BR112016017833B1 - Processo e kit para determinar a probabilidade que um paciente desenvolverá um caso severo de dengue - Google Patents
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Abstract
processo e kit para determinar a probabilidade que um paciente desenvolverá um caso severo de dengue. a presente invenção refere-se a um processo para determinar, in vitro de uma amostra de sangue, a probabilidade que um paciente desenvolverá um caso severo de dengue, em que: a) a quantidade de pelo menos um marcador, fator de plaqueta 4, é determinada na amostra de sangue; b) a quantidade do fator de plaqueta 4 determinada na etapa a) é comparada com uma quantidade de referência do referido marcador obtido de um grupo de indivíduos que foram diagnosticados com um caso não severo de dengue, e se a quantidade de fator de plaqueta 4 determinada na etapa a) for maior que a quantidade de referência na etapa b), é determinado que o paciente desenvolverá um caso de dengue severa.
Description
[001] O objeto da presente invenção é um processo para a predi ção precoce de dengue severa ou dengue hemorrágica usando marcadores de proteína.
[002] Durante os últimos 30 anos, dengue, uma doença viral transmitida por mosquitos hematófagos urbanos do gênero Aedes tem expansão preocupante ao longo do mundo. É atualmente um real problema de saúde pública para mais de cem países localizados na zona subtropical, particularmente no Oeste do Pacífico, América do Sul e zonas do Sudeste Asiático. O aparecimento da doença é em grande parte devido à explosão da população e à urbanização caótica. Anormalidades climáticas da mesma forma desempenham um papel não insignificante.
[003] Neste respeito, dengue poderia surgir nas regiões ociden tais do mundo que até agora foram poupadas do vírus. Desse modo, Aedes albopictus, um dos vetores da doença, foi encontrado recentemente no Norte da Itália e no Sul da França. Mais recentemente, casos nativos de dengue foram registrados no Sul de França. Calcula-se que perto de três bilhões de pessoas estejam expostas aos riscos de dengue. Perto de um milhão de hospitalizações são anualmente registradas e tem havido milhares de mortes. Crianças são as principais vítimas da doença.
[004] O vírus da dengue é um vírus de RNA envelopado de pola ridade positiva, de filamento único da família Flaviviridae. O genoma do vírus (11 000 nucleotídeos) codifica uma poliproteína de aproximadamente 3400 aminoácidos que sofrem clivagem co e pós- translacional que resulta em proteínas estruturais (C, prM, E) e proteí- nas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Há 4 sorotipos virais (DV1 a DV4) que podem coexistir em zonas endêmicas. Há aproximadamente 70% de homologia de sequência entre os vários sorotipos. A infecção por um determinado sorotipo confere imunidade a longo prazo para este sorotipo. A proteção cruzada permanece apenas alguns meses: a reinfecção é, portanto, possível com um sorotipo diferente.
[005] A infecção começa com uma mordida de um mosquito in fectado com um dos vírus da dengue. A incubação, o período durante o qual o vírus replica-se no sangue sem, porém, dar origem a qualquer sintoma, geralmente permanece de 4 a 10 dias. Os primeiros sinais ocorrem depois do período de incubação.
[006] Em sua forma convencional (febre da dengue “convencio nal”: DF), dengue é caracterizado por hipertermia de início súbito acompanhada por um ou mais dos seguintes sintomas: calafrios, dores de cabeça, dores articulares e/ou musculares, náuseas e vômitos. Uma erupção cutânea pode da mesma forma aparecer, geralmente em torno do 5° dia de sintomas. Este estágio febril agudo que corresponde à fase virêmica, geralmente permanece de 3 a 5 dias (extremos: 2 a 7 dias). Mais de 95% dos casos não terão sinais de doença grave e vão se recuperar sem complicações em menos de 7 dias.
[007] Em 2 a 4% dos casos, o paciente pode desenvolver uma fase crítica caracterizada por uma síndrome de vazamento de plasma mais severa e um nível de hematócrito aumentado, levando à febre hemorrágica da dengue: DHF. Esta fase tipicamente (mas não necessariamente) aparece no momento da defervescência, em torno do 4° ou 5° dia. É geralmente breve (24 a 48 horas), mas pode desenvolver- se em uma forma grave caracterizada por manifestações hemorrágicas maiores, um estado de choque e/ou a insuficiência de um ou mais órgãos. O desenvolvimento em uma forma severa é mais frequente- mente sinalizado antes de um (ou mais) sinal(is) de advertência, tais como: - febre (temperatura maior que 39°C) depois do 5° dia; - dor abdominal intensa, diarreia persistente, vômito in- controlável e recusa completa de alimento; - edemas e/ou efusão secundária; - sangramento de membranas mucosas que não param automaticamente; - letargia pronunciada ou inquietude; - trombocitopenia; - sinais de hemoconcentração.
[008] Nos casos mais severos, o vazamento de plasma pode le var ao choque hipovolêmico mortal (Síndrome de Choque da Dengue: DSS) se o paciente não for tratado rapidamente. O envolvimento hepático e neurológico raro, mas mortal está da mesma forma associado com a severidade da doença. A taxa de mortalidade, que é variável de acordo com as epidemias, pode alcançar 5% de casos de DHF estabelecidos. Esta taxa pode aumentar até 20% sem cuidado em hospital ou tratamentos apropriados.
[009] Para simplificar, estes casos severos serão referidos como dengue severa, SevD no restante da descrição, ao invés de dengue convencional, DF.
[0010] 90% dos Casos de dengue severa ocorrem durante a infec ção secundária com um sorotipo heterólogo, e 10% durante a infecção primária, geralmente em crianças com 6 meses a 1 ano de idade. Há vários fatores que influenciam a severidade da infecção, tais como os fatores do hospedeiro, sorotipo e genótipo do vírus, a ordem e tempo entre os vírus infectantes sucessivos, a qualidade e quantidade de anticorpos reativos cruzados e a resposta de CD4/CD8. Estudos mostraram uma correlação entre a carga viral e a severidade da doença. As causas exatas da ocorrência de dengue severa existem, entretanto, ainda não conhecidas. Até agora, nenhum fator determinante específico para virulência foi demonstrado. Além disso, visto que não há nenhuma vacina contra o vírus da dengue, os únicos tratamentos disponíveis são tratamentos sintomáticos. Por conseguinte, é importante poder monitorar as epidemias e predizer casos severos para cuidado em hospital apropriado.
[0011] Os métodos atualmente usados para diagnosticar a dengue não tornam possível predizer o desenvolvimento de dengue severa. Quando muito, os métodos sorológicos tornam possível fazer a distinção entre as infecções primárias e secundárias e métodos moleculares tornam-se possíveis para a detecção do vírus e para a realização da sorotipagem [1, 2, 3, 4].
[0012] A presente invenção fornece uma solução aos problemas apresentados acima por meio de um processo que permite igualmente a detecção precoce e específica de proteínas em uma amostra de sangue tornando possível predizer pacientes que desenvolvem dengue severa. Realmente, os inventores constataram, surpreendentemente, que proteínas do hospedeiro foram expressas mais ou menos abundantemente (superexpressas/subexpressas) em casos de pacientes que desenvolvem dengue severa, em comparação à quantidade ou expressão das mesmas em casos de pacientes que permanecem com dengue convencional (isto é, não desenvolvendo dengue severa) em amostras de sangue consistindo, por exemplo, de plasma. Mais particularmente, eles demonstraram pela primeira vez e completamente inesperadamente que fator de plaqueta 4 (PF4) é subexpresso no caso de pacientes que desenvolvem dengue severa e desse modo constituem um marcador para predizer dengue severa.
[0013] Desse modo, um objeto da presente invenção é um proces so para predizer, in vitro, a probabilidade de um paciente que desen- volve dengue severa, com base em uma amostra de sangue, em que: a) a quantidade na referida amostra de sangue de pelo menos um marcador, que é fator de plaqueta 4, é determinada, b) a quantidade de fator de plaqueta 4 determinado na etapa a) é comparada com uma quantidade de referência do referido marcador obtido de um grupo de indivíduos que foram diagnosticados com dengue não severa, em que, se a quantidade de fator de plaqueta 4 determinado na etapa a) for menor que a quantidade de referência estabelecida na etapa b), é predito que o paciente desenvolverá dengue severa.
[0014] De acordo com o processo da invenção, é também possível determinar, na etapa a), a quantidade na amostra de sangue de pelo menos um outro marcador escolhido dentre olfactomedina 4 (OLFM4) e (2-macroglobulina (A2M) ou as quantidades respectivas dos dois marcadores e, na etapa b), a quantidade do marcador ou dos dois marcadores de etapa a) é comparado com uma quantidade de referência obtida de um grupo de indivíduos que foram diagnosticados com dengue não severa e, se a quantidade de olfactomedina 4 na etapa a) for maior que a quantidade de referência estabelecida na etapa b) e / ou a quantidade de α2-macroglobulina for menor que a quantidade de referência estabelecida na etapa b), é determinado que o paciente desenvolverá dengue severa.
[0015] A invenção também refere-se a um kit para a predição in vitro de dengue severa, compreendendo: - um par de ligação para o fator de plaqueta 4, - um par de ligação para a proteína NS1 do vírus da dengue.
[0016] O kit também pode compreender um par de ligação para OLFM4 e / ou um par de ligação para A2M. Definições
[0017] O termo “amostra de sangue” é pretendido significar san gue, soro e plasma total.
[0018] O termo “grupo de indivíduos que foram diagnosticados com dengue não severa”, usado para determinar a quantidade de referência do marcador de interesse, é pretendido, naturalmente, significar que o grupo de indivíduos não desenvolveu dengue severa. Desse modo, na etapa b) a quantidade doe fator de plaqueta 4 determinado na etapa a) é comparada com uma quantidade de referência do referido marcador obtido de um grupo de indivíduos que foram diagnosticados com dengue sem ter desenvolvido dengue severa.
[0019] O termo “par de ligação” é pretendido significar, por exem plo, receptores, anticorpos, fragmentos de anticorpo, análogos de anticorpo e qualquer outro ligante capaz de ligar-se a uma proteína.
[0020] Os anticorpos do par de ligação são, por exemplo, anticor pos policlonais ou anticorpos monoclonais.
[0021] Os anticorpos policlonais podem ser obtidos por imunização de um animal com o imunógeno apropriado, seguido por recuperação dos anticorpos desejados em forma purificada, retirando-se o soro do referido animal, e separação dos referidos anticorpos dos outros componentes de soro, especialmente por cromatografia de afinidade em uma coluna a qual é ligada um antígeno especificamente reconhecido pelos anticorpos.
[0022] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos pela técnica de hibridoma, o princípio geral da qual é resumido abaixo.
[0023] Primeiramente, um animal, geralmente um camundongo, é imunizado com o imunógeno apropriado, e os linfócitos B do referido animal são em seguida capazes de produzir anticorpos contra este an- tígeno. Estes linfócitos de produção de anticorpo são fundidos em seguida com células de mieloma “imortais” (murino no exemplo) para dar origem aos hibridomas. Usando a mistura heterogênea de células des- se modo obtidas, uma seleção das células capazes de produzir um anticorpo particular e de multiplicar indefinidamente é em seguida realizada. Cada hibridoma é multiplicado na forma de um clone, cada qual resultando na produção de um anticorpo monoclonal do qual as propriedades de reconhecimento com respeito à proteína podem ser testadas, por exemplo, por ELISA, por manchamento do Oeste unidimensional ou bidimensional, por imunofluorescência, ou por meio de um biossensor. Os anticorpos monoclonais desse modo selecionados são subsequentemente purificados, especialmente de acordo com a técnica de cromatografia de afinidade descrita acima.
[0024] Os anticorpos monoclonais podem da mesma forma ser anticorpos recombinantes obtidos por engenharia genética, usando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
[0025] O termo “análogos de anticorpo” é pretendido significar compostos biológicos e/ou químicos que têm as mesmas capacidades de ligação como os anticorpos ou fragmentos de anticorpo ou capacidades de ligação similares. Em particular, os análogos de anticorpo incluem proteínas pequenas que, como anticorpos, são capazes de se ligarem a um alvo biológico tornando-se assim possível detectá-lo, para capturá-lo ou simplesmente para alvejá-lo dentro de um organismo ou dentro de uma amostra biológica. Os campos de aplicação destes análogos de anticorpo são virtualmente tão vastos quanto aqueles dos anticorpos. Por meio de exemplo, menção pode ser feita do Nanofi- tinsTM que são proteínas pequenas vendidas pela companhia Affilogic.
[0026] Os pares de ligação específicos para a proteína desejada podem ser usados como um reagente de captura, como um reagente de detecção ou como reagentes de captura e de detecção.
[0027] A visualização das reações imunológicas, isto é, a ligação do par de ligação/proteína, pode ser realizada por quaisquer meios de detecção, por rotulagem, do par de ligação.
[0028] O termo “rotulagem” é pretendido significar a ligação de um reagente de rótulo capaz de gerar um sinal detectável, isto é, um composto, uma substância ou uma partícula que pode ser detectado por meios visuais, fluorescentes ou instrumentais.
[0029] Uma lista não limitante destes reagentes de rótulo consiste em: - partículas de metal ou de liga de metal, tais como partículas de ouro coloidais, - partículas de polímero, tais como partículas de látex coloridas, - partículas magnéticas, - moléculas fluorescentes, - moléculas quimioluminescentes.
[0030] Por meio de exemplo de testes imunológicos como defini dos acima, menção pode ser feita de métodos "sanduíche" e de "competição".
[0031] A maioria das figuras ilustra a validação dos resultados por um ensaio ELISA quantitativo realizado em amostras individuais retiradas de pacientes durante a fase febril aguda da doença, antes da de- fervescência. Os pacientes tendo permanecido com dengue convencional são denotados DF e os pacientes tendo em seguida desenvolvido dengue severa são denotados SevD. Em todos os casos, a leitura é realizada em uma densidade ótica (OD) de 450 nm. Os resultados foram obtidos em amostras com origens geográficas diferentes: Colômbia e Camboja. Nos gráficos obtidos (software GraphPad Prism, V4.03), a média calculada é representada por uma linha horizontal. A caixa ilustra os valores que abrangem 50% dos indivíduos. Os valores máximos e mínimos são da mesma forma ilustrados. Os valores leva-dos em conta correspondem à média de dois testes independentes realizados em duplicata.
[0032] Figura 1 ilustra a presença de vírus nas frações purificadas de plasma de pacientes, porém, não no controle (C), demonstrado com manchamento do Oeste usando um anticorpo monoclonal direcionado contra a proteína viral E.
[0033] Figura 2 ilustra os resultados obtidos para o ensaio quanti tativo por meio de um ensaio ELISA do marcador de PF4 em amostras de plasma de pacientes Colombianos.
[0034] Figura 3 ilustra os resultados obtidos para o ensaio quanti tativo por meio de um ensaio ELISA do marcador de PF4 em amostra de plasma de pacientes Cambojanos.
[0035] Figura 4 ilustra os resultados obtidos para o ensaio quanti tativo por meio de um ensaio ELISA do marcador de OLFM4 em amostras de plasma de pacientes Colombianos.
[0036] Figura 5 ilustra os resultados obtidos para o ensaio quanti tativo por meio de um ensaio ELISA do marcador de OLFM4 em amostra de plasma de pacientes Cambojanos.
[0037] Figura 6 ilustra os resultados obtidos para o ensaio quanti tativo por meio de um ensaio ELISA do marcador de A2M em amostra de plasma de pacientes Cambojanos.
[0038] 15 Amostras de plasma de Colombianos positivas para dengue foram selecionados das quais 8 originam-se de pacientes que permanecem com dengue convencional sem desenvolver dengue severa (pacientes/amostras referidos em seguida como DF ou dengue convencional) e 7 originam-se de pacientes tendo em seguida desenvolvido dengue severa (pacientes/amostras referidos em seguida como SevD ou dengue severa). Os vários plasmas foram agrupados juntamente, compondo-se respectivamente uma mistura de plasma de DF de dengue convencional e uma mistura de plasma de SevD de dengue severa. Todos os plasmas foram retirados durante a fase febril aguda da doença, antes da fase crítica, de pacientes tendo uma infecção secundária. Os sorotipos interessados foram sorotipos 1, 2 e 3. Todos os pacientes tendo desenvolvido dengue severa foram hospitalizados e tiveram sinais de hemorragia. Nenhuma comorbidez foi relatada [5]. Todos os plasmas foram verificados como sendo NS1-positivos (kit de dengue Platelia, Bio-rad) e a carga viral foi da mesma forma verificada por Q-RT-PCR com um kit comercialmente disponível (PrimerDesign) seguindo as instruções do fornecedor: o número médio de cópias de RNA viral foi calculado em 4 x 106 e 4,1 x 107 para as misturas de dengue convencional (DF) e misturas de dengue severa (SevD), respectivamente. As misturas compostas correspondem a um volume de aproximadamente 2 ml de plasma. Antes da purificação, as misturas de plasma foram centrifugadas durante 5 mins em 1000 x g e a 4°C para remover as impurezas presentes na amostra e obter as amostras clarificadas.
[0039] Os critérios de seleção de plasma são descritos na tabela 1 abaixo. As amostras foram retiradas após o aparecimento dos sintomas. Tabela 1
[0040] Estas misturas de amostra de plasma foram em seguida purificadas para obter as frações enriquecidas de vírus como descrito abaixo.
[0041] Todas as etapas são realizadas a 4°C. As amostras clarifi cadas são suplementadas com 8 ml de PBS fria pH8 (PBS8), em seguida centrifugadas durante 2h em 41 000 x g em uma ultracentrífuga Optima L90 (Beckman). O rotor usado é o rotor SW41 (Beckman). Após a centrifugação, o sobrenadante é removido e a pélete viral obtida é ressuspensa em 200 microlitros de PBS8 em seguida carregada sobre um gradiente descontínuo composto de 5 ml de 60% (p/p) de sacarose em PBS8 e 5 ml de 20% (p/p) de sacarose em PBS8. Depois da centrifugação renovada durante 2 h em 41 000 x g, um anel enriquecido de vírion localizado na interface entre as duas soluções de sacarose é retirado com uma pipeta, diluído 10 vezes com PBS8 e finalmente centrifugado uma última vez durante 2 h em 41 000 x g. A pélete obtida é ressuspensa em 200 microlitros de PBS8.
[0042] Esta ressuspensão é em seguida purificada usando um po- lieletrólito insolúvel, Viraffinity (BioSupportGroup, USA). Para este propósito, 200 microlitros de um tampão de MN (60 mM de MES pH 6,5, 150 mM de NaCl) são adicionados à suspensão viral junto com 100 microlitros de Viraffinity. A mistura é incubada durante 5 min em temperatura ambiente em seguida centrifugada durante 10 min em 1000 x g, seguindo as instruções do fornecedor. O sobrenadante é removido e a pélete de polímero é enxaguada 3 vezes com 200 microlitros de tampão de MN. As proteínas virais são recuperadas aquecendo-se o polímero durante 5 min / 70°C na presença de 50 microlitros de um tampão contendo SDS (Novex InVitrogen) em seguida a centrifugação durante 5 min em 1000 g.
[0043] A presença do vírus nas amostras finais foi verificada por imunomanchamento com um anticorpo monoclonal direcionado contra a proteína envelope do vírus da dengue (proteína E). Como ilustrado na figura 1, sinais fortes em 60 KDa e 120 KDa, correspondendo respectivamente às formas monoméricas e diméricas da proteína envelope, são especificamente detectados pelo anticorpo monoclonal nas misturas de plasma. Pelo contrário, a proteína envelope não foi detec-tada em um controle que corresponde a uma mistura de plasma saudável (sem dengue) purificado da mesma maneira como foi descrito acima.
[0044] As preparações virais e a amostra de controle obtidas de acordo com o exemplo 2 são depositadas em um gel de poliacrilamida não desnaturado e migradas até que as proteínas penetrem no gel, para dessalificar a amostra. A faixa contendo as proteínas é cortada manualmente, em seguida lavada três vezes em um tampão contendo 50% de acetonitrila, em seguida finalmente secada em 100% de ace- tonitrila. O gel é em seguida reidratado em uma solução de H2O2 a 7% antes de ser lavado novamente. Uma solução de tripsina diluída em NH4HCO3 a 25 mM é em seguida adicionada para hidrólise a 37°C durante a noite. Os peptídeos desse modo obtidos são extraídos por extrações sequenciais de 15 minutos com 30 microlitros de acetonitrila a 50%, 30 microlitros de ácido fórmico a 5% e 30 microlitros de acetoni- trila a 100%. Estas extrações sequenciais são misturadas, secadas sob vácuo e ressuspensas em uma solução contendo acetonitrila a 5% e ácido trifluoroacético a 0,1%. Depois da quantificação das amostras, uma quantidade definida de peptídeos é analisada por nano cromato- grafia líquida acoplada juntamente com espectrometria de massa (Ul- timate 3000, Dionex e LTQ-Orbitrap VelosPro, Thermo Fisher Scientific). Os resultados são adquiridos em virtude do software Xcalibur (Thermo Fisher) e automaticamente convertidos pelo software Mascot Daemon V2.2 (Matrix Science). A pesquisa é realizada em seguida nas bases de dados Swissprot e Trembl por Mascot 2.2. Cada experiência foi realizada duas vezes, independentemente. As proteínas foram identificadas pelo laboratório EDyP Service (CEA Grenoble, France).
[0045] A proteína envelope viral E foi identificada repetidamente nas amostras contendo vírus. A sequência de peptídeo predominantemente identificada é GWGNGCGLLFKG. Este resultado confirma a presença do vírus na fração purificada.
[0046] Para as proteínas de origem celular, identificadas por pro- teômicas em misturas de plasma purificadas, os resultados obtidos são resumidos em tabelas 2a e 2b. Nestas tabelas, somente aquelas proteínas que têm uma discrepância de menos que 25% para o número de peptídeos encontrado de uma experiência para a outra, foram consideradas. Similarmente, para a amostra de dengue severa, vários peptídeos maiores que 2 foram requeridos. De acordo com estes critérios, 189 proteínas foram finalmente selecionadas. Estas proteínas são descritas nas tabelas 2a e 2b abaixo. Uma relação de “número de pep- tídeos em amostra de dengue severa (SevD)” / “número de peptídeos em amostra de dengue convencional (DF)” (SevD/DF) pode ser calculada para a maioria destas proteínas (cf. a tabela 2a). Algumas proteínas foram apenas identificadas na amostra de SevD (cf. a tabela 2b); neste caso, a relação de SevD/DF não pode ser calculada. Tabela 2a
Tabela 2b
[0047] Para confirmar os resultados da espectrometria de massa, ELISAs quantitativos específicos foram realizados em duplicata em plasmas individuais. As proteínas selecionadas e testadas, daquelas identificadas nas tabelas 2a/2b, são aquelas com uma relação de dengue severa (SevD) / dengue convencional (DF) maior que ou igual a 1,33 e menor que ou igual a 0,75 com um número médio de peptídeos maior que 1 para cada amostra e uma ligação potencial para patogê- nese de dengue. Esta primeira avaliação tornou possível analisar apenas aquelas proteínas de maior interesse. De acordo com estes critérios, as seguintes proteínas foram selecionadas: - ceruloplasmina, - proteína S, - fator complementar de properdina, - antitrombina-III, - componente secretório p85, - proteína C1r complementar, - proteína C1s complementar, - angiotensina, - fator II, - CFB, - antifator VIII, - componente P amiloide de soro, - olfactomedina 4 (OLFM4), - trombospondina, - fator de plaqueta 4 (PF4), - proteína C1q complementar, - moesina, e - proteína C8 complementar.
[0048] Multimerina-1, apolipoproteína B-100 e fator de von Wille brand foram da mesma forma analisados.
[0049] Deve-se notar que estas proteínas são predominantemente elementos da trilha de coagulação ou da cascata complementar.
[0050] Estes ELISAs foram realizados em virtude dos kits comer cialmente disponíveis (USCN, China), seguindo as instruções do for-necedor. Análises estatísticas (teste de Mann-Whitney e curva de ROC/AUC) foram realizadas por meio do software GraphPad Prism V4.03.
[0051] Cada marcador de candidato foi analisado em amostras de plasma individuais. Estas amostras são amostras de plasma retiradas durante a fase febril aguda da doença (fase virêmica), estas amostras originam-se de pacientes tendo permanecido com dengue convencio- nal DF, sem desenvolver dengue severa, ou de pacientes que têm de-senvolvido dengue severa SevD. Todos os pacientes tiveram dengue secundário. Apenas os sorotipos 1, 2 e 3 foram representados (nenhum sorotipo 4). Estas amostras originaram-se de l’Universidad de Industrial Santander (Bucaramanga, Colombia) [5] ou do Instituto Pasteur em Cambodia (Phnom-Penh). O último fez parte de um estudo previdente realizado de acordo com o comitê de ética local. As características das duas fontes de amostragem são dadas nas tabelas 3 e 4 abaixo. As amostras foram coletadas depois do aparecimento dos sintomas. Tabela 3 Tabela 4
SD: desvio-padrão ns: valor p não significante
[0052] Para a maioria dos marcadores analisados por ELISA, ne nhuma diferença na concentração do plasma foi observada entre os plasmas de DF e de SevD, sejam de Colombianos ou Cambojanos (p>0,1).
[0053] Por outro lado, para dois marcadores, os resultados tornam possível distinguir claramente aqueles pacientes que em seguida de-senvolveram dengue severa SevD daqueles que permaneceram somente com dengue convencional sem desenvolver dengue severa. O primeiro marcador é PF4 (fator de plaqueta 4).
[0054] Para as amostras de Colombianos, é observada uma dife rença na concentração do plasma a favor das amostras de DF (p < 0,001) (figura 2). A AUC é de 0,88 (95% de CI: 0,7305-1).
[0055] Isto é confirmado pelas amostras de Cambojanos para as quais há uma diferença significante na concentração do plasma a favor da amostra de DF (p < 0,0001) (figura 3). A AUC é de 0,94 (95% de CI = 0,87-1). A curva de ROC tornou possível determinar a melhor espe-cificidade para uma sensibilidade perto de 100%. Os resultados são resumidos na tabela 5 abaixo: para este marcador e para uma sensibi-lidade de 95%, uma especificidade perto de 78% é alcançada. Tabela 5 O segundo marcador é OLFM4 (olfactomedina 4)
[0056] Para as amostras de Colombianos, a concentração de plasma do marcador é mais alta nas amostras de SevD em comparação às amostras de DF (p=0,07; cf. figura 4).
[0057] Isto é confirmado nas amostras de Cambojanos com uma diferença extremamente significante na concentração (p < 0,0003) e uma média que é mais que duas vezes mais alta para as amostras de SevD em comparação às amostras de DF (figura 5). A AUC é de 0,858 (95% de CI = 0,7307-0,985). A curva de ROC tornou possível determinar a melhor especificidade para uma sensibilidade perto de 100%. Os resultados são resumidos na tabela 6: para este marcador e para uma sensibilidade perto de 95%, uma especificidade de maior que 72% é alcançada. Tabela 6
[0058] Em paralelo, outro marcador, α-2 macroglobulina (A2M) foi identificado de amostras de plasma de Cambojano não purificadas por um método proteômico diferencial tipo SILAC (Stable Isotope Labelling by Aminoacids in cell Culture) [6]. A identificação deste terceiro marcador é descrita nos seguintes exemplos.
[0059] A composição de cada mistura de plasma ou grupo usado nesta experiência é resumida na tabela 7. Todos os plasmas de Cam- bojanos selecionados para compor as misturas foram retirados durante a fase febril aguda da doença, antes da fase crítica, de pacientes tendo uma infecção secundária. O sorotipo interessado foi o sorotipo 1. Todos os pacientes com SevD foram hospitalizados e tiveram sinais de hemorragia. Nenhuma comorbidez foi relatada. Todos os plasmas foram verificados como sendo NS1-positivos (kit de dengue Platelia, Bio-rad) e a carga viral foi da mesma forma verificada por Q-RT-PCR com um kit comercialmente disponível seguindo as instruções do fornecedor. As misturas compostas correspondem a um volume final de aproximadamente 2 ml de plasma. Os grupos de plasma são anteriormente inativados com calor (56°C/20 minutos) em seguida pré- clarificados por centrifugação durante 5 mins em 1000 x g e a 4°C, para remover as impurezas presentes na amostra. Tabela 7
[0060] O método usado é um método proteômico semiquantitativo de tipo SILAC (Stable Isotope Labelling by Aminoacids in cell Culture) [6] desenvolvido por Pronota (Ghent, Belgia) usando a plataforma MASStermindTM e realizado em grupos de plasma de dengue convencional DF ou de dengue severa SevD. Cada grupo é composto de uma mistura de 6 amostras, como detalhado no exemplo 5.
[0061] Estas misturas de plasma foram esvaziadas anteriormente nas 14 proteínas de plasma mais abundantes por cromatografia de afinidade. A quantidade de proteínas recuperadas no fim foi obtida por um ensaio colorimétrico com base no ácido bicinconínico (BCA assay Thermo Fisher Scientific Inc., USA).
[0062] O estudo de MASStermindTM comparou cada amostra a uma amostra de referência que agrupa todas as amostras. Este método fornece informação sobre os níveis relativos, e presença ou ausência, de peptídeos/proteínas nas amostras de dengue severa SevD em comparação às amostras de dengue convencional DF. A análise dife-rencial é realizada misturando-se as amostras rotuladas com isótopos diferentes e analisando-se, por espectrometria de massa, cada pico emparelhado. O rótulo de isótopo é introduzido por hidrólise tríptica que incorpora 2 átomos de 18O (rotulagem “pesada”) sobre a arginina C-terminal de um peptídeo, que leva a uma diferença de massa de 4 daltons ao mesmo peptídeo rotulado com 16O (rotulagem “leve”). A amostra de referência é rotulada com 16O, considerando que as amostras individuais são rotuladas com 18O. Os dados de MS/MS são submetidos em seguida ao software MASCOT para identificação dos pep- tídeos e proteínas em cada amostra.
[0063] Seguindo a análise de MS/MS, mais de 250 proteínas quantificáveis foram identificáveis, 10 proteínas das quais tiveram pelo menos 1 peptídeo constatado ser diferencial. Para cada proteína iden- tificada, a relação de SevD/DF é calculada como a média ponderada dos coeficientes de todos os peptídeos identificados para a determinada proteína. No geral, os resultados mostraram um grau alto de similaridade entre os dois proteomas e apenas algumas proteínas foram constatadas ser expressas diferencialmente. Para três destas dez proteínas, os peptídeos identificados são sistematicamente expressos diferencialmente e têm uma relação de SevD/DF média que diverge de 1 (cf. tabela 8). As três proteínas identificadas são: α-2 macroglobulina (A2M), C3f complementar e cofator de heparina 2. Estas proteínas são predominantemente elementos da trilha de coagulação ou da cascata complementar. Tabela 8
[0064] Para confirmar os resultados da espectrometria de massa, ELISAs quantitativos específicos foram realizados em duplicata em plasmas individuais. As proteínas analisadas são aquelas identificadas no exemplo 6: α-2 macroglobulina (A2M), proteína C3 complementar, e cofator de heparina 2.
[0065] Estes ELISAs foram realizados em virtude dos kits comerci almente disponíveis (USCN, China), seguindo as instruções do fornece-dor. Análises estatísticas (teste de Mann-Whitney e curva de ROC/AUC) foram realizadas por meio do software GraphPad Prism V4.03.
[0066] Cada marcador de candidato foi analisado em amostras individuais. Estas amostras foram amostras de plasma retiradas de pacientes durante a fase febril aguda da doença (fase virêmica). O acompanhamento clínico dos pacientes mostrou que alguns permane-ceram finalmente com dengue convencional DF sem desenvolver dengue severa, considerando que outros tinham desenvolvido dengue severa SevD. Todos os pacientes tiveram dengue secundário. Apenas o sorotipo 1 foi representado. Estas amostras originaram-se do Instituto Pasteur em Cambodia (Phnom-Penh) e fizeram parte de um estudo previdente realizado de acordo com o comitê de ética local. As características da fonte de amostragem são determinadas na tabela 9. Tabela 9 HBG: hemoglobina de plasma SD: desvio-padrão ns: valor p não significante
[0067] Para a maioria dos marcadores analisados por ELISA, (C3f complementar e cofator de heparina 2) nenhuma diferença na concen-tração de plasma foi observada entre os plasmas de DF e de SevD (p>0,1).
[0068] Entretanto, para as amostras de Cambojanos analisadas por ELISA para A2M, havia uma diferença significante na concentração (p < 0,0004) e uma média aproximadamente duas vezes mais alta para as amostras de DF em comparação às amostras de SevD (figura 6). A AUC foi de 0,89 (95% de CI = 0,75-1).
[0069] Para A2M, a curva de ROC tornou possível determinar a melhor especificidade para uma sensibilidade perto de 100%. Os re-sultados são resumidos na tabela 10: para uma sensibilidade perto de 94%, uma especificidade maior que 83% é alcançada. Tabela 10 REFERÊN CIAS DE LITERATURA 1. SB Halstead . The lancet 2007; 370: 1644-52 2. AS Leong et al. Semin.Diagn.Pathol. 2007; 24(4):227-236 3. K. Clyde et al. J. Virol. 2006; 23: 11418-11431 4. Fields Virology, Fifth edition, Knipe DM ed., LWW 5. Villar-Centeno LA et al. Am. J.Trp.Med.Hyg. 2008; 78: 370-374 6. R. Drissi et al. FEBS J. 2013
Claims (10)
1. Processo para determinar, in vitro, a probabilidade de um paciente desenvolver dengue severa, com base em uma amostra de sangue, caracterizado pelo fato de que: a) a quantidade na referida amostra de sangue de um marcador, que é fator de plaqueta 4 é determinada, b) a quantidade de fator de plaqueta 4 (PF4) determinada na etapa a) é comparada com uma quantidade de referência do referido marcador obtido de um grupo de indivíduos que foram diagnosticados com dengue não severa, em que, se a quantidade de fator de plaqueta 4 determinado na etapa a) for menor que a quantidade de referência estabelecida na etapa b), é determinado que o paciente desenvolverá dengue severa.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa a), a quantidade de um outro marcador es-colhida de olfactomedina 4 e α2-macroglobulina é determinada na amostra de sangue e, na etapa b), a quantidade do referido outro marcador da etapa a) é comparada com uma quantidade de referência do referido outro marcador obtido de um grupo de indivíduos que foram diagnosticados com dengue não severa e, se a quantidade do referido um outro marcador determinada na etapa a) for maior para olfactome- dina 4, ou menor para α2-macroglobulina, do que a quantidade de referência estabelecida na etapa b), é determinado que o paciente desenvolverá dengue severa.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa a), a quantidade de dois outros marcadores escolhidos dentre olfactomedina 4 e α2-macroglobulina é determinada na amostra de sangue e, na etapa b), a quantidade de cada dos dois outros marcadores da etapa a) é comparada com uma quantidade de referência por cada dos referidos outros marcadores obtidos de um grupo de indivíduos que foram diagnosticados com dengue não severa e, se a quantidade de cada dos outros marcadores determinados na etapa a) for maior para olfactomedina 4, ou menor para α2- macroglobulina, do que a quantidade de referência de cada dos marcadores estabelecidos na etapa b), é predito que o paciente desenvolverá dengue severa.
4. Uso do fator de plaqueta 4 como marcador de proteína, caracterizado pelo fato de ser para determinar, in vitro, a probabilidade de um paciente desenvolver dengue severa, com base em uma amostra de sangue.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que também compreende o uso de α2-macroglobulina como marcador de proteína para determinar, in vitro, a probabilidade de um paciente desenvolver dengue severa, com base em uma amostra de sangue.
6. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que também compreende o uso de olfactomedina 4 como marcador de proteína para determinar, in vitro, a probabilidade de um paciente desenvolver dengue severa, com base em uma amostra de sangue.
7. Kit para determinar, in vitro, a probabilidade de um paciente desenvolver dengue severa, caracterizado pelo fato de que compreende um par de ligação para o fator de plaqueta 4 e um par de ligação para a proteína NS1 do vírus da dengue, os referidos pares de ligação sendo escolhidos de um receptor, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um análogo de anticorpo ou qualquer outro ligante.
8. Kit para determinar, in vitro, a probabilidade de um paciente desenvolver dengue severa, caracterizado pelo fato de que compreende um par de ligação para o fator de plaqueta 4 e um par de ligação para olfactomedina 4, os referidos pares de ligação sendo escolhi- dos de um receptor, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um análogo de anticorpo ou qualquer outro ligante.
9. Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que da mesma forma compreende um par de ligação para α2- macroglobulina.
10. Kit de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que da mesma forma compreende um par de ligação para a proteína NS1 do vírus da dengue.
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