KR102307767B1 - 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브 및 이의 제조 방법 - Google Patents
망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102307767B1 KR102307767B1 KR1020190027284A KR20190027284A KR102307767B1 KR 102307767 B1 KR102307767 B1 KR 102307767B1 KR 1020190027284 A KR1020190027284 A KR 1020190027284A KR 20190027284 A KR20190027284 A KR 20190027284A KR 102307767 B1 KR102307767 B1 KR 102307767B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- integrin
- rgd peptide
- choroidal neovascularization
- cyclic rgd
- fitc
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 108010045325 cyclic arginine-glycine-aspartic acid peptide Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010040765 Integrin alphaV Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 14
- NVHPXYIRNJFKTE-UHFFFAOYSA-N 2-[8-(4-aminobutyl)-5-benzyl-11-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-3,6,9,12,15-pentaoxo-1,4,7,10,13-pentazacyclopentadec-2-yl]acetic acid Chemical compound N1C(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 NVHPXYIRNJFKTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- -1 pacific orange Chemical compound 0.000 claims description 10
- 238000002583 angiography Methods 0.000 claims description 9
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 claims description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N cascade blue Chemical compound C=1C2=CC=CC=C2C(NCC)=CC=1C(C=1C=CC(=CC=1)N(CC)CC)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 claims description 3
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 101800001442 Peptide pr Proteins 0.000 claims description 2
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 abstract description 53
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 abstract description 53
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 abstract description 8
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 23
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 23
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 19
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 17
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 7
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 5
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 5
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 5
- 238000013534 fluorescein angiography Methods 0.000 description 5
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 5
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 210000001775 bruch membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 208000037111 Retinal Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229960002143 fluorescein Drugs 0.000 description 2
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000012014 optical coherence tomography Methods 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 229930182832 D-phenylalanine Natural products 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010047852 Integrin alphaVbeta3 Proteins 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024080 Myopic macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 208000007135 Retinal Neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N Tropicamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CO)C(=O)N(CC)CC1=CC=NC=C1 BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001497 fibrovascular Effects 0.000 description 1
- 229940020947 fluorescein sodium Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 238000013532 laser treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- SONNWYBIRXJNDC-VIFPVBQESA-N phenylephrine Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=CC(O)=C1 SONNWYBIRXJNDC-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960001802 phenylephrine Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 description 1
- 210000001210 retinal vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960004791 tropicamide Drugs 0.000 description 1
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 description 1
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
- A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/16—Ophthalmology
- G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy
Abstract
망막맥락막 혈관신생의 구조 변화가 일어나기 전에 망막맥락막 혈관신생의 발생과 재발을 예측함으로써 망막맥락막 혈관신생 또는 나이관련 황반변성의 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 인테그린 표적화 프로브 및 이의 제조방법이 제공된다. 이 인테그린 표적화 프로브는, 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브로서, NH2-고리형 RGD 펩타이드 전구체를 형광물질에 컨쥬게이트하여 완성된 형광물질 표지 고리형 RGD 펩타이드로 이루어질 수 있다.
Description
본 발명은 인테그린 표적화 프로브 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
나이관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD)은 선진국 노인들의 실명의 주요 원인으로 보고되고 있다. 특히 습성 나이관련 황반변성의 주요 발병 원인으로 알려진 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization, CNV)은 이 질환에서 시각 장애의 주요 원인 중 하나이다. 구조적으로, 맥락막 혈관신생은 망막 출혈, 광 수용체 변성 및 황반 흉터 형성을 유발한다.
하지만, 맥락막 혈관신생의 발달에 대한 정확한 메커니즘이나 혈관신생을 매개하는 주요 분자에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 나아가, 나이관련 황반변성에 대해 현재 실시되고 있는 임상 이미징 방법으로 형광혈관조영술(fluorescein angiography) 및 광 간섭성 단층촬영(optical coherence tomography, OCT)이 있는데, 이들은 질병 상태나 이미 진행된 맥락막 혈관신생에 대한 구조적인 정보만을 제공한다. 따라서 종래 기술에 따른 황반변성의 이미징 방법은, 질병 진행을 알리거나 맥락막 혈관신생의 형성이나 재발을 예측하지는 못하고 있다.
한편, 인테그린(integrin) αvβ3은 혈관신생에 우선적으로 발현되지만 정상 조직에서는 발현 수준이 낮은 것으로 알려져 있다(Kumar CC, Armstrong L, Yin Z, et al. (2000) Targeting integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 for blocking tumor-induced angiogenesis. Adv Exp Med Biol 476:169-180). 또한 인테그린 αvβ3은 맥락막 혈관신생의 주요 병리학적 과정인 안구 혈관신생에 관련이 있다고 보고되고 있다(Luna J, Tobe T, Mousa SA, Reilly TM, Campochiaro PA (1996) Antagonists of integrin alpha v beta 3 inhibit retinal neovascularization in a murine model. Lab Invest 75:563-573; Friedlander M, Theesfeld CL, Sugita M, et al. (1996) Involvement of integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 in ocular neovascular diseases. Proc Natl Acad Sci U S A 93:9764-9769). 따라서 맥락막 혈관신생의 진단 및 치료를 위해, 맥락막 혈관신생에 최적화된 인테그린 αvβ3 표적화 프로브에 대한 연구가 절실히 요구된다.
일반적으로 RGD 펩타이드는 Arginine(R), Glycine(G), 및 Aspartic acid(D)가 결합된 펩타이드로서 인테그린 αvβ3에 높은 친화도를 가지고 있기 때문에 혈관신생에 대한 우수한 조영제로 작용하는 것으로 보고되고 있다(McDonald DM, Choyke PL (2003) Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med 9:713-725; Gaertner FC, Kessler H, Wester HJ, Schwaiger M, Beer AJ (2012) Radiolabelled RGD peptides for imaging and therapy. Eur J Nucl Med Mol Imaging 39 Suppl 1:S126-138; Schottelius M, Laufer B, Kessler H, Wester HJ (2009) Ligands for mapping alphavbeta3-integrin expression in vivo. Acc Chem Res 42:969-980).
이에 본 발명자들은 많은 노력과 연구를 거친 끝에 맥락막 혈관신생의 진단과 치료에 최적화된 신규 RGD 펩타이드를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 망막맥락막 혈관신생의 구조 변화가 일어나기 전에 망막맥락막 혈관신생의 발생과 재발을 예측함으로써 망막맥락막 혈관신생 또는 나이관련 황반변성의 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 인테그린 표적화 프로브를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 이러한 인테그린 표적화 프로브의 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 인테그린 표적화 프로브는, 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브로서, NH2-고리형 RGD 펩타이드 전구체를 형광물질에 컨쥬게이트하여 완성된 형광물질 표지 고리형 RGD 펩타이드로 이루어질 수 있다.
상기 NH2-고리형 RGD 펩타이드 전구체는 NH2-D-[c(RGDfK)]2이고, 상기 형광물질 표지 고리형 RGD 펩타이드는 FITC-D-[c(RGDfK)]2일 수 있다.
상기 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), 쿠마린(coumarine), 캐스캐이드 블루(cascade blue), 퍼시픽 블루(pacific blue), 퍼시픽 오렌지(pacific orange), 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), NBD, PE, PE-Cy5, PE-Cy7, Red 613, PerCP, TruRed, 플루오르X(FluorX), BODIPY-FL, 시아닌(Cyanine) 계열의 형광물질(Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate), X-로다민(X-rhodamine), 리사민 로다민 B(lissamine rhodamine B), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 인도시아닌그린(indocyanine green) 및 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 이루어질 수 있다.
상기 형광물질 표지 고리형 RGD 펩타이드는 형광안저혈관조영술에 사용될 수 있다.
상기 다른 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 인테그린 표적화 프로브의 제조 방법은, 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브의 제조 방법으로서, NH2-고리형 RGD 펩타이드 전구체를 합성하는 단계; 및 상기 합성된 NH2-고리형 RGD 펩타이드 전구체를 형광물질에 컨쥬게이트하여 형광물질 표지 고리형 RGD 펩타이드를 완성하는 단계를 포함할 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 구체적인 내용 및 도면들에 포함되어 있다.
상술한 바와 같이 본 발명의 인테그린 표적화 프로브, 즉 FITC 표지 고리형 RGD 펩타이드는 나이관련 황반변성의 주요 발명 원인인 망막맥락막 혈관신생을 가시화할 수 있으므로 망막맥락막 혈관신생의 구조변화가 일어나기 전에 망막맥락막 혈관신생의 발생과 재발을 예측할 수 있다. 특히 망막맥락막 혈관신생 병변은 정상 망막이나 맥락막과는 달리 본 발명의 FITC 표지 고리형 RGD 펩타이드에 대해 면역형광염색이 강하게 나타나는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 FITC 표지 고리형 RGD 펩타이드는 망막의 정상 혈관에 대해서는 거의 염색이 이루어지지 않는 것을 확인하였다.
도 1은 본 발명에 따른 맥락막 혈관신생 형성의 특정을 나타낸 이미지를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따라 맥락막 혈관신생 유도 후 7일째에 얻어진 맥락막 플랫마운트 면역 형광 이미지를 나타낸다.
도 3은 RGD-결합 단백질과 인테그린 αvβ3의 중첩을 나타낸다.
도 4(a)는 1, 3, 7 및 14일째 레이저 유도 맥락막 혈관신생을 가진 망막에서 역전사 중합 효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의한 인테그린 mRNA 발현을 나타낸 것이고, 도 4(b)는 GAPDH 유전자 발현으로 정규화된 인테그린 발현 데이터를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따라 맥락막 혈관신생 유도 후 7일째에 얻어진 맥락막 플랫마운트 면역 형광 이미지를 나타낸다.
도 3은 RGD-결합 단백질과 인테그린 αvβ3의 중첩을 나타낸다.
도 4(a)는 1, 3, 7 및 14일째 레이저 유도 맥락막 혈관신생을 가진 망막에서 역전사 중합 효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의한 인테그린 mRNA 발현을 나타낸 것이고, 도 4(b)는 GAPDH 유전자 발현으로 정규화된 인테그린 발현 데이터를 나타낸다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명에서 언급된 망막맥락막 신생혈관성 질환은, 예를 들어 나이관련 황반변성, 당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄, 근시성황반변성 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 형광물질 표지 고리형 RGD 펩타이드에 사용되는 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC), 쿠마린(coumarine), 캐스캐이드 블루(cascade blue), 퍼시픽 블루(pacific blue), 퍼시픽 오렌지(pacific orange), 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), NBD, PE, PE-Cy5, PE-Cy7, Red 613, PerCP, TruRed, 플루오르X(FluorX), BODIPY-FL, 시아닌(Cyanine) 계열의 형광물질(Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate), X-로다민(X-rhodamine), 리사민 로다민 B(lissamine rhodamine B), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 인도시아닌그린(indocyanine green) 및 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 이루어질 수 있다. 다만 본 발명은 이에 한정되지 않으며 타겟의 형광수치를 증가시킬 수 있는 임의의 형광물질을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 망막맥락막 신생혈관을 가시화하기에 적합한 FITC를 예로 들어 실험을 진행하였다.
실시예 1. 동물 및 재료의 준비
<1-1> 마우스의 준비
맥락막 혈관신생을 위한 이용된 모든 마우스 모델 연구는 서울대학교병원의 동물실험윤리위원회의 승인을 얻었으며, ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research의 지침을 준수하였다. 22 내지 25g의 야생형 6 주령 C57BL/6 수컷 마우스 29 마리를 실험에 사용했다.
<1-2> 맥락막 혈관신생의 유도
맥락막 혈관신생은 다음과 같이 문헌(Reich SJ, Fosnot J, Kuroki A, et al. (2003) Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Mol Vis 9:210-216)에 따라 유도하였다. 100 mg/mL 케타민(ketamine)과 20 mg/mL 자일라진(xylazine)의 1:1 혼합물을 이용하여 정맥마취하고 5.0% 페닐에프린(phenylephrine)과 0.8% 트로픽아미드(tropicamide)로 동공확대한 후, C57BL/6 마우스를 레이저 전달 시스템 앞에 Mayo 스탠드 위에 놓았다(Coherent PC-920 Argon Ion Laser System; Coherent Medical Laser, Santa Clara, CA). 맥락막 혈관신생은 512 nm 아르곤 레이저 광 응고법을 사용하여 유도되었으며, 이는 100 um의 스팟 크기를 사용하여 0.1s 동안 100 mW 출력에서 우안에서 수행되었다. 시신경 유두부로부터 약 2-3 디스크 직경의 5개 병변이 생성되었다. 레이저 전달 시 버블이 생긴 것은 브루크 막(Bruch's membrane)의 파열 및 맥락막 혈관신생을 유도하기에 충분한 손상이 생긴 것으로 간주될 수 있다. 레이저 처리 후 망막하 출혈이 있었던 경우는 제외되었다.
<1-3> FITC 표지 고리형 RGD 펩타이드의 제조
고리형 RGD 펩타이드는 바이오이미징코리아(Bio Imaging Korea Co., Ltd.)에서 구입한 보호기가 도입된 고리형 RGD 펩타이드, 즉 cyclic R(Pdf)-G-D(tBu)-f-K-NH2로부터 합성되었다(R = Arginine; Pdf = 펜타메틸벤조퓨란설포닐; G = glycine; D = aspartic acid; tBu = tert-부틸; f = D-Phenylalanine, K = Lysine). 시작물질인 cyclic R(Pdf)-G-D(tBu)-f-K-NH2 (0.4 mmol)을 N-하이드록시벤조트라이졸(N-hydroxybenzotriazole, 0.46 mmol), O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸-우로늄-헥사플루오로포스페이트(O-benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate, 0.46 mmol)과 함께 질소가스 분위기에서 Boc로 보호된 아스파틱엑시드(0.12 mmol)이 녹여져 있는 N,N'-디메틸포름아마미드(N,N'-dimethylformamide, 5 mL)에 첨가하여 실온에서 12 시간 교반시켰다. 감압 하에 용매를 제거한 후 컬럼크로마토그래피를 통해 분리하여 아스파틱엑시드에 고리형 RGD 이합체 펩타이드, BocNH-D-[c(R(Pdf)-G-D(tBu)-f-K)]2 (MS (ESI) m/z = 2020.4 (M+H)+)가 도입된 화합물을 얻었다. 이어서 보호기 그룹을 제거하기 위해 TFA:Et3SiH:H2O (95:2.5:2.5, 3 mL)에 녹이고 상온에서 6 시간 반응시킨 후, 모든 용액을 감압 하에 거의 증발시킨 다음에 다이에틸에스테르(diethyl ether)를 첨가해서 얻어진 고체를 여과하였다. 이렇게 얻어진 하얀색 고체를 충분히 에스테르로 세척한 후 건조하여 NH2-고리형 RGD 펩타이드 전구체인 NH2-D-[c(RGDfK)]2 (MS (ESI) m/z = 1304.2 (M+H)+)를 제조하였다. 얻어진 NH2-D-[c(RGDfK)]2 (10 nmol)은 100 mM PBS (phosphate buffered solution, pH 7.5)에서 실온에서 4 ㎍ FITC(fluorescein isothiocyanate; Thermo Fisher Scientific Korea Inc., Seoul, Korea)와 1시간 동안 교반하여 우레와 결합으로 컨쥬게이트(conjugated)되었다. FITC 표지 펩타이드인 FITC-D-[c(RGDfK)]2는 아세토니트릴(acetonitrile) / 물 / 0.1% 트리플루오로 아세트산(trifluoroacetic acid)의 용매 혼합물과 함께 C-18 역상 고속 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC, Shimadzu Prominence, Kyoto, Japan)를 사용하여 95 % 이상의 순도로 정제되었고, 질량분석기(mass spectrometry, HP / Agilent 1100 series LC/MSD, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 확인되었다(MS (ESI) m/z = 1693.3 (M+H)+).
실시예 2. 조직학적 평가 및 혈관 조영 평가
마우스를 희생시키고 눈을 적출하여 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 맥락막 혈관신생 유도 후 2 주째에 적출된 6개 눈의 연속 절편을 -20℃에서 저온유지장치(HM550MP; Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)에서 20 um 두께로 절단하고 염색을 준비했다. 망막과 맥락막의 조직학적 검사를 위해 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 시행하였다.
10 개의 눈은 맥락막 플랫마운트(flatmount)로 준비되었다. 플랫마운트를 위해 마우스는 7 일 또는 14 일째에 마취된 후 눈은 적출되어 4 ℃에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정되었다. 안구 앞부분과 망막은 아이컵에서 제거되고 4개의 방사형 절개가 이루어졌다. 나머지 RPE(Retinal Pigment Epithelium)-맥락막-공막 복합체는 플랫마운트되고 커버스립되었다. 플랫마운트는 스캐닝 레이저 공초점 현미경(LSM710; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 검사되었다.
레이저 광 응고술 후 1 주째에 2% 플루오레세인 나트륨(fluorescein sodium) 0.2 mL를 복강 내 주사한 후 상업용 안저 카메라와 이미징 시스템(Heidelberg Retina Angiography, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)을 사용하여 형광혈관조영술(fluorescein angiography, FA)을 수행하였다. 맥락막 혈관신생은 레이트 페이스 리퀴지(late-phase leakage)가 있는 과형광(hyperfluorescent) 병변으로 형광혈관조영술로 확인되었다.
실시예 3. RGD 펩타이드를 이용한 망막 및 맥락막 플랫마운트에서 혈관의 형광 염색
적출된 눈은 2% 파라포름알데히드/PBS(pH 7.4)에 5 분간 고정되었다. 이어서 망막과 맥락막을 안구에서 분리한 후, 실온에서 3시간 동안 PBS에서 0.5 % Triton X-100, 5% 소태야혈청(fetal bovine serum) 및 20% DMSO(dimethyl sulfoxide)로 투과화(permeabilization)를 유도하였다. 혈관 염색을 위해, 망막을 4 ℃에서 4일간 BS-1 lectin-TRITC(Sigma-Aldrich)와 배양하였다. 앞서 준비한 FITC 표지 고리형 RGD 펩타이드인 FITC-D-[c(RGDfK)]2는 맥락막 혈관신생 병변에서의 인테그린 αvβ3 표적화에 사용되었다.
FITC-D-[c(RGDfK)]2를 이용한 형광 염색은 다음과 같이 수행하였다.
(1) 망막 및 맥락막 플랫마운트를 PBS로 세척하고 FITC-D-[c(RGDfK)]2와 함께 30분 동안 배양하였다.
(2) 슬라이드를 PBS로 여러 번 세척하고, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 대조 염색하고, ProLong Gold 안티페이드 시약(anti-fade reagent)(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)으로 마운트하였다.
(3) 염색 후, 플랫마운트는 유리 슬라이드에 유리면이 위로 가도록 마운트하고 공초점 현미경(LSM710; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 상에서 시각화하였다.
또한, 과량의 cRGD 펩타이드를 사용하여 FITC-D-[c(RGDfK)]2 염색의 특이성을 평가했다. 이 실험에서, 양쪽 눈에 대해 동일하게 레이저로 유도된 맥락막 혈관신생을 가진 한 마우스를 희생시켰다. 이 마우스의 한쪽 눈은 10nM의 FITC-D-[c(RGDfK)]2를 사용하여 상기 염색법으로 염색하였다. 다른 한쪽 눈은 형광 염색 전에 과량의 cRGD 펩타이드(예를 들어, FITC-conjugated cRGD dimer의 20배 몰 농도, 즉, 200 nM)로 2 시간 인큐베이터하고 상기 염색법으로 염색하였다. 이 염색에서 인테그린 αvβ3 항체를 사용하여, 인테그린 αvβ3 항체의 염색이 FITC-conjugated cRGD dimer의 염색과 중첩되는지를 조사하였다.
실시예 4.
in vitro
인테그린 발현을 위한 RT-PCR
기준치(baseline)과 맥락막 혈관신생 유도 후 1, 3, 7, 14일째에, 각 시점마다 4 마리 마우스를 희생시키고 안구를 적출했다. RNeasy 미니 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여, 망막 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. 역전사(reverse transcription, RT)는 Superscript III First-strand Synthesis 키트(Invitrogen)를 사용하여 2 ㎍g 변성된 RNA에서 수행하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 BioMix(Bioline, London, UK)를 사용하여 준정량적 PCR(semi-quantitative PCR, semi-quantitative Polymerase Chain Reaction)로 인테그린의 상대적 존재량을 분석하였다. 게놈 DNA 오염이 없음을 확인하기 위해, RT없이 음성 대조군을 수행하였다. 상기 시퀀스의 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성(denaturation), 58℃에서 45초간 신장(extension), 그리고 72℃에서 60초간 결합(annealing)을 33 사이클 실시하였다. PCR 산물은 150V에서 20분 동안 전기 영동에 의해 3% 아가로즈 겔(agarose gel) 상에서 분리되었다. PCR 산물은 예상되는 크기에 의해 확인되었다.
참고예1. 통계 분석
쌍을 이룬 그룹 간의 차이를 평가하기 위해 Wilcoxon signed rank test가 사용되었다. 독립적인 그룹 간의 비교를 위해 Mann-Whitney test가 사용되었다. 연속값은 평균 ± 표준오차(SE)로 표시된다. P 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 통계 분석은 SPSS 버전 18.0(SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)을 사용하여 수행되었다.
실험예 1. 맥락막 혈관신생 형성의 확인
도 1은 본 발명에 따른 맥락막 혈관신생 형성의 특정을 나타낸 이미지를 나타낸다. 여기서, (a)는 레이저 광 응고 직후 얻은 안저 사진이고(화살촉은 레이저 처리된 반점을 나타내고, 버블 형성은 Bruch's membrane 파열 직후를 나타냄), (b)는 형광혈관조영술에 의해 레이저 처리된 반점(화살촉)에서 염료 누출이 있는 맥락막 혈관신생 병변을 나타내고, (c)는 맥락막 혈관신생 유도 후 2주째에 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색된 동결절편을 나타낸다.
구체적으로, 도 1(a)에 도시된 바와 같이 맥락막 혈관신생은 레이저 광 응고법에 의해 유도되었으며, 브루크 막(Bruch's membrane)이 파괴되었다. 레이저 유도 직후, 기화 버블이 형성되었다. 도 1(b)에 도시된 바와 같이 맥락막 혈관신생의 형성은 형광혈관조영술(FA)을 사용하여 확인되었다. 형광혈관주영술은 레이저 광 응고술이 시행된 부위에서 형광 누출과 함께 과형광 스팟을 나타내었고, 이는 맥락막 혈관신생과 양립할 수 있다. 누설이 있는 스팟은 레이저 유도로 처리된 부분과 일치했다.
도 1(c)에 도시된 바와 같이 조직 병리학적으로, 맥락막 혈관신생이 유도된 눈은 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE) 및 외측 망막의 파열과 함께 맥락막과 망막에서 섬유 혈관 복합체(fibrovascular complex)를 형성하였고, 이는 맥락막 혈관신생과 양립할 수 있다.
실험예 2. 맥락막 혈관신생의 ex vivo 이미지 및 인테그린의 중첩
도 2는 본 발명에 따라 맥락막 혈관신생 유도 후 7일째에 얻어진 맥락막 플랫마운트 면역 형광 이미지를 나타낸다. 여기서, (a)에서 미처리된 눈(왼쪽)과 비교할 때 맥락막 혈관신생 유도가 있는 눈 (오른쪽)은 과형광 스팟을 나타내며 이는 레이저 처리된 부위(화살촉)에 대응한다. (b)는 (a)의 사각형 부분, 즉 맥락막 혈관신생의 확대 이미지로서, FITC 표지 RGD 펩타이드로 염색된 레이저 처리된 병변은 렉틴으로 염색된 병변과 일치함을 나타내며, 이는 맥락막 혈관신생이 RGD 기반 프로브로 염색될 수 있음을 나타낸다. 처리되지 않은 망막(하부)에서, FITC 표지 RGD 펩타이드 면역 형광이 망막 혈관을 따라 관찰된다(OP = optic disc).
구체적으로, 도 2에 도시된 바와 같이 FITC 표지 고리형 RGD 펩타이드는 레이저 처리된 영역에서 맥락막 혈관신생을 가시화하였다. 특히 도 2(a)에 도시된 바와 같이 미처리 눈에 비해(도 2(a)의 왼쪽), 맥락막 혈관신생 관련 눈은 5개의 렉틴-양성(lectin-positive)인 RGD 펩타이드-결합 스팟(화살촉)을 나타내었다. 이 스팟들은 지형적으로 5개의 레이저 처리된 스팟과 일치한다(도 2(a)의 오른쪽). 이 스팟들은 DAPI, 렉틴 및 RGD 펩타이드로 동시에 염색되었다. 도 2(b)에 도시된 바와 같이, 스팟들 중 하나의 확대 이미지는 렉틴(도 2(b)의 상부)과 RGD-결합 단백질(인테그린 αvβ3)의 중첩(co-localization)을 잘 보여준다. 대조적으로, 렉틴-양성인 망막의 정상 혈관은 FITC 표지 RGD 펩티드로 거의 염색되지 않았다(도 2(b)의 하부). 이는 RGD 펩타이드 이합체-통합 프로브가 선택적으로 맥락막 혈관신생에 결합할 때, 맥락막 혈관신생이 RGD 펩티드 이합체-통합 프로브를 사용하여 이미지화될 수 있음을 나타낸다.
도 3은 RGD-결합 단백질과 인테그린 αvβ3의 중첩을 나타낸다. 구체적으로, 양쪽 눈에 대해 동일하게 레이저 처리한 마우스에서 맥락막 플랫마운트의 형광 염색을 나타내며, 두 눈을 DAPI, FITC-RGD, CD31 및 인테그린 αvβ3 항체로 동시에 염색하였다. 여기서 좌안(b)은 FITC-RGD 염색 전에 과다 cRGD로 배양하였다. 이 경우, FITC 표지 RGD 펩타이드의 형광은 과다 cRGD에 의해 현저하게 감소되는 것이 확인되었다.
도 3의 도시된 FITC-D-[c(RGDfK)]2 혈관 조영술 이미지는 종래 방사성 동위원소를 이용한 SEPCT 이미지보다 고해상도 이미지를 제공한다.
실험예 3. 맥락막 혈관신생 유도 후 인테그린 mRNA 발현
도 4(a)는 1, 3, 7 및 14일째 레이저 유도 맥락막 혈관신생을 가진 망막에서 역전사 중합 효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의한 인테그린 mRNA 발현을 나타낸 것이고, 도 4(b)는 GAPDH 유전자 발현으로 정규화된 인테그린 발현 데이터로서 상부 막대는 95% 신뢰 구간의 상한을 나타낸다(P <0.05).
구체적으로 도 4와 같이, RT-PCR를 이용하여, 맥락막 혈관신생 유도 후 시간 경과에 따른 마우스 망막에서 인테그린 발현을 조사하였다. GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현으로 정규화 시켰을 때, 대부분의 인테그린은 유사한 발현 패턴을 나타내었다. 즉, 도 4(b)에 도시된 바와 같이 초기 단계에서 증가하였고(1일째 피크), 이후 2주 동안의 감소 양상을 보였는데 기준치와 비슷한 수준까지 감소하였다. 맥락막 혈관신생 유도 후 1일째에 integrin αv (1.48 배)와 β3 (1.24 배)의 발현이 증가하였다. 1일째에 인테그린 αv의 발현 증가는 통계적으로 유의했다(P <0.05). 3, 7, 14일째에는 기준치와 비교하여 인테그린 αv 또는 β3의 발현에는 유의한 변화가 없었다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (8)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브의 제조 방법으로서,
NH2-고리형 RGD 펩타이드 전구체인 NH2-D-[c(RGDfK)]2를 합성하는 단계; 및
상기 합성된 NH2-고리형 RGD 펩타이드 전구체를 형광물질에 컨쥬게이트하여 형광물질 표지 고리형 RGD 펩타이드를 완성하는 단계를 포함하는, 인테그린 표적화 프로브의 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 형광물질 표지 고리형 RGD 펩타이드는 FITC-D-[c(RGDfK)]2인 것을 특징으로 하는 인테그린 표적화 프로브의 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), 쿠마린(coumarine), 캐스캐이드 블루(cascade blue), 퍼시픽 블루(pacific blue), 퍼시픽 오렌지(pacific orange), 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), NBD, PE, PE-Cy5, PE-Cy7, Red 613, PerCP, TruRed, 플루오르X(FluorX), BODIPY-FL, 시아닌(Cyanine) 계열의 형광물질(Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate), X-로다민(X-rhodamine), 리사민 로다민 B(lissamine rhodamine B), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 인도시아닌그린(indocyanine green) 및 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 이루어진 것을 특징으로 하는 인테그린 표적화 프로브의 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 형광물질 표지 고리형 RGD 펩타이드는 형광안저혈관조영술에 사용되는 것을 특징으로 하는 인테그린 표적화 프로브의 제조 방법.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190027284A KR102307767B1 (ko) | 2019-03-11 | 2019-03-11 | 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브 및 이의 제조 방법 |
| US17/438,412 US20220146519A1 (en) | 2019-03-11 | 2019-11-08 | Integrin alpha v beta 3 targeting probe for diagnosing retinochoroidal neovascular diseases and preparation method therefor |
| PCT/KR2019/015132 WO2020184806A1 (ko) | 2019-03-11 | 2019-11-08 | 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αVβ3 표적화 프로브 및 이의 제조 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190027284A KR102307767B1 (ko) | 2019-03-11 | 2019-03-11 | 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브 및 이의 제조 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200108545A KR20200108545A (ko) | 2020-09-21 |
| KR102307767B1 true KR102307767B1 (ko) | 2021-10-01 |
Family
ID=72427612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190027284A KR102307767B1 (ko) | 2019-03-11 | 2019-03-11 | 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브 및 이의 제조 방법 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220146519A1 (ko) |
| KR (1) | KR102307767B1 (ko) |
| WO (1) | WO2020184806A1 (ko) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115960160A (zh) * | 2021-10-12 | 2023-04-14 | 南京大学 | 活细胞膜整合素αvβ3聚糖的原位糖链延长方法 |
| CN114949208B (zh) * | 2022-05-06 | 2023-07-04 | 温州医科大学 | 纳米光动力材料及其脉络膜新生血管的治疗的应用 |
| CN114835723B (zh) * | 2022-07-01 | 2022-09-16 | 戴格普瑞生物科技(苏州)有限公司 | Psma荧光分子探针、制备方法及试剂盒 |
| CN116239704B (zh) * | 2023-05-09 | 2023-07-14 | 北京青云智创科技有限公司 | 一种治疗新生血管性眼病的多肽及其制剂 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040198644A1 (en) * | 2001-08-01 | 2004-10-07 | Hans-Markus Bender | Integrin inhibitors for the treatment of eye diseases |
-
2019
- 2019-03-11 KR KR1020190027284A patent/KR102307767B1/ko active IP Right Grant
- 2019-11-08 WO PCT/KR2019/015132 patent/WO2020184806A1/ko active Application Filing
- 2019-11-08 US US17/438,412 patent/US20220146519A1/en active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Bioconjugate chemistry, 2014, Vol. 25, pp 1925-1941. |
| Hye kyoung Hong et al., ‘Preclinical Single photon emission computered tomography/computered tomography(SPECT/CT) imaging of choroidal neovascularization in macular degeneration mice using integrin-bi* |
| Molecular Imaging and Biology, 2019, Vol. 21, pp 644-653. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20220146519A1 (en) | 2022-05-12 |
| KR20200108545A (ko) | 2020-09-21 |
| WO2020184806A1 (ko) | 2020-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102307767B1 (ko) | 망막맥락막 신생혈관성 질환을 진단하기 위한 인테그린 αvβ3 표적화 프로브 및 이의 제조 방법 | |
| JP6788154B2 (ja) | Ｒ−ｇ−システイン酸ペプチドを含む医薬組成物 | |
| JP6797310B2 (ja) | 老化細胞が介在する疾患を治療するためのペプチド系プロテアソーム阻害物質、およびがんを治療するためのペプチド系プロテアソーム阻害物質 | |
| JP6689249B2 (ja) | 錐体細胞における増強された遺伝子発現のための組成物および方法 | |
| Narfström et al. | Functional and structural recovery of the retina after gene therapy in the RPE65 null mutation dog | |
| ES2174855T5 (es) | Metodos diagnosticos y composiciones farmaceuticas que se basan en proteinas notch y acidos nucleicos. | |
| JP6162759B2 (ja) | ペプチドを有効成分とする血管関連疾患の治療剤組成物 | |
| TW201408307A (zh) | 使用腺相關病毒（ａａｖ）ｓｆｌｔ－１治療老年性黃斑部退化（ａｍｄ） | |
| JP2015515282A (ja) | 創傷治癒および組織修復のための組成物および方法 | |
| CN112007044A (zh) | 一种预防视网膜神经节细胞氧化应激和湿性黄斑病变的药物 | |
| Tu et al. | AAV-mediated gene delivery of the calreticulin anti-angiogenic domain inhibits ocular neovascularization | |
| AU2020345915A1 (en) | Methods of treating ocular neovascular diseases using AAV2 variants encoding aflibercept | |
| US20200299356A1 (en) | Composition comprising raav containing soluble vegfr-1 varient cdna for treatment of macular degeneration | |
| US20150367004A1 (en) | Compositions and methods of diagnosing ocular diseases | |
| CN110662752B (zh) | 用于临床管理由衰老细胞引起或介导的病症以及治疗癌症的Bcl家族拮抗剂磷杂环化合物 | |
| USRE49518E1 (en) | Fluorescent probe for detecting calpain activity | |
| JP6989864B2 (ja) | ギャップ結合細胞間コミュニケーションモジュレータ及び糖尿病性眼疾患の治療のためのそれらの使用 | |
| US20110195931A1 (en) | Methods and compositions for reducing neuronal cell death | |
| WO2019117812A1 (en) | Near infra-red molecular probes for use in diagnosis of fibrotic conditions and screening of anti-fibrotic drugs | |
| US10519197B1 (en) | Peptide-based proteasome inhibitors for treating conditions mediated by senescent cells and for treating cancer | |
| TW202117016A (zh) | 使用編碼阿柏西普(aflibercept)之aav2變異體治療眼睛新生血管性疾病的方法 | |
| JP2022524094A (ja) | 色素上皮由来因子（ｐｅｄｆ）を使用する疾患の処置のための方法 | |
| Wang et al. | Receptor tyrosine kinase inhibitors AG013764 and AG013711 reduce choroidal neovascularization in rat eye | |
| JP6505408B2 (ja) | 低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬及び治療用組成物 | |
| US20240076694A1 (en) | Composition comprising raav containing soluble vegfr-1 variant cdna for treatment of macular degeneration |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |