KR102311529B1

KR102311529B1 - 환자에게서 뎅기의 중증 케이스가 발생할 개연성을 결정하는 방법 및 키트

Info

Publication number: KR102311529B1
Application number: KR1020167025427A
Authority: KR
Inventors: 프레데릭 브댕; 로맹 프라그누
Original assignee: 비오메리으
Priority date: 2014-02-18
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2021-10-13
Also published as: US20160363589A1; BR112016017833B1; FR3017714A1; ES2741821T3; US9945857B2; KR20160123358A; US10309965B2; EP3108250B1; US20180196046A1; EP3108250A1; BR112016017833A2; WO2015124850A1

Abstract

환자에게서 뎅기의 중증 케이스가 발생할 개연성을 결정하는 방법 및 키트
본 발명은 혈액 샘플에 기초하여, 환자에게서 중증 뎅기가 발생할 개연성을 in vitro 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기에서:
a) 상기 혈액 샘플 내 혈소판 인자 4인 적어도 하나의 마커의 양이 결정되고,
b) 단계 a)에서 결정된 혈소판 인자 4의 양이 비-중증 뎅기로 진단받은 개개인의 그룹에서 획득된 상기 마커의 참조 양과 비교되며,
상기에서, 단계 a)에서 결정된 혈소판 인자 4의 양이 단계 b)에서 설정된(established) 참조 양보다 작은 경우, 중증 뎅기가 발생할 환자로 결정된다.

Description

환자에게서 뎅기의 중증 케이스가 발생할 개연성을 결정하는 방법 및 키트{METHOD AND KIT FOR DETERMINING THE PROBABILITY THAT A PATIENT WILL DEVELOP A SEVERE CASE OF DENGUE}

본 발명의 대상은, 단백질 마커를 사용하여 중증 뎅기 또는 출혈성 뎅기를 조기에 예측하기 위한 벙법에 관한 것이다.

지난 30여 년간, 뎅기, 즉 Aedes 속의 도시 흡혈 모기에 의해 전파되는 바이러스 질환은 걱정스러울 정도로 전 세계적으로 전파되어 왔다. 뎅기는 아열대, 특히 남태평양(Pacific West), 남아메리카(South America) 및 동남아시아(South-East Asia) 일대에 위치되는 100개 이상의 국가들에서 현재 공중 보건 문제이다. 상기 질병의 발생은 대체로 인구 폭발 및 혼돈의 도시화(chaotic urbanization)에 기인한다. 기후 이상 또한 무의미하지 않은 역할을 수행한다.

이 점에서, 뎅기는 현재까지도 여전히 바이러스가 있는 세계 서쪽 영역에서도 발생할 수 있다. 따라서, 본 질병의 벡터 중 하나인, Aedes albopictus가 이탈리아 북부 및 프랑스 남부에서 최근에 발견되었다. 가장 최근에는, 뎅기의 토착 케이스가 프랑스 남부에서 보고되었다. 30억 명에 가까운 사람들이 뎅기의 위험에 노출된 것으로 추정된다. 연 100만 명에 가까운 입원이 등록되고, 수천 명이 사망했다. 아이들이 이 질환의 주요 희생자들이다.

뎅기 바이러스는 단일-가닥의, 양-성 외피화된(enveloped) Flaviviridae family의 RNA 바이러스이다. 바이러스의 게놈 (11 000 뉴클레오티드)은 대략 3400개 아미노산의 폴리단백질을 인코딩하고, 이는 공- 및 후- 전사적 절단을 경험하여, 구조적 단백질(C, prM, E) 및 비-구조적 단백질 (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)을 야기한다. 4개의 바이러스 혈청형(DV1 내지 DV4)이 존재하는데, 이는 풍토성 구역(endemic zone) 내에 공존할 수 있다. 대략 70%의 서열 동일성(homology)이 다양한 혈청형들 사이에서 존재한다. 주어진 혈청형에 의한 감염은 해당 혈청형에 대해 장기간의 면역을 부여한다. 교차-보호는 수개월간만 지속 된다: 따라서 서로 다른 혈청형 간의 재감염이 가능하다.

감염은 뎅기 바이러스 중 하나에 감염된 모기에 물림으로써 시작된다. 임의의 증상의 발현은 없지만 혈액 내 바이러스가 복제되는 기간인 인큐베이션은 일반적으로 4일 내지 10일간 지속 된다. 첫 번째 징후는 인큐베이션 기간 이후에 발행된다.

이의 통상적인 형태 ("통상적인" 뎅기 열: DF) 내에서, 뎅기는 하나 이상의 다음 증상이 동반되는 갑작스럽게-발현된 이상 고열에 의해 특징 화 된다: 오한, 두통, 관절 및/또는 근육 통증, 메스꺼움 및 구토. 발진 또한 일반적으로 증상 발현 약 5일째에 나타날 수 있다. 상기 급성 열 단계는 바이러스 혈증 단계와 상응하고, 일반적으로 3 내지 5일간 지속 된다(심할 경우 2 내지 7일간). 95% 이상의 케이스에서는 중증 질환의 징후를 보이지 않으며 7일 내로 합병증 없이 회복된다.

2 내지 4%의 케이스에서, 환자는 더욱 중증이거나 혹은 덜 중증인 혈장 누수 신드롬 및 헤마토크리트 레벨 상승, 이에 따른 뎅기 출혈성 열 (DHF)에 의해 특징화 되는 임계 단계로 발전 될 수 있다. 상기 단계는 (필수적이지는 않지만) 일반적으로 약 4일 또는 5일째에 해열기 기간이 나타난다. 이는 일반적으로 잠시 동안 (24 내지 48h)이지만, 주요 출혈 발현, 쇼크 상태 및/또는 하나 이상 장기의 파괴로 특징 되는 중증 형태로 발전 될 수 있다. 중증 형태로의 발전은 하나(혹은 그 이상의) 경고 징후(들), 예컨대 다음에 의해서 거의 대부분 신호 화 된다:

- 5일 차 이후의 열 (39℃를 초과하는 열);

- 강한 복부 통증, 끊임없는 설사, 통제불능의 구토 및 음식의 완전 거부;

- 부종 및/또는 작은 삼출(minor effusion);

- 자동으로 멈추지 않는 점막 출혈;

- 확연한 무기력(pronounced lethargy) 또는 정동불안(restlessness);

- 혈소판감소증(thrombocytopenia);

- 혈액 농축(hemoconcentration)의 징후.

가장 중증인 경우, 환자가 신속하게 치료되지 않으면 혈장의 누수가 생명을 앗아갈 정도의 저 볼륨 쇼크 (Dengue Shock Syndrome; DSS)를 유발할 수 있다. 드물지만 심각하게, 간 및 신경학적 관련성 또한 질병의 중증도와 관련된다. 전염병에 따라 다양한 사망률은, 보고된 DHF의 경우 5%에 도달할 수 있다. 상기 사망률은 병원 치료 또는 적절한 처지가 없을 경우 20%까지 증가 될 수 있다.

단순화를 위해, 이러한 중증의 경우는 중증 뎅기, 즉 SevD로, 통상적인 뎅기인 DF와 구분하여 이후 언급된다.

중증 뎅기 케이스의 90%는 이종기원의 혈청형을 가지는 이차 감염 중에 발생되고, 10%는 일차 감염, 일반적으로 6개월 내지 1년 연령의 영아들에게서 발생 된다. 감염의 중증도에 영향을 미치는 몇몇 인자, 예컨대, 바이러스의 숙주, 혈청형 및 유전형, 연이은 감염 바이러스 사이의 순서 및 시간, 교차-반응성 항체의 양 및 질 및 CD4/CD8 반응의 인자가 존재한다. 연구에 따르면 바이러스 양과 질병의 중증도 사이의 관련성이 확인된다. 하지만, 중증 뎅기의 정확한 발병 원인은 여전히 밝혀지지 않았다. 현재까지, 바이러스의 특이적인 결정 인자는 확인되지 않았다. 더욱이, 뎅기 바이러스에 대한 백신이 존재하지 않기 때문에, 가능한 치료는 증상적 치료에 불과하다. 따라서, 전염병을 모니터링 하고, 적당한 병원 케어를 위한 중증 케이스를 예측하는 것이 중요하다.

뎅기를 진단하는데 현재 사용되는 방법은 중증 뎅기로의 발전을 예상할 수 없다. 기껏해야, 혈청학적 방법에 의해 일차감염과 이차 감염을 구분할 수 있고, 분자적 방법이 바이러스를 검출하고 혈청형별(serotyping)을 수행하는 것을 가능하게 한다[1,2,3,4].

본 발명은 전술된 문제를 해결하기 위하여 중증 뎅기로 발전 되는 환자를 예측할 수 있도록 하는, 혈액 샘플 내 단백질을 조기에 및 특이적으로 검출할 수 있는 방법을 제공한다. 실제로, 본 발명자들은, 놀랍게도, 숙주로부터의 단백질이 예컨대 혈장으로 구성되는 혈액 샘플 내에서 통상적인 뎅기로 남아있는 환자 (즉, 중증 뎅기로 발전하지 않는 경우)에서 발현된 양과 비교하여, 중증 뎅기로 발전 된 환자에서, 더 과량 또는 더 소량으로(과발현/저발현) 발현되었다는 것을 발견하였다. 특히, 발명자들은 첫 번째로 그리고 완전히 예상치 못하게, 혈소판 인자 4(PF4)가 중증 뎅기로 발전한 환자의 경우에 저발현(underexpressed) 되고, 따라서 중증 뎅기를 예측하는 마커를 구성한다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 혈액 샘플에 기초하여 환자에게서 중증 뎅기가 발생할 개연성을 in vitro 예측하는 방법을 그 대상으로 하고, 상기에서:

a) 상기 혈액 샘플 내 혈소판 인자 4인 적어도 하나의 마커의 양이 결정되고,

b) 단계 a)에서 결정된 혈소판 인자 4의 양이 비-중증 뎅기로 진단받은 개개인의 그룹에서 획득된 상기 마커의 참조 양과 비교되며,

상기에서, 단계 a)에서 결정된 혈소판 인자 4의 양이 단계 b)에서 설정된(established) 참조 양보다 작은 경우, 중증 뎅기가 발생할 환자로 예측된다.

본 발명의 방법에 따르면, 단계 a)에서, 올팩토메딘 4 (OLFM4) 및 α2-마크로글로불린 (A2M)에서 선택되는 적어도 하나의 다른 마커의 양 또는 이들 두 마커 각각의 양을 혈액 샘플 내에서 결정하고 및, 단계 b)에서, 단계 a)의 상기 마커 또는 두 개 마커의 양을 비-중증 뎅기로 진단받은 개개인의 그룹에서 획득되는 참조 양과 비교되며, 및 단계 a) 내의 올팩토매딘 4의 양이 단계 b)에서 결정된 참조 양과 비교하여 더 크거나 및/또는 단계 b)에서 결정된 참조 양과 비교하여 α2-마크로글로불린의 양이 더 작은 경우 중증 뎅기가 발생할 환자로 결정할 수 있다.

본 발명은 또한 중증 뎅기를 in vitro 예측하기 위한 키트로 하기를 포함하는 키트와 관련된다:

- 혈소판 인자 4에 대한 결합 파트너,

- 뎅기 바이러스 NS1 단백질에 대한 결합 파트너.

상기 키트는 또한 OLFM4에 대한 결합 파트너 및/또는 A2M에 대한 결합 파트너를 포함할 수 있다.

정의

용어 "혈액 샘플"은 전혈 (whole blood), 혈청(serum) 및 혈장(plasma)을 의미하는 것으로 의도된다.

관심의 마커의 참조 양을 결정하는데 사용되는, 용어 "비-중증 뎅기로 진단받은 개개인의 그룹"은 물론 중증 뎅기가 발생하지 않은 개개인의 그룹을 의미하는 것으로 의도된다.

용어 "결합 파트너"는 단백질에 결합할 수 있는, 예컨대, 수용체, 항체, 항체 단편, 항체 유사체 및 임의의 다른 리간드를 의미하는 것으로 의도된다.

결합-파트너 항체는, 예컨대, 폴리클로날 항체이거나 또는 모노클로날 항체이다.

폴리클로날 항체는 적당한 면역원으로 동물을 면역하고, 이어서 원하는 항체를 정제된 형태로 회수하고, 상기 동물의 혈청을 취하고, 및 특히 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원이 결합 된 컬럼 상의 친환경크로마토그래피에 의해, 항체를 다른 구성성분들로부터 분리함으로써 획득될 수 있다.

모노클로날 항체는 하기에서 요약된 일반적인 원리, 하이브리도마 기술에 의해 획득될 수 있다:

첫째, 동물, 일반적으로 마우스가 적당한 면역원으로 면역되고, 이후 상기 동물의 B 림프구가 본 항원에 대한 항체를 생산할 수 있다. 이러한 항체-생산 림프구가 "불멸화" 골수 세포 (예컨대 뮤린)와 융합되어 하이브리도마가 생성된다. 이후, 따라서 획득된 세포의 이종 혼합물을 사용하여, 특정의 항체를 생산할 수 있고 무기한으로 증식할 수 있는 세포의 선별이 수행된다. 각각의 하이브리도마는 클론의 형태로 증식되고, 각각의 클론은 모노클로날 항체의 생산을 야기하며, 상기 항체의 단백질에 대한 인지특성은 예컨대, ELISA, 1-차원 또는 2-차원 웨스턴 블롯, 면역형광법, 또는 바이오센서에 의해서 테스트 될 수 있다. 따라서 선별된 모노클로날 항체가 이후, 특히 전술된 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다.

모노클로날 항체는 또한 유전 공학에 의해서 당해 분야에 공지된 테크닉을 사용하여 획득되는 재조합형 항체일 수 있다.

용어 "항체 유사체"는 항체 또는 항체 단편과 동일한 결합 능력을 가지거나 또는 유사한 결합 능력을 가지는 생물학적 및/또는 화학적 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 특히, 항체와 같이 소단백질(small protein)을 포함하는 항체 유사체는, 생물학적 타겟에 결합할 수 있어, 따라서 이를 검출하거나, 포획하거나, 또는 유기체 또는 생물학적 샘플 내에서 이를 상당히 단순하게 타겟팅 할 수 있다. 이들 항체 유사체의 적용 분야는 항체의 그것처럼 매우 다양하다. 예를 들어, Affilogic 사에서 판매되는 소단백질(small protein)인, Nanofitins™이 언급될 수 있다.

원하는 단백질에 특이적인 결합 파트너는 포획 시약, 검출 시약, 또는 포획 및 검출 시약으로 사용될 수 있다.

면역 반응, 즉 단백질/결합 파트너 결합의 시각화는 라벨링을 통한 결합 파트너의 검출에 의해서 수행될 수 있다.

용어 "라벨링"은 검출 가능한 시그널을 생산해 낼 수 있는 라벨 제제, 즉 시각, 형광 또는 기기 수단에 의해 검출될 수 있는 화합물, 물질 또는 입자의 결합을 의미하는 것으로 의도된다.

라벨 제제의 비 제한적 목록이 아래와 같이 구성된다:

- 금속 또는 합금 입자, 예컨대 콜로이드성 금 입자,

- 고분자 입자, 예컨대 컬러 라텍스 입자,

- 자기 입자(magnetic particle),

- 형광 분자,

- 화학발광 분자.

전술된 면역학적 테스트의 예로서, "샌드위치" 및 "경쟁" 방법 ("sandwich" and "competition" method)을 들 수 있다.

도면의 대다수는 해열기 전에, 질병의 급성 열성 단계 중인 환자로부터 회수된 개별 샘플에 대해서 수행된 정량적 ELISA 분석법에 의한 결과의 확인을 보여준다. 통상적인 뎅기로 남아있는 환자는 DF로 표시되고, 중증 뎅기로 발전 된 환자는 SevD로 표시된다. 모든 경우에서, 450 nm의 흡광도 (Optical density: OD)에서 리딩이 수행된다. 결과가 서로 다른 지정학적 기원을 가지는 샘플에 대해서 획득되었다: 콜롬비아(Columbia) 및 캄보디아(Cambodia). 획득된 그래프 (GraphPad Prism 소프트웨어, V4.03) 상에서, 산출된 중간 값이 수평선에 의해 표현된다. 박스는 50%의 개인들을 아우르는 값을 나타낸다. 최대 및 최소값이 또한, 표시된다. 참작된 값은 이중으로 수행된 두 개의 독립된 테스트의 평균에 상응한다.
도 1은 바이러스 단백질 E에 직접 대응되는 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 나타내어지는, 환자의 혈장에서 정제된 분획 내 바이러스의 존재 및 컨트롤(C)에서의 부재를 보여준다.
도 2는 콜롬비아인 환자의 혈장 샘플 상 PF4 마커의 ELISA 분석법에 의해 정량적 분석으로 획득되는 결과를 나타낸다.
도 3은 캄보디아인 환자의 혈장 샘플 상 PF4 마커의 ELISA 분석법에 의한 정량적 분석법으로 획득되는 결과를 나타낸다.
도 4는 콜롬비아인 환자의 혈장 샘플에 대한 OLFM4 마커의 ELISA 분석법에 의한 정량적 분석으로 획득되는 결과를 나타낸다.
도 5는 캄보디아인 환자의 혈장 샘플에 대한 OLFM4 마커의 ELISA 분석법에 의한 정량적 분석으로 획득되는 결과를 나타낸다.
도 6은 캄보디아인 환자의 혈장 샘플 상 A2M 마커의 ELISA 분석법에 의한 정량적 분석으로 획득되는 결과를 나타낸다.

실시예 1: 샘플의 특징화

뎅기에 양성인 15개의 콜롬비아인 혈장 샘플이 선별되었는데, 이 중 8개는 중증 뎅기로 발전 되지 않은 통상적인 뎅기로 남아있는 환자에서 기원 되고 (본원에서 환자/샘플을 DF 또는 통상적인 뎅기로 지칭함) 및 7개는 중증 뎅기로 발전 된 환자에서 기원 (본원에서 환자/샘플을 SevD 또는 중증 뎅기로 지칭함)된다. 다양한 혈장이 함께 그룹화되어 각각 통상적인 뎅기 DF 혈장의 풀 및 중증 뎅기로 발전한 사람의 중증 뎅기 SevD 혈장의 풀로 구성되었다. 모든 혈장들은 이차 감염된 환자로부터, 임계 단계(critical phase) 전, 질병의 급성 열성 단계 동안에 수집되었다. 고려된 혈청형은 혈청형 1, 2 및 3이었다. 중증 뎅기로 발전 된 모든 환자들은 입원하였고, 출혈의 징후를 가지고 있었다. 동시이환(comorbidity)은 보고되지 않았다 [5]. 모든 혈장들이 NS1-양성 (Platelia 뎅기 키트, Bio-rad)인 것으로 확인되었고 및 바이러스 양(virus load) 또한 상업적으로 이용가능 한 키트(PrimerDesign)를 사용하여 공급자의 인스트럭션에 따른 Q-RT-PCR에 의해 확인되었다: 바이러스 RNA 카피수의 평균 수가 통상적인 뎅기 (DF) 풀 및 중증 뎅기 (SevD) 풀 각각에 대해서 4 × 10⁶ 및 4.1 × 10⁷로 추산되었다. 구성된 풀은 대략 2 ml의 혈장 볼륨과 상응한다. 정제 전, 혈장 혼합물은 5분 동안 1000×g 및 4℃에서 원심분리되어 샘플 내 존재하는 불순물이 제거되고 정화된 샘플이 획득되었다.

혈장 선별 기준(criteria)이 하기 표 1에 개시된다. 샘플은 징후가 나타난 후에 수득 되었다.

[표 1]

이후 기술되는 바와 같이, 상기 혈장 샘플 풀은 이후 정화되어 바이러스-풍부한 분획이 획득되었다.

실시예 2: 샘플의 정제

모든 단계가 4℃에서 수행된다. 정화된 샘플에 콜드 pH8 PBS (PBS8) 8ml가 보충되었고, 이후 2h 동안 41 000 × g에서 Optima L90 초원심분리기 (Beckman) 내에서 원심분리되었다. 사용된 로터는 SW41 로터 (Beckman)이다. 원심분리 후, 상청액이 제거되고, 획득된 바이러스 펠렛이 200 마이클로리터의 PBS8 내에서 재현탁되고 이후 PBS8 내 60% (w/w) 슈크로오스 5 ml 및 PBS8 내 20% (w/w) 슈크로오스 5 ml의 불연속 구배로 로딩 된다. 2h 동안 41 000 × g로 다시 원심분리 후 두 슈크로오스 용액 사이 인터페이스에 위치되는 비리온-풍부 환(circle)이 피펫을 통해 취해지고, PBS8로 10배 희석된 후 및 최종적으로 마지막 2시간 동안 41 000 × g으로 원심분리된다. 획득된 펠렛은 PBS8 200마이크로리터 내에 재현탁된다.

상기 재현탁액은 이후 불용성 다가전해질, Viraffinity (BioSupportGroup, USA)을 사용하여 정제된다. 이를 위해, 200마이크로리터의 MN 버퍼 (60 mM MES pH 6.5, 150 mM NaCl)가 100마이크로리터의 Viraffinity와 함께 바이러스 현탁액에 첨가된다. 혼합물은 5 min 동안 상온에서 인큐베이션 되고, 이후 10 min 동안 1000 × g에서, 공급자의 인스트럭션에 따라서 원심분리된다. 상청액이 제거되고, 고분자 펠렛이 3회 200마이크로리터의 MN 버퍼를 사용하여 행궈진다. 바이러스 단백질이 50마이크로리터의 SDS (Novex InVitrogen) 함유 버퍼의 존재하에서 5 min 동안 / 70℃에서 가열됨에 의해서 회복되고, 이후 5 min 동안 1000 × g으로 원심분리 된다.

최종 샘플 내 바이러스의 존재는 뎅기 바이러스 (E 단백질)에 직접적으로 대응되는(directed against) 모노클로날 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 확인되었다. 도 1에 따르면, 외피 단백질의 모노머 및 다이머 형태에 각각 상응하는, 60 kDa 및 120 kDa에서 강한 시그널이 혈장 풀 내 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 검출된다. 반면, 전술된 방법과 동일한 방법으로 정제된 건강한 (비-뎅기) 혈장의 풀에 상응하는 컨트롤에서는 외피 단백질이 검출되지 않았다.

실시예 3: 질량 분석법(mass spectrometry: MS)에 의한, 각각의 혈장 풀, 통상적인 뎅기 DF 및 중증 뎅기 SevD에 특이적인 단백질의 확인(Identification)

방법:

실시예 2에 따라 획득되는 바이러스 제제(preparation) 및 컨트롤 샘플이 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 상에 증착되고, 단백질이 겔 내로 침투될 때까지 이동되어 샘플이 탈염화 된다. 단백질을 포함하는 밴드가 손으로 잘라내지고 이후 50% 아세토니트릴을 함유하는 버퍼 내에서 3회 세척되며, 이후 최종적으로 100% 아세토니트릴 내에서 건조된다. 겔이 이후 7% H₂O₂ 용액에서 재 수화되고 다시 세척된다. 25mM NH₄HCO₃ 내 희석된 트립신 용액이 첨가되어 하룻밤 동안 37℃에서 가수분해된다. 따라서 획득된 펩티드가 30마이크로리터의 50% 아세토니트릴, 30마이크로리터의 5% 포름산 및 30마이크로리터의 100% 아세토니트릴을 통한 15분 동안의 순차적인 추출에 의해 추출된다. 상기 순차적인 추출물이 혼합되고 진공 하에서 건조되며 5% 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로 아세트산을 함유하는 용액 내에서 재현탁된다. 샘플의 정량 후, 규정된 양의 펩티드가 질량 분석과 함께 커플링 된 나노 액체 크로마토그래피에 의해 분석된다 (Ultimate 3000, Dionex 및 LTQ-Orbitrap VelosPro, Thermo Fisher Scientific). 결과는 Xcalibur 소프트웨어 (Thermo Fisher)에 의해 획득되고 Mascot Daemon V2.2 소프트웨어 (Matrix Science)에 의해 자동으로 변환된다. 검색이 Mascot 2.2를 통한 Swissprot 및 Trembl 데이타베이스 상에서 수행된다. 각각의 실험은 독립적으로 2회 수행된다. 단백질이 EDyP Service laboratory (CEA Grenoble, France)에 의해 확인되었다.

결과:

바이러스 외피 단백질 E가 바이러스를 함유하는 샘플 내에서 반복적으로 확인되었다. 뚜렷하게 확인된 펩티드 시퀀스는 GWGNGCGLLFKG 이었다. 본 결과는 정제된 분획 내에서 바이러스가 존재함을 확인한다.

정제된 혈장 풀 상 프로테오믹스에 의해 확인된, 세포 기원 단백질에 대하여 획득된 결과는 표 2a 및 2b에 요약된다. 이들 표에서, 하나의 실험과 다른 실험에서 발견된 펩티드 펩티드 수에 대하여 25% 미만의 변화(variance)를 가지는 단백질만이 고려되었다. 유사하게, 중증 뎅기 샘플에 대하여, 2 초과의 펩티드 수가 요구되었다. 이들 기준에 따라, 189개의 단백질이 최종적으로 선별되었다. 이들 단백질은 하기 표 2a 및 2b에 기술되었다. "중증 뎅기 (SevD) 샘플 내 펩티드 수"/"통상적인 뎅기 (DF) 샘플 내 펩티드 수"의 비율((SevD/DF))은 이들 단백질의 대다수에 대해서 산출될 수 있었다 (참조. 표 2a). 몇몇 단백질은 SevD 샘플 내에서만 확인되었다 (참조. 표 2b); 이 경우에는, SevD/DF는 산출될 수 없었다.

[표 2a]

[표 2b]

실시예 4: 확인(Confirmation) ELISA

방법:

질량 분석 결과를 확인하기 위하여, 특이적 정량적 ELISA가 개별 혈장에 대해서 이중으로 수행되었다. 표 2a/2b 내 확인된 것에서 선별되고 테스트 되는 단백질은 중증 뎅기 (SevD) / 통상적인 뎅기 (DF) 비율이 1.33 이상인 것, 및 0.75 이하인 것으로, 평균 펩티드 수가 각 샘플에 대해 1을 초과하고, 뎅기 발병과 잠재적으로 관련된 것들이다. 상기 1차 스크리닝은 가장 관련된 이들 단백질의 분석만을 가능하도록 한다. 상기 기준에 따라 하기의 단백질들이 선별되었다:

- 셀룰로플라스민(ceruloplasmin),

- 단백질 S,

- 프로퍼딘 보체 인자,

- 안티트롬빈-III,

- 분비 컴포넌트 p85,

- 보체 C1r 단백질,

- 보체 C1s 단백질,

- 안지오텐신,

- 인자 II,

- CFB,

- 항-인자 VIII,

- 혈청 아밀로이드 P-컴포넌트,

- 올팩토메딘 4 (OLFM4),

- 트롬보스폰딘,

- 혈소판 인자 4 (PF4),

- 보체 C1q 단백질,

- 모에신(moesine), 및

- 보체 C8 단백질.

멀티메린-1(Multimerin-1), 아포리포단백질 B-100 및 von Willebrand 인자가 또한 분석되었다.

상기 단백질들은 응혈 경로 또는 보체 캐스케이드의 주요 요소(element)들임을 고려하여야 한다.

상기의 ELISA는 상업적으로 활용가능한 키트(USCN, China)를 사용하여, 공급자의 인스트럭션에 따라 수행되었다. 통계적 분석 (Mann-Whitney 테스트 및 ROC/AUC 곡선)이 GraphPad Prism V4.03 소프트웨어를 통해 수행되었다.

각 후보 마커가 개별 혈장 샘플에 대해서 분석되었다. 이들 샘플들은 질병의 급성 열성 단계 (바이러스 혈증 단계) 중에 취해진 혈장 샘플들이고, 이들 샘플들은 중증 뎅기로 발전 되지 않은 통상적인 뎅기로 남아 있는 환자(DF)에서 기원 되거나 또는 중증 뎅기로 발전된 환자(Sev)에서 기원 된 것이다. 모든 환자들은 이차 뎅기를 가졌다. 혈청형 1, 2 및 3 만이 나타났다 (혈청형 4는 없음). 이들 샘플은 l'Universidad Industrial de Santander (Bucaramanga, Colombia) [5] 에서 기원 되거나 또는 캄보디아 내 Institut Pasteur (Phnom-Penh)에서 기원 된다. 후자는 지역 윤리 위원회에 따라서 수행된 전향적 연구(prospective study)의 일부분이었다. 두 개의 샘플링 기원의 특성이 하기 표 3 및 표 4에서 주어진다. 샘플은 증상이 발현된 후에 수집되었다.

[표 3] 콜롬비아인 혈장 샘플

[표 4] 캄보디아인 혈장 샘플

SD: 표준 편차

ns: 비-유의한 p value

결과:

ELISA-분석된 마커의 대부분에 대하여, 혈장 농도의 차이가 DF 및 SevD 혈장 사이에서, 콜롬비아인이건 또는 캄보디아인이건 간에 발견되지 않았다 (p>0.1).

반면에, 두 개의 마커에 대해서는, 중증 뎅기로 발전함이 없는 통상적인 뎅기만 남아있는 환자와 중증 뎅기 SevD로 발전한 환자들 사이를 명백하게 구분할 수 있는 결과가 도출되었다. 첫 번째 마커는 PF4 (혈소판 인자 4)이다.

콜롬비아인 샘플에 대해서, DF 샘플에 대한 혈장 농도의 차이가 관찰된다 (p<0.001) (도 2). AUC는 0.88이다(95% CI: 0.7305-1).

캄보디아인 샘플에 대해서, DF 샘플의 혈장 농도의 유의한 차이가 있는 것으로 확인된다 (p< 0.0001) (도 3). AUC는 0.94이다 (95% CI = 0.87-1). ROC 곡선은 100%에 가까운 민감도를 위한 가장 좋은 특이성을 결정할 수 있도록 한다. 결과가 하기 표 5에 요약된다: 본 마커에 대하여 및 95%의 민감도에 대하여, 70%에 가까운 특이성이 달성된다.

[표 5]

- 두 번째 마커는 OLFM4 (올팩토메딘 4) 이다

콜롬비아인 샘플에 대하여, 마커의 혈장 농도는 DF 샘플과 비교하여 Sev 샘플 내에서 더 높았다 (p=0.07; 참조. 도 4).

캄보디아인 샘플에 대해서 농도의 극히 유의적인 차이(p<0.0003) 및 DF 샘플과 비교하여 SevD 샘플의 두 배 이상 더 높은 중간 값이 확인되었다 (도 5). AUC는 0.858이다(95% CI = 0.7307-0.985).

ROC 곡선에 의해 100%에 근접한 민감도에 대한 최상의 특이성(best specificity)을 결정할 수 있다. 결과는 표 6에서 요약된다: 상기 마커에 대해서 95%에 가까운 민감도와 72%를 초과하는 특이성에 도달된다.

[표 6]

동시에, 또 다른 마커인 α-2 마크로글로불린 (A2M)이 SILAC-타입 시차(differential) 프로테오믹 방법 (세포 배지 내 아미노산에 의한 안정한 동위 원소 라벨링)에 의해 정제되지 않은 캄보디아인 혈장 샘플에서 확인되었다 [6]. 이같은 세 번째 마커의 확인은 하기 실시예에서 기술된다.

실시예 5: 샘플의 특징화

본 실험에 사용된 개별 혈장 풀 또는 그룹의 조성이 표 7에 요약된다. 풀을 구성하도록 선별된 모든 캄보디아인 혈장은 이차 감염을 가지는 환자로부터, 임계 단계 전 질병의 급성 열성 단계 중에 취해졌다. 관련된 혈청형은 혈청형 1이었다. 모든 SevD 환자는 입원하였고, 출혈의 징후를 가지고 있었다. 동시 이환은 보고되지 않았다. 모든 혈장은 NS1-양성인 것으로 확인되었고 (Platelia 뎅기 키트, Bio-rad) 및 바이러스 양이 또한 상업적으로 입수가능 한 키트를 사용하여 공급자의 인스트럭션에 따라 Q-RT-PCR에 의해 확인되었다. 구성된 풀은 대략 2ml의 혈장의 최종 볼륨에 상응한다. 혈장 그룹은 열로 사전에 비활성화되고 (56℃/20분), 이후 5분동안 1000 × g 및 4℃에서의 원심분리에 의해 사전정화되어, 샘플 내에 존재하는 불순물이 제거되었다.

[표 7]

실시예 6: 시차 프로테옴 분석(Differential proteome analysis)

사용된 방법은 MASStermind™ 플랫폼을 사용하여 Pronota (Ghent, Belgium)에 의해 개발된 SILAC 타입 (Stable Isotope Labelling by Aminoacids in cell Culture) [6]의 세미-정량적 프로테오믹 방법으로, 통상적인 뎅기 DF 또는 중증 뎅기 SevD 혈장 그룹에 대하여 수행되었다. 각 그룹은 실시예 5에 기술된 바와 같이 6개의 샘플의 혼합물로 구성된다.

상기 혈장 혼합물은 친화성 크로마토그래피에 의해서 14개의 가장 풍부한 혈장 단백질이 사전에 결핍된다(depleted). 회수된 단백질의 양은 종국엔 바이신코닉산에 기초한 비색 분석법 (BCA assay Thermo Fisher Scientific Inc., USA)에 의해 획득되었다.

MASStermind™ 연구는 모든 샘플을 함께 모은 참조 샘플에 대해 각 샘플을 비교하였다. 상기 방법은 통상적인 뎅기 DF 샘플과 비교하여 중증 뎅기 SevD 샘플 내에 펩티드/단백질의 상대적 레벨, 존재 또는 부재에 대한 정보를 제공한다. 시차 분석(differential analysis)이 라벨 된 샘플을 상이한 동위 원소와 혼합하고, 질량 분석법에 의해서 각 매치 된 피크를 분석함으로써 수행되었다. 동위원소 라벨이 트립신 가수분해에 의해 삽입, 즉 2개의 ¹⁸O 원소가 ("헤비(heavy)" 라벨링) 펩티드의 C-말단 아르기닌 상으로 편입되어 ¹⁶O로 라벨 된 ("라이트(light)" 라벨링) 동일한 펩티드와 4 달톤의 질량 차이를 유발하였다. 참조 샘플은 ¹⁶O로 라벨링 되고, 반면 개별 샘플은 ¹⁸O로 라벨링된다. 각 샘플 내 펩티드 및 단백질의 확인을 위해 MS/MS 데이터가 MASCOT 소프트웨어에 제출되었다.

MS/MS 분석에 따라, 250개 초과의 정량 가능한 단백질이 인식가능하고 이들 중 10개의 단백질은 상이한 것으로 확인되는 적어도 하나의 펩티드를 가진다. 인식된 단백질 각각에 대하여 Sev/DF 비율이, 주어진 단백질에 대하여 인식된 모든 펩티드의 계수의 가중 평균으로서 산출되었다. 종합적으로, 결과에 따르면 두 개의 프로테옴 사이에 높은 정도의 유사성이 관찰되었고, 단지 몇몇 단백질들이 상이하게 발현된 것으로 관찰되었다. 이들 10개의 단백질 중 3개에 대해서 인식된 펩티드는 시스템적으로 상이하게 발현되었고, 1의 편차가 있는 평균 Sev/DF 비율을 가졌다 (참조 표 8). 3개의 단백질이 인식되었다: α-2 마크로글로불린 (A2M), 보체 C3f 및 헤파린 보조인자 2. 이들 단백질은 응혈 경로 또는 보체 캐스케이드의 주요 요소이다.

[표 8]

실시예 7: 확인(Confirmation) ELISA

방법:

질량 분석 결과를 확인하기 위하여, 특이적 정량 ELISA가 개별 혈장에 대해서 이중으로 수행되었다. 실시예 6에서 확인된 단백질이 분석되었다: α-2 마크로글로불린 (A2M), 보체 C3 단백질, 및 헤파린 보조인자 2.

상기 ELISA는 상업적으로 사용가능한 키트 (USCN, China)를 사용하여, 공급자의 인스트럭션에 따라서 수행되었다. 통계적 분석 (Mann-Whitney test 및 ROC/AUC 곡선)이 GraphPad Prism V4.03 소프트웨어를 이용하여 수행되었다.

각 후보 마커가 개별 샘플에 대해서 분석되었다. 이들 샘플들은 질병의 급성 열성 단계 (바이러스 혈증 단계) 중인 환자로부터 취해진 혈장 샘플이었다. 환자의 임상적 팔로우업에 따르면, 몇몇은 중증 뎅기로 발전되지 않고 통상적인 뎅기 DF로 최종적으로 남았고, 반면, 다른 몇몇은 중증 뎅기 SevD로 발전되었다. 모든 환자들은 이차 뎅기를 가지고 있었다. 혈청형 1만이 확인되었다. 이들 샘플들은 캄보디아 내 Institut Pasteur (Phnom-Penh)로부터 기원되었고, 지역 윤리 위원회와의 협약 내에서 수행된 전향적인 연구의 일부분 이었다. 샘플링 기원의 특징화가 표 9에 개시된다.

[표 9]

HBG: 혈장 헤모글로빈

SD: 표준 편차

ns: 비-유의한 p value

결과:

ELISA-분석된 마커의 대부분에 대해서, (보체 C3f 및 헤파린 보조인자 2) DF 및 SEvD 혈장 사이에서 혈장 농도의 차이가 관찰되지 않았다 (p>0.1).

하지만, A2M에 대해 ELISA 분석된 캄보디아인 샘플에 대해서는, 유의한 농도의 차이가 관찰되었고 (p<0.0004) 및 SevD 샘플과 비교하여 DF 샘플에서 대략 두배만큼 높은 중간값이 관찰되었다 (도 6). AUC는 0.89 이었다 (95% CI = 0.75-1).

A2M에 대해서, ROC 곡선으로 100%에 근접한 민감도를 위한 가장 좋은 특이성을 결정할 수 있었다. 결과가 표 10에서 요약된다: 94%에 근접한 민감도에 대해서, 83% 초과의 특이성에 도달된다.

[표 10]

참조 문헌

1. SB Halstead . The lancet 2007; 370: 1644-52

2. AS Leong et al. Semin.Diagn.Pathol. 2007; 24(4):227-236

3. K. Clyde et al. J. Virol. 2006; 23: 11418-11431

4. Fields Virology, Fifth edition, Knipe DM ed., LWW

5. Villar-Centeno LA et al. Am. J.Trp.Med.Hyg. 2008; 78: 370-374 6. R. Drissi et al. FEBS J. 2013

Claims

혈액 샘플에 기초하여, 환자에게서 중증 뎅기가 발생할 개연성(probability)을 in vitro 결정하는 방법으로, 상기에서:
a) 상기 혈액 샘플 내 적어도 하나의 마커인, 혈소판 인자 4의 양이 결정되고,
b) 단계 a)에서 결정된 혈소판 인자 4의 양이 비-중증 뎅기로 진단받은 개개인의 그룹에서 획득된 상기 마커의 참조 양과 비교되며,
상기에서, 단계 a)에서 결정된 혈소판 인자 4의 양이 단계 b)에서 설정된(established) 참조 양보다 작은 경우, 환자에게서 중증 뎅기가 발생할 것으로 결정되는, 방법.
제1항에 있어서,
단계 a)에서, 올팩토메딘 4 및 α2-마크로글로불린에서 선택되는 적어도 하나의 다른 마커의 양이 혈액 샘플 내에서 결정되고 및, 단계 b)에서, 단계 a)의 상기 다른 마커의 양이 비-중증 뎅기로 진단받은 개개인의 그룹에서 획득되는 상기 다른 마커의 참조 양과 비교되며, 및 단계 a)에서 결정된 상기 적어도 하나의 다른 마커의 양이 단계 b)에서 결정된 참조 양과 비교하여 올팩토메딘 4에 대해서 더 크거나 또는 α2-마크로글로불린에 대해서 더 작은 경우 중증 뎅기가 발생할 환자로 결정되는, 방법.
제1항에 있어서,
단계 a)에서, 올팩토메딘 4 및 α2-마크로글로불린에서 선택되는 적어도 두 개의 다른 마커의 양이 혈액 샘플 내에서 결정되고, 및, 단계 b)에서, 단계 a)의 두 개의 다른 마커 각각이 비-중증 뎅기로 진단받은 개개인의 그룹에서 획득되는 상기 다른 마커 각각의 참조 양과 비교되며, 및, 단계 a)에서 결정된 상기 다른 마커 각각의 양이 단계 b)에서 결정된 마커 각각의 참조 양과 비교하여 올팩토메딘 4에 대해서 더 크거나 또는 α2-마크로글로불린에 대해서 더 작은 경우, 중증 뎅기가 발생 할 환자로 결정되는, 방법.
혈액 샘플에 기초하여, 환자에게서 중증 뎅기가 발생할 개연성을 in vitro 결정하기 위하여, 단백질 마커로서 혈소판 인자 4와 α2-마크로글로불린을 사용하는 방법.
혈액 샘플에 기초하여, 환자에게서 중증 뎅기가 발생할 개연성을 in vitro 결정하기 위하여, 단백질 마커로서 혈소판 인자 4와 올팩토메딘을 사용하는 방법.
혈소판 인자 4에 대한 결합 파트너 및 뎅기 바이러스 NS1 단백질에 대한 결합 파트너를 포함하고, 상기 결합 파트너는 수용체, 항체, 항체 단편, 항체 유사체 또는 임의의 다른 리간드에서 선택되는, 환자에게서 중증 뎅기가 발생할 개연성을 in vitro 결정하기 위한 키트.
혈소판 인자 4에 대한 결합 파트너 및 α2-마크로글로불린에 대한 결합 파트너를 포함하고, 상기 결합 파트너는 수용체, 항체, 항체 단편, 항체 유사체 또는 임의의 다른 리간드에서 선택되는, 환자에게서 중증 뎅기가 발생할 개연성을 in vitro 결정하기 위한 키트.
혈소판 인자 4에 대한 결합 파트너 및 올팩토메딘 4에 대한 결합 파트너를 포함하고, 상기 결합 파트너는 수용체, 항체, 항체 단편, 항체 유사체 또는 임의의 다른 리간드에서 선택되는, 환자에게서 중증 뎅기가 발생할 개연성을 in vitro 결정하기 위한 키트.
제8항에 있어서,
α2-마크로글로불린에 대한 결합 파트너를 추가로 포함하는 키트.
제7항, 제8항 또는 제9항에 있어서,
뎅기 바이러스 NS1 단백질에 대한 결합 파트너를 추가로 포함하는 키트.
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