KR102310128B1 - 트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 및 이의 제조방법 - Google Patents

트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102310128B1
KR102310128B1 KR1020140088669A KR20140088669A KR102310128B1 KR 102310128 B1 KR102310128 B1 KR 102310128B1 KR 1020140088669 A KR1020140088669 A KR 1020140088669A KR 20140088669 A KR20140088669 A KR 20140088669A KR 102310128 B1 KR102310128 B1 KR 102310128B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
formula
alkyl
alpha
cycloalkyl
Prior art date
Application number
KR1020140088669A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160008436A (ko
Inventor
임현석
오미숙
큐. 호앙 쿠엔
왕 웨이
Original Assignee
주식회사 포스코
포항공과대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 포스코, 포항공과대학교 산학협력단 filed Critical 주식회사 포스코
Priority to KR1020140088669A priority Critical patent/KR102310128B1/ko
Priority to PCT/KR2014/012746 priority patent/WO2016010210A1/ko
Priority to US15/326,422 priority patent/US10131650B2/en
Priority to JP2017502630A priority patent/JP6349456B2/ja
Priority to CN201480081313.2A priority patent/CN106661003B/zh
Publication of KR20160008436A publication Critical patent/KR20160008436A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102310128B1 publication Critical patent/KR102310128B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/53—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with three nitrogens as the only ring hetero atoms, e.g. chlorazanil, melamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 알파-헬릭스 유사체로서 트리아진-피페라진 골격을 갖는 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 단백질 이차구조인 알파-헬릭스 구조를 효율적으로 모방하여, 알파-헬릭스에 의해 매개되는 다양한 질환 특이적 단백질 상호작용의 저해제로 작용할 수 있다. 따라서 이러한 화합물은 생물학적 탐침으로서 매우 유용하게 쓰여질 뿐 아니라, 질병의 치료제로서 높은 잠재성을 갖는다.

Description

트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 및 이의 제조방법{Alpha-helix mimetics having a triazine-piperazine scaffold and preparation method thereof}
본 발명은 알파-헬릭스 유사체로서 트리아진-피페라진 골격을 갖는 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 단백질의 이차구조인 알파-헬릭스 구조를 효율적으로 모방하여, 알파-헬릭스에 의해 매개되는 다양한 질환 특이적 단백질 상호작용의 저해제로 작용할 수 있다. 따라서 이러한 화합물은 생물학적 탐침으로서 매우 유용하게 쓰여질 뿐 아니라, 질병의 치료제로서 높은 잠재성을 갖는다.
세포는 다양하고 복잡한 단백질-단백질 상호작용(Protein-protein interactions: PPI)을 통하여 유전자 조절, 세포성장, 세포 주기, 대사, 신호전달 등의 여러 생물학적 기능을 수행함으로써 생명현상을 유지하고 있다. 또한, 많은 질병들이 비정상적인 단백질-단백질 상호작용 또는 단백질 미스폴딩(misfolding)과 관련된 것으로 알려져 있다. 따라서 세포 내에서의 단백질-단백질 상호작용 및 상호작용의 기능을 이해하는 것은 생명현상들을 이해하는 초석이 되며 신약개발 및 질병 치료의 중요한 기반이 된다.
많은 단백질 간 상호작용에서 단백질은 2~3 턴(turn)으로 이루어진 짧은 알파-헬릭스(α-helix)를 인지하여 대상 단백질과 결합하는 것으로 알려져 있다. 알파-헬릭스 구조는 약 3.14 개의 아미노산 잔기마다 회전(턴)이 존재하고, 3~4개 잔기마다 곁사슬(side chain)이 공간적으로 배치되어 있다. 각 곁사슬이 위치한 공간을 i, i+3/i+4, i+7 등으로 지칭하며, i, i+3/i+4, i+7 에 위치한 잔기는 표적 단백질과 결합할 때 인식부위(recognition motif)로 작용한다. 따라서, 이러한 알파-헬릭스 펩타이드의 구조를 모방할 수 있는 저분자 물질은 단백질 상호작용의 저해제로서 역할을 할 수 있을 것으로 기대되며, 알파-헬릭스 유사체의 개발에 대한 연구가 매우 활발히 이루어지고 있다.
이와 관련하여, 테르페닐(terphenyl) 골격을 가지는 알파-헬릭스 유사 화합물이 보고된 바 있다(J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 5382-3; Nat. Chem. 2013, 5(3):161-173; Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14(3):341-346). 상술한 바와 같이, 자연계에 존재하는 알파-헬릭스는 단백질과 결합할 때 인식부위로 작용하는 세 개의 아미노산 잔기(i, i+3/i+4, i+7 위치의 아미노산 잔기)가 존재하는데, 상기 테르페닐 구조 기반의 알파-헬릭스 유사체의 경우, 테르페닐 골격을 구성하는 세 개의 벤젠 고리에 각각 연결된 치환기가 상기 세 개의 아미노산 잔기에 해당하는 3차원 공간 위치에 놓이게 되어, 알파-헬릭스의 기능을 모방하도록 디자인되었다.
그러나, 테르페닐 구조 기반의 알파-헬릭스 유사체는 합성이 매우 어려울 뿐만 아니라, 소수성(hydrophobicity)이 강해서 수용액에서 용해도가 매우 낮기 때문에 생리활성을 검증하기도 쉽지 않아, 치료제로서 개발하기에 어려움이 많다.
따라서, 수용액에서의 용해도 및 세포투과성이 우수하면서도 합성이 용이한 구조를 가지는 저분자 알파-헬릭스 유사체를 개발할 필요가 있다.
본 발명자들은, 종래 테르페닐 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체의 문제점을 극복하기 위하여, 트리아진-피페라진을 중심 구조로 하는 새로운 알파-헬릭스 유사체 화합물을 개발하였다. 또한, 상기 알파-헬릭스 유사체 화합물이 알파-헬릭스에 필수적인 세 개의 아미노산 잔기(i, i+3 또는 i+4, i+7) 의 3차원적 배향(orientation)을 성공적으로 모방한다는 것을 확인하였다. 나아가, 본 발명자들은 상기 트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체를 간단하게 합성할 수 있는 고체상 합성법을 개발하였다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은, 트리아진-피페라진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물 및 이의 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, 상기 알파-헬릭스 유사체 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, 상기 알파-헬릭스 유사체 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 단백질 및 단백질 간의 상호작용을 억제하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, 상기 알파-헬릭스 유사체 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 단백질 및 단백질 간의 상호작용을 탐지하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, 상기 알파-헬릭스 유사체 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 알파-헬릭스에 의해 매개되는 단백질 간 상호작용과 관련된 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 트리아진-피페라진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물 및 이의 염, 그리고 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 트리아진-피페라진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물은 다음의 화학식 1로 표시할 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112014066135921-pat00001
상기 식에서,
X는
Figure 112014066135921-pat00002
또는
Figure 112014066135921-pat00003
이고,
R1, R2, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 -NR8R9 또는 -OR10이고,
이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C2 -6 알케닐, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, -N-(C3-C10) 아릴, -N-(C3-C10) 헤테로아릴, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
상기 R8 및 R9 는 이들과 결합하는 C, N 또는 O 원자와 함께 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있고,
R10 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)n-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)n-(C3-C10) 아릴, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로아릴로서, n은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, 카르복시, 하이드록실, 아미노, 옥소, 페닐 및 페녹시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
R3은 (C1-C6) 알킬 또는 -(CH2)p-(C3-C10) 아릴이고, p 는 0 내지 3의 정수이고
R6은 -NR11이고, 이 때, R11 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)q-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)q-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)q-(C3-C10) 아릴, -(CH2)q-(C3-C10) 헤테로아릴로서, q 는 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C2 -6 알케닐, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
상기 R11 은 이와 결합하는 C 또는 O 원자와 함께 결합하여 고리를 형성할 수 있고, 및
R7 은 -NH2 이다.
본 발명의 화합물은 이의 입체 화학적 이성질체를 포함하며, 예를 들어, 기본 분자 구조의 모든 디아스테레오머 및 에난티오머를 포함할 수 있다. 특히, 입체 중심은 (R)- 또는 (S)-배위를 가질 수 있으며 2가 사이클릭(부분적으로) 포화 라디칼 상의 치환기는 시스-또는 트란스-배위를 가질 수 있다. 이중 결합을 포함하는 화합물은 상기 이중결합에서 E 또는 Z-입체 화학을 가질 수 있다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 입체 화학적 이성질체 형태는 상기 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
보다 상세하게, 본 발명의 화합물은 트리아진-피페라진-트리아진을 중심 구조로 하는 화합물과, 페닐-피페라진-트리아진을 중심 구조로 하는 화합물을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명에서 제공하는 화합물을 보다 상세하게 설명하기로 한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 트리아진-피페라진-트리아진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물 및 이의 염에 관한 것이다.
상기 트리아진-피페라진-트리아진을 중심 구조로 하는 화합물은 하기 화학식 2로 표시할 수 있다:
[화학식 2]
Figure 112014066135921-pat00004
상기 식에서,
R1, R2, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 -NR8R9 또는 -OR10이고,
이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C2 -6 알케닐, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, -N-(C3-C10) 아릴, -N-(C3-C10) 헤테로아릴, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
상기 R8 및 R9 는 이들과 결합하는 C, N 또는 O 원자와 함께 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있고,
R10 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)n-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)n-(C3-C10) 아릴, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로아릴로서, n은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, 카르복시, 하이드록실, 아미노, 옥소, 페닐 및 페녹시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
R3은 (C1-C6) 알킬 또는 -(CH2)p-(C3-C10) 아릴이고, 및
p 는 0 내지 3의 정수이다.
구체적인 일예로, 상기 화학식 2에서, R1, R2, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고, 이 때, R1 및 R4의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, -(CH2)rNH2, -(CH2)rN(H)C(=NH)NH2, -(CH2)rC(=O)OH, 또는 -(CH2)rOH 이고, r은 1 내지 6의 정수이고, R2 및 R5 의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, (CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -4 알콕시, 하이드록실 또는 페녹시로 치환될 수 있고, 및 R3 은 (C1-C6) 알킬 또는 벤질일 수 있다.
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 2에서, R1, R2, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고, 이 때, R1 및 R4의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소 또는 (C1-C6) 알킬이고, R2 및 R5 의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬, -(CH2)m-페닐, -(CH2)m-페녹시페닐, -(CH2)m-벤조다이옥솔, -(CH2)m-디알콕시벤젠, -(CH2)m-다이메톡시페닐, -(CH2)m-하이드록시페닐, 또는 -(CH2)m-(C3-C6) 사이클로알킬이고, 및 R3 은 (C1-C6) 알킬 또는 벤질일 수 있다.
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 2에서, R1, R2, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고, 이 때, R1 및 R4의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소 또는 (C1-C6) 알킬이고, R2 및 R5 의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬, -(CH2)m-페닐, -(CH2)m-페녹시페닐, -(CH2)m-벤조다이옥솔, -(CH2)m-디알콕시벤젠, -(CH2)m-다이메톡시페닐, -(CH2)m-하이드록시페닐, 또는 -(CH2)m-(C3-C6) 사이클로알킬이고, 및 R3 은 (C1-C6) 알킬 또는 벤질일 수 있다.
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 2에서, 상기 R1, R2, R4 및 R5는 각각 독립적으로 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure 112014066135921-pat00005
Figure 112014066135921-pat00006
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 2에서, 상기 R3 은 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure 112014066135921-pat00007
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 2의 화합물은, 하기 화학식 4 내지 화학식 8의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다:
[화학식 4]
Figure 112014066135921-pat00008
[화학식 5]
Figure 112014066135921-pat00009
[화학식 6]
Figure 112014066135921-pat00010
[화학식 7]
Figure 112014066135921-pat00011
[화학식 8]
Figure 112014066135921-pat00012
구체적인 다른 일예로, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 9의 화합물일 수 있다:
[화학식 9]
Figure 112014066135921-pat00013
상기 화학식 9에서,
R1 및 R4 는 각각 독립적으로 -NR8R9 또는 -OR10이고,
이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C2 -6 알케닐, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, -N-(C3-C10) 아릴, -N-(C3-C10) 헤테로아릴, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
상기 R8 및 R9 는 이들과 결합하는 C, N 또는 O 원자와 함께 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있고, 및
R10 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)n-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)n-(C3-C10) 아릴, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로아릴로서, n은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, 카르복시, 하이드록실, 아미노, 옥소, 페닐 및 페녹시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있다.
또는, 상기 화학식 9에서, R1 및 R4는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고, 이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, -(CH2)rNH2, -(CH2)rN(H)C(=NH)NH2, -(CH2)rC(=O)OH, 또는 -(CH2)rOH 이고, 및 r은 1 내지 6의 정수일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 페닐-피페라진-트리아진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물 및 이의 염에 관한 것이다.
상기 페닐-피페라진-트리아진을 중심 구조로 하는 화합물은 하기 화학식 3으로 표시할 수 있다:
[화학식 3]
Figure 112014066135921-pat00014
상기 식에서,
R1 및 R2 는 각각 독립적으로 -NR8R9 또는 -OR10이고,
이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C2 -6 알케닐, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, -N-(C3-C10) 아릴, -N-(C3-C10) 헤테로아릴, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
상기 R8 및 R9 는 이들과 결합하는 C, N 또는 O 원자와 함께 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있고,
R10 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)n-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)n-(C3-C10) 아릴, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로아릴로서, n은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, 카르복시, 하이드록실, 아미노, 옥소, 페닐 및 페녹시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
R3은 (C1-C6) 알킬 또는 -(CH2)p-(C3-C10) 아릴이고, p 는 0 내지 3의 정수이고
R6은 -NR11이고, 이 때, R11 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)q-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)q-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)q-(C3-C10) 아릴, -(CH2)q-(C3-C10) 헤테로아릴로서, q 는 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C2 -6 알케닐, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
상기 R11 은 이와 결합하는 C 또는 O 원자와 함께 결합하여 고리를 형성할 수 있고, 및
R7 은 -NH2 이다.
구체적인 일예로, 상기 화학식 3에서, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고, 이 때, R8 는 수소이고, R9 는 수소, C1-C6 알킬 또는 -(CH2)m-(C3-C10)아릴이고, m은 0 내지 3의 정수이고, R3 은 (C1-C6) 알킬 또는 벤질이고, R6는 -NR11이고, 이 때, R11 은 (C1-C6) 알킬 또는 -(CH2)q-(C3-C10) 아릴이고, q 는 0 내지 3의 정수이고, 및 R7 은 -NH2 일 수 있다.
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 3에서, 상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure 112014066135921-pat00015
Figure 112014066135921-pat00016
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 3에서, 상기 R3 은 각각 독립적으로 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure 112014066135921-pat00017
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 3에서, 상기 R6 은 각각 독립적으로 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure 112014066135921-pat00018
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 3에서 R1, R2, R3, R6 및 R7 은 각각 다음으로 표시될 수 있다:
R1 R2 R3 R6 R7
NHEt NHiPr iBu NHEt NH2
NHEt NHiBu iBu NHEt NH2
NHEt NHBn iBu NHEt NH2
NHEt NHNaph iBu NHEt NH2
NHEt NHiPr Bn NHEt NH2
NHEt NHiBu Bn NHEt NH2
NHEt NHBn Bn NHEt NH2
NHEt NHNaph Bn NHEt NH2
NHEt NHiPr Me NHEt NH2
NHEt NHiBu Me NHEt NH2
NHEt NHBn Me NHEt NH2
NHEt NHNaph Me NHEt NH2
NHEt NHiPr iBu NHiBu NH2
NHEt NHiBu iBu NHiBu NH2
NHEt NHBn iBu NHiBu NH2
NHEt NHNaph iBu NHiBu NH2
NHEt NHiPr Bn NHiBu NH2
NHEt NHiBu Bn NHiBu NH2
NHEt NHBn Bn NHiBu NH2
NHEt NHNaph Bn NHiBu NH2
NHEt NHiPr Me NHiBu NH2
NHEt NHiBu Me NHiBu NH2
NHEt NHBn Me NHiBu NH2
NHEt NHNaph Me NHiBu NH2
NHEt NHiPr iBu NHBn NH2
NHEt NHiBu iBu NHBn NH2
NHEt NHBn iBu NHBn NH2
NHEt NHNaph iBu NHBn NH2
NHEt NHiPr Bn NHBn NH2
NHEt NHiBu Bn NHBn NH2
NHEt NHBn Bn NHBn NH2
NHEt NHNaph Bn NHBn NH2
NHEt NHiPr Me NHBn NH2
NHEt NHiBu Me NHBn NH2
NHEt NHBn Me NHBn NH2
NHEt NHNaph Me NHBn NH2
Figure 112014066135921-pat00019

Figure 112014066135921-pat00020
구체적인 다른 일예로, 상기 화학식 3의 화합물은 하기 화학식 10으로 구체화될 수 있다:
[화학식 10]
Figure 112014066135921-pat00021
본 발명의 화합물에서, 상기 R2, R3, R5 및 R6 는, 자연계에 존재하는 알파-헬릭스가 단백질과 결합할 때 인식부위(recognition motif)로 작용하는 세 개의 아미노산 잔기(i, i+3/i+4, i+7 위치의 아미노산 잔기)에 해당하는 3 차원 공간 위치에 놓이게 되는 부분으로, 알파-헬릭스 유사체 화합물이 타겟 단백질과 결합할 수 있도록 한다.
또한, 본 발명의 화합물에서, 상기 R1 및 R4는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 친수성 잔기가 도입될 수 있으며, 친수성 잔기가 도입되는 경우 알파-헬릭스 유사체 화합물이 양친성(amphipatic)을 가질 수 있다. 자연계에 존재하는 대부분의 알파-헬릭스 펩타이드는 한쪽 면은 소수성 잔기들로 이루어져 다른 단백질과 결합할 때 인식부위(recognition motif) 로서 중요한 역할을 하고, 반대쪽 면은 친수성을 가지는 아미노산 잔기들로 이루어져 있어 알파-헬릭스 펩타이드가 단백질에 결합했을 때 이러한 친수성 잔기들이 바깥쪽으로 향하면서 물에 노출되는 부위에 놓이게 되므로 에너지 적으로 유리한 상태가 되도록 한다. 또한, 알파-헬릭스 펩타이드의 친수성 잔기들은 단백질과 결합할 때 단백질 표면의 아미노산 잔기들과 친수성 상호작용(hydrophilic interaction)을 하며, 소수성 상호작용에 더해서 이러한 친수성 상호작용으로 인해 알파-헬릭스 펩타이드는 타겟 단백질에 더욱 강하게 결합할 수 있게 된다. 따라서, 바람직한 일구현예로, 본 발명에서는 알파-헬릭스 유사체 화합물이 소수성 치환기와 친수성 치환기를 함께 갖도록 하여, 자연계에 존재하는 알파-헬릭스의 양친성 특징을 모방할 수 있다. 지금까지 개발된 알파-헬릭스 유사 화합물들 중 양친성을 갖는 화합물은 개발된 바가 거의 없다.
따라서, 바람직한 일구현예로, 본 발명의 알파-헬릭스 유사체 화합물은, 트리아진-피페라진을 중심 구조로 가지면서, 세 개의 치환기(R2, R3, R5 , 또는 R2, R3, R6)는 주로 소수성 상호작용을 통해 대상 단백질과의 결합에서 중요한 역할을 하고, 이들 세 치환기의 반대쪽에 위치하는 두 개의 치환기(R1, R4)는 친수성 치환기가 도입되어 자연계에 존재하는 양친성 알파-헬릭스의 기능을 효과적으로 모방함으로써 강력한 단백질 간 상호작용 저해제로 작용하도록 디자인될 수 있다. 도 1은 위에서 설명한 본 발명의 알파-헬릭스 유사체 화합물의 특성을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 트리아진-피페라진-트리아진 골격의 화합물과 종래 보고된 테르페닐 골격의 화합물을 각각 에너지 최소화된 구조로 제조하였을 때, Clog P (calculated log P octanol / water) 값이 본 발명의 화합물은 1.366, 종래 테르페닐 골격의 화합물은 6.21로 나타나, 본 발명 화합물이 더욱 개선된 친수성 성질을 나타내어 약물과 유사한 특성을 구현한다는 것을 확인할 수 있다.
본 발명에서 치환기에 대한 정의에서, 용어 '알킬' 은 지방족 탄화수소 래디칼을 의미한다. 알킬은 알케닐이나 알키닐 부위를 포함하지 않는 "포화 알킬(saturated alkyl)" 이거나, 적어도 하나의 알케닐 또는 알키닐 부위를 포함하는 "불포화 알킬(unsaturated alkyl)" 일 수 있다. "알케닐(alkenyl)" 은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 그룹을 의미하며, "알키닐(alkynyl)" 은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 그룹을 의미한다. 알킬은 단독으로 또는 알콕시와 같이 조합하여 사용되는 경우에 각각 분지형 또는 직쇄형일 수 있다.
알킬 그룹은 달리 정의하지 않는 한 1 내지 20 개의 탄소원자를 가질 수 있다. 알킬 그룹은 1 내지 10 개의 탄소원자들을 가지는 중간 크기의 알킬일 수도 있다. 알킬 그룹은 1 내지 6 개의 탄소원자들을 가지는 저급 알킬일 수도 있다. 전형적인 알킬 그룹에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 에테닐, 프로페닐, 부테닐 등이 포함되지만, 이들 만으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, C1-C4-알킬은 알킬쇄에 1 내지 4 개의 탄소원자를 가지며, 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸 및 t-부틸로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
용어 '알콕시'는 달리 정의하지 않는 한 1 내지 10 개의 탄소원자를 가지는 알킬옥시를 의미한다. 예를 들어, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, iso-프로폭시, n-부톡시, t-부톡시, iso-부톡시, sec-부톡시 등이 있다.
용어 '사이클로알킬'은 달리 정의하지 않는 한 포화 지방족 3~10원 환을 의미한다. 전형적인 사이클로알킬 그룹에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등이 포함되지만, 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.
용어 '아릴(aryl)'은 공유 파이 전자계를 가지는 적어도 하나의 환을 포함하며, 예를 들어 모노사이클릭 또는 융합환 폴리사이클릭(즉, 탄소원자들의 인접한 쌍들을 나눠 가지는 링들) 그룹을 포함한다. 즉, 본 명세서에서 아릴은 달리 정의하지 않는 한 페닐, 나프틸 등을 포함하는 4~10원, 바람직하게는 6~10원 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭환을 의미할 수 있다.
용어 '헤테로아릴'은 달리 정의하지 않는 한 N, O 및 S로 이루어진 그룹에서 선택된 1 내지 3 개의 헤테로 원자를 포함하고, 벤조 또는 C3-C8 사이클로알킬과 융합될 수 있는 방향족 3~10원 환, 바람직하게는 4~8원 환, 더욱 바람직하게는 5~6원 환을 의미한다. 모노사이클릭 헤테로아릴의 예로는 티아졸, 옥사졸, 티오펜, 퓨란, 피롤, 이미다졸, 이소옥사졸, 이소티아졸, 피라졸, 트리아졸, 트리아진, 티아디아졸, 테트라졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다. 비사이클릭 헤테로아릴의 예로는 인돌, 인돌린, 벤조티오펜, 벤조퓨란, 벤조다이옥솔, 벤즈이미다졸, 벤족사졸, 벤즈이속사졸, 벤즈티아졸, 벤즈티아디아졸, 벤즈트리아졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퓨린, 퓨로피리딘 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 '헤테로사이클'은 달리 정의하지 않는 한 N, O 및 S로 이루어진 그룹에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하며, 벤조 또는 C3-C8 사이클로알킬과 융합될 수 있고, 포화되거나 1 또는 2 개의 이중결합을 포함하는 3~10원 환, 바람직하게는 4~8원 환, 더욱 바람직하게는 5~6원 환을 의미한다. 헤테로사이클의 예로는 피롤린, 피롤리딘, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 피라졸린, 피라졸리딘, 피란, 피페리딘, 모폴린, 티오모폴린, 피페라진, 하이드로퓨란 등을 들 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
용어 '아릴알킬'은 아릴기로 추가로 치환된 C1-C4 알킬렌, 예컨대 -CH2-, -CH2CH2- 등을 의미하며, 예를 들어, 벤질, 페네틸렌 등이 있다.
용어 '사이클로알케닐'은 4 내지 10개의 고리 탄소 및 1개 이상의 이중 결합을 함유하는 비-방향족 고리 라디칼을 나타내고, 일부 실시양태는 4 내지 6개의 탄소를 함유하고, 일부 실시양태는 4 또는 5개의 탄소를 함유하고, 일부 실시양태는 4개의 탄소를 함유한다. 예로는 사이클로부테닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐 등이 있다.
용어 '사이클로알킬'은 3 내지 10개의 탄소를 함유하는 포화된 고리 라디칼을 나타내고, 일부 실시양태는 3 내지 6개의 탄소를 함유하고, 일부 실시양태는 3 내지 5개의 탄소를 함유하고, 일부 실시양태는 5 내지 7개의 탄소를 함유하고; 일부 실시양태는 3 또는 4개의 탄소를 함유한다. 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 등이 있다.
용어 '할로겐' 또는 '할로'는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도기를 나타낸다.
용어 '할로알킬'은 알킬이 1개의 할로겐으로 치환 내지 완전 치환된, 본원에 정의된 C1 -6 알킬기를 나타내며, 완전 치환된 C1 -6 할로알킬은 화학식 CnL2n +1 (여기서, L은 할로겐이고, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6임)로 나타내어질 수 있고, 1개 이상의 할로겐이 존재하는 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이할 수 있고, F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 할로알킬기의 예로는 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 클로로디플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 펜타플루오로에틸 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
용어 '아미노'는 -NH2 기를 나타낸다.
용어 '벤질'은 기 -CH2C6H5를 나타낸다.
용어 '카르복시' 또는 '카르복실'은 기 -CO2H 기를 나타내며, 또한 카르복실산 기라고 지칭되기도 한다.
용어 '히드록실'은 기 -OH 기를 나타낸다.
용어 '니트로'는 기 -NO2 기를 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 '옥소'는 치환체 =O를 지칭하므로, 탄소가 옥소기에 의해 치환된 경우, 탄소 및 옥소로부터 함께 생성된 새로운 기는 카르보닐기이다.
용어 '페녹시'는 C6H5O- 기를 나타낸다.
용어 '페닐'은 C6H5- 기를 나타낸다.
용어 '술폰아미드'는 -SO2NH2 기를 나타낸다.
기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 "약학적으로 허용되는 염"은 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 황산, 염산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산; 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산 부가염이 포함된다. 또한, 약학적으로 허용되는 염기 부가염, 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염; 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염; 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린, 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다. 본 발명에 따른 화합물은 통상적인 방법에 의해 그의 염으로 전환될 수 있으며, 염의 제조는 별도의 설명이 없이도 상기 화학식들의 구조를 바탕으로 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 트리아진-피페라진-트라아진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
일예로, 본 발명의 제조방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
아민(NH2)으로 개질된 폴리머 비드에 화학식 a의 화합물을 결합하여 화학식 b의 화합물을 제조하는 단계,
상기 화학식 b의 화합물에 2-니트로벤젠설포닐로 보호된 화학식 c의 화합물을 커플링시켜, 화학식 d의 화합물을 제조하는 단계,
상기 화학식 d의 화합물로부터 2-니트로벤젠설포닐 보호기를 제거한 후, 화학식 e의 화합물을 도입하여 화학식 f의 화합물을 제조하는 단계,
상기 화학식 f의 화합물의 클로라이드 자리에 아민기(R2'R2"NH)를 치환시키는 단계, 및
아민(NH2)으로 개질된 폴리머 비드를 제거하는 단계.
[화학식 a]
Figure 112014066135921-pat00022
[화학식 b]
Figure 112014066135921-pat00023
[화학식 c]
Figure 112014066135921-pat00024
[화학식 d]
Figure 112014066135921-pat00025
[화학식 e]
Figure 112014066135921-pat00026
[화학식 f]
Figure 112014066135921-pat00027
상기 제조방법에 의하여 본 발명에서 제공하는 알파-헬릭스 유사체 화합물을 매우 간단한 고체상 합성법으로 제조할 수 있으며, 아민(NH2)으로 개질된 폴리머 비드에 몇 단계의 순차적인 커플링(coupling) 반응을 통해 원하는 화합물을 평균 92% 의 수율로 얻을 수 있었다. 상기 제조 방법을 도 2를 기준으로 보다 상세히 설명하면, 제1 단계로, 단일치환된 디클로로트리아진("3")을 Rink-Amide MBHA 레진 상에 로딩하여 레진에 결합시켜, 레진에 결합된 트리아진 유도체 "4"를 생성할 수 있다. 제2 단계로, 2-니트로벤젠설포닐(Ns)로 보호된 피페라진 유도체("5")를 레진에 결합된 트리아진 유도체("4")에 커플링시켜, 화합물 "6" 를 제조할 수 있다. 제3 단계로, 위에서 커플링된 화합물("6")로부터 N-Ns 보호기를 제거한 후, 여기에 2-에틸아미노-4,6-디클로로-[1,3,5]트리아진("7")을 도입하여 화합물 "8"을 제조할 수 있다. 제4 단계로, 위에서 제조된 화합물("8")의 클로라이드 자리에 다양한 아민기(R2R2'NH)를 대체할 수 있다. 제5 단계로, TFA(trifluoroacetic acid)를 가하여 절단 반응을 수행하여, 세 개의 치환기로 기능화된 화합물 "9"를 제조할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 페닐-피페라진-트라아진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
아민(NH2)으로 개질된 폴리머 비드에 4-플루오로-3-니트로벤조산을 결합하여 화학식 b'의 화합물을 제조하는 단계,
상기 화학식 b'의 화합물에 2-니트로벤젠설포닐로 보호된 화학식 c'의 화합물을 커플링시켜, 화학식 d'의 화합물을 제조하는 단계,
상기 화학식 d'의 화합물로부터 2-니트로벤젠설포닐 보호기를 제거한 후, 화학식 e'의 화합물을 도입하여 화학식 f'의 화합물을 제조하는 단계,
상기 화학식 f'의 화합물의 클로라이드 자리에 아민기(R3NH)를 치환시고 니트로 그룹을 환원시켜 화학식 g'의 화합물을 제조하는 단계,
상기 화학식 g'의 화합물에 R1 기능기를 도입하여 화학식 h'의 화합물을 제조하는 단계, 및
아민(NH2)으로 개질된 폴리머 비드를 제거하는 단계.
[화학식 b']
Figure 112014066135921-pat00028
[화학식 c']
Figure 112014066135921-pat00029
[화학식 d']
Figure 112014066135921-pat00030
[화학식 e']
Figure 112014066135921-pat00031
[화학식 f']
Figure 112014066135921-pat00032
[화학식 g']
Figure 112014066135921-pat00033
[화학식 h']
Figure 112014066135921-pat00034
상기 제조방법에 의하여 본 발명에서 제공하는 알파-헬릭스 유사체 화합물을 매우 간단한 고체상 합성법으로 제조할 수 있으며, 아민(NH2)으로 개질된 폴리머 비드에 몇 단계의 순차적인 커플링(coupling) 반응을 통해 원하는 화합물을 평균 90% 의 수율로 얻을 수 있었다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 알파-헬릭스 유사체 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 단백질 및 단백질 간의 상호작용을 억제하기 위한 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 알파-헬릭스 유사체 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 단백질 및 단백질 간의 상호작용을 탐지하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 알파-헬릭스 유사체 화합물은, 자연계에 존재하는 알파-헬릭스 펩타이드의 구조를 모방하며 알파-헬릭스 펩타이드의 기능을 효과적으로 모방함으로써 강력한 단백질-단백질 간 상호작용 저해제로 사용될 수 있다. 또한, 타겟 단백질과 결합하는 성질을 이용하여, 단백질 및 단백질 간의 상호작용을 탐지하기 위한 탐침으로 사용될 수 있다.
본 발명에서는, 본 발명의 알파-헬릭스 유사체 화합물들을 포함하는 라이브러리가 제공된다. 상기 라이브러리는 트리아진-피페라진 중심구조를 가지며 양친성을 나타내는 알파-헬릭스 유사체 화합물들로 구성되어 있으며, 타겟 단백질의 종류에 따라 이에 특이적으로 결합하는 화합물들을 스크리닝할 수 있다. 이들 타겟 단백질은, 항체, 효소, 수용체 또는 세포주가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 단백질 및 단백질 간의 상호작용이란, 단백질 및 단백질 간의 결합, 또는 단백질 및 단백질 간의 응집을 포함한다. 이러한 상호작용은, 예를 들어, 두 개의 막-결합된 단백질 사이, 막-결합된 단백질과 세포질성 단백질 사이(예를 들어, 수용체와 리간드), 세포질성 단백질 사이 등에서 있을 수 있다. 바람직하게는, 알파-헬릭스 구조를 통해 일어나는 단백질-단백질 상호작용에 대하여 본 발명이 적용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, MCL-1(myeloid cell leukemia-1) 단백질과 BCL-2(B-cell lymphoma 2) 단백질 간의 상호작용(즉, 단백질 간의 결합)과, 알파-시누클레인 단백질 간의 상호작용(즉, 단백질 간의 응집)을 대상으로 이러한 상호작용을 저해 및 탐지하는 알파-헬릭스 유사체 화합물을 스크리닝한 결과를 보여주었으나, 이는 대표적인 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 알파-헬릭스 유사체 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 알파-헬릭스에 의해 매개되는 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
일예로, 본 발명은 하기 화학식 4 내지 화학식 6, 화학식 9 및 화학식 10의 의 화합물의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다:
[화학식 4]
Figure 112014066135921-pat00035
[화학식 5]
Figure 112014066135921-pat00036
[화학식 6]
Figure 112014066135921-pat00037
[화학식 9]
Figure 112014066135921-pat00038
상기 식에서,
R1 및 R4 는 각각 독립적으로 -NR8R9 또는 -OR10이고,
이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C2 -6 알케닐, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, -N-(C3-C10) 아릴, -N-(C3-C10) 헤테로아릴, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
상기 R8 및 R9 는 이들과 결합하는 C, N 또는 O 원자와 함께 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있고, 및
R10 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)n-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)n-(C3-C10) 아릴, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로아릴로서, n은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, 카르복시, 하이드록실, 아미노, 옥소, 페닐 및 페녹시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있다.
[화학식 10]
Figure 112014066135921-pat00039
MCL-1(myeloid cell leukemia-1)은 항-아폽토시스 활성을 가지는 BCL-2(B-cell lymphoma 2) 패밀리 단백질들 중 하나로, BAK 와 같은 BH3(BCL-2 homology domain 3) 패밀리 단백질들과 상호작용을 함으로써, BH3에 의한 세포사멸(apoptosis)를 억제하고 세포가 생존하도록 하는 역할을 한다. 따라서 암세포 내에서 MCL-1 단백질과 BH3 단백질들 간의 상호작용을 막는다면, 효과적으로 암의 생존을 막을 수 있기 때문에 매우 유망한 항암 전략으로 평가되고 있다.
이에, 본 발명에서는 트리아진-피페라진-트리아진 계열의 화합물이 단백질 간 상호작용을 억제하는 알파-헬릭스 유사체로서 역할을 할 수 있는지 증명하기 위해, 본 발명에서 구축한 라이브러리로부터 BH3 단백질 및 MCL-1 단백질 간 상호작용을 저해하는 화합물을 선별하기로 하였다. MCL-1/BH3 단백질 상호작용을 저해하는 알파-헬릭스 유사체 화합물을 선별하기 위하여, 본 발명자들은 트리아진-피페라진-트라아진 중심구조를 가지는 화합물 라이브러리를 폴리머 비드상에서 구축하였고, 도 4에 나타낸 비드상 스크리닝(on-bead screening) 방법을 이용하여 MCL-1 단백질에 직접 결합하는 화합물들을 선별하였다.
그 결과, 화학식 4~6의 화합물이 MCL-1 에 결합하며, MCL-1과 BH3 단백질 간의 상호작용을 저해한다는 것이 확인되었고, 이들 화합물이 암 세포의 사멸(apoptosis)을 유도한다는 것이 확인되었다(도 6 내지 도 10). 나아가, 본 발명에서는 화학식 6의 화합물의 R4 및 R5 자리에 다양한 친수성 기를 도입하여 MCL-1와의 결합력이 증진된 유도체들을 다량 확보할 수 있었고(도 11 및 도 12), 이러한 유도체들을 화학식 9로 나타내었다.
또한, 이에, 본 발명에서는 페닐-피페라진-트리아진 계열의 화합물이 단백질 간 상호작용을 억제하는 알파-헬릭스 유사체로서 역할을 할 수 있는지 증명하기 위해, 본 발명에서 구축한 라이브러리로부터 BH3 단백질 및 MCL-1 단백질 간 상호작용을 저해하는 화합물로서, 화학식 10의 화합물을 선별하였다. 화학식 10의 화합물이 MCL-1 에 결합하며, MCL-1과 BH3 단백질 간의 상호작용을 저해한다는 것이 확인되었고, 이들 화합물이 암 세포의 사멸(apoptosis)을 유도한다는 것이 확인되었다(도 16 및 도 17).
따라서, 화학식 4~6 및 화학식 9, 10의 화합물을 암의 예방 또는 치료 물질로 사용할 수 있다.
또 다른 일예로, 본 발명은 하기 화학식 7 및 화학식 8의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
[화학식 7]
Figure 112014066135921-pat00040
[화학식 8]
Figure 112014066135921-pat00041
알파-시누클레인의 응집은 루이소체(Lewy bodies)의 형성을 유도하며 이는 파킨슨 질환의 병리적 특성으로 알려져 있다. 이에, 본 발명에서는 본 발명에서 개발한 알파-헬릭스 유사체 화합물들이 알파-시누클레인의 폴딩 구조를 안정화하여 알파-시누클레인 응집을 저해할 수 있는지를 증명하기 위해, 본 발명에서 구축한 라이브러리로부터 알파-시누클레인의 응집을 저해하는 화합물을 선별하기로 하였다. 그 결과, 화학식 7~8의 화합물이 알파-시누클레인에 결합하며, 알파-시누클레인의 응집을 저해한다는 것이 확인되었다(도 13 및 도 14).
따라서, 화학식 7~8의 화합물을 파킨슨 질환의 예방 또는 치료 물질로 사용할 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.　경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 한 가지 이상의 부형제 및/또는 윤활제 등을 포함할 수 있다.　경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함될 수 있다.
상기 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 보다 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분을 기준으로 1일 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg으로 하는 것이 좋으나 이에 제한되는 것은 아니다.　투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육, 피하주사 등에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 유효성분의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명은 알파-헬릭스 유사체로서 트리아진-피페라진 골격을 갖는 화합물을 제공하며, 상기 화합물은 단백질의 이차구조인 알파-헬릭스 구조를 효율적으로 모방하여, 알파-헬릭스에 의해 매개되는 다양한 질환 특이적 단백질 상호작용의 저해제로 작용할 수 있다.
도 1의 A는 알파-헬릭스의 i, i+4, i+7 곁사슬의 위치를 나타내고, B는 종래 테르페닐 골격의 알파-헬릭스 유사체의 구조를 나타내고, C는 본 발명의 트리아진-피페라진-트리아진 골격의 알파-헬릭스 유사체의 구조를 나타낸다. D는 본 발명의 트리아진-피페라진-트리아진 골격의 알파-헬릭스 유사체를 에너지 최소화된 구조(2a)로 제조하였을 때 (즉, R2, R3, R5=CH3; R1, R4=H) 알파-헬릭스와 오버레이(overlay)된 그림을 나타낸다. E는 테르페닐 골격의 알파-헬릭스 유사체와 트리아진-피페라진-트리아진 골격의 알파-헬릭스 유사체 각각을 에너지 최소화된 구조로 제조하였을 때(1a, 1b), Clog P 값을 비교한 결과이다.
도 2는 트리아진-피페라진-트라아진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물을 제조하는 고체상 합성법의 개요를 나타낸 것이다.
도 3은 펩토이드를 coding tag로 하여 알파-헬릭스 유사체 화합물 라이브러리를 구축하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 알파-헬릭스 유사체 화합물 라이브러리로부터, 원하는 타겟 단백질에 결합하는 알파-헬릭스 유사체 화합물을 선별하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 화합물 9a, 9b 및 9c를 형광 표지하는 과정을 나타낸 것이다.
도 6의 A는 MCL-1에 결합하는 것으로 선별된 화합물 9a (화학식 4), 9b (화학식 5) 및 9c (화학식 6), 그리고 음성 대조군 9-nc 의 구조를 나타내고, B는 화합물 9a, 9b 및 9c 가 MCL-1 에 결합하는 것을 확인한 형광 평광 분석 결과를 나타내고, C는 화합물 9a, 9b 및 9c 가 형광-표지된 BH-3 펩타이드가 MCL-1 에 결합하는 것을 저해하는 것을 확인한 경쟁적 형광 편광 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 A 는 MCL-1 및 BH3 펩타이드 복합체의 결정 구조를 나타낸 것으로, BH3 의 3개의 소수성 잔기(Leu213, Val216 and Val220)의 곁사슬에 MCL-1 의 주요 결합 부위임을 나타낸다. B는 화합물 9c 가 MCL-1의 BH3 결합 부위에 결합하는 것을 나타내는 컴퓨터 도킹 연구 결과를 나타낸다.
도 8의 A 는 다양한 농도의 화합물 9c (10, 50, 100μM) 또는 DMSO 를 Jurkat 백혈병 T 세포에 2.5 시간 처리한 후, Jurkat T 세포 내에서 MCL-1/BAK 상호작용이 저해되는지를 MCL-1 면역침전 및 BAK 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다. B는 A549 세포에 1 μM의 9c-FL 또는 5(6)-carboxyfuorescein (Flu) 을 4 시간 처리한 후 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸다. C는 다양한 농도의 화합물 9c 및 9-nc(음성 대조군)을 각각 Jurkat T 세포(좌측 그림) 및 WS-1 정상 섬유아세포(우측 그림)에 처리했을 때 세포 생존율(%)을 나타낸 것이다.
도 9는 화합물 9c (25, 50μM), 화합물 9-nc (100μM) 또는 DMSO 를 Jurkat T 세포에 2.5 시간 처리한 후, Jurkat T 세포 내에서 MCL-1/BAK 상호작용이 저해되는지를 MCL-1 면역침전 및 BAK 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10의 A는 다양한 농도의 화합물 9c 및 9-nc(음성 대조군)을 U266 세포에 24 시간 처리했을 때 세포 생존율(%)을 나타낸 것이고, B는 정상 HEK293 세포에 처리했을 때 세포 생존율(%)을 나타낸 것이다. C는 U266 세포 및 WS-1 세포에 DMSO 또는 표시된 농도의 화합물 9c 를 16시간 동안 처리한 후 Caspase 활성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 11은 화합물 9c에서 R1 자리에 해당하는 Et를 다양한 친수성 기능기로 치환하는 과정을 나타낸다.
도 12는 화합물 9c에서 R4 자리에 해당하는 수소를 다양한 친수성 기능기로 치환하는 과정을 나타낸다.
도 13의 A는 화합물 Q1 (화학식 7) 및 Q2 (화학식 8) 의 구조를 나타낸 것이고, B는 화합물 Q1, Q2, 음성대조군으로서 화합물 9a, 9b, 9c, 및 fluro-linker 가 각각 야생형 알파-시누클레인에 결합하는지를 확인한 형광 편광 분석 결과를 나타낸 것이다. C 는 화합물 Q1 및 Q2 의 존재 또는 부재 하에서 알파-시누클레인의 unfolding 을 모니터링한 CD(circular dichroism) 열변성 결과를 나타낸다.
도 14의 A는 화합물 Q1, Q2, 9a, 9b, 9c 및 fluor-linker 가 각각 알파-시누클레인 돌연변이 A53T 에 결합하는지를 확인한 형광 편광 분석 결과를 나타낸 것이다. B는 화합물 Q1, Q2 및 음성대조군 9c 가 알파-시누클레인 돌연변이 A53T의 응집에 영향을 미치는지를 확인한 티오플라빈-T 형광 응집 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15은 페닐-피페라진-트라아진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물을 제조하는 고체상 합성법의 개요를 나타낸 것이다. 도면에서 (a) 는 4-플루오로-3-니트로벤조산, HATU, DIEA, DMF, 실온, 24 시간의 반응을 나타내고; (b) 는 N-노실 보호된 피페라진 유도체("3"), DIEA, DMF, 95℃, 12 시간의 반응을 나타내고; (c)는 2-메트캅토에탄올, DBU, DMF, rt, 3시간의 반응을 나타내고; (d)는 22-에틸아미노-4,6-디클로로-[1,3,5]트리아진("5"), DIEA, THF, 60℃, 시간의 반응을 나타내고; (e)는 R3NH2, DIEA, NMP, 80℃, 밤새 반응을 나타내고; (f)는 SnCl2ㆍ2H2O, DMF, 실온, 24 시간의 반응을 나타내고, (g)는 조건 A (방향족 알데히드의 경우): R1CHO, CH(OMe)3/DMF/MeOH 9:1:2 (1% HOAc), 50℃, 18 h; 이후 NaCNBH3, THF, 50℃, 6 시간의 반응, 조건 B (지방족 알데히드의 경우): R1CHO, 벤조트리아졸, CH(OMe)3/DMF/MeOH 9:1:2 (1% HOAc), 실온, 18 시간의 반응; 이후 NaCNBH3, THF, 실온, 6 시간의 반응을 나타내고; (h)는 95% TFA in CH2Cl2, 실온, 3 시간의 반응을 나타낸다.
도 16은 페닐-피페라진-트라아진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물 36종이 Mcl-1 및 BH3 펩타이드 간의 상호작용을 저해하는 효과를 확인한 경쟁적 형광 편광 분석(competitive fluorescence polarization assay) 결과를 나타낸다. 파란색 막대는 10 μM 농도에서의 저해 효과를, 붉은색 막대는 50 μM 농도에서의 저해 효과를 나타낸다.
도 17의 A는 PPT-31로 명명된 화합물(화학식 10의 화합물)의 구조를 나타내고, B는 PPT-31의 에너지-최소화 구조 및 BH3 헬릭스 펩타이드와 중복시킨 분자 모델링 결과를 나타낸다. C는 형광 표지된 BH3 펩타이드가 Mcl-1(검정색) 및 Bcl-XL(회색)과 결합하는 것을 저해하는 PPT-31의 저해 곡선을 나타낸다. 오차 막대는 3회의 독립된 실험 결과에 대한 표준 편차를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 트리아진 -피페라진- 트라아진을 중심 구조로 하는 알파- 헬릭스 유사체 화합물의 제조
1-1. 실험재료의 준비
TentaGel B NH2/Boc 레진 (130 μm, 0.25 mmol/g) 및 TentaGel S NH2 레진 (130 ?m, 0.29 mmol/g)은 Rapp Polymere 에서 구입하였다. Rink amide MBHA 레진 (0.96 mmol/g)은 Novabiochem 에서 구입하였다. LC-MS(liquid chromatograph-mass spectrometer) 분석은 Agilent 1200 LC/MS 시스템(Agilent Technology)에서 C18 역상 칼럼(Kinetex, 2 μm, 4.6 mm * 50 mm)을 사용하여 수행하였다. 유속 0.8mL/min 으로, 90% A 용매의 기울기 용리(gradient elution)에서 2분간 및 100% B 용매에서 14분간 수행하였다(A 용매는 95% 물, 5% 메탄올, 0.01% TFA; B 용매는 메탄올, 0.01% TFA). HPLC 정제는 Agilent 1120 Compact LC 시스템(Agilent Technology)에서 C18 역상 칼럼(Agilent Technology, 5 μm, 25 mm * 125 mm)을 사용하여 수행하였다. 40분마다 용매 조성을 바꾸면서, 10% B 용매부터 100% B 용매를 이용하여 linear gradient를 사용하였다. MALDI-TOF MS 는 ABI 4800 및 ABI 5800 질량분석기(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였고, 기질로는 α-시아노-4-하이드록시신남산을 사용하였다.
1-2. 고체상 합성법에 의한 알파- 헬릭스 유사체 화합물의 제조
트리아진-피페라진-트라아진 계열의 화합물을 합성하기 위해, 도 2에 나타낸 바와 같은 고체상 합성법을 개발하였다. 아민(NH2)으로 개질된 폴리머 비드에 5 단계의 순차적인 커플링(coupling) 반응을 통해 원하는 화합물을 평균 92% 의 수율로 얻을 수 있었다.
도 2를 기준으로 설명하면, 제1 단계로, 단일치환된 디클로로트리아진("3")을 Rink-Amide MBHA 레진 상에 로딩하여 레진에 결합시켜, 레진에 결합된 트리아진 유도체 "4"를 생성하였다. 제2 단계로, 2-니트로벤젠설포닐(Ns)로 보호된 피페라진 유도체("5")를 레진에 결합된 트리아진 유도체("4")에 커플링시켜, 화합물 "6" 를 제조하였다. 제3 단계로, 위에서 커플링된 화합물("6")로부터 N-Ns 보호기를 제거한 후, 여기에 2-에틸아미노-4,6-디클로로-[1,3,5]트리아진("7")을 도입하여 화합물 "8"을 제조하였다. 제4 단계로, 위에서 제조된 화합물("8")의 클로라이드 자리에 다양한 아민기(R2'R2"NH)를 대체시켰다. 제5 단계로, TFA(trifluoroacetic acid)를 가하여 절단 반응을 수행하여, 세 개의 치환기로 기능화된 화합물 "9"을 제조하였다.
위의 제조 과정을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
Rink amide MBHA 레진(100 mg, 69 μmol)을 5 mL fritted syringe 내 DMF (2 mL) 에서 1시간 처리하고, DMF (2 X 10 min) 에서 20% 피페리딘을 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 DMF (3 X) 로 세척한 후, 단치환된 디클로로트리아진("3")을 레진에 로딩시키기 위하여 DMF (1 mL)에서 Et3N (5 equiv)와 실온에서 밤새 반응시켰다. 2-니트로벤젠설포닐(Ns)로 보호된 피페라진 유도체("5")(10 equiv)를 레진에 결합된 트리아진 유도체("4")에 커플링시키기 위하여, DMF에서 Et3N (5 equiv)의 존재 하에 60℃에서 밤새 반응시켰다. 특별한 언급이 없는 한 각 반응 단계의 마지막 과정에서 레진을 DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 DMF (3 X)로 완전히 세척하였다. 위에서 커플링된 화합물("6")로부터 N-Ns 보호기를 제거하기 위하여, DMF에서 2-mercaptoethanol (20 equiv) 및 DBU (10 equiv)와 실온에서 2시간 반응시켰다. 이어서, 2-에틸아미노-4,6-디클로로-[1,3,5]트리아진("7")을 도입하여 화합물 "8"를 제조하기 위하여, NMP 에서 화합물 7 (5 equiv) 및 DIEA (5 equiv)을 비드에 처리하여 60℃에서 밤새 반응시켰다. 위에서 제조된 화합물("8")의 클로라이드 자리에 다양한 아민기(R2'R2"NH)를 대체시켰다. 마지막으로, TFA(trifluoroacetic acid)를 가하여 절단 반응을 수행하여, 세 개의 치환기로 기능화된 트리아진-피페라진-트리아진 화합물 "9"를 제조하였다.
위 고체상 합성법으로 합성된 화합물들의 순도(purity)와 특징(identity)을 LC-MS로 확인한 결과, 최종물의 평균 순도가 92% 이상으로 나타나, 위 고체상 합성법의 효율을 확인할 수 있었다.
대표적인 최종 화합물 40종의 질량(Mass) 및 정제(purity) 데이터
Figure 112014066135921-pat00042
Entry R 2 R 3 R 5 Calculated
Mass (M) 		Observed
Mass (M+H) 		Purity (%)
1 A Benzyl Ntyr 632.3 633.2 94
2 B Benzyl Ntyr 694.4 695.2 94
3 C Benzyl Ntyr 674.4 675.2 95
4 D Benzyl Ntyr 736.4 737.0 95
5 A Benzyl Nnaph 652.4 653.2 96
6 B Benzyl Nnaph 714.4 715.2 94
7 C Benzyl Nnaph 632.4 633.2 95
8 D Benzyl Nnaph 756.4 757.2 95
9 A Benzyl Ndcp 684.3 685.0 92
10 B Benzyl Ndcp 746.3 747.0 96
11 C Benzyl Ndcp 726.3 727.0 95
12 D Benzyl Ndcp 788.3 789.0 92
13 A Benzyl Ndpe 692.4 693.2 95
14 B Benzyl Ndpe 754.4 755.2 93
15 C Benzyl Ndpe 734.4 735.2 96
16 D Benzyl Ndpe 796.4 797.2 95
17 A Benzyl Npip 646.3 647.0 93
18 B Benzyl Npip 708.3 709.0 95
19 C Benzyl Npip 688.4 689.2 95
20 D Benzyl Npip 750.4 751.2 96
21 A Isobutyl Ntyr 598.4 599.2 98
22 B Isobutyl Ntyr 660.4 661.2 97
23 C Isobutyl Ntyr 640.4 641.2 97
24 D Isobutyl Ntyr 702.4 703.2 98
25 A Isobutyl Nnaph 618.4 619.2 94
26 B Isobutyl Nnaph 680.4 681.2 97
27 C Isobutyl Nnaph 660.4 661.2 96
28 D Isobutyl Nnaph 722.4 723.2 95
29 A Isobutyl Ndcp 650.3 651.0 94
30 B Isobutyl Ndcp 712.3 713.0 97
31 C Isobutyl Ndcp 692.3 693.0 96
32 D Isobutyl Ndcp 754.4 755.2 96
33 A Isobutyl Ndpe 658.4 659.2 96
34 B Isobutyl Ndpe 720.4 721.2 97
35 C Isobutyl Ndpe 700.4 701.2 96
36 D Isobutyl Ndpe 762.5 763.2 95
37 A Isobutyl Npip 612.3 613.0 93
38 B Isobutyl Npip 674.4 675.2 95
39 C Isobutyl Npip 654.4 655.2 96
40 D Isobutyl Npip 716.4 717.2 95
Average purity 92.2%
실시예 2. 트리아진 -피페라진- 트라아진을 중심 구조로 하는 알파- 헬릭스 유사체 화합물 라이브러리의 구축
본 발명에서는 아민(NH2)으로 개질된 폴리머 비드를 사용하여, 트리아진-피페라진-트라아진을 중심 구조로 하는 알파-헬릭스 유사체 화합물 라이브러리를 구축하고, 이를 OBOC(one-bead one-compound) 라이브러리 라고 명명하였다. 그 과정을 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에서는 비드의 표면(exterior)에는 BOC(tert-butyloxycarbonyl)기로 보호된 아민이 결합되고, 비드의 안쪽(interior)에는 아민(free amine)이 결합되어 있는, bifunctional 비드를 사용하였다. 상기 비드의 표면에서는 실시예 1에 기재한 고체상 합상법에 따라 알파-헬릭스 유사체를 합성하였고, 위 합성 과정에서 알파-헬릭스 유사체에 치환기가 도입될 때마다 동시에 각 치환기에 상응하는 펩토이드 잔기를 하나씩 비드의 안쪽에 연결시켜, 최종적으로 한 개의 비드에 두 종류의 화합물이 결합하도록 하였다. 다시 말해, 비드 표면 상에는 알파-헬릭스 유사체가 존재하고, 비드 안쪽에는 위 알파-헬릭스 유사체에 특이적인 펩토이드가 존재하도록 하였다. 이 펩토이드는 비드 표면에 결합된 알파-헬릭스 유사체의 구조를 알 수 있게 하는 coding tag 의 역할을 한다. 경우에 따라서는 알파-헬릭스 유사체의 각 치환기에 해당하는 펩토이드의 치환기가 같을 경우도 있지만, 알파-헬릭스 유사체의 치환기가 이차 아민이거나, 피페라진에 해당할 경우 펩토이드의 치환기는 다른 것을 사용하도록 하였다.
이와 같은 방식으로, 본 발명에서는 R5 치환기 18종, R3 치환기 3종, 및 R2 치환기 27종을 각각 펩토이드로 태깅하여 다양한 조합의 알파-헬릭스 유사체를 제조하였고, 그 결과, 총 1,458 종(= 18 X 3 X 27)의 화합물을 포함하는 라이브러리를 구축할 수 있었다.
라이브러리 합성을 위하여 펩토이드 태그를 결합시킨 치환기의 구조. 괄호 안의 구조는 각 치환기가 동일하지 않은 경우 코딩 펩토이드 합성을 위해 사용한 아민류를 나타낸다.
Figure 112014066135921-pat00043
이와 같이 구축된 알파-헬릭스 유사체 화합물 라이브러리는 비드상 고효율 스크리닝에 사용될 수 있다. 그 과정을 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 표적 단백질과의 비드 상 스크리닝 과정에서 비드 표면의 알파-헬릭스는 타겟 단백질에 노출이 되지만, 비드 안쪽의 펩토이드는 노출되지 않는다. 스크리닝 이후 비드 표면의 알파-헬릭스 유사체의 구조는 비드 내부의 펩토이드의 sequencing을 통해서 분석이 가능하다.
위의 제조 과정을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
TentaGel B NH2/Boc 레진 (250 mg, NH2: 62.5 μmol/ Boc: 1.3 ?mol)을 DMF (2 mL)에서 2시간 처리하였다. DMF (1 mL) 내 HOBt (5 equiv), HBTU (5 equiv) 및 DIEA (10 equiv)의 존재 하에서, 비드에 Fmoc-L-methionine (Fmoc-Met-OH) (5 equiv)를 처리하고 실온에서 반응시켰다. 2시간 교반 후, 반응 혼합물을 빼내고 DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 DMF (3 X)로 세척하였다. 다음으로, 같은 펩타이드 커플링 조건을 사용하여 Fmoc-4-aminobutyric acid (Abu) (5 equiv)를 첨가하였다. 위 과정을 두 번 반복하여 3개의 Abu 링커 잔기를 커플링하였다. Fmoc를 탈보호시킨 후, 결과물인 아민에, 실온에서 DMF (2 mL)에서 1 M bromoacetic acid 및 1 M DIC를 처리하여 브로모아세틸화시켰다. 비드를 동량으로 18 reaction vessel에 나누고, 각 부분에 18개의 다른 아민(2M amine in 2 mL DMF)을 처리하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 펩토이드의 N-말단을 allyloxycarbonyl (Alloc) group으로 보호시키기 위하여, 무수 CH2Cl2 내 allyl chloroformate (5 equiv) 및 Et3N (6 equiv)을 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 비드 표면의 Boc 그룹을 제거하기 위해 CH2Cl2 내 50 % TFA 를 처리하여 1시간 반응시켰다. 결과물인 1차 아민을 18개의 다른 단일치환된 트리아진 유도체("4")(5 equiv)와 커플링하였다. DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 NMP (3 X)로 완전히 세척한 후, 모든 비드를 250 mL vessel에 섞어 랜덤화하고 3 vessel에 나누었다. 트리아진의 클로라이드를 세 개의 다른 피페라진으로 치환시키기 위해, DIEA (10 equiv) 내 Boc 보호된 피페라진(10 equiv) 및 NMP (1 mL) 을 처리하여 60℃에서 밤새 반응시켰다. DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X)로 세척한 후, Alloc 그룹을 제거하기 위하여 무수 CH2Cl2 (1 mL) 내 Pd(PPh3)4 (0.2 equiv) 및 PhSiH3 (10 equiv)을 처리하였다. submonomer route를 사용하여, 두번째 펩토이드 잔기(R2")를 커플링시켰다. 비드를 다시 섞어 랜덤화하였다. 브로모아세틸화(bromoacetylation) 후, 비드를 27 vessel에 나누고 27개의 다른 아민들과 반응시켰다. 펩토이드의 N-말단을 브로모아세틸화 및 이어진 피페리딘과의 반응으로 block 하였다. 다음으로, Boc 그룹을 제거하기 위해 CH2Cl2 내 50 % TFA를 처리하여 1시간 반응시켰다. DMF 내 10% DIEA로 중화한 후, 비드에 NMP내 DIEA 와 4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-ethylamine을 첨가하여 60℃에서 밤새 반응시켰다. DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X)로 세척한 후, 모든 비드를 혼합하고 95% TFA를 처리하여 글로벌 탈보호(global deprotection)하였다. 절단을 위해, 각 비드에 대하여 ACN/AcOH/H2O (5:4:1) 내 20 μL CNBr (40 mg/mL)을 처리하고 실온에서 12시간 반응시켰다.
라이브러리 합성의 효율을 확인하기 위하여, 라이브러리로부터 30개 비드를 랜덤하게 골랐다. CNBr에 의한 절단 반응 후, 결과물인 펩토이드를 MS 로 분석하였다. 표면에 있는 알파-헬릭스 유사 분자는 절단되지 않고 오직 메티오닌을 통해 비드에 부착된 펩토이드만 CNBr 처리에 의해 방출되었다. 실험 대상인 모든 비드에서 유의적인 불순물 피크(impurity peaks)가 나타나지 않고 높은 정제율을 나타내어, 라이브러리 합성의 효율성을 확인할 수 있었다.
실시예 3. BH3 ( BCL -2 homology domain 3) 단백질 및 MCL -1( myeloid cell leukemia-1) 단백질 간 상호작용을 저해하는 알파- 헬릭스 유사체 화합물의 선별 및 효능 확인
3-1. 화합물의 선별
본 발명에서는 트리아진-피페라진-트라아진 계열의 화합물이 단백질 간 상호작용을 억제하는 알파-헬릭스 유사체로서 역할을 할 수 있는지 증명하기 위해, 실시예 2에서 구축한 라이브러리로부터 BH3 단백질 및 MCL-1 단백질 간 상호작용을 저해하는 화합물을 선별하기로 하였다.
MCL-1 은 BCL-2(B-cell lymphoma 2) 패밀리 단백질들 중 하나로, BH3 단백질들과 상호작용을 함으로써, BH3에 의한 세포사멸(apoptosis)를 억제하고 세포가 생존하도록 하는 역할을 한다. 따라서 암세포 내에서 BCL-2 단백질과 BH3 단백질들 간의 상호작용을 막는다면, 효과적으로 암의 생존을 막을 수 있기 때문에 매우 유망한 항암 전략으로 평가되고 있다.
MCL-1/BH3 단백질 상호작용을 저해하는 알파-헬릭스 유사체 화합물을 선별하기 위하여, 본 발명자들은 실시예 2에 기재한 바와 같이 화합물 라이브러리를 폴리머 비드상에서 구축하였고, 도 4에 나타낸 비드상 스크리닝(on-bead screening) 방법을 이용하여 MCL-1 단백질에 직접 결합하는 화합물들을 선별하였다. 우선, 비드에 결합된 화합물들을 포함하는 라이브러리 25 mg(∼0,200 beads, ∼copies of diversity) 을 200nM 의 비오틴화된 MCL-1ΔNΔC (biotinylated MCL-1)과 함께 4℃ 에서 밤새 배양하였다. 결합을 형성하지 못한 단백질들을 씻어내고 스트렙타비딘이 커플링된 Dynabeads(iron oxide particles)를 처리하여, 자력 분리(magnetic separation)에 의하여 양성 비드(positive bead)들만 선별하였다. 1차 스크리닝에서, 수백개의 비드가 선별되었다. 스트렙타비딘과 결합된 비드(위양성의 가능성 있음)들은 MCL-1 과 스크리닝 하기 전에 제거하였다. 선별된 비드들은 1% SDS 에서 가열하여 결합된 단백질들을 제거하였다. 세척 후, 비드들을 다시 100 nM의 비오틴화된 MCL-1ΔNΔC 과 함께 4℃ 에서 4시간 배양하였고, 스트렙타비딘이 결합된 알카라인 포스파타아제로 표지하였다. 최적의 화합물을 선별하기 위하여, 보다 엄격한 조건(stringent condition; 즉, 더 적은 양의 단백질 및 더 짧은 배양 시간)에서 2차 스크리닝을 실시하였다. 다음으로, 비드에 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 포스페이트를 처리하여, 알카라인 포스파타아제를 비색 검출(colorimetric detection)하였다. 10개의 푸른색 비드가 후보 화합물로 분리되었다. 각 비드에서 유래한 펩토이드를 MS/MS 로 분석한 결과, 10개의 비드가 동일한 펩토이드 서열을 포함하고 있었고, 크게 3 종류의 펩토이드로 구분할 수 있었다. 5개는 펩토이드-1, 3개는 펩토이드-2, 2개는 펩토이드-3을 포함하고 있었다.
Entry Peptoid sequence Number of hit beads Structure of hit compounds
1
Figure 112014066135921-pat00044
 5 9a
(화학식 4)
2
Figure 112014066135921-pat00045
 3 9b
(화학식 5)
3
Figure 112014066135921-pat00046
 2 9c
(화학식 6)
이러한 결과는, 라이브러리에 각 화합물들이 7 카피 정도씩 포함되어 있었기 때문인 것으로 생각되며, 이는 본 발명에서 개발한 스크리닝 시스템이 잘 작동하고 있음을 나타내는 것이다. 위의 3 종류의 펩토이드를 분석한 결과, 선별된 화합물들은 다음의 구조를 가지고 있었으며, 이를 9a(화학식 4), 9b(화학식 5) 및 9c(화학식 6)으로 각각 나타내었다. 이들 화합물을 HPLC 로 분리하였으며, 수용성임을 확인하였다(pH 7.4의 인산완충식염수에서 ~100 μg/mL 용해되며, 이는 약물로 사용시 경구 흡수가 가능한 정도의 수용해도 범위를 나타내는 것임).
[화학식 4]
Figure 112014066135921-pat00047
[화학식 5]
Figure 112014066135921-pat00048
[화학식 6]
Figure 112014066135921-pat00049

3-2. 형광 표지된 화합물의 합성
상기 선별된 화학식 4~6의 화합물에 형광을 표지하는 과정을 도 5에 나타내었고, 형광 표지된 화합물을 각각 9a-FL, 9b-FL 및 9c-FL로 나타내었다.
먼저, TentaGel S NH2 레진 (100 mg, 29 μmol)을 DMF (2 mL)에서 1시간 처리하였다. DMF (1 mL) 내 HOBt (5 equiv), HBTU (5 equiv) 및 DIEA (10 equiv)의 존재 하에서, 비드에 Fmoc-L-methionine (Fmoc-Met-OH) (5 equiv)를 처리하고 실온에서 반응시켰다. 2시간 교반 후, 반응 혼합물을 빼내고 세척하였다. Fmoc 보호기를 제거하기 위하여 DMF (1 mL, 2 X 10 min) 내 20% 피페리딘을 처리하였다. 다음으로, 같은 펩타이드 커플링 조건 하에서 Fmoc-Lys(Alloc)-OH 및 Fmoc-Abu-OH 을 커플링하였다. Fmoc를 탈보호시킨 후, DMF 내 DIEA (5 equiv) 및 단일치환된 디클로로트리아진을 처리하여 실온에서 밤새 반응시켰다. 반응 혼합물을 빼내고 DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 NMP (3 X)로 세척하였다. NMP (1 mL) 내 비드에 Boc 보호된 피페라진 유도체 (10 equiv) 및 DIEA(10 equiv)를 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 밤새 저었다. 세척 후, Boc 기를 제거하기 위하여 CH2Cl2 내 50 % TFA를 1시간 처리하였다. DMF (1 mL) 내 10% DIEA로 레진을 1시간 중화한 후, DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 NMP (3 X)로 세척하였다. 다음으로, 비드에 NMP 내 DIEA (5equiv)와 4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-ethylamine을 첨가하여 60℃에서 밤새 반응시킨 후, DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 NMP (3 X)로 세척하였다. 그 다음 레진에 NMP 내 DIEA (20 equiv) 및 아민 (20 equiv)을 처리하여 60℃에서 밤새 반응시킨 후, DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 로 세척하였다. 무수 CH2Cl2 (1 mL) 내 Pd(PPh3)4 (0.2 equiv) 및 PhSiH3 (10 equiv) 을 1시간 처리하여 Alloc 를 탈보호화한 후, 펩타이드 커플링 조건을 이용하여, 생성된 Lys 잔기 상의 NH2을 5,6-carboxyfluorescein (5 equiv)와 커플링하였다. 절단을 위해, 비드에 대하여 ACN/AcOH/H2O (5:4:1) 내 20 μL CNBr (40 mg/mL)을 처리하고 실온에서 12시간 반응시켰다. 절단된 조 생성물(crude product)은 HPLC로 정제하였다.
3-3. 컴퓨터를 이용한 분자 도킹 연구
화합물의 구조는 Maestro(Maestro v9.0, Schrdinger, LLC, Portland, OR)를 이용하여 구축하였고, CHARMM Gen-eral Force Field(Vanommeslaeghe, K; Hatcher, E.; Acharya, C.; Kundu, S.; Zhong,S.; Shim, J.; Darian, E.; Guvench, O.; Lopes, P.; Vorobyov, I.; Mackerell, A. D. J.Comput. Chem. 2010, 31, 671)를 이용하여 에너지-최소화를 수행하였다. 도킹을 위한 리간드와 수용체 구조는 Raccoon(Forli, S. Raccoon?Autodock VS: an automated tool for preparing AutoDock virtual screenings)을 이용하여 미리 분석하였다. BH3 헬릭스 잔기의 geometric center를 사용하여 도킹 박스 센터(docking box center)를 조직화하였고, 박스 사이즈를 X, Y 및 Z 에서 25로 설정하였다. MCL-1 결정 구조(PDB entry: 3MK8)에서 pose decoy를 생성하기 위하여, 각 화합물에 대하여 독립적인 20 AutoDock Vina(Trott, O.; Olson, A. J. J. Comput. Chem. 2010, 31, 455) 도킹을 수행하였다. 각 화합물에 대하여 400 pose decoy 를 얻었고 최종 모델은 best scoring pose로 결정하였다. 소프트웨어 PyMol를 사용하여 분자구조를 가시화하였다.
3-4. 단백질 정제
인간 MCL-1ΔNΔC 단백질 중 BH3-결합 도메인(172-320번째 아미노산)을 코딩하는 발현 플라스미드를 GST 로 태깅하고 BL21(DE3) E.coli 세포에 도입하였다. 1mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하여 단백질 발현을 유도하였다. 세포 펠렛을 용해 버퍼(20 mM Tris, pH 7.2, 250 mM NaCl, complete protease tablet(Roche))에 재현탁시키고 음파 처리하여 용해하였다. 원심분리 후, 세포 용해물을 5-mL GSTrap HP column(GE Life Sciences) 에 적용하였고, 제조사의 지시에 따라 수행하였다. MCL-1 단백질을 트롬빈 프로테아제에 의한 절단 반응을 통하여 수득하였고, GST 를 제거하기 위하여 GSTrap HP column 을 다시 로딩하고 크기 배제 크로마토그래피를 실시하였다.
MCL-1 단백질을 비오티닐화하기 위하여 0.1 M NaHCO3 buffer (pH 8.3) 내 sulfo-NHS-Biotin (Thermo Scientific)와 함께 실온에서 45분간 인큐베이팅하였다 (실험에 사용한 MCL-1ΔNΔC 단백질은 표면에 노출되어 BH3 결합 활성 부위와 떨어져 있는 여러 개의 라이신 잔기를 가지고 있으므로, 변경(modification)없이 비오티닐화하였다). 1.5 M hydroxylamine을 첨가하여 반응을 중단하였다. 표지된 단백질을 0.05% Tween20 (pH 7.4)을 함유하는 1xPBS 버퍼로 투석하여 분리하였다. 표지 정도는 제조자의 지시에 따라 결정하였다(degree of biotinylation: 1.05 biotin per protein).
3-5. 형광 편광 분석( fluorescence polarization assay )
형광표지된 화합물(50nM)을 black Costar 384-웰 플레이트 내에서 최종 농도가 60 ?L 으로 조정된 결합 버퍼(50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0) 를 사용하여, MCL-1ΔNΔC 또는 BCL-XLΔC와 함께 상온에서 어둠의 존재 하에 30분간 인큐베이션하였다. 형광 편광 값은 SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices)로 측정하였다. Excitation wavelength 는 485nm 로 하였고, emission은 535nm 에서 측정하였다. KD 는 GraphPad Prism 4 software로 계산하였다. 경쟁적 형광 편광 분석(competitive fluorescence polarization assay)을 위하여, MCL-1ΔNΔC 을 FITC-labeled MCL-1 BH3 peptide(FITC-MCL-1-BH3 peptide)로 바꾸었다. N-말단 표지된 FITC-MCL-1-BH3 peptide(FITC-Abu-KALETLRRVGDGVQRNHETAF-NH2)를 합성하고 HPLC 로 정제하였다. 다양한 농도의 화합물을, FITC-MCL-1-BH3 (50 nM)를 0.8 ?M MCL-1ΔNΔC 과 함께 결합 버퍼 내에서 30분간 인큐베이션한 후, FITC-MCL-1-BH3(50 nM)를 첨가하였다. 다양한 농도의 화합물을 첨가하여 30분간 인큐베이션한 후, 형광 편광 값을 측정하였다. Ki 값은 이전에 알려진 방법대로 계산하였다((Nikolovska-Coleska, Z. et al, Anal. Biochem. 2004, 332, 261).
3-6. 세포 생존력 분석( Cell viability assay )
Jurkat T 세포는 10% FBS 가 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였고, 4 X 104 세포를 100 μL Opti-MEM 배지(Invitrogen) 내 96-웰 플레이트에 시딩하였다. WS-1 세포는 10% FBS 가 포함된 MEM 배지에서 배양하였고, 2 X 104 세포를 10% FBS 가 포함된 100 μL MEM 배지 내 96-웰 플레이트에 24시간 동안 플레이팅하고, PBS 로 세척한 후, 100 μL Opti-MEM 배지 내에서 배양하였다. 6시간 동안 세포를 serum-starved로 유지하고 화합물을 처리하였다. 24시간 배양 후, CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit(Promega)를 사용하여, 제조자의 지시에 따라 세포 생존을 분석하였다.
3-7. 카스파아제 분석( Caspase Assays )
Jurkat T 세포를 Opti-MEM 배지 내 white-walled 96-well plates에 2 x104 cells/well로 플레이팅하고, 다양한 농도의 화합물 또는 DMSO를 16시간 처리하였다. WS-1 세포를 white-walled 96-well plates에 1 x104 cells/well로 플레이팅하고, 10% FBS가 포함된 MEM 배지 내에서 24시간 배양하였다. 세포들을 PBS 로 세척한 다음, Jurkat T 세포 처럼 Opti-MEM 배지 내에서 화합물들을 처리하였다. caspase 3/7 활성을 Caspase-Glo 3/7 Assay kit (Promega)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다.
3-8. 공초점 현미경 실험 ( Confocal microscopy experiment )
A549 cells (5 x 103 cells) 세포를 10% FBS가 포함된 MEM 배지 내 in 96-well plate에 플레이팅하였다. 24시간 동안 세포를 유지하고 PBS 로 세척한 다음, 형광 표지된 화합물 또는 5(6)-carboxyfluorescein 1 μL을 Opti-MEM 배지 내 처리하여 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 1 X PBS (2 times) 로 세포를 세척한 후 형광 이미지 분석을 하였다.
3-9. 공동면역침전 분석( Co - immunoprecipitation assay )
Opti-MEM 배지에서, Jurkat T cells(1 X 107 cells)에 DMSO 를 처리하거나 화합물을 처리하였다. 2.5시간 배양 후 세포를 수확하고 PBS 로 1회 세척한 후 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, and complete protease inhibitor tablet)로 얼음에서 용해하였다. 세포 용해물을 4℃에서 밤새 항-MCL-1 항체(S-19, Santa Cruz)와 배양시키고, 프로테인 A/G 아가로스 배양을 1시간 실시하였다. 비드를 침전시키고, 용해 버퍼로 3회 세척하고, 변성된 단백질에 대하여 anti-BAK(Cell Signaling) 및 anti-MCL-1 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. 웨스턴 블랏은 Immobilon-FL(Millipore) PVDF membrane 에서 실시하였고, 2차 항체로 Goat anti-Rabbit IRDye 680 항체(Licor)를 사용하였으며, 시그널은 Odyssey 3.0 software로 분석하였다.
3-10. 실험결과
먼저 화합물들의 형광 편광 분석(fluorescence polarization assay)을 통해, 선별된 3종의 화합물들의 MCL-1 단백질에 대한 결합력을 측정한 결과, 화학식 4~6의 화합물이 MCL-1 에 결합하는 KD 값이 각각 2.8, 3.0, 1.1μM 로 측정되어, 3종의 화합물 모두 효과적으로 MCL-1 단백질에 결합하는 것을 확인하였다. 양성 대조군으로 사용한 알려진 BH3 펩타이드의 KD 값은 0.3 μM 로 나타났다. 음성 대조군으로 사용한 Fluor-linker는 MCL-1과 결합하지 않았으며, 이는 각 화합물에 결합된 형광단(fluorophore) 및 링커가 MCL-1과의 결합에는 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다 (도 6B). 또한, 이들 화합물들이 실제 MCL-1과 BH3 단백질 간의 상호작용을 저해하는지를 보기 위해 경쟁적 형광 편광 분석(competitive fluorescence polarization assay)을 실시한 결과, 화학식 5 및 6의 화합물이 MCL-1 및 BH-3 상호작용을 해리시키는 Ki값이 각각 17.2 및 9.3 μM 로 측정되었고, 화학식 4의 화합물은 약한 활성을 나타내었다. 음성 대조군으로 사용한 화합물 9-nc 는 MCL-1 에 결합하지 않았다 (도 6C). 다음으로, 컴퓨터를 이용한 도킹 모델 연구(docking model study) 결과, 화학식 6의 화합물이 MCL-1의 BH3 결합 부위에 잘 결합할 것으로 예측되었다(도 7B).
위에서 언급한 대로 MCL-1과 BH3 간의 단백질 상호작용을 억제하게 되면, BH3가 자유롭게 되면서 암세포의 세포사멸을 유발하게 된다. 따라서, 선별된 화합물들이 MCL-1 과 결합하여 MCL-1과 BH3 간의 단백질 상호작용을 억제함으로써 암세포의 사멸을 유발하는지를 확인해보았다.
우선, 화학식 5의 화합물이 세포 내에서 MCL-1/BH3 단백질 상호작용을 저해하는지 확인하기 위해, 암 세포인 Jurkat 백혈병 T 세포(Jurkat leukemia T cells)에 화학식 6의 화합물을 처리하고, 세포 용해물에 항-MCL-1 항체를 처리하여 면역침전시키고, 항-BAK 및 항-MCL-1 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 화학식 5의 화합물은 효과적으로 MCL-1과 BAK(BH3 단백질 중 하나)과의 단백질 상호작용을 저해하는 것으로 확인되었다(도 8A). 그러나 음성 대조군인 화합물 9nc 는 MCL-1과 BAK과의 단백질 상호작용을 저해하지 않았다(도 9). 또한, 화학식 6의 화합물은 세포를 투과하여 경쟁적으로 MCL-1 에 결합하여 BAK 단백질을 방출시키는 것으로 확인되었다. 공초점 현미경 분석은 상기 화합물이 세포에 투과된다는 것을 나타낸다(도 8B). 또한, 화학식 6의 화합물은 암 세포인 Jurkat 백혈병 T 세포와 다발성 골수종 세포인 U266 세포의 생존을 효과적으로 억제하였으나, 정상 세포인 WS-1 인간 섬유아세포(WS-1 human fibroblast cell) 및 HEK293 배아 신장 세포의 생존에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 화학식 6의 화합물이 암 세포에 대해 선택적으로 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 8C 및 도 10B, C).
화학식 6의 화합물에 의한 암세포의 사멸이 apoptosis에 의한 것인지를 살펴보기 위해 caspase 3/7 assay를 시행한 결과, 화학식 6의 화합물은 U266 세포에서는 농도 의존적으로 caspase 활성을 증가시키지만, 정상 세포인 WS-1에서는 효과가 없는 것으로 확인되었다(도 10C).
결과적으로 화학식 4~6의 화합물이 모두 BH3 단백질 및 MCL-1 단백질 간 상호작용을 저해하였으며, 이 중에서도 특히 화학식 6의 화합물은 암세포에서 선택적으로 세포독성을 보였다. 따라서, 이들 화합물들은 향후 항암제로서 매우 유망한 가능성 가지고 있다고 할 수 있다. 또한, 본 발명에서 개발한 트리아진-피페라진-트라아진 골격의 화합물이 알파-헬릭스 유사체로 기능하여 단백질-단백질 간 상호작용을 효과적으로 억제할 수 있다는 것이 확인되었다.
실시예 4. 트리아진 -피페라진- 트라아진을 중심 구조로 하는 알파- 헬릭스 유사체 화합물의 친수성을 증진시킨 유도체의 제조
BH3 단백질 및 MCL-1 단백질 간 상호작용을 저해하는 효과가 우수한 것으로 나타난 화학식 6의 화합물에 대하여, R1 자리에 해당하는 Et 및 R4 자리에 해당하는 H 를 대체하여 다양한 친수성 기능기를 도입하여, 화학식 6의 화합물 보다 MCL-1에 강하게 결합하는 유도체들을 발굴하였다.
우선, 화학식 6의 화합물에서, R1 자리에 해당하는 Et를 다양한 친수성 기능기로 치환하여, MO-01 내지 MO-10으로 명명된 10종의 유도체를 제조하였고, 그 제조과정을 도 11에 나타내었다.
또한, 화학식 6의 화합물에서, R4 자리에 해당하는 H를 다양한 친수성 기능기로 치환하여, MO-11 내지 MO-20으로 명명된 10종의 유도체를 제조하였고, 그 제조과정을 도 12에 나타내었다.
위에서 제조한 MO-01 내지 MO-20 유도체들은 다음과 같다:
Figure 112014066135921-pat00050
화합물 R 1 R 4
MO-01
Figure 112014066135921-pat00051
 H
MO-02
Figure 112014066135921-pat00052
 H
MO-03
Figure 112014066135921-pat00053
 H
MO-04
Figure 112014066135921-pat00054
 H
MO-05
Figure 112014066135921-pat00055
 H
MO-06
Figure 112014066135921-pat00056
 H
MO-07
Figure 112014066135921-pat00057
 H
MO-08
Figure 112014066135921-pat00058
 H
MO-09
Figure 112014066135921-pat00059
 H
MO-10
Figure 112014066135921-pat00060
 H
MO-11 Et
Figure 112014066135921-pat00061
MO-12 Et
Figure 112014066135921-pat00062
MO-13 Et
Figure 112014066135921-pat00063
MO-14 Et
Figure 112014066135921-pat00064
MO-15 Et
Figure 112014066135921-pat00065
MO-16 Et
Figure 112014066135921-pat00066
MO-17 Et
Figure 112014066135921-pat00067
MO-18 Et
Figure 112014066135921-pat00068
MO-19 Et
Figure 112014066135921-pat00069
MO-20 Et
Figure 112014066135921-pat00070
실시예 5. 알파- 시누클레인(α-synuclein)의 응집을 저해하는 알파- 헬릭스 유사체 화합물의 선별 및 효능 확인
5-1. 화합물의 선별
본 발명에서는 트리아진-피페라진-트라아진 계열의 화합물이 단백질 폴딩을 안정화하고 단백질 응집을 저해할 수 있는지 증명하기 위하여, 대표적인 단백질 폴딩 관련 질환 인자로서 알파-시누클레인을 사용하였다. 알파-시누클레인의 응집은 루이소체(Lewy bodies)의 형성을 유도하며 이는 파킨슨 질환의 병리적 특성으로 알려져 있다. 루이소체 형성의 기전은 아직 명확히 밝혀져 있지 않으나, 알파-시누클레인의 미스폴딩과 이에 의한 부절절한 자가-연합(self-association)이 루이소체의 형성에 관여할 것으로 여겨지고 있다. 또한, 알파-시누클레인은 ~65% 정도가 알파-헬릭스로 구성되어 있다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는 본 발명에서 개발한 알파-헬릭스 유사체 화합물들이 알파-시누클레인의 폴딩 구조를 안정화하여 알파-시누클레인 응집을 저해할 수 있는지를 실험해보았다.
이를 위하여, 알파-시누클레인의 N-말단에 MKCK 쿼드-펩타이드(즉, 메티오닌-라이신-시스테인-라이신으로 구성된 펩타이드)를 도입한 컨스트럭트를 제조하여, 형광단(fluorophore)과 비드의 화학적 가교가 가능하도록 반응성 시스테인을 도입하였다(야생형 알파-시누클레인은 시스테인을 포함하지 않음). 이와 같이 시스테인을 포함하는 알파-시누클레인(cys-Syn)을 비오틴화한 후 위 실시예 3-1에 기재한 방법대로 화합물을 스크리닝하였다. 그 결과, 다음의 화학식 7 (Q1) 및 화학식 8 (Q2)의 화합물을 선별하였다.
[화학식 7]
Figure 112014066135921-pat00071
[화학식 8]
Figure 112014066135921-pat00072

5-2. 단백질 정제
pRS 벡터로부터 N-terminal extension MKCK quad-peptide open reading frame와 알파-시누클레인의 컨스트럭트를 증폭하였다. 이 때 SamI 제한 효소 부위를 포함하는 정방향 프라이머(5'-GGAATTCCCGGGAATGTGTGTATTCTGCAAAGGACTTTCAAAGGC-3') 및 XhoI 제한 효소 부위를 포함하는 역방향 프라이머(5'- GCCTTTGAAAGTCCTTTGCAGAATACACACATTCCCGGGAATTCC-3')를 사용하였다. 증폭된 DNA 는 pGEX-6P-1 plasmid(GE Biosciences)에 클로닝하여, GST 융합 컨스트럭트를 생성하였다. 발현 플라스미드를 rossetta 2 (DE3) E. coli cell에 도입하고, 20℃에서 1 mM IPTG를 처리하여 단백질 발현을 유도하였다. 세포 펠렛을 용해 버퍼(100 mM HEPES, pH =7.4, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0.1% BOG, Halt Protease Inhibitor cocktail (Thermo Scientific))에 재현탁시키고 음파 처리하여 용해하였다. 원심분리 후, 세포 용해물을 20-mL GSTPrep HP column(GE Life Sciences) 에 적용하였고, 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 알파-시누클레인 단백질을 PreScission 프로테아제(GE healthcare life sciences)에 의한 밤새 절단 반응을 통하여 수득하였다. 버퍼 교환 후, GST 를 제거하기 위하여 GSTPrep column 을 다시 로딩하고 크기 배제 크로마토그래피를 실시하였다.
알파-시누클레인 단백질을 비오티닐화하기 위하여 0.1 M NaHCO3 buffer (pH 8.3) 내 sulfo-NHS-Biotin (Thermo Scientific)와 함께 실온에서 45분간 인큐베이팅하였다. 1.5 M hydroxylamine을 첨가하여 반응을 중단하였다. 표지된 단백질을 0.05% Tween20 (pH 7.4)을 함유하는 1xPBS 버퍼로 투석하여 분리하였다. 표지 정도는 제조자의 지시에 따라 결정하였다(degree of biotinylation: 1.07 biotin per protein).
5-3. 티오플라빈 -T 응집 분석( Thioflavin -T aggregation assay )
화합물 및 2~10 uL DMSO(as blank)를 각각 100 uL 의 0.2 mM 알파-시누클레인 질환-관련 돌연변이 A53T에 처리하고, 버퍼(100 mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 10% glycerol, 0.1%BOG and 5 uM Thioflavin-T)를 사용하여 최종 농도가 100 ?M가 되도록 하여, 37℃ 에서 frequent agitation 와 인큐베이션하였다. . 티오플라빈-T 의 형광(excitation wavelength 440 nm, emission wavelength 482 nm, cutoff wave-length 475 nm)은 FlexStation2(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 37℃ 에서 1시간 간격으로 측정하여 총 30시간 측정하였다.
5-4. 원평광이색성 열변성 연구( Circular Dichroism ( CD ) Thermal Denaturation Study )
화합물의 존재 또는 부재에서 알파-시누클레인의 열 변성 과정을, 1-cm pathlength quartz cuvette 을 사용하여, Peltier temperature controller 가 장착된 BioLogic MOS-450 spectrophotometer 상의 222 nm CD signal 로 모니터링하였다. DMSO 용액 및 화합물을 단백질 샘플(0.05 mg/mL, 100 mL HEPES, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0.1% BOG, 1% taurodeoxycholic acid)에 나누어 첨가하여 최종 농도가 1 uM 및 1% DMSO가 되도록 하였다. 25~60℃ 범위 및 1℃/min 의 비율로 하였다.
5-5. 실험결과
선별된 화학식 7 및 화학식 8의 화합물이 알파-시누클레인에 결합하는지 확인하기 위하여, 위 실시예 3-5에 기재된 방법으로 알파-시누클레인에 대한 KD 값을 측정한 결과, 각각 68nM 및 148nM로 측정되어, 2종의 화합물 모두 효과적으로 알파-시누클레인에 결합하는 것을 확인하였다(도 13B). 화학식 7 및 화학식 8의 화합물은 R3 및 R5 의 치환기가 동일하며, R2가 모두 1,2-디알콕시벤젠으로 구성되어 있다는 점에서 구조가 유사하다(도 13A).
화학식 7 및 8의 화합물이 알파-시누클레인과 결합할 때 화합물 골격과 형광단(fluorophore) 링커가 어떤 작용을 하는지 알아보기 위하여, 화학식 7 및 8과 같은 골격을 가지는 화학식 4~6의 화합물(9a~9c) 및 Fluor-linker 가 알파-시누클레인에 결합하는 정도를 확인하였다. 그 결과, 화학식 6의 화합물(화학식 7, 8과 두 개의 치환기가 동일함)은 알파-시누클레인에 친화력을 나타내었는데(도 13B), 이는 타겟 단백질에 대한 화합물의 결합과 선택성이 화합물의 곁사슬에 의해 결정된다는 것을 뒷받침한다.
화학식 7, 8의 화합물과의 결합이 알파-시누클레인의 열 안정성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 CD(circular dichroism) 열 안정성 분석을 수행한 결과, 화학식 7, 8의 화합물이 알파-시누클레인의 융해 온도(melting temperature)를 37℃에서 각각 40, 41℃로 변화시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 알파-시누클레인의 알파-헬릭스는 길다란 소수성 표면을 가지면서 양친성을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 상대적으로 소수성인 화학식 7, 8의 화합물이 알파-시누클레인의 소수성 표면과 상호작용하는 것으로 보인다.
다음으로, 선별된 화학식 7 및 화학식 8의 화합물이 알파-시누클레인의 응집에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 질환과 관련된 알파-시누클레인의 돌연변이형(A53T)을 이용하였다. 우선, 상기 돌연변이(A53T)에 대한 화학식 7, 8의 화합물의 KD 값을 측정한 결과, 각각 268nM 및 372nM로 측정되어, 2종의 화합물 모두 효과적으로 알파-시누클레인 돌연변이에 결합하는 것을 확인하였다(도 14A). 또한, 화학식 7, 8의 화합물, 화학식 4의 화합물(9a)을 각각 상기 돌연변이와 함께 화합물들을 배양한 후, 티오플라빈-T 형광 응집 분석을 통하여 응집 저해 여부를 모니터하였다. 그 결과, 화학식 7, 8의 화합물 모두 알파-시누클레인의 응집의 시작을 유의적으로 지연시켰으며, 실험을 실시한 30시간 동안 응집된 피브릴(fibril)의 양을 현저히 감소시킨 반면, 화학식 4의 화합물 및 음성 대조군인 DMSO 처리군의 경우 응집을 저해하는 효과가 나타나지 않았다(도 14B).
결과적으로, 본 발명에서 제공하는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리 화합물들이 알파-시누클레인에 결합하여 알파-시누클레인의 응집을 저해할 수 있다는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명에서 제공하는, 다양한 치환기로 치환된 트리아진-피페라진-트라아진 골격의 화합물의 라이브러리는 MCL-1 이나 알파-시누클레인 뿐 아니라 일반적인 알파-헬릭스에 의해 매개되는 단백질 상호작용을 제어할 수 있는 저해제 발굴을 위해 널리 사용될 수 있다.
실시예 6. 페닐 -피페라진- 트라아진을 중심 구조로 하는 알파- 헬릭스 유사체 화합물의 제조
페닐-피페라진-트라아진 계열의 화합물을 합성하기 위해, 도 13에 나타낸 바와 같은 고체상 합성법을 개발하였다. 아민(NH2)으로 개질된 폴리머 비드에 순차적인 커플링(coupling) 반응을 통해 원하는 화합물을 평균 90% 이상의 수율로 얻을 수 있었다.
도 15를 기준으로 설명하면, 제1 단계로, 4-플루오로-3-니트로벤조산을 Rink-Amide MBHA 레진 상에 로딩하여 레진에 결합시켜, 레진에 결합된 화합물 "2"를 생성하였다. 제2 단계로, N-노실(Ns)로 보호된 피페라진 유도체("3")를 레진에 결합된 화합물("2")에 커플링시켜, 화합물 "4" 를 제조하였다. 제3 단계로, 2- 메트캅토에탄올을 처리하여 위에서 커플링된 화합물("4")로부터 N-Ns 보호기를 제거한 후, 여기에 2-에틸아미노-4,6-디클로로-[1,3,5]트리아진("5")을 도입하여 화합물 "6"을 제조하였다. 제4 단계로, 위에서 제조된 화합물("6")의 클로라이드 자리에 다양한 아민기(R3NH2)를 대체시켜 화합물 "7"을 제조하였다. 제5 단계로, DMF 내 SnCl2을 반응시켜 화합물의 니트로 그룹을 환원시켜 화합물 "8"을 제조하였다. 그 결과 생긴 아민을 다양한 알데히드를 이용한 환원-아미노화(reductive amination) 반응을 통하여 알킬화하여 R1 기능기를 도입하였다. 방향족 알데히드와의 반응은 의도한 알킬화된 산물을 높은 수율로 생성하지만, 같은 조건에서 지방족 알데히드와의 반응은 디알킬화된 산물을 주요 산물로 생성하므로, 과도한 알킬화(over-alkylation)에 의한 부산물 생성을 막기 위하여, 반응 혼합물에 벤조트리아졸을 첨가하였다. 벤조트리아졸은 환원-아미노화에서 디알킬화된 부산물의 형성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 마지막 단계로, 95% TFA를 가하여 절단 반응을 수행하여, 세 개의 치환기로 기능화된 페닐-피페라진-트리아진 유도체를 제조하였다.
위의 제조 과정을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
Rink amide MBHA 레진(100 mg, 93μmol)을 DMF (2 mL) 에서 1시간 처리하고, DMF (2 X 10 min) 에서 20% 피페리딘을 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 특별한 언급이 없는 한 각 반응 단계의 마지막 과정에서 레진을 DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 DMF (3 X)로 완전히 세척하였다. DMF (1.5 mL) 내의 4-플루오로-3-니트로벤조산 (70 mg, 378 μmol), HATU (142 mg, 378 μmol) 및 DIEA (130 μL, 756 μmol)의 용액에 레진을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 반응시켰다. 노실로 보호된 피페라진(Nosyl-protected piperazin)(4 equiv)을 레진에 도입시키기 위하여 DMF 에서 DIEA (10 equiv)을 사용하여 95℃에서 12시간 반응시켜, 레진에 결합된 피페라진 유도체 "4"를 생성하였다. 유도체 "4"의 노실기를 제거하기 위해 DMF 에서 2-mercaptoethanol (20 equiv) 및 DBU (10 equiv)을 처리하여 실온에서 반응시켰다. 다음으로, 2-ethylamino-4,6-dichloro-[1,3,5]triazine(10 equiv)을 레진에 커플링시키기 위하여, THF 에서 DIEA (5 equiv)을 사용하여 60℃에서 3시간 반응시켜, 화합물 "6"을 생성하였다. 화합물 "6" 의 클로라이드를 다양한 아민기(R3NH2, 5 equiv)로 치환시키기 위하여, NMP에서 DIEA (10 equiv)의 존재 하에 80℃에서 밤새 반응시켜, 화합물 "7"을 생성하였다. DMF 에서 SnCl2ㆍ2H2O (60 equiv) 용액을 레진에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 교반하였다. 레진이 결합된 아민("8")을 건조된 CH(OMe)3:DMF = 9:1 내 알데히드(10 equiv) 용액 0.4M 및 메탄올 내 아세트산 용액 20% (v/v)을 처리하여 50℃에서 18시간 반응시켰다. 이어서, THF 내 NaCNBH3 (50 equiv) 용액 5M 을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 6시간 교반하여, 알킬화된 산물을 제조하였다. 지방족 알데히드를 사용하는 경우에는, 벤조트리아졸 (100 equiv)을 첨가하여 디알킬화(dialkylated)된 부산물이 생성되지 않도록 하였다. 마지막으로, TFA를 가하여 절단 반응을 수행하여, 세 개의 치환기로 기능화된 페닐-피페라진-트리아진 유도체를 제조하였다.
위 고체상 합성법으로 합성된 화합물들의 순도(purity)와 특징(identity)을 LC-MS로 확인한 결과, 최종물의 평균 순도가 90% 이상으로 나타나, 위 고체상 합성법의 효율을 확인할 수 있었다. 이후 역상 HPLC로 화합물을 정제하고 1H-NMR, 13C-NMR 및 HRMS(high-resolution mass spectrometer)로 화합물을 동정하였다.
위와 같이 합성된 알파-헬릭스 유사체 36종은 다음과 같다.
Figure 112014066135921-pat00073
화합물 R 6 ' R 3 R 2 ' purity
ppt-01 Et i-Bu i-Pr i-Pr
ppt-02 Et i-Bu i-Bu i-Bu
ppt-03 Et i-Bu Bn Bn
ppt-04 Et i-Bu Naph Naph
ppt-05 Et Bn i-Pr i-Pr
ppt-06 Et Bn i-Bu i-Bu
ppt-07 Et Bn Bn Bn
ppt-08 Et Bn Naph Naph
ppt-09 Et Me i-Pr i-Pr
ppt-10 Et Me i-Bu i-Bu
ppt-11 Et Me Bn Bn
ppt-12 Et Me Naph Naph
ppt-13 i-Bu i-Bu i-Pr i-Pr
ppt-14 i-Bu i-Bu i-Bu i-Bu
ppt-15 i-Bu i-Bu Bn Bn
ppt-16 i-Bu i-Bu Naph Naph
ppt-17 i-Bu Bn i-Pr i-Pr
ppt-18 i-Bu Bn i-Bu i-Bu
ppt-19 i-Bu Bn Bn Bn
ppt-20 i-Bu Bn Naph Naph
ppt-21 i-Bu Me i-Pr i-Pr
ppt-22 i-Bu Me i-Bu i-Bu
ppt-23 i-Bu Me Bn Bn
ppt-24 i-Bu Me Naph Naph
ppt-25 Bn i-Bu i-Pr i-Pr
ppt-26 Bn i-Bu i-Bu i-Bu
ppt-27 Bn i-Bu Bn Bn
ppt-28 Bn i-Bu Naph Naph
ppt-29 Bn Bn i-Pr i-Pr
ppt-30 Bn Bn i-Bu i-Bu
ppt-31 Bn Bn Bn Bn
ppt-32 Bn Bn Naph Naph
ppt-33 Bn Me i-Pr i-Pr
ppt-34 Bn Me i-Bu i-Bu
ppt-35 Bn Me Bn Bn
ppt-36 Bn Me Naph Naph
Figure 112014066135921-pat00074
실시예 7. BH3 단백질 및 MCL -1 단백질 간 상호작용을 저해하는 알파- 헬릭스 유사체 화합물의 선별 및 효능 확인
7-1. 단백질 정제
인간 Mcl-1172-320(172-320번째 아미노산) 또는 인간 Bcl-xL1 -212 (1-212 번째 아미노산)의 BH3-결합 도메인을 발현하는 플라스미드를 GST 로 태깅하고 BL21(DE3) E.coli 세포에 도입하였다. 1mM IPTG를 처리하여 단백질 발현을 유도하였다. 세포 펠렛을 용해 버퍼(20 mM Tris, pH 7.2, 250 mM NaCl, complete protease tablet(Roche))에 재현탁시키고 음파 처리하여 용해하였다. 원심분리 후, 세포 용해물을 5-mL GSTrap HP column(GE Life Sciences) 에 적용하였고, 제조사의 지시에 따라 수행하였다. Mcl-1172-320 및 Bcl-xL1 -212 단백질을 트롬빈 프로테아제에 의한 절단 반응을 통하여 수득하였고, GST 를 제거하기 위하여 GSTrap HP column 을 다시 로딩하고 크기 배제 크로마토그래피를 실시하였다.
7-2. 형광 편광 분석( fluorescence polarization assay )
경쟁적 형광 편광 분석(competitive fluorescence polarization assay)을 위하여, Mcl-1172- 320 로부터 형광 표지된 Bak-BH3 펩타이드의 치환을 모니터링하였다. 보다 상세하게는, 10 nm의 TAMRA-표지된 Bak-BH3 (TAMRA-Abu-KALETLRRVGDGVQRNHETAF-NH2) 펩타이드를, black Costar 384-well plate 내에서 최종 부피가 60 μL인 결합 버퍼(50 mM Tris, 100 mM NaCl, 20 nM of bovine serum albumin, pH 8.0)에서, 어둠 속에서 30분간 0.8 μM 의 Mcl-1172-320와 인큐베이션시켰다. 40 μL의 결합 버퍼 내 다양한 농도의 페닐-피페라진-트리아진을 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 15분간 인큐베이션 후, Infinite®200 PRO Microplate Reader (Tecan)로 형광 평광 값(mP units)을 측정하였다. Excitation wavelength 는 485nm 로 하였고, emission은 535nm 에서 측정하였다. Ki 값은 이전에 알려진 방법대로 계산하였다(Wang, G. P. et al., Abstr Pap Am Chem S 2004, 228, U926-U926).
7-3. 실험결과
실시예 6에 기재한 고체상 합성법에 따라, 페닐-피페라진-트레아진 화합물의 라이브러리를 구축하였다. BH3 헬릭스 펩타이드의 세 개의 소수성 잔기(Leu, Val, 및 Val)를 모방하기 위하여, R2, R3 및 R6 자리에 다양한 소수성 측쇄가 도입된 화합물들을 제조하였다. 36종의 라이브러리 화합물들 중에서, 두 가지 다른 농도(10 μM 및 50 μM)에서, Mcl-1172-320 (BH3-결합 그루브를 포함하는 결실 구조체) 및 알고 있는 형광 표지된 BH3 펩타이드 간의 상호작용을 저해하는 화합물을 선별하였다.
도 16에 나타난 바와 같이, PPT-31 이 10 μM 및 50 μM 모두에서 Mcl-1/BH3 간 상호작용의 저해효과가 가장 우수하였고 농도-의존도가 우수한 것으로 나타났다. 도 17에 나타난 바와 같이, PPT-31 은 R2, R3 및 R6 자리에 각각 페닐기를 포함하고 있으며(도 17A), 분자 모델링에 의하면, 각 페닐기는 BH3 펩타이드의 알파 헬릭스 상에서 Mcl-1의 소수성 부분(hydrophobic cleft)과 결합하는 핵심 잔기인 Val220, Val216 및 Leu213 자리에 위치할 것으로 예상된다(도 17B). PPT-31의 결합 친도는 동일한 경쟁적 FP 분석(K i = 7.3 μM)을 사용하여 결정하였다(도 17C).
또한, Mcl-1의 BH3 결합 포켓은 Bcl-xL과 같은 Bcl-2 패밀리 단백질의 BH3 결합 포켓과 유사하기 때문에, 본 발명자들은 PPT-31 이 선택성을 가지는지 알아보았다. PPT-31이 Bcl-xL에 결합 친화력을 가지는지 확인한 결과, PPT-31은 BH3의 Bcl-xL1-212 (BH3-결합 포켓을 포함하는 결실 구조체)과 BH3 간의 상호작용은 저해하지 않는 것으로 나타났다(도 17C). 이는, PPT-31이 선택적 Mcl-1 저해제라는 것을 나타낸다.
제조예 I. 트리아진 -피페라진- 트리아진 골격의 화합물의 합성
도 3에 나타난 바와 같이, Rink amide MBHA resin (100 mg, 93 μmol)을 을 5 mL fritted syringe 내 DMF (2 mL)에서 1시간 처리하였다. DMF (2 X 10 min) 에서 20% 피페리딘을 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 DMF (3 X) 로 완전히 세척한 후, 단일치환된 디클로로트리아진을 레진에 로딩시키기 위하여 단일치환된 디클로로트리아진("3") (5 equiv)을 DMF (1 mL)에서 DIEA (5 equiv)와 실온에서 밤새 반응시켰다. 2-니트로벤젠설포닐(Ns)로 보호된 피페라진 유도체("5")(10 equiv)를 레진에 결합된 트리아진 유도체("4")에 커플링시키기 위하여, DMF에서 Et3N (5 equiv)의 존재 하에 60℃에서 밤새 반응시켰다. 특별한 언급이 없는 한 각 반응 단계의 마지막 과정에서 레진을 DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 DMF (3 X)로 완전히 세척하였다. 위에서 커플링된 화합물("6")로부터 N-Ns 보호기를 제거하기 위하여, DMF (10 equiv)에서 2-mercaptoethanol (20 equiv) 및 DBU (10 equiv)와 실온에서 2시간 반응시켰다. 이어서, 2-에틸아미노-4,6-디클로로-[1,3,5]트리아진("7")을 도입하여 화합물 "8"를 제조하기 위하여, NMP 에서 화합물 e (5 equiv) 및 DIEA (5 equiv)을 비드에 처리하여 60℃에서 밤새 반응시켰다. 위에서 제조된 화합물("8")의 클로라이드 자리에 다양한 아민기(R2'R2"NH)를 대체시켰다. 마지막으로, TFA(trifluoroacetic acid)를 가하여 절단 반응을 수행하여, 세 개의 치환기로 기능화된 트리아진-피페라진-트리아진 화합물 "9"을 제조하였다.
위 고체상 합성법으로 합성된 화합물들의 순도(purity)와 특징(identity)을 LC-MS로 확인하였고, 최종물의 평균 순도가 92% 이상으로 나타나, 위 고체상 합성법의 효율을 확인할 수 있었다. 이후 역상 HPLC로 화합물을 정제하고 1H-NMR, 13C-NMR 및 HRMS(high-resolution mass spectrometer)로 화합물을 동정하였다.
제조예 2. 화학식 4의 화합물의 제조
6-(4-(4- amino -6-(( benzo [ d ][1,3]dioxol-5- ylmethyl ) amino )-1,3,5- triazin -2-yl)-2-benzylpiperazin-1-yl)- N 2 -benzyl- N 4 -ethyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine?TFA.
Yield: 25.8 mg (43 %) from 100 mg of resin. 1H-NMR (500 MHz, methanol-d 4) δ 1.26 (m, 3H) 2.61-2.77 (m, 2H), 3.05-3.15 (m, 2H), 3.31-3.35 (m, 3H), 4.31 (m, 1H), 4.45-4.65 (m, 6H), 5.04 (m, 1H), 5.71 (d, J = 36.0 Hz, 1H), 5.83 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 6.65-6.81 (m, 3H), 6.98-7.08 (m, 5H), 7.19 (m, 1H), 7.25-7.27 (m, 4H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ 14.4, 35.9, 39.1, 43.4, 44.3, 44.5, 44.7, 53.2, 53.5, 55.3, 101.2, 107.9, 108.4, 120.8, 121.1, 127.0, 127.5, 127.7, 128.5, 128.8, 129.2, 130.7, 136.9, 137.2, 147.2, 147.9, 155.7, 156.2, 157.5, 162.6; HRMS (ESI) calculated for C34H39N12O2 [M + H]+ : 647.3319; Found: 647.3319.
제조예 2. 화학식 5의 화합물의 제조
6-(4-(4- amino -6-(( cyclopropylmethyl )( propyl ) amino )-1,3,5- triazin -2- yl )-2- benzylpiperazin -1- yl )- N 2 -( benzo [ d ][1,3]dioxol-5- ylmethyl )- N 4 - ethyl -1,3,5-triazine-2,4-diamine?T FA .
Yield: 18.8 mg (31 %) from 100 mg of resin. 1H-NMR (500 MHz, methanol-d 4) δ 0.40 (m, 2H), 0.62 (m, 2H), 1.00 (m, 3H), 1.12 (br s, 1H), 1.25 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.72 (m, 2H), 2.91-3.00 (m, 2H), 3.33 (m, 2H), 3.49-3.56 (m, 7H), 4.46-4.61 (m, 4H), 4.73 (m, 1H), 5.19 (m, 1H), 5.91 (s, 1H), 5.94 (s, 1H). 6.76-6.88 (m, 3H), 7.13 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.20-7.25 (m, 4H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ 3.7, 9.3, 9.6, 10.7, 11.5, 14.4, 20.9, 35.9, 39.1, 43.4, 44.3, 49.4, 50.1, 51.8, 52.9, 55.4, 101.2, 107.6, 108.3, 120.4, 121.1, 127.1, 128.6, 129.2, 130.0, 130.8, 131.0, 136.9, 147.2, 148.1, 155.6, 156.0, 158.2, 162.6; HRMS (ESI) calculated for C34H45N12O2 [M + H]+: 653.3788; Found: 653.3787.
제조예 3. 화학식 6의 화합물의 제조
4-(2-((4-(4-(4- amino -6-((4- phenoxyphenyl ) amino )-1,3,5- triazin -2- yl )-2-benzylpiperazin-1-yl)-6-(ethylamino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethyl)phenol?T FA .
Yield: 27.0 mg (41 %) from 100 mg of resin. 1H-NMR (500 MHz, methanol-d 4) δ 1.25 (m, 3H), 2.82 (m, 2H), 2.91(br s, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.49 (m, 3H), 3.66 (m, 2H), 4.57-4.68 (m, 3H), 5.13 (m, 1H), 6.73 (m, 2H), 6.90 (br s, 1H), 7.03-7.07 (m, 6H), 7.17-7.24 (m, 5H) 7.41 (m, 3H), 7.58 (br s, 1H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 14.6, 14.8, 34.2, 35.7, 36.0, 42.5, 43.2, 44.1, 53.9, 115.6, 118.7, 119.5, 122.9, 123.7, 126.7, 128.7, 129.2, 129.6, 130.0, 130.1, 130.5, 138.2, 152.5, 155.1, 155.4, 156.3, 157.6, 162.1, 163.8; HRMS (ESI) calculated for C39H43N12O2 [M + H]+ : 711.3632; Found: 711.3613.
제조예 4. 화학식 7의 화합물의 제조
6-(4-(4- amino -6-(4- phenoxyphenylamino )-1,3,5- triazin -2- yl )-2- benzylpiperazin -1- yl )- N 2 -( benzo [ d ][1,3]dioxol-5- ylmethyl )- N 4 - ethyl -1,3,5-triazine-2,4-diamine?T FA .
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 1.28 (m, 3H) 2.80-2.86 (m, 2H), 3.14-3.22 (m, 2H), 3.36-3.43 (m, 1H), 3.48-3.53 (m, 2H), 4.50-4.56 (m, 2H), 4.63-4.77 (m, 3H), 5.12 (bs, 1H), 5.93-5.98 (m, 2H), 6.76-6.89 (m, 4H), 7.01-7.20 (m, 7H), 7.26-7.29 (m, 1H), 7.38-7.41 (m, 3H), 7.58 (dd, J = 3.0, 9.0 Hz, 1H), 7.76-7.82 (m, 1H), 8.05-8.16 (m, 1H), 10.58 (m, 1H), 14.59 (bs, 1H); 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ 14.3, 35.9, 36.2, 39.1, 39.2, 43.6, 44.2, 44.5, 53.4, 101.2, 107.6, 108.4, 118.9, 120.4, 121.0, 123.2, 123.7, 127.1, 128.6, 129.0, 129.3, 129.8, 131.3, 136.7, 147.2, 148.1, 154.2, 154.7, 155.8, 156.2, 157.0, 157.6, 162.5; HRMS (ESI) calculated for C39H41N12O3 [M + H]+ : 725.3425; Found: 725.3427.
제조예 5. 화학식 8의 화합물의 제조
6-(4-(4- amino -6-(4- phenoxyphenylamino )-1,3,5- triazin -2- yl )-2- benzylpiperazin -1- yl )- N 2 -(3,4- dimethoxybenzyl )- N 4 - ethyl -1,3,5- triazine -2,4-diamine?T FA ( Q2 ).
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 1.28 (m, 3H) 2.81-2.86 (m, 2H), 3.16-3.22 (m, 2H), 3.36-3.43 (m, 1H), 3.47-3.51 (m, 2H), 3.80-3.91 (m, 5H), 4.55-4.59 (m, 2H), 4.65-4.69 (m, 2H), 4.74-4.76 (m, 1H), 5.12 (bs, 1H), 6.81-6.89 (m, 4H), 7.00-7.21 (m, 7H), 7.26-7.29 (m, 1H), 7.38-7.41 (m, 3H), 7.58 (dd, J = 3.0, 9.0 Hz, 1H), 7.69-7.77 (m, 1H), 8.23-8.30 (m, 1H), 10.58 (m, 1H), 14.31 (bs, 1H); 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ 14.3, 35.9, 36.3, 39.2, 43.6, 44.3, 44.5, 53.4, 55.9, 110.6, 110.1, 111.3, 118.9, 119.1, 119.4, 119.9, 123.2, 123.6, 127.1, 128.6, 129.0, 129.3, 129.9, 131.3, 136.7, 148.7, 149.3, 154.2, 154.7, 155.7, 156.0, 157.0, 157.5, 162.5; HRMS (ESI) calculated for C40H40N12O3 [M + H]+ : 741.3748; Found: 741.3741.
제조예 6. 9- nc 의 화합물의 제조
6-(4-(4- amino -6-( ethylamino )-1,3,5- triazin -2- yl ) piperazin -1- yl )- N 2 , N 4 -diethyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine?T FA.
Yield: 18.0 mg (50 %) from 100 mg of resin. 1H-NMR (500 MHz, methanol-d 4) δ 1.14 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 3.38 (m, 6H), 3.89 (br s, 8H); 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 14.6, 35.7, 43.4, 155.8, 157.4, 162.1; HRMS (ESI) calculated for C16H29N12 [M + H]+: 389.2638; Found: 389.2631.
제조예 II . 페닐 -피페라진- 트리아진 골격의 화합물의 합성
도 15에 나타난 바와 같이, Rink amide MBHA 레진(100 mg, 93 μmol)을 DMF (2 mL) 에서 1시간 처리하고, DMF (2 X 10 min) 에서 20% 피페리딘을 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 특별한 언급이 없는 한 각 반응 단계의 마지막 과정에서 레진을 DMF (3 X), MeOH (2 X), CH2Cl2 (2 X) 및 DMF (3 X)로 완전히 세척하였다. DMF (1.5 mL) 내의 4-플루오로-3-니트로벤조산 (70 mg, 378 μmol), HATU (142 mg, 378 μmol) 및 DIEA (130 μL, 756 μmol)의 용액에 레진을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 반응시켰다. 노실로 보호된 피페라진(Nosyl-protected piperazin)(4 equiv)을 레진에 도입시키기 위하여 DMF 에서 DIEA (10 equiv)을 사용하여 95℃에서 12시간 반응시켜, 레진에 결합된 피페라진 유도체 "4"를 생성하였다. 유도체 "4"의 노실기를 제거하기 위해 DMF 에서 2-mercaptoethanol (20 equiv) 및 DBU (10 equiv)을 처리하여 실온에서 반응시켰다. 다음으로, 2-ethylamino-4,6-dichloro-[1,3,5]triazine(10 equiv)을 레진에 커플링시키기 위하여, THF 에서 DIEA (5 equiv)을 사용하여 60℃에서 3시간 반응시켜, 화합물 "6"을 생성하였다. 화합물 "6" 의 클로라이드를 다양한 아민기(R3NH2, 5 equiv)로 치환시키기 위하여, NMP에서 DIEA (10 equiv)의 존재 하에 80℃에서 밤새 반응시켜, 화합물 "7"을 생성하였다. DMF 에서 SnCl2ㆍ2H2O (60 equiv) 용액을 레진에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 교반하였다. 레진이 결합된 아민("8")을 건조된 CH(OMe)3:DMF = 9:1 내 알데히드(10 equiv) 용액 0.4M 및 메탄올 내 아세트산 용액 20% (v/v)을 처리하여 50℃에서 18시간 반응시켰다. 이어서, THF 내 NaCNBH3 (50 equiv) 용액 5M 을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 6시간 교반하여, 알킬화된 산물을 제조하였다. 지방족 알데히드를 사용하는 경우에는, 벤조트리아졸 (100 equiv)을 첨가하여 디알킬화(dialkylated)된 부산물이 생성되지 않도록 하였다. 마지막으로, TFA를 가하여 절단 반응을 수행하여, 세 개의 치환기로 기능화된 페닐-피페라진-트리아진 유도체를 제조하였다.
위 고체상 합성법으로 합성된 화합물들의 순도(purity)와 특징(identity)을 LC-MS로 확인한 결과, 최종물의 평균 순도가 90% 이상으로 나타나, 위 고체상 합성법의 효율을 확인할 수 있었다. 이후 역상 HPLC로 화합물을 정제하고 1H-NMR, 13C-NMR 및 HRMS(high-resolution mass spectrometer)로 화합물을 동정하였다.
제조예 7. PPT -3 화합물의 제조
2-{4-(2- aminoethyl -4- carbamoylphenyl )-2- isobutyl - piperazine }-4-aminoethyl-6-aminobenzyl-[1,3,5]triazine ( PPT -3). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.92 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 0.97 (dd, J = 6.3, 9.3 Hz, 3H), 1.20 (q, J = 7.2 Hz, 3H), 1.33 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 1.55-1.62 (m, 1H), 1.76-1.91 (m, 2H), 2.60-2.84 (m, 2H), 3.05-3.32 (m, 5H), 3.42- 3.48 (m, 2H), 4.61 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 4.84 (t, , J = 14.7 Hz, 1H), 4.98-5.03 (m, 1H), 6.93 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.07-7.13 (m, 2H), 7.24-7.37 (m, 4H), 7.60-7.62 (m, 1H), 7.97-8.00 (m, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 16.1, 16.2, 16.6, 24.4, 24.5, 24.9, 26.7, 37.7, 40.4, 40.7, 41.8, 46.0, 46.1, 46.3, 52.0, 52.7, 55.9, 111,4, 117.9, 121.1, 129.0, 129.5, 129.8, 132.1, 139.2, 143.7, 145.0, 157.4, 157.9, 164.1, 173.0. HRMS (FAB) calculated for C29H42N9O [M+H]+ 532.3512, found: 532.3509.
제조예 8. PPT -5 화합물의 제조
2-{4-(2- aminoethyl -4- carbamoylphenyl )-2- benzyl - piperazine }-4-aminoethyl-6-aminoisopropyl-[1,3,5]triazine ( PPT -5). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.20-1.30 (m, 6H), 1.36 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 2.69-2.78 (m, 1H), 2.83 (dd, J = 3.9, 12.0 Hz, 1H), 3.11-3.54 (m, 9H), 4.07-4.20 (m, 1H), 4.79-4.86 (m, 1H), 5.17 (brs, 1H), 6.94 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz, 1H), 7.16-7.43 (m, 6H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 16.1, 16.3, 16.8, 24.0, 24.2, 37.6, 40.2, 42.2, 45.1, 53.1, 54.6, 55.2, 111.4, 117.7, 121.2, 130.4, 130.9, 131.0, 131.6, 139.7, 143.5, 145.1, 156.6, 157.3, 164.3, 164.6, 172.7. HRMS (FAB) calculated for C28H39N9O [M+H]+ 518.3356, found: 518.3355.
제조예 9. PPT -15 화합물의 제조
2-{4-(2- aminoisobutyl -4- carbamoylphenyl )-2- isobutyl - piperazine }-4-aminoethyl-6-aminobenzyl-[1,3,5]triazine ( PPT -15). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.89 (dd, J = 3, 6.6 Hz, 3H), 0.98 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.03 (dd, J = 3, 6.6 Hz, 6H), 1.20-1.26 (m, 3H), 1.50-1.57 (m, 1H), 1.67-1.74 (m, 1H), 1.92-2.04 (m, 2H), 2.67-2.83 (m, 2H), 2.98-3.12 (m, 4H), 3.31-3.49 (m, 3H), 4.58-4.62 (m, 2H), 4.78 (t, J = 15.0 Hz, 1H), 5.02-5.05 (m, 1H), 6.93 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.06- 7.11 (m, 2H), 7.28-7.33 (m, 2H), 7.60-7.63 (m, 1H), 8.01-8.03 (m, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 12.3, 12.4, 18.7, 20.8, 21.0, 22.8, 26.2, 33.9, 37.0, 38.0, 42.4, 42.6, 48.1, 48.2, 49.2, 49.8, 52.2, 107.6, 113.9, 117.4, 125.3, 125.7, 126.8, 127.1, 135.2, 135.4, 140.1, 141.5, 153.5, 153.8, 160.1, 169.8. HRMS (FAB) calculated for C31H46N9O [M+H]+ 560.3825, found: 560.3827.
제조예 10. PPT -19 화합물의 제조
2-{4-(2- aminoisobutyl -4- carbamoylphenyl )-2- benzyl - piperazine }-4-aminoethyl-6-aminobenzyl-[1,3,5]triazine ( PPT -19). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.06-1.08 (m, 6H), 1.20-1.26 (m, 3H), 1.96-2.05 (m, 1H), 2.57-2.68 (m, 2H), 2.84-2.94 (m, 1H), 3.06-3.23 (m, 5H), 3.35-3.49 (m, 3H), 4.50-4.65 (m, 2H), 4.78 (t, J = 15.0 Hz, 1H), 5.10-5.16 (m, 1H), 6.90 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz, 2H), 6.98-7.04 (m, 2H), 7.11-7.34 (m, 7H), 7.57-7.65 (m, 1H), 7.96-8.03 (m, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 13.9, 14.0, 20.2, 27.8, 35.4, 35.6, 40.1, 44.0, 51.1, 51.9, 109.0, 115.0, 118.8, 126.4, 127.1, 128.2, 128.3, 128.7, 129.8, 137.3, 140.8, 143.1, 155.6, 162.1, 169.9. HRMS (FAB) calculated for C34H43N9O [M+H]+ 594.3669, found: 594.3665.
제조예 11. PPT -23 화합물의 제조
2-{4-(2- aminoisobutyl -4- carbamoylphenyl )-2- methyl - piperazine }-4-aminoethyl-6-aminobenzyl-[1,3,5]triazine ( PPT -23). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.05 (q, J = 3.3 Hz, 6H), 1.26 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.38 (dd, J = 6.9, 25.5 Hz, 3H), 1.95-2.07 (m, 1H), 2.74-2.85 (m, 2H), 2.97-3.18 (m, 4H), 3.32-3.50 (m, 3H), 4.52-4.63 (m, 3H), 4.88-5.02 (m, 1H), 6.95 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.98-7.09 (m, 2H), 7.28 (d, J = 2.7 Hz, 3H), 7.67-7.74 (m, 1H), 8.12-8.21 (m, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 16.1, 17.3, 22.5, 30.1, 37.7, 41.6, 46.4, 49.4, 52.8, 53.5, 57.3, 111.2, 117.3, 120.8, 129.4, 130.5, 131.8, 143.3, 145.2, 172.1. HRMS (FAB) calculated for C28H40N9O [M+H]+ 518.3356, found: 518.3353.
제조예 12. PPT -28 화합물의 제조
2-{4-(2- aminobenzyl -4- carbamoylphenyl )-2- isobutyl - piperazine }-4-aminoethyl-6-amino-2-naphthylmethyl-[1,3,5]triazine ( PPT -28). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.61 (dd, J = 6.0, 14.7 Hz, 3H), 0.78 (dd, J = 6.0, 14.7 Hz, 3H), 1.18-1.26 (m, 3H), 1.30-1.44 (m, 2H), 1.72-1.81 (m, 1H), 2.60-2.86 (m, 2H), 3.01-3.49 (m, 5H), 4.27-4.43 (m, 2H), 4.68-5.07 (m, 4H), 6.93 (dd, J =4.2, 7.8 Hz, 1H), 7.10-7.14 (m, 2H), 7.31-8.04 (m, 12H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 13.8, 22.1, 24.3, 35.5, 38.2, 38.3, 39.5, 41.3, 48.1, 49.7, 49.8, 50.5, 53.6, 53.9, 109.2, 116.1, 117.2, 118.9, 122.4, 122.6, 124.9, 125.6, 126.1, 127.4, 128.1, 128.5, 128.7, 130.6, 130.8, 131.8, 132.1, 133.5, 138.2, 141.7, 142.6, 155.1, 155.3, 155.5, 161.6, 161.7, 162.1, 171.0. HRMS (FAB) calculated for C38H46N9O [M+H]+ 644.3825, found: 644.3827.
제조예 13. PPT -31 화합물의 제조
2-{4-(2- aminobenzyl -4- carbamoylphenyl )-2- benzyl - piperazine }-4-aminoethyl-6-aminobenzyl-[1,3,5]triazine ( PPT -31). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.18-1.25 (m, 3H), 2.63-3.14 (m, 6H), 3.22-3.31 (m, 1H), 3.36-3.45 (m, 2H), 4.45 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 4.53-4.64 (m, 2H), 4.76 (t, J =13.8 Hz, 1H), 5.06-5.12 (m, 1H), 6.91-7.37 (m, 16H), 7.57-7.68 (m, 1H), 7.96-8.03 (m, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 14.4, 35.8, 40.4, 44.1, 44.2, 44.4, 48.1, 51.2, 51.3, 52.3, 52.4, 53.2, 53.3, 109.7, 116.3,119.4, 126.7, 127.3, 127.6, 128.6, 128.9, 129.0, 130.0, 137.6, 138.9, 141.5, 143.0, 155.5, 156.0, 162.4, 170.4. HRMS (FAB) calculated for C37H42N9O [M+H]+ 628.3512, found: 628.3510.
제조예 14. PPT -36 화합물의 제조
2-{4-(2- aminobenzyl -4- carbamoylphenyl )-2- methyl - piperazine }-4-aminoethyl-6-amino-2-naphthylmethyl-[1,3,5]triazine ( PPT -36). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.08-1.24 (m, 6H), 2.65-2.84 (m, 2H), 3.03-3.29 (m, 3H), 3.40 (quin, J = 6.8 Hz, 2H), 4.28 (q, J = 13.5 Hz, 2H), 4.65 (t, J =13.5 Hz, 1H), 4.87-5.10 (m, 3H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.09-7.12 (m, 2H), 7.30-7.52 (m, 8H), 7.76-7.87 (m, 1H), 8.01-8.17 (m, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 16.0, 17.1, 37.8, 44.1, 49.4, 50.3, 52.6, 57.1, 111.4, 118.5, 120.9, 124.8, 127.2, 127.8, 128.0, 128.3, 129.5, 129.6, 130.4, 130.7, 130.8, 133.0, 134.4, 135.7, 140.4, 140.8, 144.1, 144.6, 157.6, 163.5, 163.6, 164.0, 173.5 . HRMS (FAB) calculated for C35H40N9O [M+H]+ 602.3356, found: 602.3358.

Claims (25)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염:
    [화학식 2]
    Figure 112021068884472-pat00119

    상기 식에서,
    R1, R2, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고,
    이 때, R1 및 R4의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, -(CH2)rNH2, -(CH2)rN(H)C(=NH)NH2, -(CH2)rC(=O)OH, 또는 -(CH2)rOH 이고, r은 1 내지 6의 정수이고,
    R2 및 R5 의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, (CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1-4 알콕시, 하이드록실 또는 페녹시로 치환될 수 있고, 및
    R3 은 (C1-C6) 알킬 또는 벤질인,
    화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식에서,
    R1, R2, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고,
    이 때, R1 및 R4의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소 또는 (C1-C6) 알킬이고,
    R2 및 R5 의 경우 R8 및 R9 는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬, -(CH2)m-페닐, -(CH2)m-페녹시페닐, -(CH2)m-벤조다이옥솔, -(CH2)m-디알콕시벤젠, -(CH2)m-다이메톡시페닐, -(CH2)m-하이드록시페닐, 또는 -(CH2)m-(C3-C6) 사이클로알킬이고, 및
    R3 은 (C1-C6) 알킬 또는 벤질인,
    화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
  6. 제4항에 있어서, 상기 R1, R2, R4 및 R5는 각각 독립적으로 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염:
    Figure 112021068884472-pat00079

    Figure 112021068884472-pat00080

  7. 제4항에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물은 (R)- 또는 (S)- 거울상 이성질체로 나타나는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
  8. 제4항에 있어서, 상기 R3 은 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염:
    Figure 112021068884472-pat00081

  9. 제4항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 4 내지 화학식 8 의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
    [화학식 4]
    Figure 112021068884472-pat00082

    [화학식 5]
    Figure 112021068884472-pat00083

    [화학식 6]
    Figure 112021068884472-pat00084

    [화학식 7]
    Figure 112021068884472-pat00085

    [화학식 8]
    Figure 112021068884472-pat00086

  10. 제4항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 9로 표시되는 것인 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
    [화학식 9]
    Figure 112021068884472-pat00087

    상기 식에서,
    R1 및 R4 는 각각 독립적으로 -NR8R9 또는 -OR10이고,
    이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1-8 알킬, C2-6 알케닐, C1-4 알콕시, C3-6 사이클로알킬, 할로겐, C1-4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, -N-(C3-C10) 아릴, -N-(C3-C10) 헤테로아릴, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
    상기 R8 및 R9 는 이들과 결합하는 C, N 또는 O 원자와 함께 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있고, 및
    R10 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)n-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)n-(C3-C10) 아릴, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로아릴로서, n은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1-8 알킬, C1-4 알콕시, C3-6 사이클로알킬, 할로겐, C1-4 할로알킬, 카르복시, 하이드록실, 아미노, 옥소, 페닐 및 페녹시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있다.
  11. 제10항에 있어서, 상기 식에서,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고,
    이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, -(CH2)rNH2, -(CH2)rN(H)C(=NH)NH2, -(CH2)rC(=O)OH, 또는 -(CH2)rOH 이고, 및
    r은 1 내지 6의 정수인,
    화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
  12. 하기 화학식 3으로 표시되는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염:
    [화학식 3]
    Figure 112021068884472-pat00088

    상기 식에서,
    R1 및 R2 는 각각 독립적으로 -NR8R9 또는 -OR10이고,
    이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1-8 알킬, C2-6 알케닐, C1-4 알콕시, C3-6 사이클로알킬, 할로겐, C1-4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, -N-(C3-C10) 아릴, -N-(C3-C10) 헤테로아릴, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
    상기 R8 및 R9 는 이들과 결합하는 C, N 또는 O 원자와 함께 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있고,
    R10 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)n-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)n-(C3-C10) 아릴, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로아릴로서, n은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1-8 알킬, C1-4 알콕시, C3-6 사이클로알킬, 할로겐, C1-4 할로알킬, 카르복시, 하이드록실, 아미노, 옥소, 페닐 및 페녹시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
    R3은 (C1-C6) 알킬 또는 -(CH2)p-(C3-C10) 아릴이고, p 는 0 내지 3의 정수이고
    R6은 -NR11이고, 이 때, R11 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)q-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)q-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)q-(C3-C10) 아릴, -(CH2)q-(C3-C10) 헤테로아릴로서, q 는 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1-8 알킬, C2-6 알케닐, C1-4 알콕시, C3-6 사이클로알킬, 할로겐, C1-4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
    상기 R11 은 이와 결합하는 C 또는 O 원자와 함께 결합하여 고리를 형성할 수 있고, 및
    R7 은 -NH2 이다.
  13. 제12항에 있어서, 상기 식에서
    R1 및 R2 는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고, 이 때, R8 는 수소이고, R9 는 수소, C1-C6 알킬 또는 -(CH2)m-(C3-C10)아릴이고, m은 0 내지 3의 정수이고,
    R3 은 (C1-C6) 알킬 또는 벤질이고,
    R6는 -NR11이고, 이 때, R11 은 (C1-C6) 알킬 또는 -(CH2)q-(C3-C10) 아릴이고, q 는 0 내지 3의 정수이고, 및
    R7 은 -NH2 인,
    화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
  14. 제12항에 있어서, 상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염:
    Figure 112014066135921-pat00089

    Figure 112014066135921-pat00090

  15. 제12항에 있어서, 상기 화학식 3의 화합물은 R3 에 의해 (R)- 또는 (S)- 거울상 이성질체로 나타나는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
  16. 제12항에 있어서, 상기 R3 은 각각 독립적으로 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염:
    Figure 112014066135921-pat00091

  17. 제12항에 있어서, 상기 R6 은 각각 독립적으로 하기 구조식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염:
    Figure 112014066135921-pat00092
  18. 제12항에 있어서, 상기 식에서, R1, R2, R3, R6 및 R7 는 각각 다음으로 표시되는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염:
    Figure 112014066135921-pat00093

  19. 제12항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 10으로 표시되는 것인, 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
    [화학식 10]
    Figure 112014066135921-pat00094

  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 하기 화학식 4 내지 화학식 6, 화학식 9 및 화학식 10의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 4]
    Figure 112014066135921-pat00095

    [화학식 5]
    Figure 112014066135921-pat00096

    [화학식 6]
    Figure 112014066135921-pat00097

    [화학식 9]
    Figure 112014066135921-pat00098

    상기 식에서,
    R1 및 R4 는 각각 독립적으로 -NR8R9 또는 -OR10이고,
    이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)m-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)m-(C4-C10) 사이클로알케닐, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)m-(C3-C10) 아릴, -(CH2)m-(C3-C10) 헤테로아릴로서, m은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C2 -6 알케닐, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, C3-C10 헤테로아릴, C3-C10 헤테로사이클릭, -N-(C3-C10) 아릴, -N-(C3-C10) 헤테로아릴, 카르복시, 구아니딜, 하이드록실, 니트로, 아미노, 페닐, 페녹시, 옥소 및 술폰아미드로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있고,
    상기 R8 및 R9 는 이들과 결합하는 C, N 또는 O 원자와 함께 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있고, 및
    R10 은 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, -(CH2)n-(C3-C10) 사이클로알킬, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로사이클, -(CH2)n-(C3-C10) 아릴, -(CH2)n-(C3-C10) 헤테로아릴로서, n은 0 내지 3의 정수이고, 상기 각각은 C1 -8 알킬, C1 -4 알콕시, C3 -6 사이클로알킬, 할로겐, C1 -4 할로알킬, 카르복시, 하이드록실, 아미노, 옥소, 페닐 및 페녹시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체로 치환될 수 있다.
    [화학식 10]
    Figure 112014066135921-pat00099

  24. 제23항에 있어서, 상기 화학식 9에서,
    R1 및 R4는 각각 독립적으로 -NR8R9 이고,
    이 때, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, -(CH2)rNH2, -(CH2)rN(H)C(=NH)NH2, -(CH2)rC(=O)OH, 또는 -(CH2)rOH 이고, 및
    r은 1 내지 6의 정수인,
    약학 조성물.
  25. 하기 화학식 7 및 화학식 8의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 7]
    Figure 112014066135921-pat00100

    [화학식 8]
    Figure 112014066135921-pat00101

KR1020140088669A 2014-07-14 2014-07-14 트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 및 이의 제조방법 KR102310128B1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140088669A KR102310128B1 (ko) 2014-07-14 2014-07-14 트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 및 이의 제조방법
PCT/KR2014/012746 WO2016010210A1 (ko) 2014-07-14 2014-12-23 트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 및 이의 제조방법
US15/326,422 US10131650B2 (en) 2014-07-14 2014-12-23 Alpha-helix analog having triazine-piperazine backbone and method for preparing same
JP2017502630A JP6349456B2 (ja) 2014-07-14 2014-12-23 トリアジン−ピペラジン骨格を有するアルファ−ヘリックス類似体およびその製造方法
CN201480081313.2A CN106661003B (zh) 2014-07-14 2014-12-23 具有三嗪-哌嗪主链的α-螺旋类似物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140088669A KR102310128B1 (ko) 2014-07-14 2014-07-14 트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 및 이의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160008436A KR20160008436A (ko) 2016-01-22
KR102310128B1 true KR102310128B1 (ko) 2021-10-06

Family

ID=55078679

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140088669A KR102310128B1 (ko) 2014-07-14 2014-07-14 트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 및 이의 제조방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10131650B2 (ko)
JP (1) JP6349456B2 (ko)
KR (1) KR102310128B1 (ko)
CN (1) CN106661003B (ko)
WO (1) WO2016010210A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220067278A (ko) 2020-11-17 2022-05-24 (주)플래닛나인 어묵탕 제조방법
WO2024073502A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Accutar Biotechnology Inc. Heterocyclic compounds as e3 ligase inhibitors

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58217554A (ja) * 1982-06-11 1983-12-17 Adeka Argus Chem Co Ltd 安定化合成樹脂組成物
EP0189877A3 (en) * 1985-01-29 1987-05-13 The B.F. GOODRICH Company Hindered 2-keto-1,4-diazacycloalkane oligomers containing triazine rings or ester groups and compositions stabilized thereby
AU627615B2 (en) 1989-08-28 1992-08-27 Ministero Dell Universita E Della Ricerca Scientifica E Tecnologica Self-extinguishing polymeric compositions
AU2002305450A1 (en) 2001-05-08 2002-11-18 Yale University Proteomimetic compounds and methods
CN1629157A (zh) * 2003-12-19 2005-06-22 中国科学院上海药物研究所 哌嗪三嗪类化合物、其制备方法及药物组合物
WO2010011864A2 (en) * 2008-07-23 2010-01-28 The Scripps Research Institute Alpha-helix mimetic with functionalized pyridazine
US20100113466A1 (en) * 2008-10-08 2010-05-06 The Scripps Research Institute Oxazole-pyridazine-oxazole alpha-helix mimetic
WO2010083501A2 (en) 2009-01-16 2010-07-22 University Of South Florida Alpha-helix mimetic using a 2,5-oligopyrimidine scaffold
KR101779137B1 (ko) 2009-01-23 2017-09-18 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 폴리(ａｄｐ-리보스)폴리머라제(ｐａｒｐ) 억제제

Also Published As

Publication number Publication date
JP6349456B2 (ja) 2018-06-27
CN106661003A (zh) 2017-05-10
WO2016010210A1 (ko) 2016-01-21
CN106661003B (zh) 2020-05-19
KR20160008436A (ko) 2016-01-22
JP2017521447A (ja) 2017-08-03
US10131650B2 (en) 2018-11-20
US20170204086A1 (en) 2017-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI473801B (zh) 用於治療癌症及免疫與自體免疫疾病之細胞凋亡誘導劑
JP5230865B2 (ja) Ｉａｐ結合性化合物
TWI432212B (zh) Ｉａｐ抑制劑
KR20200013058A (ko) Ssao 억제제
CN104755484B (zh) Bace抑制剂
US20200140489A1 (en) Peptide-Based Quorum Sensing Inhibitors for the Attenuation of Virulence in Staphylococcus Aureus
EA019420B1 (ru) Пирролидиновые ингибиторы иап (ингибиторов апоптоза)
BRPI0719481A2 (pt) " composto, método de indução de apoptose em uma célula, de sensibilização de uma célula, para inibir a ligação de uma proteína iap a uma proteína caspase, para tratar uma doença ou condição associada com a superexpressão de uma proteína iap e para tratar câncer"
JP5688826B2 (ja) カルパイン活性検出蛍光プローブ
CN105611930B (zh) 作为非凋亡调控性细胞死亡抑制剂的螺环喹喔啉衍生物
WO2022119756A9 (en) Compositions and methods for inhibiting m pro protease activity and for preventing and treating sars-cov-2 infection
NZ590500A (en) Azaindole inhibitors of iap
Doan et al. Solid‐phase synthesis of C‐terminal azapeptides
KR102310128B1 (ko) 트리아진-피페라진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 및 이의 제조방법
Wang et al. Design, synthesis and antimycobacterial activity of less lipophilic Q203 derivatives containing alkaline fused ring moieties
CA3146439A1 (en) 1-(6-(methoxy)pyridazin-3-yl)cyclopropane-1-carboxamide derivatives as autotaxin (atx) modulators for the treatment of inflammatory airway diseases
Corredor et al. Optimizing the control of apoptosis by amide/triazole isosteric substitution in a constrained peptoid
CN113620863A (zh) 新的哌嗪和哌啶衍生物、它们的合成及其用途
CA3145868A1 (en) N-methyl, n-(6-(methoxy)pyridazin-3-yl) amine derivatives as autotaxi n (atx) modulators for the treatment of inflammatory airway or fibrotic diseases
JP2009503027A (ja) アルツハイマー病ｉｉの治療のための置換エタン−１，２−ジアミン
CN111556749A (zh) 靶向凋亡抑制蛋白的新型药物
CA3198096A1 (en) Aryl derivatives for treating trpm3 mediated disorders
Wang et al. Structure–activity relationships of tetrahydrocarbazole derivatives as antifungal lead compounds
WO2022266368A1 (en) Protease inhibitors and methods of use
KR20230133396A (ko) Rip2 키나아제 억제제로서의 헤테로아릴 화합물, 이의 조성물 및 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant