q는 96-웰에 고정시키거나 균질 용액에 넣을 수 있다. 특정 실시양태에서, 표지된 항-C1q 항체(예를 들어, M1)의 결합을 차단하는 비표지된 후보 항체(들)의 능력은 방사능, 효소 또는 기타 표지를 사용하여 측정할 수 있다. 역검정에서, 표지된 항-C1q 항체와 C1q(여기서, 상기 표지된 항-C1q 항체, 예를 들어, M1과 C1q는 이미 결합되어 있다)와의 상호작용을 방해하는 비표지된 항체의 능력이 측정된다. 결합 표지의 측정 내내 판독한다. C1q 및 후보 항체(들)는 임의의 순서로 또는 동일한 시간에 첨가할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 C1q와 자가항체간의 상호작용을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 2013년 6월 6일자로 ATCC에 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된, 생쥐 항-사람 C1q 단일클론 항체 M1이다.
몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 필수적으로 M1과 동일한 C1q 에피토프에 결합된 분리된 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 2013년 6월 6일자로 ATCC에 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 기탁된 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손에 의해 생산된 단일클론 항체 M1의 경쇄 가변 도메인의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 분리된 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 2013년 6월 6일자로 ATCC에 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 기탁된 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손에 의해 생산된 단일클론 항체 M1의 중쇄 가변 도메인의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 분리된 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 2013년 6월 6일자로 ATCC에 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 기탁된 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손에 의해 생산된 단일클론 항체 M1의 경쇄 가변 도메인의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3과 중쇄 가변 도메인의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 분리된 항체이다.
몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 C1q 단백질에 결합되고 (a) 서열번호 1의 아미노산 잔기 196-226(서열번호 16), 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 196-226(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHI)(서열번호 16)에 상응하는 C1q 단백질 쇄 A(C1qA)의 아미노산 잔기; (b) 서열번호 1의 아미노산 잔기 196-221(서열번호 17), 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 196-221(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(서열번호 17)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; (c) 서열번호 1의 아미노산 잔기 202-221(서열번호 18), 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 202-221(SGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(서열번호 18)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; (d) 서열번호 1의 아미노산 잔기 202-219(서열번호 19), 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 202-219(SGGMVLQLQQGDQVWVEK)(서열번호 19)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; 및 (e) 서열번호 1의 아미노산 잔기 Lys 219 및/또는 Ser 202, 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 Lys 219 및/또는 Ser 202에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산 잔기 내의 상기 C1q 단백질의 아미노산 중 하나 이상에 결합된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 추가로 (a) 서열번호 3의 아미노산 잔기 218-240(서열번호 20), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 218-240(WLAVNDYYDMVGI QGSDSVFSGF)(서열번호 20)에 상응하는 C1q 단백질 쇄 C(C1qC)의 아미노산 잔기; (b) 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-240(서열번호 21), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-240(YDMVGI QGSDSVFSGF)(서열번호 21)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (c) 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-232(서열번호 22), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-232(YDMVGIQG)(서열번호 22)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (d) 서열번호 3의 아미노산 잔기 Tyr 225, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 Tyr 225에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (e) 서열번호 3의 아미노산 잔기 174-196(서열번호 23), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(서열번호 23)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (f) 서열번호 3의 아미노산 잔기 184-192(서열번호 24), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 184-192(RSGVKVVTF)(서열번호 24)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (g) 서열번호 3의 아미노산 잔기 185-187, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 185-187(SGV)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; 및 (h) 서열번호 3의 아미노산 잔기 Ser 185, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 Ser 185에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산 잔기 내의 상기 C1q 단백질의 아미노산 중 하나 이상에 결합된다.
몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 서열번호 1에 나타낸 사람 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219 및 Ser 202, 또는 서열번호 1에 나타낸 Lys 219 및 Ser 202에 상응하는 사람 C1qA의 아미노산 잔기, 및 서열번호 3에 나타낸 사람 C1qC의 아미노산 잔기 Tyr 225, 또는 서열번호 3에 나타낸 Tyr 225에 상응하는 사람 C1qC의 아미노산 잔기에 결합된다. 특정 실시양태에서, 항-C1q 항체는 서열번호 1에 나타낸 사람 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219, 또는 서열번호 1에 나타낸 Lys 219에 상응하는 사람 C1qA의 아미노산 잔기, 및 서열번호 3에 나타낸 사람 C1qC의 아미노산 잔기 Ser 185, 또는 서열번호 3에 나타낸 Ser 185에 상응하는 사람 C1qC의 아미노산 잔기에 결합된다.
몇몇 실시양태에서, 항-C1q 항체는 C1q 단백질에 결합되고 (a) 서열번호 3의 아미노산 잔기 218-240(서열번호 20), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 218-240(WLAVNDYYDMVGI QGSDSVFSGF)(서열번호 20)에 상응하는 C1q 단백질 쇄 C(C1qC)의 아미노산 잔기; (b) 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-240(서열번호 21), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-240(YDMVGI QGSDSVFSGF)(서열번호 21)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (c) 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-232(서열번호 22), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 225-232(YDMVGIQG)(서열번호 22)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (d) 서열번호 3의 아미노산 잔기 Tyr 225, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 Tyr 225에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (e) 서열번호 3의 아미노산 잔기 174-196(서열번호 23), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(서열번호 23)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (f) 서열번호 3의 아미노산 잔기 184-192(서열번호 24), 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 184-192(RSGVKVVTF)(서열번호 24)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (g) 서열번호 3의 아미노산 잔기 185-187, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 185-187(SGV)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; 및 (h) 서열번호 3의 아미노산 잔기 Ser 185, 또는 서열번호 3의 아미노산 잔기 Ser 185에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산 잔기 내의 상기 C1q 단백질의 아미노산 중 하나 이상에 결합된다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체는 C1q와 C1s간의 상호작용을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1q와 C1r간의 상호작용을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1q와 C1s간의 상호작용 및 C1q와 C1r간의 상호작용을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1q와 다른 항체, 예를 들어, 자가항체간의 상호작용을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 2.5;1 미만, 2.0:1 미만, 1.5:1 미만 또는 1.0:1 미만의 화학량론으로 각각의 상호작용을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 C1q 항체는 C1q와 항-C1q 항체의 대략 등몰 농도에서 C1q-C1s 상호작용과 같은 상호작용을 억제한다. 다른 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 20:1 미만, 19.5:1 미만, 19:1 미만, 18.5:1 미만, 18:1 미만, 17.5:1 미만, 17:1 미만, 16.5:1 미만, 16:1 미만, 15.5:1 미만, 15:1 미만, 14.5:1 미만, 14:1 미만, 13.5:1 미만, 13:1 미만, 12.5:1 미만, 12:1 미만, 11.5:1 미만, 11:1 미만, 10.5:1 미만, 10:1 미만, 9.5:1 미만, 9:1 미만, 8.5:1 미만, 8:1 미만, 7.5:1 미만, 7:1 미만, 6.5:1 미만, 6:1 미만, 5.5:1 미만, 5:1 미만, 4.5:1 미만, 4:1 미만, 3.5:1 미만, 3:1 미만, 2.5:1 미만, 2.0:1 미만, 1.5:1 미만, 또는 1.0:1 미만의 화학량론으로 C1q에 결합된다. 특정 실시양태에서, 상기 C1q 항체는 20:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위의 결합 화학량론으로 C1q에 결합된다. 특정 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 6:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위의 결합 화학량론으로 C1q에 결합된다. 특정 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 2.5:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위의 결합 화학량론으로 C1q에 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1q와 C1r간의 상호작용, 또는 C1q와 C1s간의 상호작용, 또는 C1q와 C1r 및 C1s 둘 다간의 상호작용을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1q와 C1r간의 상호작용, C1q와 C1s간의 상호작용, 및/또는 C1q와 C1r 및 C1s 둘 다간의 상호작용을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1qA-쇄에 결합된다. 다른 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1qB-쇄에 결합된다. 다른 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1qC-쇄에 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1qA-쇄, C1qB-쇄 및/또는 C1qC-쇄에 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1qA-쇄, C1qB-쇄 및/또는 C1qC-쇄의 구상 도메인에 결합된다. 다른 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 C1qA-쇄, C1qB-쇄 및/또는 C1qC-쇄의 콜라겐-유사 도메인에 결합된다.
본원의 항체가 2개 이상의 보체 인자간의 상호작용, 예를 들어, C1q와 C1s간의 상호작용 또는 C1q와 C1r간의 상호작용을 억제하는 경우, 상기 항체의 존재하에 일어나는 상호작용은 본원의 항체가 부재하는 대조군에 비해 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 감소될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 항체의 존재하에 일어나는 상호작용은 본원의 항체가 부재하는 대조군에 비해 30% 이상 내지 99% 이상의 범위의 양이 감소된다.
특정 실시양태에서, 본원의 항체는 C4-분열(cleavage)을 본원의 항체가 부재하는 대조군에 비해 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상, 또는 30% 이상 내지 99% 이상의 범위의 양을 억제한다. C4-분열 측정방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. C4-분열에 대한 본원의 항체의 EC50 값은 3μg/ml 미만, 2.5μg/ml 미만, 2.0μg/ml 미만, 1.5μg/ml 미만, 1.0μg/ml 미만, 0.5μg/ml 미만, 0.25μg/ml 미만, 0.1μg/ml 미만, 0.05μg/ml 미만일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원의 항체는 C4-분열을 C1q와 항-C1q 항체의 대략 등몰 농도에서 억제한다.
특정 실시양태에서, 본원의 항체는 자가항체-의존적 및 보체-의존적 세포독성(CDC)을 본원의 항체가 부재하는 대조군에 비해 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상, 또는 30% 이상 내지 99% 이상의 범위의 양을 억제한다. 자가항체-의존적 및 보체-의존적 세포독성에 대한 본원의 항체의 EC50 값은 3μg/ml 미만, 2.5μg/ml 미만, 2.0μg/ml 미만, 1.5vg/ml 미만, 1.0μg/ml 미만, 0.5μg/ml 미만, 0.25vg/ml 미만, 0.1μg/ml 미만, 0.05μg/ml 미만일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 항체는 보체-의존적 세포-중재된 세포독성(CDCC)을 본원의 항체가 부재하는 대조군에 비해 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상, 또는 30% 이상 내지 99% 이상의 범위의 양을 억제한다. CDCC 측정방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. CDCC에 대한 본원의 항체의 EC50 값은 3μg/ml 미만, 2.5μg/ml 미만, 2.0μg/ml 미만, 1.5μg/ml 미만, 1.0μg/ml 미만, 0.5μg/ml 미만, 0.25μg/ml 미만, 0.1μg/ml 미만, 0.05μg/ml 미만일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원의 항체는 CDCC는 억제하나 항체-의존적 세포의 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC)은 억제하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 항체는 C1F 용혈(CH50 용혈로도 지칭됨)을 본원의 항체가 부재하거나, 보체 인자 또는 자가항체와 같은 기타 항체에 결합하지 않는 대조용 항체가 사용되는 대조군에 비해 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상, 또는 30% 이상 내지 99% 이상의 범위의 양을 억제한다(예를 들어, 실시예 3 참조). C1F 용혈의 측정방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 실시예 3 참조). C1F 용혈에 대한 본원의 항체의 EC50 값은 3μg/ml 미만, 2.5μg/ml 미만, 2.0μg/ml 미만, 1.5μg/ml 미만, 1.0μg/ml 미만, 0.5μg/ml 미만, 0.25μg/ml 미만, 0.1μg/ml 미만, 0.05μg/ml 미만일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체는 200ng/ml 미만, 100ng/ml 미만, 50ng/ml 미만 또는 20 ng/ml 미만의 용량으로 C1F 용혈을 50% 이상 중화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 상기 항체는 C1F 용혈을 C1q와 항-C1q 항체의 대략 등몰 농도에서 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 상기 항-C1q 항체는 사람 C1F 용혈 검정에서 용혈을 중화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 상기 항체는 사람, 마우스 및 래트 C1F 용혈 검정에서 용혈을 중화시킨다(예를 들어, 실시예 3 참조).
몇몇 실시양태에서, 대안적 경로는 C1q 결합 및 후속적인 C1s 활성화에 의해CDC를 증폭시킬 수 있고, 이들 실시양태 중 적어도 몇몇 실시양태에서는 본원의 항체가 대안적 경로를 본원의 항체가 부재하는 대조군에 비해 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상, 또는 30% 이상 내지 99% 이상의 범위의 양을 억제한다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 상기 항체는 시냅스 소실의 세포 시험관내 모델, 또는 생체내 마우스 모델과 같은 생체내 모델에서의 시냅스 소실을 예방한다. 생체내 마우스 모델은 알쯔하이머 질환의 마우스 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein: APP) 형질변환 모델인 Tg2576, 헌팅턴병에 대한 형질변환 모델인 R6/2 NT-CAG150, 척수성근위축에 대한 마우스 모델인 SMAΔ7, 또는 녹내장의 유전자 마우스 모델인 DBA/2J를 포함할 수 있다. 일반적으로, 시냅스 소실을 나타내는 임의의 신경퇴행성 질환 모델을 사용할 수 있다.
시험관내 또는 생체내 시냅스 소실의 측정방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 시험관내 병변 생성이 본원의 항체가 부재하는 대조군 실험에 비해 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상, 또는 30% 이상 내지 95% 이상의 범위의 양만큼 저하될 수 있다. 시험관내 병변 생성 예방에 대한 본원의 항체의 EC50 값은 3μg/ml 미만, 2.5μg/ml 미만, 2.0μg/ml 미만, 1.5μg/ml 미만, 1.0μg/ml 미만, 0.5μg/ml 미만, 0.25μg/ml 미만, 0.1μg/ml 미만, 0.05μg/ml 미만일 수 있다. 시험관내 시냅스 소실이 본원의 항체가 부재하는 대조군 실험에 비해 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 35% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상, 또는 5% 이상 내지 50% 이상의 범위의 양만큼 저하될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 상기 항체는 NMO의 생체외 척수 슬라이스 모델 또는 NMO의 생체내 마우스 모델에서의 병변 생성을 예방한다. 생체외 또는 생체내 병변 생성의 측정방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 생체외 병변 생성은 적어도 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 또는 4.0의 상대적 스코어만큼 감소될 수 있다. 생체외 병변 생성의 예방에 대한 본원의 항체의 EC50 값은 3μg/ml 미만, 2.5μg/ml 미만, 2.0μg/ml 미만, 1.5μg/ml 미만, 1.0μg/ml 미만, 0.5μg/ml 미만, 0.25μg/ml 미만, 0.1μg/ml 미만, 0.05μg/ml 미만일 수 있다. 생체내 병변 생성이 착색(staining) 소실(면적%) 면에서 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 35% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상, 또는 5% 이상 내지 50% 이상의 범위의 양만큼 감소될 수 있다. 착색은 APQ4 착색, GFAP 착색 또는 MBP 착색으로 평가할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원은 항-C1q 항체를 제공한다. 본원의 상기 항체는 다음 특징 중 하나 이상을 가질 수 있다. 본원의 상기 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 사람 항체, 항체 단편, 이중특이 및 다중특이 항체, 다가 항체 또는 이형접합 항체일 수 있다. 본원의 항체 단편은 본원의 임의의 항-C1q 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 기능적 단편일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 상기 항체 단편은 C1q에 특이적으로 결합되고 C1q의 생물학적 활성을 중화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 상기 항체 단편은 상기 항-C1q 항체의 축소판이거나 상응하는 전장 항체의 동일한 에피토프를 가지나 분자량이 훨씬 작은 본원의 항체 단편이다. 이러한 축소된 항-C1q 항체 단편은 보다 우수한 뇌 투과능과 보다 짧은 반감기를 갖는데, 이는 조영 및 진단 용도에서 유리하다(예를 들어, Lutje S et al., Bioconjug Chem. 2014 Feb 19;25(2):335-41; Tavare R et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Jan 21;111(3):1108-13; 및 Wiehr S et al., Prostate. 2014 May;74(7):743-55 참조). 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체 단편은 그의 상응하는 전장 항체에 비해 우수한 뇌 투과능을 갖고/거나 그의 상응하는 전장 항체에 비해 짧은 반감기를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체는 제1 항원과 제2 항원을 인지하는 이중특이 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 제1 항원은 C1q 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 제2 항원은 혈액-뇌-장벽을 통과하는 수송을 용이하게 하는 항원으로, 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGFR), 저밀도 지단백질 수용체 관련된 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), 디프테리아 독소 수용체, CRM197, 라마 단일 도메인 항체, TMEM 30(A), 단백질 도입 도메인, TAT, Syn-B, 페너트라틴(penetratin), 폴리-아르기닌 펩타이드, 안지오펩(angiopep) 펩타이드 및 ANG1005를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원의 항체는 가공된 실행 기능, 아미노산 서열 개질 또는 당해 분야에 공지된 기타 항체 개질을 추가로 함유할 수 있고; 예를 들어, 본원에 기재된 항-C1q 항체의 불변 영역은 개질되어 보체 활성화를 악화시킬 수 있다.
추가의 항-C1q 항체, 예를 들어, 본원의 C1q 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 검정 방법에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 특성에 대해 동정되고/되거나 선별되고/되거나 특징화될 수 있다.
항체 제제
본원의 항-C1q 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 사람 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 F(ab')2 단편), 이중특이 및 다중특이 항체, 다가 항체, 이형접합 항체, 라이브러리 유도된 항체, 개질된 실행 기능을 갖는 항체, 항체 부분을 함유하는 융합 단백질, 및 항체의 글리코실화된 변종, 항체의 아미노산 서열 변종 및 공유적으로 개질된 항체를 포함하는, 본원의 C1q 단백질의 아미노산 잔기를 갖는 에피토프와 같은 항원 인지 위치를 포함하는 면역글로불린 분자의 기타 개질된 구조를 포함할 수 있다. 상기 항-C1q 항체는 사람, 생쥐, 래트 또는 기타 임의의 기원(키메라 또는 인간화 항체 포함)일 수 있다.
(1) 다클론 항체
다클론 항-C1q 항체와 같은 다클론 항체는 일반적으로 관련 항원 및 보강제의 다중 피하(sc) 또는 복막내(ip) 주입에 의해 동물에서 자란다. 이는 관련 항원(예를 들어, 본원의 정제된 또는 재조합 C1q 단백질)을, 면역화되는 종에서 면역성인 단백질(예를 들어, 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제)에 이관능성 또는 유도체화 제제(예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(여기서, R 및 R1은 독립적으로 저급 알킬 그룹이다))를 사용하여 접합시키는 데 유용할 수 있다. 사용될 수 있는 보강제의 예는 프로인트 완전면역보강제(Freund's complete adjuvant) 및 MPL-TDM 보강제(모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로즈 다이코리노마이콜레이트)를 포함한다. 과도한 실험없이 당해 분야의 숙련가에 의해 면역 프로토콜이 선택될 수 있다.
동물을, 예를 들어, 단백질 또는 접합물 100μg(토끼의 경우) 또는 5μg(마우스의 경우)을 3용적의 프로인트 완전면역보강제와 합하고 이 용액을 여러 위치에 피부내 주입함으로써 목적한 항원, 면역성 접합물 또는 유도체에 대해 면역화한다. 한 달 후, 상기 동물을 프로인트 완전면역보강제 중의 펩타이드 또는 접합물의 원래 양의 1/5 내지 1/10로 여러 위치에 피하 주입하여 부스팅한다. 7 내지 14일 후. 상기 동물을 출혈시키고 혈청을 항체가(antibody titer)에 대해 검정한다. 항체가가 정체될 때까지 동물을 부스팅한다. 접합물을 또한 재조합-세포 배지 중에서 단백질 융합물로 만들 수 있다. 또한, 명반(alum)과 같은 응집제가 면역 반응을 개선시키는 데 적합하다.
(2) 단일클론 항체
단일클론 항-C1q 항체와 같은 단일클론 항체가 사실상 균질한 항체 집락으로부터 수득되는데, 즉 집락을 포함하는 개별 항체들이 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 및/또는 번역후 개질(예를 들어, 이성체화, 아미드화)을 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 별개 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 가리킨다.
예를 들어, 단일클론 항-C1q 항체는 먼저 "Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)"에 기재된 하이브리도마법을 사용하여 만들 수 있고, 또는 제조합 DNA법(미국 특허 제4,816,567호)으로 만들 수 있다.
하이브리도마법에서, 마우스 또는 기타 적합한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터를 상기한 바와 같이 면역화하여 면역화에 사용되는 단백질(예를 들어, 본원의 정제된 또는 재조합 C1q 단백질)에 특이적으로 결합할 항체를 생산하는 또는 생산할 수 있는 림프구를 끌어낸다. 대안적으로, 림프구를 시험관내 면역화할 수 있다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제(fusiong agent), 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성시킨다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
면역화제는 통상적으로 항원 단백질(예를 들어, 본원의 정제된 또는 재조합 C1q 단백질) 또는 이의 융합 변종을 포함한다. 일반적으로 사람 기원의 세포가 바람직한 경우 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes: PBL)가 사용되는 반면, 비-사람 포유동물 공급원이 바람직한 경우에는 비장 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 무한증식세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성시킨다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103).
무한증식세포주는 보통 형질변환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 또는 사람 기원의 골수종 세포이다. 통상, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포를, 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 물질을 하나 이상 함유할 수 있는 적합한 배지에 시딩하고 성장시킨다. 예를 들어, 상기 모 골수종 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트란스퍼라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase: HGPRT 또는 HPRT)가 결핍되면, 하이브리도마용 배지는 통상적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 물질들인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다(HAT 배지).
몇몇 실시양태에서, 무한증식 골수종 세포는 효과적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의해 항체의 안정한 고수준 생산을 지원하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포이다. 이들 중 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양(the Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, California USA) 시판)으로부터 유도된 것 뿐만 아니라 SP-2 세포 및 이의 유도체(예를 들어, X63-Ag8-653)(the American Type Culture Collection(Manassas, Virginia USA) 시판)와 같은 생쥐 골수종 세포주가 있다. 사람 골수종 및 마우스-사람 이종 골수종 세포주가 또한 사람 단일클론 항체의 제조를 위해 기재되어 있다(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배지를 항원(예를 들어, 본원의 C1q 단백질)에 대해 지시된 단일클론 항체의 생산에 대해 검정한다. 몇몇 실시양태에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성을 면역침전반응 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어, 방사면역측정법(radioimmunoassay: RIA) 또는 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)으로 측정한다.
하이브리도마 세포가 배양되는 배지를 목적한 항원(예를 들어, 본원의 C1q 단백질)에 대해 지시된 단일클론 항체의 존재에 대해 검정한다. 몇몇 실시양태에서, 단일클론 항체의 결합 친화도 및 특이성을 면역침전반응 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어, 방사면역측정법(RIA) 또는 효소면역측정법(ELISA)으로 측정할 수 있다. 이러한 기술 및 검정은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 결합 친화도는 "Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)"의 스캐차드(Scatchard) 분석으로 측정할 수 있다.
목적한 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 클론을 희석 과정을 제한함으로써 아클론화(subcloned)하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다(Goding, supra). 이 목적을 위한 적합한 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 포유동물의 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
아클론에 의해 분비된 단일클론 항체를 배지, 복수액(ascites fluid) 또는 혈청으로부터 통상의 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어, 단백질 A-세파로스 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화도 크로마토그래피 및 상기한 바와 같은 기타 방법으로 적합하게 분리한다.
항-C1q 단일클론 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은, 또한 위에 기재된 것과 같은 재조합 DNA법으로 제조할 수 있다. 단일클론 항체를 코드화하는 DNA는 통상의 방법을 사용하여(예를 들어, 생쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 분리하고 서열화한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 제공된다. DNA가 일단 분리되면, DNA를, 재조합 숙주 세포 내에서 단일클론 항체를 합성하기 위해 차후에 숙주 세포(예를 들어, E. coli 세포, 유인원 COS 세포, 중국비단털쥐난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포)로 형질감염되는, 발현 벡터에 넣는다. 항체를 코드화하는 DNA의 세균에서의 재조합 발현에 대한 리뷰글은 "Skerra et al., Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993)" 및 "Pluckthun, Immunol. Rev. 130:151-188 (1992)"을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-C1q 항체는 "McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)"에 기재된 기술을 사용하여 제조된 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 문헌 "Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)" 및 "Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)"은 각각 파지 라이브러리로부터의 생쥐 항체의 분리 및 사람 항체의 분리를 기재하였다. 이후의 문헌들은 쇄 셔플링에 의한 고친화도(나노몰 "nM" 범위) 사람 항체의 생산(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)) 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합(Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993))을 기재하고 있다. 따라서, 이들 기술은 목적한 특이성의 단일클론 항체(예를 들어, 본원의 C1q 단백질에 결합하는 항체)의 분리를 위해 고전적인 단일클론 항체 하이브리도마 기술의 성공가능한 대안이다.
항체를 코드화하는 DNA 또는 이의 단편을 또한, 예를 들어, 코드화 서열을 동종 생쥐 서열 대신 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인으로 대체함으로써(미국 특허 제4,816,567호; Morrison, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 코드화 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코드화 서열에 공유결합시킴으로써 개질시킬 수 있다. 전형적으로 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 항체의 불변 도메인으로 대체되거나, 하나의 항원에 대한 특이성을 갖는 항원-결합 위치 및 다른 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원-결합 위치를 포함하는 키메라 이가 항체를 생성하기 위해 하나의 항체의 하나의 항원-결합 위치의 가변 도메인으로 대체된다.
본원에 기재된 단일클론 항체(예를 들어, 본원의 항-C1q 항체 또는 이의 단편)는 일가일 수 있고, 이의 제조는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 개질된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 상기 중쇄를, 중쇄 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점의 길이를 줄인다. 다르게는, 가교결합을 방지하기 위해 관련 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환할 수 있거나 제거할 수 있다. 시험관내 방법은 또한 일가 항체를 제조하는데 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 생산하기 위한 항체의 소화는 당해 분야에 공지된 통상의 기술을 사용하여 성취할 수 있다.
키메라 또는 하이브리드 항-C1q 항체를 또한 가교결합제가 관련된 방법을 포함한 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조할 수 있다. 예를 들어, 다이설파이드-교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 생성함으로써 면역독소를 생성시킬 수 있다. 이 목적을 위해 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
(3) 인간화 항체
본원의 항-C1q 항체 또는 이의 항체 단편은 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-사람(예를 들어, 생쥐) 항체의 인간화 형태는 비-사람 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린쇄 또는 이의 단편(예를 들어, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 위치)이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 목적한 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-사람종(공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 사람 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우, 사람 면역글로불린의 Fv 골조 잔기가 상응하는 비-사람 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체에서도 이입된 CDR이나 골조 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는, 전부 또는 사실상 전부의 CDR 영역이 비-사람 면역글로불린의 관련 영역에 상응하고 전부 또는 사실상 전부의 FR 영역이 사람 면역글로불린 공통(consensus) 서열의 관련 영역에 상응하는 가변 도메인을 사실상 전부 또는 하나 이상, 전형적으로 2개를 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 사람 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다(Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) 및 Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)). 몇몇 실시양태에서, 상기 항-C1q 항체는 본원에 기재된 임의의 항-C1q 항체(예를 들어, 항체 M1 및 4A4B11)의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 사람 면역글로불린으로부터의불변 영역을 포함하는 키메라 항체이다.
비-사람 항-C1q 항체의 인간화방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-사람 공급원으로부터 도입된 아미노산 잔기를 하나 이상 갖는다. 이러한 비-사람 아미노산 잔기는 종종 "이입(import)" 가변 도메인으로부터 전형적으로 취해지는 "이입" 잔기로 지칭된다. 인간화는 필수적으로 "Winter and co-workers, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)"의 방법에 따라, 또는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 사람 항체의 상응하는 서열로 대체함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 사람 가변 도메인이 결코 비-사람종으로부터의 상응하는 서열로 치환되지 않는 키메라 항체이다(미국 특허 제4,816,567호). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 몇몇 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇 FR 잔기가 설치류 항체의 상사 위치로부터의 잔기에 의해 치환된 사람 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄의 사람 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적(best-fit)"법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 사람 가변 도메인 서열의 라이브러리에 대해 선별한다. 이어서 설치류 서열에 가장 근접한 사람 서열을 인간화 항체를 위한 사람 골조(FR)로서 수용한다(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 아그룹의 모든 사람 항체의 공통 서열로부터 유도된 특정 골조를 사용한다. 동일한 골조가 몇몇 상이한 인간화 항체를 위해 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
또한, 항체는 항원에 대한 높은 친화도 및 기타 유리한 생물학적 특성을 갖도록 인간화되는 것이 중요하다. 이 목표를 성취하기 위해, 모 서열 및 인간화 서열의 입체 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념의 인간화 생성물의 분석방법을 통해 인간화 항체를 제조한다. 면역글로불린 입체 모델이 통상적으로 이용가능하고 당해 분야의 숙련가에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 개연성있는 입체 배좌 구조를 설명하고 보여주는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이의 조사는 상기 후보 면역글로불린 서열의 기능에 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 항원에 결합하는 상기 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이렇게 하여, 수용자 및 이입 서열로부터 FR 잔기가 선택되고 조합되어 목적한 항체 특징, 예를 들어, 표적 항원 또는 항원들(예를 들어, 본원의 C1q 단백질)에 대한 증가된 친화도가 성취된다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 직접적으로, 또한 가장 실질적으로 관련된다.
다양한 형태의 인간화 항-C1q 항체가 고찰된다. 예를 들어, 상기 인간화 항-C1q 항체는 면역접합을 생성시키기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)와 임의로 접합된 Fab와 같은 항체 단편일 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 인간화 항-C1q 항체는 무손상 IgG1 항체와 같은 무손상 항체일 수 있다.
(4) 사람 항체
대안적으로, 사람 항-C1q 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역화시 내생 면역글로불린 생산의 부재하에 사람 항체의 전체 목록을 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 이제 생산할 수 있다. 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서의 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형(homozygous) 제거는 내생 항체 생산의 완전 억제를 제공한다. 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에서의 사람 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 수송은 항원 챌린지시 사람 항체의 생산을 초래한다(예를 들어, "Jakobovits et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)"; "Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)"; "Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)"; 미국 특허 제5,591,669호 및 WO 97/17852 참조).
그렇지 않으면, 비면역화 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자로부터 사람 항-C1q 항체 및 시험관내 항체 단편을 생산하기 위해 파지 디스플레이 기술을 사용할 수 있다(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)). 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 사상 박테리오파지(filamentous bacteriophage)의 메이저 또는 마이너 코트(major or minor coat) 단백질 유전자, 예를 들어, M13 또는 fd 내로 뼈대가 완성되어 복제되고, 파지 입자의 표면상에 기능적 항체 단편을 내보인다. 사상 입자가 파지 게놈의 단가닥 DNA 복제를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기초로 한 선택은 또한 이러한 특성을 나타내는 항체를 코드화하는 유전자의 선택을 야기한다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성 중 몇몇을 모사한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 예를 들어, "Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993)"에서 검토할 수 있다. V-유전자 분획의 몇몇 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. "Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)"에서는 면역화 마우스의 비장으로부터 유도된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 분리하였다. 비면역화 사람 공여자로부터의 V 유전자의 목록이 구성될 수 있고 항원(자기-항원 포함)의 다양한 배열에 대한 항체가 필수적으로 "Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)" 또는 "Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)"에 기재된 기술에 따라 분리될 수 있다. 또한 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호도 참조한다. 추가로, 사람 항-C1q 항체 및 시험관내 항체 단편을 생산하기 위해 이스트 디스플레이 기술을 사용할 수 있다(예를 들어, WO 2009/036379; WO 2010/105256; WO 2012/009568; US 2009/0181855; US 2010/0056386; 및 Feldhaus and Siegel (2004) J. Immunological Methods 290:69-80). 다른 실시양태에서, 사람 항-C1q 항체 및 시험관내 항체 단편을 생산하기 위해 리보좀 디스플레이 기술을 사용할 수 있다(예를 들어, "Roberts and Szostak (1997) Proc Nat'l Acad Sci 94:12297-12302"; "Schaffitzel et al. (1999) J. Immunolical Methods 231:119-135"; "Lipovsek and Pluckthun (2004) J. Immunological Methods 290:51-67").
콜(Cole) 등과 뵈르너(Boerner) 등의 기술이 또한 사람 항-C1q 항체의 제조를 위해 이용가능하다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991)). 유사하게, 사람 항-C1q 항체는 사람 면역글로불린 좌위를 내생 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)에게 도입함으로써 만들 수 있다. 챌린지시 사람 항체 생산이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 포함한 모든 측면에서 사람에서 보이는 것과 아주 흡사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호 및 제5,661,016호와 다음 과학 간행물에 기재되어 있다: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
끝으로, 사람 항-C1q 항체는 또한 활성화 B-세포에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).
(5) 항체 단편
특정 실시양태에서, 항-C1q 전항체를 사용하는 것보다 항-C1q 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 보다 작은 단편 크기는 신속한 제거를 가능하게 한다.
항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해 소화를 통해 유도되었다(예를 들어, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Method. 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985) 참조). 그러나, 이러한 단편들은 이제 재조합 숙주 세포에 의해, 예를 들어, 본원의 항-C1q 항체를 코드화하는 핵산을 사용하여 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 단편들은 모두 E. coli에서 발현되고 이로부터 분비되어, 이들 단편의 간단한 대량 생산이 가능하다. 항-C1q 항체 단편은 또한 상기한 바와 같이 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 대안으로, Fab'-SH 단편이 E. coli로부터 직접 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 생성된다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편이 재조합 숙주 세포 배지로부터 직접 분리될 수 있다. 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 항체 단편의 생산은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다(WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호 참조). 항-C1q, 항-C1r 또는 항-Clq 항체 단편이 또한, 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이성 또는 이중특이성일 수 있다.
(6) 이중특이 및 다중특이 항체
이중특이 항체(BsAb)는 동일하거나 상이한 단백질(예를 들어, 본원의 하나 이상의 C1q 단백질) 상에서의 에피토프를 포함한, 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 그렇지 않으면, BsAb의 한 부분이 표적 C1q 항원에 결합하기 위한 암(arm)일 수 있고, 다른 부분은 두 번째 단백질에 결합하는 암과 조합될 수 있다. 이러한 항체는 전장 항체나 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중특이 항체)으로부터 유도될 수 있다.
이중특이 항체의 제조방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이 항체의 고전적 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동발현을 기초로 하며, 여기서 상기 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 모음으로 인해, 이들 하이브리도마(quadromas)는 10개의 상이한 항체 분자들의 잠재 혼합물을 생성하는데고, 상기 분자 중 하나만 정확한 이중특이 구조를 갖는다. 통상 친화성 크로마토그래피 단계에서 행해지는 상기 정확한 구조의 정제는 상당히 어렵고 생성물 수율이 낮다. 유사한 과정이 WO 93/08829 및 "Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)"에 기재되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 목적한 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 위치)이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합체는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 최소한 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 결합에 필수적인 위치를 함유하는 첫 번째 중쇄 불변 영역(CH1)이 융합체 하나 이상에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 목적한 경우, 면역글로불린 경쇄를 코드화하는 DNA가 개별 발현 벡터내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체내로 공동-형질전환된다. 이는, 구성에 사용된 3개의 폴리펩타이드쇄의 부등 비율이 최적 수율을 제공하는 경우, 실시양태에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호간 비율을 조절하는 데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동등 비율의 적어도 2개의 폴리펩타이드쇄의 발현이 고수율을 제공하는 경우 또는 상기 비율이 특별한 유의성이 없는 경우, 하나의 발현 벡터내의 3개의 폴리펩타이드쇄 중 2개 또는 3개 모두에 대한 코드화 서열을 삽입할 수 있다.
이 접근법의 몇몇 실시양태에서, 이중특이 항체는 하나의 암에 첫 번째 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(두 번째 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이러한 비대칭 구조는 목적한 이중특이 화합물을 원치않는 면역글로불린쇄 조합으로부터 분리하는 것을 용이하게 하는데, 그 이유는 상기 이중특이 분자의 반쪽에만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 쉬운 분리 방법을 제공하기 때문이다. 이 접근법은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이중특이 항체의 생성에 대한 추가의 상세한 사항에 대해서는, 예를 들어, "Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)"을 참조한다.
WO 96/27011 또는 미국 특허 제5,731,168호에 기재된 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자간의 계면이 재조합-세포 배지로부터 회수되는 헤테로다이머의 퍼센트를 최대화하기 위해 가공될 수 있다. 상기 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 이 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 상기 큰 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 보상(compensatory) "공동(cavity)"이, 큰 아미노산 측쇄가 보다 작은 것(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체됨으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 생긴다. 이는 호모다이머와 같은 원치않는 최종 생성물에 비해 헤테로다이머의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
항체 단편으로부터 이중특이 항체를 생성시키는 기술은 문헌에 기재되어 있었다. 예를 들어, 이중특이 항체는 화학 결합을 사용하여 제조할 수 있다. "Brennan et al., Science 229:81 (1985)"은 무손상 항체가 단백질분해적으로 분리되어 F(ab')2 단편을 생성시키는 과정을 기재하고 있다. 이들 단편은 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원되어 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 다이설파이드 생성을 방지한다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 재전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나가 Fab'-TNB 유도체로 재전환되어 이중특이 항체를 형성시킨다. 생성된 이중특이 항체는 효소의 선택적 부동화에 대한 시약으로 사용될 수 있다.
Fab' 단편은 E. coli 로부터 직접 회수할 수 있고 화학적으로 커플링하여 이중특이 항체를 형성한다. "Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)"은 완전히 인간화 이중특이 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 별도로 E. coli 로부터 선택되고 시험관내 화학적 커플링시켜 이중특이 항체를 형성시킨다. 이렇게 형성된 이중특이 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 사람 T-세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 사람 유방 종양 표적에 대한 사람 세포독성 림프구의 용해 활성을 야기한다.
이가 항체 단편을 재조합 세포 배지로부터 직접 제조하고 분리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 이가 헤테로다이머는 류신 지퍼(leucine zipper)를 사용하여 생산되었다(Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 결합되었다. 항체 호모다이머는 힌지 영역에서 환원되어 모노머를 형성시킨 다음, 재산화되어 항체 헤테로다이머를 생성시켰다. "Hollinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)"에 기재된 "이중체" 기술은 이중특이/이가 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 메카니즘을 제공하였다. 상기 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 결합된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하고, 상기 링커는 동일한 쇄 상에서 상기 2개의 도메인을 쌍으로 만들기에는 너무 짧다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인을 다른 단편의 상보적 VH 및 VL 도메인과 쌍으로 만들어서 2개의 항원-결합 위치를 생성시킨다. 단일쇄 Fv(sFv) 다이머의 사용에 의한 이중특이/이가 항체 단편을 제조하기 위한 다른 전략이 또한 보고되었다(참조: Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)).
2개 이상의 원자가를 갖는 항체가 또한 포함된다. 예를 들어, 삼중특이 항체가 제조될 수 있다(Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).
예시된 이중특이 항체는 2개의 상이한 항원에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이중특이 항체는 제1 항원 C1q 및 혈액-뇌-장벽을 통한 수송을 용이하게 하는 제2 항원에 결합될 수 있다. 혈액-뇌-장벽을 통한 수송을 용이하게 하는 다수의 항원이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, "Gabathuler R., Approaches to transport therapeutic drugs across the blood-brain barrier to treat brain diseases, Neurobiol. Dis. 37 (2010) 48-57" 참조). 이러한 제2 항원은 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGFR), 저밀도 지단백질 수용체 관련된 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), CRM197(디프테리아 독소의 비독성 돌연변이)을 포함하는 디프테리아 독소 수용체, TMEM 30(A)(플립파제)와 같은 라마 단일 도메인 항체, TAT와 같은 단백질 도입 도메인, Syn-B, 페너트라틴, 폴리-아르기닌 또는 일반적으로 양전하를 띤 펩타이드, 및 ANG1005와 같은 안지오펩 펩타이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예를 들어, "Gabathuler, 2010" 참조).
(7) 다가 항체
다가 항체는 이 항체가 결합된 항원을 발현하는 세포에 의해 이가 항체보다 빠르게 흡수(및/또는 이화)될 수 있다. 본원의 항-C1q 항체 또는 이의 항체 단편은 3개 이상의 항원 결합 위치를 갖는 (IgM급 이외의) 다가 항체(예를 들어, 4가 항체)일 수 있고, 이는 상기 항체의 폴리펩타이드쇄를 코드화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 상기 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 위치를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다. 이 사나리오에서, 상기 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역에 대한 3개 이상의 항원 결합 위치 아미노 말단을 포함할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 및 몇몇 실시양태에서는 4개의 항원 결합 위치를 함유한다. 다가 항체는 하나 이상의 폴리펩타이드쇄 (및 몇몇 실시양태에서는 2개의 폴리펩타이드쇄)를 함유하는데, 여기서 상기 폴리펩타이드쇄 또는 쇄들은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드쇄 또는 쇄들은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc(여기서, VD1은 첫 번째 가변 도메인이고, VD2는 두 번째 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩타이드쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내고, n은 0 또는 1이다)를 포함할 수 있다. 유사하게, 상기 폴리펩타이드쇄 또는 쇄들은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역쇄 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역쇄를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 2개 이상 (및 몇몇 실시양태에서는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는, 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려된 상기 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
(8) 이종접합 항체
이종접합 항체가 또한 본원의 범위 내에 있다. 이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체(예를 들어, 본원의 항-C1q 항체 또는 이의 항체 단편)로 이루어진다. 예를 들어, 이종접합된 항체 중 하나는 아비딘에 커플링된 것이고 다른 하나는 바이오틴에 커플링된 것일 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 원치않는 세포에 대한 표적 면역 시스템 세포로 제안되었고(미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염 치료에 사용되었다(국제 공보 WO 91/00360 및 WO 92/200373, 및 EP 0308936). 상기 항체는 가교결합제가 관여하는 방법을 포함한, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 면역독소는 다이설파이드 교환반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 생성시킴으로써 구성할 수 있다. 이를 위해 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸 4-머캅토부티르이미데이트와, 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호에 기재된 것들이 포함된다. 이종접합 항체는 임의의 통상적인 가교결합법을 사용하여 만들 수 있다. 적합한 가교결합제는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.
(9) 실행 기능 가공
본원의 항-C1q 항체를, 실행 기능을 개선시키고/시키거나 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 개질시키는 것이 또한 바람직하다. 예를 들어, 불변 영역상의 Fc 수용체 결합 위치를 특정한 Fc 수용체, 예를 들어, FcγRI, FcγRII 및/또는 FcγRIII에 대한 결합 친화도를 없애거나 감소시키기 위해 개질시키거나 돌연변이화할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 실행 기능은 Fc 영역(예를 들어, IgG의 CH2 도메인에서)의 N-글리코실화를 제거함으로써 부여된다. 몇몇 실시양태에서, 실행 기능은 PCT WO 99/58572 및 "Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000)"에 기재된 바와 같이 사람 IgG의 233-236, 297 및/또는 327-331과 같은 영역을 개질시킴으로써 부여된다.
본원에 기재된 항-보체 항체의 불변 영역이 또한 개질되어 보체 활성화를 손상시킬 수 있다. 예를 들어, IgG 항체의 보체 활성화에 따른 보체의 C1 성분의 결합이 C1 결합 모티프(예를 들어, C1q 결합 모티프)에서의 불변 영역에서의 아미노산의 돌연변인화에 의해 감소될 수 있다. 사람 IgG1의 D270, K322, P329, P331 각각에 대한 Ala 돌연변이가 C1q에 대한 상기 항체의 결합 능력 및 보체 활성화를 현저히 저하시키는 것으로 보고되었다. 생쥐 IgG2b의 경우, C1q 결합 모티프는 잔기 E318, K320 및 K322를 구성한다(Idusogie et al. (2000) J. Immunology 164:4178-4184; Duncan et al. (1988) Nature 322: 738-740). 생쥐 IgG2b에 대해 동정된 C1s 결합 모티프 E318, K320 및 K322가 기타 항체 아이소타입에 대해 공통인 것으로 여겨지기 때문에(Duncan et al. (1988) Nature 322:738-740), IgG2b에 대한 C1q 결합 활성은 3개의 특정화된 잔기 중 임의의 하나가 그 측쇄에 부적합한 관능기를 갖는 잔기로 대체됨으로써 없어질 수 있다. 이온성 잔기들만을 Ala로 대체하여 C1q 결합을 없앨 필요는 없다. 또한, C1s 결합을 없애기 위해, 다른 알킬-치환된 비이온성 잔기들, 예를 들어, Gly, Ile, Leu 또는 Val, 또는 방향족 비극성 잔기, 예를 들어, Phe, Tyr, Trp 및 Pro를 상기 3개의 잔기 중 임의의 하나 대신 사용할 수 있다. 또한, C1q 결합 활성을 없애기 위해, 극성 비이온성 잔기, 예를 들어, Ser, Thr, Cys 및 Met를 잔기 320 및 322 대신(318은 아님) 사용할 수도 있다. 또한, 보체 결합에 필수적인 Fc 영역의 탄수화물 개질의 제거는 보체 활성화를 막을 수 있다. IgG 중쇄의 CH2 도메인상에서의 보존된 아스파라긴(Asn-297)의 글리코실화는 항체 실행 기능에 필수적이다(Jefferis et al. (1998) Immunol Rev 163:59-76). Fc 글리칸의 개질은 IgG 형태를 바꾸고, 보체 단백질 C1q와 실행 세포 수용체 FcR의 결합에 대한 Fc 친화도를 저하시킨다(Alhorn et al. (2008) PLos ONE 2008;3:e1413). Fc 글리칸의 완전 제거는 CDC 및 ADCC를 없앤다. 데글리코실화(deglycosylation)는 글리코시다제 효소, 예를 들어, 다른 면역글로불린급 또는 기타 당단백에 대한 작용없이 모든 IgG 아급의 중쇄상의 아스파라긴-결합된 글리칸을 선택적으로 소화하는 스트렙토코커스 화농균의 유전자 엔도에스(endoS)에 의해 코드화된 108kDa 효소인 엔도글리코시다제 S(EndoS)를 사용하여 수행할 수 있다(Collin et al. (2001) EMBO J 2001;20:3046-3055).
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이, 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프를 상기 항체(특히 항체 단편)에 도입할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 생체내 혈청 반감기를 증가시킬 책임이 있는 상기 IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
(10) 기타 아미노산 서열 개질
본원의 항-C1q 항체 또는 이의 항체 단편의 아미노산 서열 개질이 또한 포함된다. 예를 들어, 상기 항체 또는 항체 단편의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편을 코드화하는 핵산에 적합한 뉴클레오타이드 변경을 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 상기 항체 또는 항체 단편의 아미노산 서열 변종을 제조한다. 이러한 개질은, 예를 들어, 상기 항체의 아미노산 서열내의 잔기로부터의 제거 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 임의 조합의 제거, 삽입 및 치환으로 최종 구조에 도달하고, 단 최종 구조는 바람직한 특성(즉, 본원의 C1q에 결합하거나 이와 물리적으로 상호작용하는 능력)을 갖는다. 아미노산 변경은 또한 상기 항체의 번역후 과정, 예를 들어, 글리코실화 위치의 수 또는 위치의 변경을 바꿀 수 있다.
돌연변이에 대한 바람직한 위치인, 상기 항-C1q 항체의 특정 잔기 또는 영역의 동정을 위한 유용한 방법은 "Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989)"에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기 그룹은 동정되고(예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu과 같은 하전된 잔기) 전하를 띠지 않거나 음전하를 갖는 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 상기 아미노산과 표적 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서 추가 변종 또는 기타 변종이 치환 위치에 또는 치환을 위해 도입됨으로써 치환에 대한 기능적 감도를 나타내는 아미노산 위치가 개선된다. 따라서, 아미노산 서열 변종 도입을 위한 위치는 미리 결정되는 반면, 돌연변이 자체의 특성은 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 제시된 위치에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이가 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고 발현된 항체 변종은 바람직한 활성에 대해 선별된다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 아미노("N") 및 카복시("C") 말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 서열의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩타이드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변종은 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드로의 상기 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
다른 유형의 변종은 아미노산 치환 변종이다. 이들 변종은 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 대체된 항체 분자에 갖는다. 치환 돌연변이를 위해 가장 흥미로운 위치는 과가변 영역을 포함하나, FR 변경도 포함된다. 보수적 치환을 하기 표 A에 "바람직한 치환"의 제목하에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성을 변경시키면, 표 A에 "바람직한 치환"으로 명명되거나 아미노산급에 대해 아래에 추가로 기재된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물이 선별된다.
표 A: 아미노산 치환
Figure 112016011187739-pct00002

상기 항체의 생물학적 특성의 실질적 개질은 (a) 치환 면적에서의 폴리펩타이드 골격의 구조, 예를 들어, 시트 또는 나선 구조, (b) 표적 위치에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지시키는 영향면에서 현저히 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기초로 다음 그룹으로 나뉜다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 상기 급들 중 어느 정도의 것을 다른 급으로 교환하는 것을 수반한다.
상기 항체의 적합한 구조를 유지하는데 관여하지 않은 임의의 시스테인 잔기가 또한 상기 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상(aberrant) 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 항체의 안정성 개선을 위해 시스테인 결합(들)이 항체에 첨가될 수 있다(특히 상기 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
몇몇 실시양태에서, 치환 변종은 모 항체의 하나 이상의 과가변 영역 잔기의 치환을 포함한다(예를 들어, 인간화 또는 사람 항-C1q 항체). 일반적으로, 추가 형성을 위해 선택된 생성된 변종(들)은 이들이 생성된 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환형 변종을 생성하기 위한 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 포함한다. 간단히 말하면, 몇몇 과가변 영역 잔기(예를 들어, 6 내지 7개의 위치)를 성숙시켜 각각의 위치에서의 모든 가능한 아미노 치환을 발생시킨다. 이렇게 생성된 항체 변종은 각 사상 파지 입자내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합으로서 사상 파지 입자로부터 1가 방식으로 나타난다. 이어서, 파지 디스플레이된 변종은 본원에 기재된 바와 같이 그들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)으로 선별된다. 후보 과가변 영역 위치를 개질에 대해 동정하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이를 수행하여 항원 결합에 현저히 공헌한 과가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 그렇지 않으면, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원(예를 들어, 본원의 C1q 단백질) 사이의 접촉점을 동정하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접한 잔기가 본원에서 검토된 기술에 따른 치환용 후보이다. 일단 이러한 변종이 생산되면, 변종의 패널(panel)을 본원에 기재된 바와 같이 선별하고 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 형성을 위해 선택할 수 있다.
상기 항체의 아미노산 변종의 다른 유형이 상기 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변경한다. 변경이란 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 탐지 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 위치의 첨가를 의미한다.
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-링크되거나 O-링크된 것이다. N-링크된 것이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 결합된 것을 말한다. 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌의 트리펩타이드 서열(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 잔기의 아스파라긴 측쇄로의 효소적 결합에 대한 인지 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 중의 이들 트리펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 위치를 생성한다. O-링크된 글리코실화는 당인 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토즈 또는 자일로스 중 하나가 하이드록시아미노산-비록 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용될 수 있지만-가장 흔히는 세린 또는 트레오닌에 결합한 것을 말한다.
항체로의 글리코실화 위치의 추가는 아미노산 서열을, 이것이 (N-링크된 글리코실화 위치에 대해) 하나 이상의 상기한 트리펩타이드 서열을 함유하도록 변경함으로써 편리하게 수행한다. 상기 변경은 또한 (O-링크된 글리코실화 위치에 대해) 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래 항체의 서열에 첨가하거나 상기 잔기로 치환함으로써 이룰 수 있다.
항-IgE 항체의 아미노산 서열 변종을 코드화하는 핵산은 당해 분야에 공지된 여러 가지 방법으로 제조할 수 있다. 이들 방법은 천연 공급원으로부터의 분리(잔연 발생 아미노산 서열 변종의 경우) 또는 올리고뉴클레오타이드-매개된 (또는 위치-지시된) 돌연변이, PCR 돌연변이, 및 항체(예를 들어, 본원의 항-C1q 항체) 또는 항체 단편의 미리 제조된 변종 또는 비-변종 형태에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
(11) 기타 항체 개질
본원의 항-C1q 항체 또는 이의 항체 단편은 당해 분야에 알려져 있고 쉽게 이용가능한 추가의 비-단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 개질될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 포로피온알데히드는 이의 수중 안정성으로 인해 제조에 유리하다. 상기 중합체는 어떠한 분자량이어도 되고 측쇄 또는 비측쇄일 수 있다. 상기 항체에 결합된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 이상의 중합체가 결합하는 경우, 이는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개질되는 항체의 특별한 특성 또는 기능, 항체가 한정된 조건하에 치료에 사용될지의 여부 등을 포함한 고려사항에 기초해 결정할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 기술 및 기타 적합한 제제들이 "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000)"에 기재되어 있다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
본원의 항-C1q 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 임의의 항-C1q 항체를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 상기 항-C1q 항체의 VL을 함유하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 함유하는 아미노산 서열(예를 들어, 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코드화할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 핵산을 함유하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 핵산을 함유하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 (1) 상기 항체의 VL을 함유하는 아미노산 서열 및 상기 항체의 VH를 함유하는 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 함유 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL을 함유하는 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 함유 제1 벡터 및 상기 항체의 VH를 함유하는 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 함유 제2 벡터를 함유한다(예를 들어, 상기 (1) 또는 (2)가 형질도입된다). 몇몇 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어, 중국비단털쥐난소(CHO) 세포 또는 림프구양세포(lymphoid cell)(예: Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
본원의 항-C1q 항체의 제조방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 항체 발현에 적합한 조건하에서 상기 항-C1q 항체를 코드화하는 핵산을 함유하는 본원의 숙주 세포의 배양을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 후속적으로 상기 숙주 세포로부터 회수된다. 또한 실시예 1 참조.
본원의 항-C1q 항체의 재조합 생산을 위해, 상기 항-C1q 항체를 코드화하는 핵산을 숙주 세포 내에서의 추가 클로닝(cloning) 및/또는 발현을 위해 분리하고 하나 이상의 벡터내로 삽입한다. 이러한 핵산은 쉽게 분리될 수 있고 통상의 절차를 사용하여(예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 서열화할 수 있다.
본원의 임의의 항-C1q 항체를 코드화하는 핵산 서열 또는 이의 단편인 본원에 기재된 (항체를 포함하는) 폴리펩타이드를 함유하는 적합한 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구성될 수 있거나, 당해 분야에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있는 반면, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가복제능력을 갖고 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 가질 수 있고/있거나 상기 벡터를 함유하는 클론을 선택하는 데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 가지고 있을 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 세균 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript)(예: pBS SK+) 및 이의 유도체, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 pSA3 및 pAT28과 같은 셔틀 벡터(shuttle vector)를 포함한다. 이들 및 다수의 기타 클로닝 벡터가 바이오라드(BioRad), 스트레이트진(Strategene) 및 인비트로겐(Invitrogen)과 같은 판매업자로부터 구입가능하다.
발현 벡터는 일반적으로 본원의 핵산을 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오타이드 구조이다. 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 유전자부체 또는 염색체 DNA의 구성요소로서 복제가능하다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드를 포함하는 바이러스 벡터, 및 PCT 공보 WO87/04462에 기재되어 있는 발현 벡터(들)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 적합한 전사 제어 요소(예: 촉진제, 개선제 및 종결제). 발현(예를 들어, 번역)을 위해, 리보좀 결합 위치, 번역억제 위치 및 정지 코돈과 같은 하나 이상의 번역 제어 요소가 또한 통상 필요하다.
흥미있는 핵산을 함유하는 벡터를 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 기타 물질을 사용한 형질감염; 미세투과물 충격(microprojectile bombardment); 리포펙션(lipofection); 및 감염(예를 들어, 벡터가 우두바이러스와 같은 감염제인 경우)을 포함하는 다수의 임의의 적합한 수단을 사용하여 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드의 도입의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 좌우될 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 벡터는 본원의 항-C1q 항체를 코드화하는 하나 이상의 아미노산 서열을 함유하는 핵산을 함유한다.
항체-코드화 백터의 클로닝 또는 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 본원의 항-C1q 항체는 세균 내에서, 특히 글리코실화 및 Fc 실행 기능이 필요하지 않은 경우 생산될 수 있다. 세균 내에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서는, 예를 들어, E. coli.의 항체 단편의 발현을 기재하고 있는 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호 및 제5,840,523호, 및 "Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254"을 참조한다. 발현 후, 상기 항체가 가용성 분획 내의 세균 세포 페이스트로부터 분리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에도, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물이 또한, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 완전히 사람 글리코실화 패턴을 갖는 항체가 생산되는 진균류 또는 효모 계통을 포함하는, 항체-코드화 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(예를 들어, "Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)" 및 "Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)").
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 또는 척추동물)로부터 유도될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 계통(baculoviral strain)이 확인되었다. 식물 세포 배지가 또한 숙주로서 사용될 수 있다(예를 들어, 형질변환 식물에서의 항체 생산을 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 기재하고 있는 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서의 성장에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)로 변형된 원숭이 신장 CV1주; 사람 배아 신장주(293 또는 293 세포가, 예를 들어, "Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)"에 기재되어 있음), 새끼 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney: BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들어, "Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 기재된 것과 같은 TM4); 원숭이 신장 CV1주; 아프리카 사바나원숭이 신장 세포(VERO-76); 사람 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 사람 폐 세포(W138); 사람 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어, "Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)"에 기재된 것과 같은 TRI 세포' MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유동물 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 중국비단털쥐난소(CHO) 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)), 및 Y0, NS0 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정한 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, "Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)"을 참조한다.
약제학적 조성물
본원의 항-C1q 항체는 이 항체가 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 합쳐져 치료학적 용도를 위한 여러가지의 제형으로(예를 들어, 투여에 의해) 또는 (예를 들어, 신경퇴행성 질환 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방용의) 약제의 제조에 도입될 수 있고, 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 제제의 예는 정제, 캡슐제, 산제(powders), 입제(granules), 연고제, 용액제, 현탁액제, 주사제, 흡입제, 겔제, 미소구제 및 에어로졸제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 약제학적 조성물은 목적한 제제에 따라 동물 또는 사람 투여용의 약제학적 조성물을 제형화하는 데 통상 사용되는 비히클인 희석제의 약제학적으로 하용되는 비독성 담체를 포함할 수 있다. 희석제는 배합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 완충수, 생리식염수, PBS, 링거 용액(Ringer's solution), 덱스트로즈 용액 및 행크 용액(Hank's solution)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원의 약제학적 조성물 또는 제제는 기타 담체, 보조제, 또는 비독성, 비치료학적, 비면역원성 안정제, 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한 생리학적 조건에 근사하게 하는 추가의 물질, 예를 들어, pH 조절제, 완충제, 독성 조절제, 습윤제 및 세제를 포함할 수 있다.
본원의 약제학적 조성물은 또한, 예를 들어, 항산화제와 같은 임의의 다양한 안정화제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물이 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 상기 폴리펩타이드는 이의 생체내 안정성을 개선시키거나, 그렇지 않으면 이의 약리학적 특성을 개선시키는(예를 들어, 상기 폴리펩타이드의 반감기를 개선시키고, 이의 독성을 저하시키고 용해도나 흡수도를 개선시키는) 다양한 잘 알려진 화합물과 착화될 수 있다. 이러한 개질 또는 착화제의 예는 설페이트, 글루코네이트, 시트레이트 및 포스페이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 조성물의 폴리펩타이드는 또한 이의 생체내 속성을 개선시키는 분자와 착화될 수 있다. 이러한 분자는 탄수화물, 폴리아민, 아미노산, 기타 펩타이드, 이온(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간) 및 지방을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 유형의 투여에 적합한 제제의 추가 예는 "Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)"에서 찾을 수 있다. 약물 전달 방법으 간단한 검토를 위해 "Langer, Science 249:1527-1533 (1990)"을 참조한다.
경구 투여를 위해, 활성 성분을 고체 투여형, 예를 들어, 캡슐제, 정제 및 산제, 또는 액체 투여형, 예를 들어, 엘릭시르제, 시럽제 및 현탁액제로 투여할 수 있다. 활성 성분(들)은 불활성 성분 및 분말화된 담체, 예를 들어, 글루코즈, 락토즈, 수크로즈, 만니톨, 전분, 셀룰로즈 또는 셀룰로즈 유도체, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 나트륨 사카린, 활석, 탄산마그네슘을 함께 젤라틴 캡슐 속에 캡슐화할 수 있다. 목적한 색상, 맛, 안정성, 완충능, 분산 또는 기타 공지된 목적한 특성을 제공하기 위해 첨가할 수 있는 추가의 비활성 성분의 예는 벵갈라(red iron oxode), 실리카겔, 나트륨 라우릴 설페이트, 이산화티탄, 및 식용 화이트 잉크이다. 압축 정체를 만들기 위해 유사한 희석제를 사용할 수 있다. 정제 및 캡슐제 둘 다 수 시간에 걸친 약제의 연속 방출의 제공을 위한 지연 방출 제품으로서 제조할 수 있다. 압축 정제는 임의의 불쾌한 맛을 차폐하고 정제를 대기로부터 보호하기 위해 당 또는 필름으로 코팅될 수 있고, 또는 소화관에서의 선택적 분해를 위해 장 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액제 투여형은 환자의 수용성을 증가시키기 위해 색상 및 향미를 함유할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제, 및 제제를 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성, 등장성 무균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 살균 현탁액을 포함한다.
상기 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용되는 성분은 바람직하게는 고순도이고 사실상 잠재적으로 유해한 오염물질을 함유하지 않는다(예를 들어, 적어도 NF(National Food) 등급, 일반적으로 적어도 분석적 등급, 보다 전형적으로 적어도 약제학적 등급). 또한, 생체내 용도용 조성물은 보통 무균이다. 제공된 화합물을 사용 전에 합성해야 할 정도로, 생성된 생성물은 전형적으로 합성 또는 정제 과정 동안 존재할 수 있는 임의의 잠재적 독성 제제, 특히 임의 내독소를 사실상 함유하지 않는다. 비경구 투여용 조성물은 또한 무균이고, 사실상 등장성이며 GMP 조건하에 제조된다.
제제는 뇌 또는 중추 신경계 내에 보유되고 안정화되기에 최적일 수 있다. 제제가 두개 구역(cranial compartment)으로 투여되는 경우, 제제는 구역 내에 보유되고 혈액 뇌 장벽으로 확산되거나 통과하지 않는 것이 바람직히다. 분자량 증가를 위한 안정화 기술은 가교결합, 다량체화, 또는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아미드, 중성 단백질 담체 등과 같은 그룹으로의 결합을 포함한다.
보유력을 증가시키기 위한 기타 전략은 본원의 항-C1q 항체와 같은 항체를 생분해성 임플란트(biodegradable or bioerodible implant)에 구속(entrapment)시키는 것을 포함한다. 치료학적 활성제의 방출 속도는 중합체 매트릭스를 통한 이동 속도 및 임플란트의 생분해에 의해 조절된다. 중합체 장벽을 통한 약제의 이동은 또한 화합물 안정성, 중합체 친수성, 중합체 가교결합 정도, 약제가 중합체 장벽을 보다 잘 투과할 수 있도록 하는 물 흡수시의 중합체의 팽창, 임플란트의 기하학적 구조 등에 의해 영향을 받는다. 임플란트는 이식 위치로 선택된 크기 및 형태에 상응하는 치수의 것이다. 임플란트는 입자, 시트, 패치, 플라크, 섬유, 미세캡슐 등일 수 있고, 선택된 삽입 위치에 맞는 임의의 크기 또는 형태일 수 있다.
임플란트는, 예를 들어, 중합체 매트릭스를 통해 균질하게 분포되어 있거나 캡슐화되어 있는(활성제 저장소가 중합체 매트릭스에 의해 캡슐화되어 있다), 활성제를 포함하는 모노리식(monolithic)일 수 있다. 사용될 중합체 조성물의 선택은 투여 위치, 목적한 치료 기간, 환자 수용성, 치료될 질환의 성질 등에 따라 달라질 것이다. 중합체의 특성은 이식 위치에서의 생분해성, 흥미로운 약제와의 상용성, 캡슐화의 용이성, 생리학적 환경에서의 반감기를 포함할 것이다.
사용될 생분해성 중합체 조성물은, 분해되는 경우, 단량체를 포함한 생리학적으로 허용되는 분해 산물을 생성시키는 유기 에스테르 또는 에테르일 수 있다. 무수물, 아미드, 오르토에스테르 등은 그 자체로 또는 다른 단량체와의 조합으로 사용될 수 있다. 상기 중합체는 축합 중합체일 수 있다. 상기 중합체는 가교결합된 것이거나 가교결합되지 않은 것일 수 있다. 특히 흥미로운 것은 단독중합체 또는 공중합체인 하이드록시 지방족 카복실산, 및 다당류의 중합체이다. 흥미로운 중합체에는 D-락트산, L-락트산, 라세믹 락트산, 글리콜산, 폴리카프로락톤 및 이의 조합이 포함된다. L-락테이트 또는 D-락테이트를 사용함으로써, 중합체의 느린 생분해가 달성되는데, 사실상 분해는 라세메이트로 증진된다. 글리콜산과 락트산의 공중합체가 특히 흥미로운데, 생분해 속도는 락트산에 대한 글리콜산의 비율에 의해 조절된다. 가장 신속히 분해되는 공중합체는 대략 동량의 글리콜산과 락트산을 갖는데, 단독중합체가 분해에 대해 보다 저항적이다. 락트산에 대한 글리콜산의 비율은 또한 임플란트의 취성에 영향을 미치는데, 보다 유연한 임플란트가 보다 큰 기하학적 구조를 위해 바람직하다. 흥미로운 다당류는 칼슘 알기네이트, 및 관능화된 셀룰로즈, 특히 수용성이며 분자량이 약 5kD 내지 500kD인 것이 특징인 카복시메틸셀룰로즈 에스테르 등이다. 생분해성 하이드로겔이 또한 본 발명의 임플란트에 사용될 수 있다. 하이드로겔은 전형적으로 액체를 흡수하는 능력이 특징인 공중합체 물질이다. 사용될 수 있는 생분해성 하이드로겔의 예는 "Heller in: Hydrogels in Medicine and Pharmacy, N. A. Peppes ed., Vol. III, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1987, pp 137-149"에 기재되어 있다.
약제학적 투여량
본원의 항-C1q 항체를 함유하는 본원의 약제학적 조성물은 볼러스(bolus)로서의 정맥내 투여와 같은 공지된 방법에 따라, 또는 일정 기간에 걸친 연속 투입, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 두개내, 피하, 관절내, 활막내(intrasynovial), 수막내(intrathecal), 경구, 국소 또는 흡입 경로로 사용될 수 있다(예를 들어, 치료가 필요한 개체, 예를 들어, 사람 개체에 항-C1q 항체 투여).
본원의 약제학적 조성물의 투여량 및 목적한 약제 농도는 구상된 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적합한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 통상의 기술자의 기술내에 있다. 동물 실험은 사람 치료를 위해 효과적인 용량 결정에 믿을 수 있는 가이드라인을 제공한다. 효과적인 용량의 종간 조절은 "Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46"에 기재된 원리에 따라 수행할 수 있다.
본원의 임의의 항-C1q 항체의 생체내 투여를 위해, 통상의 투여량은 투여 경로에 따라 1일당 개체의 체중 1kg당 약 10ng 내지 100mg 또는 그 이상으로 달라질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 투여량은 약 1mg/kg/일 내지 약 10mg/kg/일이다. 7일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 치료될 질환, 장애 또는 병태의 중증도에 따라, 증상의 목적한 억제가 성취될때까지 치료를 지속한다.
예시적 투여 용법은 항-C1q 항체를 약 2mg/kg의 초기 용량으로 투여한 후, 약 1mg/kg의 주간 유지 용량으로 격주로 투여함을 포함한다. 기타 투여 용법이 내과의가 성취하고자 하는 약물동력학 붕괴(decay) 패턴에 따라 유용할 수 있다. 예를 들어, 1주에 1회 내지 21회의 개체 투여가 본원에 포함된다. 특정 실시양태에서, 약 3㎍/kg 내지 약 2mg/kg의 용량 범위(예를 들어, 약 3㎍/kg, 약 10㎍/kg, 약 30㎍/kg, 약 100㎍/kg, 약 300㎍/kg, 약 1mg/kg 또는 약 2mg/kg)가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 빈도는 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 격일로 1회, 매주 1회, 2주에 1회, 4주에 1회, 5주에 1회, 6주에 1회, 7주에 1회, 8주에 1회, 9주에 1회, 10주에 1회, 또는 매달 1회, 2달에 1회, 3달에 1회, 또는 그 이상이다. 치료의 진전은 통상의 기술과 검정으로 쉽게 모니터링한다. 항-C1q 항체 투여를 포함한 투여 용법은 사용된 용량과는 독립적으로 기간에 걸쳐 달라질 수 있다.
특정 항-C1q 항체의 투여량은 상기 항-C1q 항체를 1회 이상 투여받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체는 상기 항-C1q 항체의 증분 용량을 투여받는다. 항-C1q 항체의 효능을 분석하기 위해, 신경퇴행성 장애, 염증성 장애 또는 자가면역 장애의 임의의 임상적 증상을 모니터링할 수 있다.
본원의 항-C1q 항체의 투여는, 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태에 따라, 투여 목적이 치료용인지 예방용인지에 따라, 또한 숙련된 의사에게 알려진 기타 요인에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 항-C1q 항체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 필수적으로 연속적이거나 일련의 간격을 둔 투여일 수 있다.
특정 투여량 및 전달 방법에 관한 가이드라인은 문헌에, 예를 들어, 미국 특허 제4,657,760호, 제5,206,344호 또는 제5,225,212호에 제공되어 있다. 상이한 제제가 상이한 치료 및 상이한 장애에 효과적일 것이고 특정 기관 또는 조직을 치료하고자 하는 투여가 상기와는 상이한 방식으로 다른 기관 또는 조직으로의 전달에 필요할 수 있음은 본원의 범위내에 있다. 또한, 투여량은 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 투입에 의해 투여될 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라, 질환 증상의 목적한 억제가 일어날때까지 치료가 지속된다. 그러나, 기타 투여량 용법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
치료 용도
본원은 항-C1q 항체, 및 C1q에 결합하고 이의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 상기 항체의 항원-결합 단편을 제공한다. 이들 항-C1q 항체는 신경퇴행성 장애, 염증성 장애 및 자가면역 장애를 포함하나 이에 한정되지 않는 보체 활성화와 관련된 질환 범위를 예방하거나 위험을 줄이거나 치료하는 데 유용하다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이, 본원의 항-C1q 항체는 개체에서의 신경퇴행성 장애, 염증성 장애 및 자가면역 장애를 포함하나 이에 한정되지 않는 보체 활성화와 관련된 질환을 치료하거나 예방하거나 위험을 줄이는 데 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 이러한 질환을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 사람이다.
본원의 항-C1q 항체로 치료될 수 있는 신경퇴행성 장애는 CF1-의존적 시냅스 소실을 포함한, 신경 연결 또는 시냅스의 소실과 관련된 질환을 포함한다. 이러한 장애는 알쯔하이머병, 근위축측삭경화증, 다발성 경화증, 녹내장, 근긴장성 이영양증, 다운증후군, 파킨슨병 및 헌팅톤병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 신경퇴행성 장애에서, 시냅스 소실은 보체 수용체 3(CR3)/C3 또는 보체 수용체 CR1에 좌우된다. 몇몇 신경퇴행성 장애에서, 시냅스 소실은 병리학적 활성-의존적 시냅스 가지치기와 관련된다. 몇몇 장애에서, 시냅스는 미세아교세포에 의해 포식된다(phagocytosed). 따라서, 본원의 항-C1q 항체가 본원의 신경퇴행성 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하거나 개선시키는데 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원은, 본원의 항-C1q 항체를, 예를 들어, C1q와 항강글리오사이드 자가항체와 같은 자가항체간의 상호작용, C1q와 C1r의 상호작용 및/또는 C1q와 C1s의 상호작용을 억제하기 위해 투여함으로써, 본원의 신경퇴행성 장애를 갖는 개체에서의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하거나 개선시키는 방법을 제공한다.
본원의 항-C1q 항체로 치료될 수 있는 염증성 또는 자가면역 질환은 류마티스성 관절염(RA), 급성 호흡곤란증후군(ARDS), 허혈 및 재관류 후 원격 조직 손상, 심폐우회술 동안의 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 루푸스신염 및 이로 인한 사구체신염과 혈관염, 심폐우회술, 심장마비-유도된 심장 내피 부전, 타입 II 막증식 사구체신염, IgA 신장병, 급성 신부전, 저온글로불린증, 항인지질증후군, 황반변성질환, 예를 들어, 연령 관련 황반변성(AMD), 맥락막혈관신생(CNV), 포도막염, 당뇨병 및 기타 허혈 관련 당뇨망막병증, 안구내염, 및 기타 안구내 혈관신생질환, 예를 들어, 당뇨황반부종, 병리학적 근시, 폰히펠-린다우병(von Hippel-Lindau disease), 눈의 히스토플라스마증, 시신경 척수염(NMO), 망막중심정맥폐쇄(CRVO), 각막혈관신생, 망막혈관신생, 뿐만 아니라 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 천식 및 흡인폐렴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 자가면역 질환은 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 중증근육무력증, 당뇨병 타입 1, 하시모토 갑상선염, 애디슨병, 셀리악병, 크론병, 악성빈혈, 심상성 천포창, 백반증, 자가면역 용혈빈혈, 부종양증후군, 혈관염, 류마티스성 다발성근육통, 관자동맥염 및 베게너 육아종을 추가로 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
시신경 척수염(NMO)과 같은 자가면역 질환에서, 자가항체가 보체 시스템을 활성화시킨다. NMO 환자에서, AQP4-표적화된 자가항체와 같은 자가항체의 이의 항원 AQP4로의 결합에 의해 고전적인 보체 경로가 촉발된다. 이에 의해 AQP4는 보체 활성화의 고전적 경로를 활성화한다. 이 활성화 과정의 첫 번째 단계에서, 보체 인자 C1q가 자가항체-자가항원-면역 복합체에 결합한다. 자가항체는 NMO 환자로부터의 혈청 항체(통상 NMO-IgG로 지칭됨)와 같은 자연 발생 항체, 또는 rAb-53과 같은 단일클론 항체를 포함할 수 있다.
따라서, 본원의 항-C1q 항체는 본원의 감염성 또는 자가면력 질환의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하거나 개선시키는데 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원은, 본원의 항-C1q 항체를, 예를 들어, C1q와 항강글리오사이드 자가항체와 같은 자가항체간의 상호작용, C1q와 C1r의 상호작용 및/또는 C1q와 C1s의 상호작용을 억제하기 위해 투여함으로써, 본원의 감염성 또는 자가면력 질환을 갖는 개체에서의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하거나 개선시키는 방법을 제공한다.
본원의 항-C1q 항체로 치료할 수 있는 대사 장애는 타입 II 당뇨병과 같은 당뇨병, 및 비만을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항-C1q 항체의 시험에 사용될 수 있는 대사 장애의 시험관내 및 생체내 모델은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 본원의 항-C1q 항체가 본원의 대사 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하거나 개선시키는 데 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원은, 본원의 항-C1q 항체를, 예를 들어, C1q와 항강글리오사이드 자가항체와 같은 자가항체간의 상호작용, C1q와 C1r의 상호작용 및/또는 C1q와 C1s의 상호작용을 억제하기 위해 투여함으로써, 본원의 대사 장애를 갖는 개체에서의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하거나 개선시키는 방법을 제공한다.
병용 치료
본원의 항체를 신경퇴행성 장애, 염증성 장애 및/또는 자가면역 장애의 임의의 추가 치료제와 조합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체가 치료학적 유효량으로 항-C1s 또는 항-C1r 항체와 같은 제2 항-보체 인자 항체(예를 들어, 중화 항-보체 인자 항체) 또는 제2 항-C1q 항체와 조합되어 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체가 치료학적 유효량으로 제2 항-C1q 항체, 항-C1s 항체 및/또는 항-C1r 항체와 같은 제2 및 제3 중화 항-보체 인자 항체와 함께 투여된다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체가 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 억제제와 조합되어 투여된다. ADCC 억제제는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C를 인지하는 살해세포 Ig-유사 수용체(KIR), 및 HLA-E(예를 들어, "Lopez-Botet M., T. Bellon, M. Llano, F. Navarro, P. Garcia & M. de Miguel. (2000), Paired inhibitory and triggering NK cell receptors for HLA class I molecules. Hum. Immunol. 61: 7-17"; "Lanier L.L. (1998) Follow the leader: NK cell receptors for classical and nonclassical MHC class I. Cell 92: 705-707" 참조) 및 카드뮴(예를 들어, "Immunopharmacology 1990; Volume 20, Pages 73-8" 참조)을 인지하는 CD94/NKG2A 헤테로다이머와 같은 가용성 NK 세포 억제 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 항체가 보체 활성화의 대안적 경로의 억제제와 조합되어 투여된다. 이러한 억제제는 인자 B 차단 항체, 인자 D 차단 항체; CD59, DAF, CR1 CR2, Crry, 또는 SB 290157과 같은 C3, 비-펩타이드 C3aR 길항제의 분리를 차단하는 콤스타틴(Comstatin)-유사 펩타이드의 가요성, 막-결합된, 표지되거나 융합된 단백질 형태; 코브라 독 인자, 또는 나파모스타트 메실레이트(FUTHAN; FUT-175), 아프로티닌, K-76 모노카복실산(MX-1) 및 헤파린과 같은 비-특이적 보체 억제제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(예를 들어, "T.E. Mollnes & M. Kirschfink, Molecular Immunology 43 (2006) 107-121" 참조). 몇몇 실시양태에서, 본원의 항체가 자가항체와 이의 항원간의 상호작용의 억제제와 조합되어 투여된다. 이러한 억제제는 자가항원, 또는 AQP4 항원의 아바타(minotope)를 포함한 펩타이드 또는 RNA-유도된 아바타의 항원 모사체의 정제된 가용성 형태를 포함할 수 있다. 다르게는, 이러한 억제제는 자가항원을 인지하고 고전적인 보체 경로를 촉발시키지 않으면서 자가항체의 결합을 방지하는 차단제를 포함할 수 있다. 이러한 차단제는, 예를 들어, 자가항원-결합 RNA 앱타머(aptamer) 또는 Fc 도메인에 기능적 C1q 결합 위치가 결여된 항체(예를 들어, Fab 단편, 또는 그렇지 않으면 C1q에 결합되도록 만들어진 항체)를 포함할 수 있다.
진단 용도
본원의 항체 또는 이의 기능적 단편은 또한 진단 용도를 갖는다. 그러므로, 본원은 개체 또는 개체로부터 유도된 조직 샘플에서의 C1q의 탐지와 같은 진단 목적을 위한 본원의 항체 또는 이의 기능적 단편의 사용방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 개체는 사람이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 개체는 신경퇴행성 장애, 또는 감염성 또는 자가면역 질환을 앓고 있는 사람이다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 항-C1q 항체가 시냅스 및 시냅스 소실을 탐지하는 데 사용된다. 예를 들어, 시냅스 소실은 알쯔하이머 질환 또는 녹내장과 같은 신경퇴행성 장애를 앓고 있는 개체에서 측정될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 진단방법은 본원의 항-C1q 항체 또는 이의 기능적 단편을 개체에 투여하는 단계, 및 상기 개체의 시냅스에 결합된 항체를 탐지하는 단계를 포함한다. 시냅스로의 항체-결합은, 예를 들어, 양전자방출단층촬영(PET), X-선 컴퓨터 단층촬영, 단일광자방출단층촬영(SPECT), 컴퓨터 단층촬영(CT) 및 컴퓨터 축 단층촬영(CAT)과 같은 비외과적 기술에 의해 정량화될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 진단방법은 생검 시료, 조직 또는 세포와 같은 생물학적 샘플에서의 시냅스의 탐지를 포함한다. 항-C1q 항체 또는 이의 기능적 단편이 상기 생물학적 샘플과 접촉되고 시냅스-결합된 항체가 탐지된다. 탐지방법은 시냅스-결합된 항체의 정량화를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플에서의 항체 탐지는 면역형광 현미경검사, 면역세포화학, 면역조직화학, ELISA, FACS 분석 또는 면역침전반응을 포함한 당해 분야에 알려진 임의의 방법으로 수행할 수 있다.
시냅스-결합된 항체의 정량화는 개체에 존재하는 시냅스의 수의 상대적 척도를 제공한다. 전형적으로, 시냅스는 일정 기간에 걸쳐 반복적으로 정량화된다. 시냅스 정량화의 정확한 주기는 신경퇴행성 질환, 질환 진행의 단계, 치료 양상 및 다수의 기타 인자를 포함한 다수의 인자에 좌우된다. 반복적 측정은 통상 신경퇴행성 장애를 갖는 개체에서의 점진적인 시냅스 소실을 드러낸다. 다르게는, 상대적인 시냅스 수가 단일 시점에서 질환을 갖는 개체 및 건강한 대조군에서 비교될 수 있다. 치료받고 있는 질환을 갖는 개체에서, 치료 효능은 치료된 개체에서의 시냅스 소실 속도를 대조군에서의 시냅스 소실 속도와 비교함으로써 평가할 수 있다. 대조군 구성원은 치료를 받지 않거나, 위약과 같은 대조군 치료를 받았다.
키트
본 발명은 또한 본원의 항체 또는 이의 기능적 단편을 함유하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원의 정제된 항-C1q 항체를 포함하는, 하나 이상의 용기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 키트는 본원의 방법에 따라 사용하기 위한 지시를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 지시는 본원의 임의의 방법에 따라 신경퇴행성 장애(예를 들어, 알쯔하이머 질환), 염증성 질환, 자가면역 질환 및/또는 대사 장애를 포함하나 이에 한정되지 않는, 보체 활성화와 관련된 질환을 치료하거나 진단하기 위해 상기 항-C1q 항체를 투여한다는 기재를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지시는, 예를 들어, 개체, 조직 샘플 또는 세포에서 어떻게 C1q를 탐지하는지에 대한 기재를 포함한다. 상기 키트는 개체가 질환 및 질환의 단계를 갖는지의 확인을 기초로 한 치료에 적합한 개체의 선택에 대한 기재를 추가로 포함한다.
상기 지시는 일반적으로 의도한 치료를 위한 투여량, 투여 스케쥴 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 상기 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중용량 패키지) 또는 아단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 지시는 전형적으로 라벨 또는 패키지 인서트(package insert)(예를 들어, 키트에 포함된 인쇄지) 위에 쓰여진 지시이지만, 기계 판독가능한 지시(예를 들어, 마그네틱 또는 광학 저장 디스크에 담겨진 지시)도 허용가능하다.
라벨 또는 패키지 인서트는 조성물이, 예를 들어, 신경퇴행성 질환을 치료하는 데 사용됨을 지시한다. 지시는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 실행하는 데 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 포장에 적합하다. 적합한 포장은 바이알, 병, 단지(jar), 가요성 포장(예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 비닐봉지) 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 흡입기, 코 투여 장치(예를 들어, 분무기), 또는 미니펌프와 같은 투입 장치와 같은 특정 장치와 함께 사용되는 패키지도 포함된다. 키트는 무균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥주사 용액 백 또는 피하주사용 주입 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 용기는 또한 무균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥주사 용액 백 또는 피하주사용 주입 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 고전적인 보체 경로의 억제제이다. 상기 용기는 제2의 약제학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의로 완충제와 같은 추가 성분 및 설명적 정보를 제공한다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 위에 또는 용기 가까이에 라벨 또는 패키지 인서트(들)를 포함한다.
본 발명은 다음 실시예를 참고로 보다 상세히 이해될 것이다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원 전체에서의 모든 인용은 확실히 본원에 참조로 도입된다.
실시예
실시예 1: 항-C1q 항체의 생산
항-C1q 항체 M1은, 표준 마우스 면역화 및 하이브리도마 선별 기술을 사용하여 C1q 녹아웃 마우스(knockout mouse)를 사람 C1q로 면역시켜 안티바디 솔루션즈 인코포레이트(Antibody Solutions Inc., Sunnyvale CA)가 만들었다(Milstein, C (1999). Bioessays 21: 966-73; Mark Page, Robin Thorpe, The Protein Protocols Handbook 2002, Editors: John M. Walker, pp 1111-1113).
항-C1q 항체 1C7, 2A1, 3A2 및 5A3은 마우스를 사람 혈장으로부터 정제된 사람 C1q 단백질(Complement Technology Inc., Tyler Texas, Cat #A-099)로 면역시켜 이뮤노프리사이즈 리미티드(ImmunoPrecise Ltd., Victoria, BC Canada)에서 만들었다. 간단히 말해, 암컷 BALB/c 마우스에 0일에 프로인트 완전면역보강제(CFA) 중의 단백질 25㎍으로 복막내 주입하고, 21일, 42일, 52일에 프로인트 완전면역보강제(CFA) 중의 C1q 효소 25㎍을 주사하고, 63일에 최종 정맥내 주사하였다. 최종 주사 후 4일에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 제거하고, 비장세포를 골수종 세포주 SP2/0과 융합시켰다. 융합된 세포를 10 내지 12일 동안 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 선택적 반고체 배지 속에서 성장시키고, 생성된 하이브리도마 클론을 96-웰 조직 배지 플레이트로 옮긴 다음, 항체 적가가 높아질 때까지 HAT 배지 속에서 성장시켰다. 클론의 항체-풍부 상청액을 분리하고 C1q와의 반응성에 대해 ELISA 검정으로 시험하였다. 양성 클론을 동형화(isotype)하고 32일 동안(HAT 선택 후) 배양시켜 안정한 발현 클론을 확인하였다.
항-C1q 항체 M1을 생성하고 마우스 하이브리도마 C1q-M1 7788-1(M) 051613으로 불리는 하이브리도마 세포주를 2013년 6월 6일자로 ATCC에 ATCC 수탁번호 PTA-120399로 기탁하였다. M1은 사람 및 마우스 C1q에 특이적으로 결합하고 C1q의 생물학적 기능, 예를 들어, 보체 매개된 용혈을 중화시키는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 실시예 3 참조).
실시예 2: C1q에 특이적으로 결합하는 항-C1q 항체
ELISA 선별검사
항-C1q 항체 1C7, 2A1, 3A2 및 5A3을 표준 EISA 프로토콜을 사용하여 C1q-결합에 대해 선별하였다.
간단히 말하면, 검정을 수행하기 전날에 96-웰 미량 역가판을 밤새 4℃에서 카보네이트 피복 완충액(pH 9.6) 100μL/웰 중 C1q-효소 항원 0.2㎍/웰로 피복하였다. 대조용 웰을 사람 트랜스페린으로 피복하였다. 이어서, 상기 판을 실온에서 1시간 동안 PBS 중 3% 분유로 채웠다. 이어서, 하이브리도마 조직 배지 상청액을 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 100μL/웰로 플레이팅하였다. 2차 항체(1:10,000 염소 항-마우스 IgG/IgM(H+L)-HRP)를 진탕시키면서 실온에서 1.5시간 동안 100μL/웰로 적용하였다. TMB 기질을 암중 실온에서 5분 동안 50μL/웰로 첨가하였다. 반응을 1M HCl 50μL/웰로 중단시키고 흡광도를 450nm의 파장에서 판독하였다.
항-C1q 항체 1C7, 2A1, 3A2 및 5A3을 함유하는 4개의 하이브리도마 상청액을 사람 C1q에 대한 결합에 대해 시험하였다(도 1). ELISA에 의하면, 4개의 상청액 모두 사람 C1q의 존재하에 강한 결합 신호를 보인 반면, 사람 트랜스페린을 함유하는 대조용 웰에서는 백그라운드 신호만이 관찰되었다. 이 실험은 항-C1q 항체 1C7, 2A1, 3A2 및 5A3이 사람 C1q에 특이적으로 결합함을 나타냈다.
키네틱 분석
전장 항-C1q 항체 M1과 사람 및 마우스 C1q 단백질의 상호작용을 먼저 키네틱 모드로 측정하고, 이어서 열역학 해리상수를 계산하였다. 추가로, M1 결합 데이터를 참조용 항체 4A4B11을 사용하여 수득한 상응하는 데이터와 비교하였다. 4A4B11은 미국 특허 제4,595,654호에 기재되어 있다. 하이브리도마 세포주를 생산하는 4A4B11은 ATCC(ATCC HB-8327TM)로부터 구할 수 있다.
C1q 항체 상호작용은 표준 프로토콜 및 제조업자의 지시에 따라 옥테트 시스템(OCTETTM System)을 사용하여 측정하였다. 간단히, 사람 및 마우스 C1q 단백질을 생체감응장치(biosensor) 상에서 각각 3개의 농도(3nM, 1.0nM 및 0.33nM)로 부동화시켰다. 이어서, 항-C1q 항체 M1을 C1q 피복된 생체감응장치에 2.0㎍/ml의 농도로 주입하고, 항-C1q 항체 M1 및 4A4B11에 대한 결합상수(kon) 및 해리상수(koff)를 측정하였다. 데이터를 비선형 회귀 분석에 의해 옥테트 데이터 어낼리시스(Octet Data Analysis) 소프트웨어를 사용하여 맞춰 M1 및 4A4B11과 사람 및 마우스 C1q의 상호작용 각각에 대한 친화도(KD) 및 키네틱 매개변수(kon/off)를 수득하였다(표 B 참조).
표 B: M1 및 4A4B11의 키네틱 분석
Figure 112016011187739-pct00003

이 실험 시리즈에서. 항-C1q 항체 M1은 매우 높은 친화도로 사람 및 마우스 C1q 단백질 둘 다에 결합하는 것으로 나타났다(KD < 10-10M). 비교해 보건대, 참조용 항체 4A4B11이 사람 C1q에 결합하는 반면, 마우스 C1q에 대한 결합은 탐지불능이었다. 사람 C1q에 대한 M1 및 4A4B11의 친화도가 동일한 자릿수인 반면(예를 들어, 두 자릿수의 피코몰 범위: KD ~ 10 내지 30pM), 마우스 C1q에 대한 M1의 친화도는 마우스 C1q에 대한 4A4B11의 친화도(KD ~ 40nM) 보다 높은 대략 네 자릿수(KD ~ 30pM)로 측정되었다.
항-C1q 항체 M1 및 4A4B11은 C1q 결합에 대해 경쟁하지 않는다
항-C1q 항체 M1 및 4A4B11이 사람 C1q의 동일하거나 겹치는 에피토프에 결합하는지 또는 M1 및 4A4B11이 개별 C1q 에피토프에 결합하는지를 측정하기 위해 차단 실험을 수행하였다.
이를 위해, M1을 생체감응장치 칩(BIACORETM) 상에 피복시키고, 이어서 사람 C1q와 M1의 조합, 사람 C1q와 4A4B11의 조합, 또는 사람 C1q 단독과 접촉시켰다. M1에 대한 C1q 결합이 10분 후에 이어졌고 M1-C1q 복합체의 해리가 이어서 20분 동안 이어졌다. 상대적 결합 신호를 결합 시점 및 해리 시점 종말에 기록하였다. 표 C는 이들 실험 결과를 나타낸다.
표 C: M1 및 4A4B11과 사람 C1q 의 동시 상호작용의 분석
Figure 112016011187739-pct00004

C1q 단독으로 생체감응장치 칩 상의 부동화된 M1에 효과적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. C1q와 가용성 M1 항체의 배양(incubation)은 생성된 M1-C1q 복합체의 부동화된 M1으로의 모든 결합을 방지하였다. 대조적으로, C1q와 4A4B11의 예비배양은 생성된 4A4B11-C1q 복합체와 부동화된 M1과의 상호작용을 방지하지 않았다. C1q 단독을 포함한 결합 실험에 비해 4A4B11-C1q 복합체를 포함한 결합 실험에서 관찰된 보다 높은 상대적 결합 신호는 상대적 결합 신호가 가용성 결합 파트너의 분자량과 연관성이 있고 4A4B11-C1q 복합체가 C1q 단독보다 높은 분자량을 갖는다는 사실에 기인한다.
이러한 결과는 4A4B11이 C1q 결합에 대해 M1과 경쟁하지 않음을 나타낸다. 그러므로, 4A4B11 및 M1은 C1q 상의 개별 에피토프를 인지할 수 있다.
실시예 3: 항-C1q 항체는 보체-매개된 용혈을 억제한다
항-C1q 항체를 이들이 C1q를 중화시키고 다운스트림 보체 케스케이드의 활성화를 차단하는 능력에 대해 사람 및 설치류 용혈 검정(CH50)으로 시험하였다. CH50 검정은 필수적으로 "Current Protocols in Immunology (1994) Supplement 9 Unit 13.1"에 기재된 대로 수행하였다. 간단히, 사람 혈청(Cedarlane, Burlington, NC) 5마이크로리터(μl), 위스타 래트(Wistar rat) 혈청 0.625μl, 또는 C57B1/6 마우스 혈청 2.5μl를 GVB 완충제(Cedarlane, Burlington, NC) 50μl로 희석하고 GVB 완충제에 희석된 단일클론 항체(1μg) 50μl에 첨가하였다. 항체:혈청 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 예비배양한 다음, 래트 및 사람 검정을 위한 EA 세포(2×108/ml) 및 마우스 검정을 위한 4×107/ml 100μl에 첨가하였다. 상기 EA 세포는 앨서버(Alsever)(Cedarlane Cat #CL2581) 및 용혈소(Cedalane Cat #CL9000) 중 양 혈액을 사용한 커런트 프로토콜(Current Protocol)에 명시된대로 정확하게 만들었다. 상기 EA 세포, 혈청 및 항체 혼합물을 30분 동안 37℃에서 배양한 다음, 얼음 위에 놓았다. 이어서, 0.15M NaCl 1.2ml를 상기 혼합물에 첨가하고 세포 용해량을 측정하기 위해 분광광도계로 샘플의 OD412를 판독하였다. 시험 항체의 억제율(%)을 대조용 마우스 IgG1 항체에 대해 측정하였다(Abcam ab18447).
또한, 사람 혈청으로부터의 C1 복합체의 한계량을 제공하는 개질된 CH50 검정(C1F 용혈 검정으로도 지칭됨)을 수행하여 C1 활성 및 잠재적 C1 억제의 평가를 위한 보다 큰 감도를 제공한다. 간단히 말해, 상기 검정을 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 양 적혈구 세포(RBC) 3×107를 항-양 RBC IgM 항체로 배양하여 활성화된 적혈구(EA 세포)를 만들었다. 이어서, 상기 EA 세포를 정제된 C4b 단백질로 배양하여 EAC4b 세포를 생성하였다. 이어서 EAC4b 세포를 항-C1q 및 대조용 마우스 IgG 항체의 존재 또는 부재하에 예비배양된 희석된(1:1000 내지 1:10000) 정상 사람 혈청(normal human serum: NHS)으로 배양하여 사람 C1의 한계량을 제공하였다. 다음에, 생성된 EAC14 세포를 정제된 사람 C2 단백질로 배양하여 EAC14b2a 세포를 만들었다. 최종적으로, 기니 피그 혈청을 EDTA 완충제에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포 용해를 450nm의 파장에서 분광광도계로 측정하였다.
먼저, 4개의 C1q 결합 항체(1C7, 2A1, 3A2 및 5A3)를 단일 농도(1μg)에서 사람 CH50 검정으로 시험하였다(도 2). 4개의 항체 모두 용혈을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 항-C1q 항체 1C7은 용혈을 90% 이상 억제하고, 2A1은 용혈을 40% 이상 억제하고, 3A2는 용혈을 60% 이상 억제하고, 5A3은 용혈을 50% 이상 억제하였다.
이어서, 항-C1q 항체 1C7 및 3A2를 용량-반응 포맷으로 사람 CH50 용혈 검정으로 시험하였다(도 3). 항-C1q 항체 4A4B11을 참조용으로서 사용하였다. 1C7 및 3A2 항체 둘 다 용량-반응 방식으로 CH50 용혈을 억제하였다. 관찰된 용혈의 50%를 억제하는 데는 약 100ng의 1C7 항체 및 약 200ng의 3A2가 필요했다(도 3).
항-C1q 항체 M1을 이의 C1q 중화 활성에 대해 사람, 마우스 및 래트 CH50 검정으로 시험하였다(도 4A 내지 4C). 시험은 용량-반응 포맷으로 수행하였다. 항-C1q 항체 4A4B11을 참조용으로서 사용하였다. M1은 용량-반응 방식으로 사람, 마우스 및 래트 CH50 용혈 검정에서 C1q 활성을 중화시키는 것으로 나타났다(도 4A 내지 4C). 대조적으로, 4A4B11은 사람 CH50 검정에서만 C1q 활성을 중화시키는 것으로 밝혀진 반면, 참조용 항체는 마우스 및 래트 CH50 용혈 검정에서 불활성이었다(2μg 이하). 사람 및 래트 CH50 용혈 검정에서 M1은 용혈을 90% 이상 100% 이하로 억제하였고(도 4A 및 4C); 마우스 검정에서 M1은 용혈을 50% 이상 억제하였다(도 4B). 사람 CH50 검정에서는 용혈을 50% 억제하는데 125ng 미만의 M1이 필요했다. 마우스 CH50 검정에서는 용혈을 50% 억제하는데 M1이 약 500ng 필요했다. 래트 CH50 검정에서는 용혈을 50% 억제하는데 16ng 미만이 필요했다.
실시예 4: 항체 4A4B11 및 M1에 대한 에피토프 매핑
에피토프의 특성(즉, 선형 또는 구조)을 측정하기 위해, C1q 항체의 단백질분해에 의해 생산된 구조화되지 않은 펩타이드에 의한 C1q 단백질과 항체 4A4B11(ANN-001) 및 M1(ANN-005)간의 상호작용의 억제를 평가하였다. 상기 항체의 완전 단백질분해에 의해 생산된 상기 단백질이 항원의 상기 항체 상의 결합을 억제할 수 있다면, 상호작용은 구조에 기초하지 않고, 상기 에피토프는 선형이다. 상기 항체의 완전 단백질분해에 의해 생산된 상기 단백질이 항원의 항체 4A4B11 및 M1 상의 결합을 억제할 수 없다면, 구조는 상호작용을 위해 필수적이다. 아래에 상세히 기재된 데이터를 근거로 할 때, 네이티브 C1q의 소화에 의해 생산된 구조화되지 않은 펩타이드는 4A4B11(ANN-001) 및 M1(ANN-005) 항체에 대한 결합을 위해 무손상 C1q와 경쟁하지 않았고(도 2 참조), 이는 이들 항체에 대한 C1q 에피토프가 복합체 형태의 에피토프임을 시사한다.
높은 분할도로 C1q 항원 상에 ANN-001 및 ANN-005를 결합시키는 상기 형태의 C1q 에피토프의 핵심 잔기를 측정하기 위해, 항체/항원 복합체를 중수소화된 가교결합제로 배양하고 다중-효소적 단백질분해적 분열을 시킨다. 가교결합된 단백질의 농축 후, 샘플을 고분할 질량 분광분석(nLC-Orbitrap MS)으로 분석하고 생성된 데이터를 XQuest 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 아래에 기재한 분석은 항체 4A4B11(ANN-001)이 사람 C1qA의 아미노산 S202 및 K219, 및 사람 C1qC의 Y225를 포함하는 에피토프에 결합하고, 항체 M1(ANN-005)은 사람 C1qA의 아미노산 K219, 및 사람 C1qC의 S185를 포함하는 에피토프에 결합함을 나타낸다. 사람 및 마우스 C1qA 및 C1qC의 아미노산 서열 정렬은 아래에 나타낸 것을 참조한다.
사람 및 마우스 C1qA의 아미노산 서열 정렬
MEGPRGWLVLCVLAISLASMVTEDLCRAPDGKKGEAGRPGRRGRPGLKGEQGEPGAPGIR 사람 METSQGWLVACVLTMTLVWTVAEDVCRAPNGKDGAPGNPGRPGRPGLKGERGEPGAAGIR 마우스
** .:**** ***:::*. *:**:****:**.* .*.*** ********:*****.***
TGIQGLKGDQGEPGPSGNPGKVGYPGPSGPLGARGIPGIKGTKGSPGNIKDQPRPAFSAI 사람 TGIRGFKGDPGESGPPGKPGNVGLPGPSGPLGDSGPQGLKGVKGNPGNIRDQPRPAFSAI 마우스 ***:*:*** **.**.*:**:** ******** * *:**.**.****:********** RRNPPMGGNVVIFDTVITNQEEPYQNHSGRFVCTVPGYYYFTFQVLSQWEICLSIVSSSR 사람 RQNPMTLGNVVIFDKVLTNQESPYQNHTGRFICAVPGFYYFNFQVISKWDLCLFIKSSSG 마우스 *:** *******.*:****.*****:***:*:***:***.***:*:*::** * *** GQVRRSLGFCDTTNKGLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHIYQGSEADSVFSGFL 사람 GQPRDSLSFSNTNNKGLFQVLAGGTVLQLRRGDEVWIEKDPAKGRIYQGTEADSIFSGFL 마우스 ** * **.*.:*.*******::** ****::**:**:**** **:****:****:*****
IFPSA 사람(서열 번호 1)
IFPSA 마우스(서열 번호 14)
*****
사람 및 마우스 C1qC의 아미노산 서열 정렬
MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLP-LRGQANTGCYGIPGMPGLPGAPGKDGYDGLPGPKGE 사람 MVVGPSCQPPCGLCLLLLFLLALPLRSQASAGCYGIPGMPGMPGAPGKDGHDGLQGPKGE 마우스
* ****. ** ** ****:** **.**.:**********:********:*** *****
PGIPAIPGIRGPKGQKGEPGLPGHPGKNGPMGPPGMPGVPGPMGIPGEPGEEGRYKQKFQ 사람 PGIPAVPGTRGPKGQKGEPGMPGHRGKNGPRGTSGLPGDPGPRGPPGEPGVEGRYKQKHQ 마우스 *****:** ***********:*** ***** * *:** *** * ***** ******* *
SVFTVTRQTHQPPAPNSLIRFNAVLTNPQGDYDTSTGKFTCKVPGLYYFVYHASHTANLC 사람 SVFTVTRQTTQYPEANALVRFNSVVTNPQGHYNPSTGKFTCEVPGLYYFVYYTSHTANLC 마우스 ********* * * .*:*:***:*:*****.*:.*******:*********::*******
VLLYRSGVKVVTFCGHTSKTNQVNSGGVLLRLQVGEEVWLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSG 사람 VHLNLNLARVASFCDHMFNSKQVSSGGVLLRLQRGDEVWLSVNDYNGMVGIEGSNSVFSG 마우스
* * . .:*.:**.* :::**.********* *;****;**** .****:**:*****
FLLFPD 사람(서열 번호 3)
FLLFPD 마우스(서열 번호 15)
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1. 질량 분광분석에 의한 C1q/항체 복합체의 동정
C1q 항원과 항체의 등몰 용액(각각 5μl중 4μM)을 혼합하여 C1q/항체 복합체를 만들었다. 수득된 혼합물 1μl를 아세토니트릴/물(1:1, v/v) 중 재결정화된 시나핀산 매트릭스(10mg/ml), TFA 0.1%(K200 MALDI Kit)로 이루어진 매트릭스 1μl와 혼합하였다. 혼합 후, 각각의 샘플 1μl를 MALDI 플레이트(SCOUT 384) 상에 스포팅(spotting)하였다. 실온에서 결정화시킨 후, 상기 플레이트를 MALDI 질량 분광계에 도입하고 즉시 분석하였다. 분석을 3회 반복하였다. 도 5는 C1q/4A4B11(도 5A) 및 C1q/M1(도 5B)에 대한 항원, 항체 및 항원/항체 복합체의 존재를 나타낸다. 피크가 단량체 항체(~ 150kDa) 및 C1q 항체(~ 460kDa)의 예측된 분자량에 존재하고 항체:항원의 복합체는 ~ 615kDa에 존재한다.
2. 단밸질분해에 의해 생산된 구조화되지 않은 C1q 펩타이드는 C1q의 항체로의 결합에 대해 경쟁하지 않는다
C1q/항체 복합체가 펩타이드와 경쟁할 수 있는지 측정하기 위해, C1q 항원을 부동화된 펩신 중에서 소화시켰다. 10μM 농도의 항원 25μl를 부동화된 펩신 5μM과 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 배양 시간 후, 샘플을 원심분리하고 상청액을 피펫팅하였다. 단백질분해의 완결은 선형 모드로 High-Mass MALDI 질량 분광분석으로 조절하였다. 1000 내지 3500Da 범위의 펩타이드를 다량 수득하기 위해 펩신 단백질분해를 최적화하였다. 이어서, 단백질분해에 의해 생산된 항원 펩타이드 5μl를 ANN-001 또는 ANN-005(8μM) 5μl와 혼합하고 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. ANN-001 또는 ANN-005를 C1q 항원 펩타이드로 배양한 후, 상기 혼합물 5μl를 C1q 항원(4μM) 5μl와 혼합하여 최종 혼합물이 C1q 항원/4A4B11 또는 M1/C1q 항원 펩타이드를 2μM/2μM/2.5μM 함유하였다.
표준 질소 레이저가 장착되고 0 내지 2000kDa의 상이한 질량 범위에 촛점을 맞춘 CovalX HM3 상호작용 모듈을 사용하여 MALDI ToF MS 분석을 수행하였다. 분석을 위해, 다음 매개변수가 적용되었다: 질량 분광계: 선형 및 포지티브 모드; 이온 공급원 1: 20kV; 이온 공급원 2: 17kV; 펄스 이온 추출: 400ns; HM3: 이득 전압: 3.14kV; 가속 전압: 20kV.
기구들을 보정하기 위해, 인슐린, BSA 및 IgG의 클러스터를 사용한 외부 보정을 적용하였다. 각 샘플에 대해, 3개의 스폿(spot)을 분석하였다(스폿당 300 레이저 샷(laser shot)). 제공된 스펙트럼은 300 레이저 샷의 합계에 상응한다. Complex Tracker 분석 소프트웨어 버젼 2.0(CovalX Inc)을 사용하여 MS 데이터를 분석하였다.
결과를 도 6에 도시했고 C1q 펩타이드가 단일클론 항체 ANN-005(M1)으로의 결합에 대해 무손상 C1q와 경쟁하지 않음을 나타낸다.
3. ANN-001 및 ANN-005로의 C1q 결합에 대한 구조적 에피토프의 동정
화학적 가교결합, High-Mass MALDI 질량 분광분석 및 nLC-Orbitrap 질량 분광분석을 사용하여, 항원 C1q와 2개의 단일클론 항체 ANN-001 및 ANN-005간의 상호작용 계면을 특징화하였다. 최종 농도 2μM/2μM의 항체/항원 혼합물을 수득하기 위해 샘플 C1q 항원(농도 4μM) 5μl를 샘플 ANN-001(농도 4μM) 또는 ANN-005(농도 4μM) 5μl와 혼합하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 180분 동안 배양하였다. 첫 번째 단계에서, 디석신이미딜수베레이트 H12(DSS-H12) 가교결합제 1mg을 디석신이미딜수베레이트 D12(DSS-D12) 가교결합제 1mg과 혼합하였다. DSS-H12/D12의 2mg/ml 용액을 수득하기 위해 상기 제조물 2mg을 DMF 1ml와 혼합하였다. 미리 제조한 항체/항원 혼합물 10μl를 제조된 가교결합제 d0/d12 용액(2mg/ml) 1μl와 혼합하였다. 가교결합 반응을 달성하기 위해 상기 용액을 실온에서 180분 동안 배양하였다. 단백질분해를 용이하게 하기 위해, 이 단백질에 존재하는 결합된 다이설파이드를 환원시킬 필요가 있었다. 가교결합된 샘플을 중탄산암모늄(25mM, pH 8.3) 20μl와 혼합하였다. 혼합 후, DTT(500mM) 2.5μl를 상기 용액에 첨가하였다. 이어서, 상기 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 요오도아세트아미드(1M) 2.5μl를 실온의 암실에서 배양하기 1시간 전에 첨가하였다. 배양 후, 상기 용액을 단백질분해에 사용된 완충제 120μl를 첨가하여 1/5로 희석하였다. 환원된/알킬화된 가교결합된 샘플 145μl를 트립신(Sigma, T6567) 2μl와 혼합하였다. 단백질분해 혼합물을 37℃에서 밤새 배양하였다. α-키모트립신 단백질분해를 위해, 단백질분해 완충제는 Tris-HCl 100 mM, CaCl2 10 mM, pH7.8였다. 환원된/알킬화된 가교결합된 복합체 145μl를 α-키모트립신(200μM) 2μl와 혼합하고 30℃에서 밤새 배양하였다. 이 분석을 위해, nLC와 Orbitrap 질량 분광분석을 조합 사용하였다. 가교결합제 펩타이드를 Xquest 버젼 2.0 및 스타브록스(stavrox) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 동정된 펩타이드 및 가교결합된 아미노산을 하기 표 D에 제시한다. 표 D - ANN-001 및 ANN-005 결합에 필요한 C1q 가교결합된 펩타이드 및 접촉 잔기
Figure 112016011187739-pct00005

4. 항체 M1의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열
표준 기술을 사용하여, 항체 M1의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코드화하는 핵산 및 아미노산 서열을 측정하였다.
항체 M1의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 DVQITQSPSYLAASPGETITINC RASKSINKYLA WYQEKPGKTNKLLIY SGSTLQS GIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYC QQHNEYPLT FGAGTKLELK(서열 번호 4)이다. 상기 경쇄 가변 도메인의 초가변영역(hyper variable region: HVR)을 굵게 밑줄을 그어 표시하였다. 몇몇 실시양태에서, M1의 경쇄 가변 도메인의 HVR-L1은 서열 RASKSINKYLA(서열 번호 5)를 갖고, M1의 경쇄 가변 도메인의 HVR-L2는 서열 SGSTLQS(서열 번호 6)를 갖고, M1의 경쇄 가변 도메인의 HVR-L3은 서열 QQHNEYPLT(서열 번호 7)를 갖는다.
항체 M1의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKSS GYHFTSYWMH WVKQRPGQGLEWIG VIHPNSGSINYNEKFES KATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAG ERDSTEVLPMDY WGQGTSVTVSS(서열 번호 8)이다. 상기 중쇄 가변 도메인의 초가변영역(HVR)을 굵게 밑줄을 그어 표시하였다. 몇몇 실시양태에서, M1의 중쇄 가변 도메인의 HVR-H1은 서열 GYHFTSYWMH(서열 번호 9)를 갖고, M1의 중쇄 가변 도메인의 HVR-H2는 서열 VIHPNSGSINYNEKFES(서열 번호 10)를 갖고, M1의 중쇄 가변 도메인의 HVR-H3은 서열 ERDSTEVLPMDY(서열 번호 11)를 갖는다.
상기 경쇄 가변 도메인을 코드화하는 핵산 서열을 측정하였으며 다음과 같다: GATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAACAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAACATAATGAATACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(서열 번호 12). 상기 중쇄 가변 도메인을 코드화하는 핵산 서열을 측정하였으며 다음과 같다:CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGTCTTCTGGCTACCATTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGTGATTCATCCTAATAGTGGTAGTATTAACTACAATGAGAAGTTCGAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCGGCGGTCTATTATTGTGCAGGAGAGAGAGATTCTACGGAGGTTCTCCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열 번호 13).
상기 발명을 명확한 이해를 위해 설명 및 실시예를 통해 좀 더 상세히 기재하였지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 내용은 특별히 그 전문이 본원에 참조로 도입된다.
재료의 기탁
다음 재료들을 부타페스트 조약에 따라 ATCC(American Type Culture Collection, ATCC Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, USA (ATCC)에 기탁하였다:
Figure 112016011187739-pct00006

M1 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(마우스 하이브리도마 C1qM1 7788-1(M) 051613)를, 본 특허원의 계류 동안 및 30년 동안, 또는 가장 최근의 요구 후 5년 동안, 또는 본 특허의 유효 기간 동안, 어느 쪽이든 더 긴 기간 동안 배지에의 접근이 유용할 것임이 확실한 조건하에 ATCC에 기탁하였다. 기탁물은 이것이 상기 기간 동안 생존 불가능하게 된 경우 대체될 것이다. 본 출원의 대응 출원 또는 이의 분할출원이 출원된 나라들에서의 외국 특허법에 의해 필요한 대로 기탁이 이용가능하다. 그러나, 기탁의 유용성은 정부 조치에 의해 허여된 특허권의 수정으로 본 발명을 수행하기 위한 허가권을 구성하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> ANNEXON, INC. ROSENTHAL, ARNON LEVITEN, MICHAEL <120> ANTI-COMPLEMENT FACTOR C1Q ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 717192000640 <150> US 61/844,369 <151> 2013-07-09 <150> US 61/871,813 <151> 2013-08-29 <160> 26 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Gly Pro Arg Gly Trp Leu Val Leu Cys Val Leu Ala Ile Ser 1 5 10 15 Leu Ala Ser Met Val Thr Glu Asp Leu Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Arg Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys 35 40 45 Gly Glu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ile Arg Thr Gly Ile Gln 50 55 60 Gly Leu Lys Gly Asp Gln Gly Glu Pro Gly Pro Ser Gly Asn Pro Gly 65 70 75 80 Lys Val Gly Tyr Pro Gly Pro Ser Gly Pro Leu Gly Ala Arg Gly Ile 85 90 95 Pro Gly Ile Lys Gly Thr Lys Gly Ser Pro Gly Asn Ile Lys Asp Gln 100 105 110 Pro Arg Pro Ala Phe Ser Ala Ile Arg Arg Asn Pro Pro Met Gly Gly 115 120 125 Asn Val Val Ile Phe Asp Thr Val Ile Thr Asn Gln Glu Glu Pro Tyr 130 135 140 Gln Asn His Ser Gly Arg Phe Val Cys Thr Val Pro Gly Tyr Tyr Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Phe Gln Val Leu Ser Gln Trp Glu Ile Cys Leu Ser Ile Val 165 170 175 Ser Ser Ser Arg Gly Gln Val Arg Arg Ser Leu Gly Phe Cys Asp Thr 180 185 190 Thr Asn Lys Gly Leu Phe Gln Val Val Ser Gly Gly Met Val Leu Gln 195 200 205 Leu Gln Gln Gly Asp Gln Val Trp Val Glu Lys Asp Pro Lys Lys Gly 210 215 220 His Ile Tyr Gln Gly Ser Glu Ala Asp Ser Val Phe Ser Gly Phe Leu 225 230 235 240 Ile Phe Pro Ser Ala 245 <210> 2 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Met Met Lys Ile Pro Trp Gly Ser Ile Pro Val Leu Met Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Ile Asp Ile Ser Gln Ala Gln Leu Ser Cys Thr 20 25 30 Gly Pro Pro Ala Ile Pro Gly Ile Pro Gly Ile Pro Gly Thr Pro Gly 35 40 45 Pro Asp Gly Gln Pro Gly Thr Pro Gly Ile Lys Gly Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Pro Gly Leu Ala Gly Asp His Gly Glu Phe Gly Glu Lys Gly Asp Pro 65 70 75 80 Gly Ile Pro Gly Asn Pro Gly Lys Val Gly Pro Lys Gly Pro Met Gly 85 90 95 Pro Lys Gly Gly Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu 100 105 110 Ser Gly Asp Tyr Lys Ala Thr Gln Lys Ile Ala Phe Ser Ala Thr Arg 115 120 125 Thr Ile Asn Val Pro Leu Arg Arg Asp Gln Thr Ile Arg Phe Asp His 130 135 140 Val Ile Thr Asn Met Asn Asn Asn Tyr Glu Pro Arg Ser Gly Lys Phe 145 150 155 160 Thr Cys Lys Val Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Thr Tyr His Ala Ser Ser 165 170 175 Arg Gly Asn Leu Cys Val Asn Leu Met Arg Gly Arg Glu Arg Ala Gln 180 185 190 Lys Val Val Thr Phe Cys Asp Tyr Ala Tyr Asn Thr Phe Gln Val Thr 195 200 205 Thr Gly Gly Met Val Leu Lys Leu Glu Gln Gly Glu Asn Val Phe Leu 210 215 220 Gln Ala Thr Asp Lys Asn Ser Leu Leu Gly Met Glu Gly Ala Asn Ser 225 230 235 240 Ile Phe Ser Gly Phe Leu Leu Phe Pro Asp Met Glu Ala 245 250 <210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Val Gly Pro Ser Ser Leu Pro His Leu Gly Leu Lys Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Arg Gly Gln Ala Asn Thr Gly Cys 20 25 30 Tyr Gly Ile Pro Gly Met Pro Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly Lys Asp 35 40 45 Gly Tyr Asp Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Ile Pro Gly Ile Arg Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Leu 65 70 75 80 Pro Gly His Pro Gly Lys Asn Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Met Pro 85 90 95 Gly Val Pro Gly Pro Met Gly Ile Pro Gly Glu Pro Gly Glu Glu Gly 100 105 110 Arg Tyr Lys Gln Lys Phe Gln Ser Val Phe Thr Val Thr Arg Gln Thr 115 120 125 His Gln Pro Pro Ala Pro Asn Ser Leu Ile Arg Phe Asn Ala Val Leu 130 135 140 Thr Asn Pro Gln Gly Asp Tyr Asp Thr Ser Thr Gly Lys Phe Thr Cys 145 150 155 160 Lys Val Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Val Tyr His Ala Ser His Thr Ala 165 170 175 Asn Leu Cys Val Leu Leu Tyr Arg Ser Gly Val Lys Val Val Thr Phe 180 185 190 Cys Gly His Thr Ser Lys Thr Asn Gln Val Asn Ser Gly Gly Val Leu 195 200 205 Leu Arg Leu Gln Val Gly Glu Glu Val Trp Leu Ala Val Asn Asp Tyr 210 215 220 Tyr Asp Met Val Gly Ile Gln Gly Ser Asp Ser Val Phe Ser Gly Phe 225 230 235 240 Leu Leu Phe Pro Asp 245 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 8 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr His Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Glu Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Glu Arg Asp Ser Thr Glu Val Leu Pro Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Tyr His Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Val Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Glu 1 5 10 15 Ser <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Arg Asp Ser Thr Glu Val Leu Pro Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 321 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Ala Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr Ala Thr Cys Thr 20 25 30 Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Ala 50 55 60 Ala Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Cys Ala Thr Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr 85 90 95 Thr Thr Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala Gly 100 105 110 Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys 115 120 125 Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr Cys 130 135 140 Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Thr Thr 145 150 155 160 Thr Gly Cys Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys 165 170 175 Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys 180 185 190 Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly 195 200 205 Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr 210 215 220 Cys Ala Gly Thr Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr 225 230 235 240 Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Thr Gly Thr 245 250 255 Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala 260 265 270 Thr Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Cys Cys Cys Gly Cys Thr Cys 275 280 285 Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala 305 310 315 320 Ala <210> 13 <211> 363 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr 35 40 45 Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala 65 70 75 80 Cys Cys Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys 85 90 95 Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala 115 120 125 Ala Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Thr 130 135 140 Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ala Thr Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Ala 145 150 155 160 Ala Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ala Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys 180 185 190 Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Cys 195 200 205 Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Thr Cys 210 215 220 Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Cys 225 230 235 240 Ala Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys 260 265 270 Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr Thr 290 295 300 Cys Thr Ala Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys Cys 305 310 315 320 Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr 325 330 335 Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Cys Ala 340 345 350 Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala 355 360 <210> 14 <211> 245 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Met Glu Thr Ser Gln Gly Trp Leu Val Ala Cys Val Leu Thr Met Thr 1 5 10 15 Leu Val Trp Thr Val Ala Glu Asp Val Cys Arg Ala Pro Asn Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Ala Pro Gly Asn Pro Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly Leu Lys 35 40 45 Gly Glu Arg Gly Glu Pro Gly Ala Ala Gly Ile Arg Thr Gly Ile Arg 50 55 60 Gly Phe Lys Gly Asp Pro Gly Glu Ser Gly Pro Pro Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 Asn Val Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Leu Gly Asp Ser Gly Pro 85 90 95 Gln Gly Leu Lys Gly Val Lys Gly Asn Pro Gly Asn Ile Arg Asp Gln 100 105 110 Pro Arg Pro Ala Phe Ser Ala Ile Arg Gln Asn Pro Met Thr Leu Gly 115 120 125 Asn Val Val Ile Phe Asp Lys Val Leu Thr Asn Gln Glu Ser Pro Tyr 130 135 140 Gln Asn His Thr Gly Arg Phe Ile Cys Ala Val Pro Gly Phe Tyr Tyr 145 150 155 160 Phe Asn Phe Gln Val Ile Ser Lys Trp Asp Leu Cys Leu Phe Ile Lys 165 170 175 Ser Ser Ser Gly Gly Gln Pro Arg Asp Ser Leu Ser Phe Ser Asn Thr 180 185 190 Asn Asn Lys Gly Leu Phe Gln Val Leu Ala Gly Gly Thr Val Leu Gln 195 200 205 Leu Arg Arg Gly Asp Glu Val Trp Ile Glu Lys Asp Pro Ala Lys Gly 210 215 220 Arg Ile Tyr Gln Gly Thr Glu Ala Asp Ser Ile Phe Ser Gly Phe Leu 225 230 235 240 Ile Phe Pro Ser Ala 245 <210> 15 <211> 246 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Met Val Val Gly Pro Ser Cys Gln Pro Pro Cys Gly Leu Cys Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Leu Ala Leu Pro Leu Arg Ser Gln Ala Ser Ala Gly 20 25 30 Cys Tyr Gly Ile Pro Gly Met Pro Gly Met Pro Gly Ala Pro Gly Lys 35 40 45 Asp Gly His Asp Gly Leu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ile Pro 50 55 60 Ala Val Pro Gly Thr Arg Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly 65 70 75 80 Met Pro Gly His Arg Gly Lys Asn Gly Pro Arg Gly Thr Ser Gly Leu 85 90 95 Pro Gly Asp Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Val Glu 100 105 110 Gly Arg Tyr Lys Gln Lys His Gln Ser Val Phe Thr Val Thr Arg Gln 115 120 125 Thr Thr Gln Tyr Pro Glu Ala Asn Ala Leu Val Arg Phe Asn Ser Val 130 135 140 Val Thr Asn Pro Gln Gly His Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Lys Phe Thr 145 150 155 160 Cys Glu Val Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Val Tyr Tyr Thr Ser His Thr 165 170 175 Ala Asn Leu Cys Val His Leu Asn Leu Asn Leu Ala Arg Val Ala Ser 180 185 190 Phe Cys Asp His Met Phe Asn Ser Lys Gln Val Ser Ser Gly Gly Val 195 200 205 Leu Leu Arg Leu Gln Arg Gly Asp Glu Val Trp Leu Ser Val Asn Asp 210 215 220 Tyr Asn Gly Met Val Gly Ile Glu Gly Ser Asn Ser Val Phe Ser Gly 225 230 235 240 Phe Leu Leu Phe Pro Asp 245 <210> 16 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Leu Phe Gln Val Val Ser Gly Gly Met Val Leu Gln Leu Gln Gln 1 5 10 15 Gly Asp Gln Val Trp Val Glu Lys Asp Pro Lys Lys Gly His Ile 20 25 30 <210> 17 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Leu Phe Gln Val Val Ser Gly Gly Met Val Leu Gln Leu Gln Gln 1 5 10 15 Gly Asp Gln Val Trp Val Glu Lys Asp Pro 20 25 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ser Gly Gly Met Val Leu Gln Leu Gln Gln Gly Asp Gln Val Trp Val 1 5 10 15 Glu Lys Asp Pro 20 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ser Gly Gly Met Val Leu Gln Leu Gln Gln Gly Asp Gln Val Trp Val 1 5 10 15 Glu Lys <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Trp Leu Ala Val Asn Asp Tyr Tyr Asp Met Val Gly Ile Gln Gly Ser 1 5 10 15 Asp Ser Val Phe Ser Gly Phe 20 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Tyr Asp Met Val Gly Ile Gln Gly Ser Asp Ser Val Phe Ser Gly Phe 1 5 10 15 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Tyr Asp Met Val Gly Ile Gln Gly 1 5 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 His Thr Ala Asn Leu Cys Val Leu Leu Tyr Arg Ser Gly Val Lys Val 1 5 10 15 Val Thr Phe Cys Gly His Thr 20 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Arg Ser Gly Val Lys Val Val Thr Phe 1 5 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gly Leu Phe Gln Val Val Ser Gly Gly Met Val Leu Gln Leu Gln Gln 1 5 10 15 Gly Asp Gln Val Trp Val Glu Lys 20 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Phe Gln Val Val Ser Gly Gly Met Val Leu Gln Leu 1 5 10

Claims (94)

  1. 경쇄 가변 도메인(light chain variable domain)과 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain)을 포함하는 항-C1q 항체로서, 상기 경쇄 가변 도메인은 ATCC 수탁번호 PTA-120399의 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손(progeny)에 의해 생산된 단일클론 항체의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 ATCC 수탁번호 PTA-120399의 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손에 의해 생산된 단일클론 항체의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는, 항-C1q 항체.
  2. C1q 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호(SEQUENCE ID NO) 5의 아미노산 서열로 이루어지는 HVR-L1, 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 HVR-L2 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 HVR을 포함하고, 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 HVR-H1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 HVR-H2 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 HVR을 포함하는, 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간 C1q와 마우스 C1q 둘 다에 특이적으로 결합되고, 래트 C1q에 특이적으로 결합되거나, 인간 C1q, 마우스 C1q, 및 래트 C1q에 특이적으로 결합되는, 항체.
  7. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, C1q에 특이적으로 결합되고 C1q의 생물학적 활성을 중화시키는, 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 (1) 자가항체에 대한 C1q 결합, (2) C1r에 대한 C1q 결합, (3) C1s에 대한 C1q 결합, (4) 포스파티딜세린에 대한 C1q 결합, (5) 펜트락신-3에 대한 C1q 결합, (6) C-반응성 단백질(CRP)에 대한 C1q 결합, (7) 구형(globular) C1q 수용체(gC1qR)에 대한 C1q 결합, (8) 보체 수용체 1(CR1)에 대한 C1q 결합, (9) 베타-아밀로이드에 대한 C1q 결합, 또는 (10) 칼레티쿨린(calreticulin)에 대한 C1q 결합인, 항체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 (1) 고전적인 보체 활성화 경로의 활성화, (2) 항체 및 보체 의존적 세포독성의 활성화, (3) CH50 용혈(hemolysis), (4) 시냅스 소실(synapse loss), (5) B-세포 항체 생산, (6) 수지상 세포(dentritic cell) 성숙, (7) T-세포 증식, (8) 사이토카인 생산, (9) 미세아교세포 활성화, (10) 아르투스(Arthus) 반응, (11) 시냅스 또는 신경종말의 포식작용, 또는 (12) 보체 수용체 3(CR3/C3) 발현 세포의 활성화인, 항체.
  10. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 생쥐(murine) 항체인, 항체.
  11. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간화(humanized) 항체 또는 키메라(chimeric) 항체인, 항체.
  12. ATCC 수탁번호 PTA-120399의 하이브리도마 세포주 또는 이의 자손에 의해 생산된 생쥐 항-인간 C1q 단일클론 항체.
  13. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 이중특이(bispecific) 항체인, 항체.
  14. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 뇌 투과를 증가시키도록 만들어진, 항체.
  15. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, IgG 급(class)의 항체인, 항체.
  16. 제15항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입(isotype)을 갖는, 항체.
  17. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체 단편인, 항체.
  18. 제17항에 있어서, Fab, F(ab')2 또는 Fab' 단편인, 항체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항체 단편이 C1q에 특이적으로 결합되고 C1q의 생물학적 활성을 중화시키는, 항체.
  20. 제17항에 있어서, 상기 항체 단편이 이의 상응하는 전장(full-length) 항체에 비해 뇌 투과가 더 우수한, 항체.
  21. 제17항에 있어서, 상기 항체 단편이 이의 상응하는 전장 항체에 비해 반감기가 더 짧은, 항체.
  22. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 항체를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제22항의 핵산 서열을 포함하는 분리된 숙주 세포.
  24. ATCC 수탁번호 PTA-120399의 하이브리도마 세포 또는 이의 자손.
  25. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 항체를 포함하는 신경퇴행성 장애를 치료하거나 예방하는 약제학적 조성물로서, 신경퇴행성 장애가 알쯔하이머병, 근위축측삭경화증, 다발성 경화증, 녹내장, 근긴장성 이영양증, 다운증후군, 파킨슨병 및 헌팅톤병으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 신경퇴행성 장애가 시냅스 소실 또는 신경 연결 소실과 관련된, 약제학적 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 신경퇴행성 장애가 보체 수용체 3(CR3)/C3 또는 보체 수용체 CR1에 의존적인 시냅스 소실, 병리학적 활성-의존적 시냅스 가지치기(synaptic pruning), 또는 미세아교세포에 의한 시냅스 포식작용과 관련된, 약제학적 조성물.
  28. 삭제
  29. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 항체를 포함하는 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 대사 장애를 치료하거나 예방하는 약제학적 조성물로서, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 대사 장애가 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 당뇨병, 비만, 류마티스성 관절염(RA), 급성 호흡곤란증후군(ARDS), 허혈 및 재관류 후 원격 조직 손상, 심폐우회술 동안의 보체 활성화, 피부근염, 천포창(pemphigus), 루푸스신염 및 이로 인한 사구체신염과 혈관염, 심폐우회술, 심장마비-유도된 심장 내피 부전, 타입 II 막증식 사구체신염, IgA 신장병, 급성 신부전, 저온글로불린증, 항인지질증후군, 황반변성질환, 연령 관련 황반변성(AMD), 맥락막혈관신생(CNV), 포도막염, 당뇨망막병증, 허혈 관련 망막병증, 안구내염, 안구내 혈관신생질환, 당뇨황반부종, 병리학적 근시, 폰히펠-린다우병(von Hippel-Lindau disease), 눈의 히스토플라스마증, 시신경 척수염(NMO), 망막중심정맥폐쇄(CRVO), 각막혈관신생, 망막혈관신생, 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 천식 및 흡인폐렴으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  30. 삭제
  31. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 항체를 포함하는 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는 약제학적 조성물로서, 자가면역 질환이 중증근육무력증, 당뇨병 타입 1, 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 애디슨병(Addision's disease), 셀리악병(coeliac disease), 크론병, 악성빈혈, 심상성 천포창(Pemphigus vulgaris), 백반증, 자가면역 용혈빈혈, 부종양증후군, 혈관염, 류마티스성 다발성근육통, 관자동맥염(temporal arteritis) 및 베게너 육아종(Wegener's granulomatosis)으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  32. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 항체와, 상기 항체를 치료가 필요한 개체에 있어 고전적인 보체 활성화와 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용한다는 지시를 포함하는 패키지 인서트(package insert)를 포함하는 키트.
  33. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 항체를 포함하는 진단 키트.
  34. a) 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 항체를 생물학적 샘플과 접촉시키고;
    b) 시냅스에 결합된 항체를 탐지함으로써 상기 생물학적 샘플에서의 시냅스를 탐지함을 포함하는, 생물학적 샘플에서의 시냅스의 탐지방법.
  35. 제34항에 있어서, 단계 a)전에 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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