KR102297123B1 - 탈지 난황 단백질 가수분해물 제조 방법 및 이를 포함하는 항산화용 조성물 - Google Patents

탈지 난황 단백질 가수분해물 제조 방법 및 이를 포함하는 항산화용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탈지 난황 단백질 가수분해물 제조 방법 및 이를 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 탈지 난황에 알칼라아제(Alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 판크레아틴(Pancreatin) 및 프로타멕스(Protamex)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 분해효소를 처리하여 탈지 난황 단백질 가수분해물을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 판크레아틴(Pancreatin), 뉴트라아제(Neutrase), 알칼라아제(Alcalase) 또는 프로타멕스(Protamex)를 처리하여 제조한 탈지 난황 가수분해물이 우수한 항산화 활성을 보이는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 뉴트라아제-판크레아틴 효소 조합과 판크레아틴-프로타멕스 효소 조합을 이용하여 복합 효소 가수분해물을 제조하였을 때 라디칼 소거능이 단독 효소 가수분해물보다 증가하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물은 항산화용 화장료 또는 기능성 식품 소재로 이용될 수 있다.

Description

탈지 난황 단백질 가수분해물 제조 방법 및 이를 포함하는 항산화용 조성물{Method for Producing Hydrolysate of Egg Yolk Protein and Composition for Antioxidant Using The Same}
본 발명은 탈지 난황 단백질 가수분해물 제조 방법 및 이를 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 탈지 난황에 알칼라아제(Alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 판크레아틴(Pancreatin) 및 프로타멕스(Protamex)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 분해효소를 처리하여 탈지 난황 단백질 가수분해물을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
산화적 스트레스(oxidative stress)란 외부적인 요인으로 체내에 자극을 주어 활성산소종(reactive oxidative species, ROS)을 생성하는 것을 이야기 한다. 이러한 활성산소종에는 슈퍼옥사이드(superoxide), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical) 및 퍼록실 라디칼(peroxyl radical) 등이 있으며, 체내에서 세포간의 신호 전달이나 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 적절한 수준으로의 활성산소종을 제어하는 것이 중요하다 (Ihsan, A. U. et al., Biomedicine & Pharmacotherapy, 106:714, 2018). 사람의 체내에서는 이러한 활성산소종을 적정 수준으로 제어하기 위해 다양한 방어 시스템을 사용하고 있는데, 그 중 대표적인 것이 바로 항산화 효소(SOD(super oxide dismutase), GPX(glutathione peroxidase) 및 카탈라아제(catalase) 등)이다. 하지만, 이런 방어 시스템에 문제가 생겨 활성산소종을 적정 수준으로 제어하지 못 할 경우, 체내의 지질(lipid), DNA, 단백질(protein) 및 세포막 등을 산화시켜 신체에 손상을 유발하는 문제가 발생한다고 알려져 있다 (Kim, Y. H., Surgical Metabolism and Nutrition, 2:11, 2011). 그 동안 많이 사용되어 왔던 BHT (butylatedhydroxytoluene), BHA (butylatedhydroxyanisole)과 같은 합성 항산화제의 경우 항산화력이 우수하고 가격이 저렴하여 경제적인 측면에서 장점이 있지만, 체내에 부작용을 나타내는 위험성을 가지고 있어, 천연의 물질로부터 항산화 활성이 뛰어난 새로운 항산화제를 찾는 연구가 활발하게 진행되고 있다 (Hu, F. et al., Food Chemistry, 261: 301, 2018).
천연의 항산화제를 찾기 위한 후보로 많이 사용되어지고 있는 것 중에 하나가 바로 단백질이다. 우유 단백질(Aguilar-Toala, J. E. et al., Journal of Dairy Science, 100:65, 2017), 대두 단백질(Lee, J. S. et al., Food Science and Biotechnology, 22:973, 2013), 어육 단백질(Jemil, I. et al., Process Biochemistry, 49:963, 2014), 유청 단백질(Zhang, Q. X. et al., Journal of Dairy Research, 80:367, 2013) 등 다양한 단백질을 효소를 통해 가수분해를 실시하고, 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 찾는 연구가 활발하게 진행되어 오고 있다. 기능성 펩타이드는 그 펩타이드의 길이, 아미노산 서열 등 다양한 요인들로 인해 항산화 활성을 갖는 것으로 보고되고 있다. 따라서 여러 가지 효소를 이용함으로써 다양한 길이, 다양한 아미노산 서열 등을 갖는 항산화 활성을 가지는 펩타이드들을 제조할 수 있으므로, 많은 단백질 연구에서 효소를 이용한 가수분해 연구를 진행하고 있다 (Jemil, I. et al., Food Research International, 89:347, 2016). 효소 처리 이외에도 미생물의 발효를 이용하여 항산화 펩타이드를 제조한 연구도 활발하게 진행되고 있다 (Elfahri, K. R. et al., Journal of Dairy Science, 99:31, 2016; Solieri, L. et al., Food Microbiology, 51:108, 2015).
계란은 우유와 함께 천연의 완전식품으로 잘 알려져 있는데, 인간에게 필요한 영양소를 갖추고 있을 뿐 아니라 하나의 생명체가 자라나는 데 필요한 방어체계 등도 보유하고 있어 많은 계란의 성분들이 기능성 소재의 연구에서 사용되고 있다 (Kovacs-Nolan, J. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53:8421, 2005). 계란의 성분 중에서 단백질을 활용한 많은 기능성 연구가 보고되어지고 있는데 대표적으로, 난황의 포스비틴(phosvitin)은 항산화, 항균, 면역 증진 효과 등이 있다고 보고되었고, 난백의 오브알부민(ovalbumin)과 그 가수분해물들의 항산화, 항균, 항암 효과 등이 보고되었으며, 오보트랜스페린(ovotransferrin)과 그 가수분해물들의 항산화, 항고혈압, 항암 효과 등이 보고되었다 (Katayama, S. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54:773, 2006; Huang, X. et al., Food Research International, 48:866, 2012; Kim, J. et al., Poultry Science 91:2747, 2012)
이에, 본 발명에서는 항산화 활성이 높은 난황 단백질 가수분해물을 제조하기 위해 노력한 결과, 탈지 난황에 알칼라아제(Alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 브로멜라인(Bromelain), 플라보자임(Flavourzyme), 판크레아틴(Pancreatin), 파파인(Papain), 펩신(Pepsin) 및 프로타멕스(Protamex)로 구성된 하나 이상의 단백질 분해효소를 처리하여 탈지 난황 단백질 가수분해물을 제조하였으며, 이 중 판크레아틴(Pancreatin), 뉴트라아제(Neutrase) 및 플라보자임(Flavourzyme)를 이용한 경우 200% 이상의 가수분해율을 보이는 것을 확인하였으며, 판크레아틴(Pancreatin), 뉴트라아제(Neutrase), 알칼라아제(Alcalase) 및 프로타멕스(Protamex) 효소 가수분해물 등이 우수한 항산화 활성을 보이는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 탈지 난황에 단백질 분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 탈지 난황 단백질 가수분해물 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물 및 항산화용 건강 기능성 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은,
탈지 난황에 알칼라아제(Alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 판크레아틴(Pancreatin) 및 프로타멕스(Protamex)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 탈지 난황 단백질 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단백질 분해효소는 뉴트라아제 및 판크레틴 혼합 효소 또는 판크레아틴 및 프로타멕스 혼합 효소일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서, 상기 탈지 난황은
(a) 계란으로부터 난황 및 난백을 분리한 후, 난황을 45 ~ 65 ℃에서 1 ~ 2시간 동안 진공 건조하여 분쇄하는 단계;
(b) 상기 분쇄한 건조 난황에 80% ~ 99% 에탄올을 첨가하여 45 ~ 65 ℃에서 1 ~ 2시간 동안 추출한 후, 1 ~ 5μm 필터로 여과하는 단계; 및
(c) 상기 여과된 고형물을 60 ~ 80 ℃에서 2 ~ 4시간 건조하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에서, 상기 단백질 분해효소를 pH 6.5 ~7.5, 45 ~ 55 ℃ 조건에서 3 ~ 5시간 동안 처리하여 탈지난황을 가수분해 시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에서, 상기 제조방법은 단백질 분해효소를 불활성화 시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 탈지 난황에 판크레아틴(Pancreatin), 뉴트라아제(Neutrase), 알칼라아제(Alcalase) 또는 프로타멕스(Protamex)를 처리하여 제조한 탈지 난황 가수분해물이 우수한 항산화 활성을 보이는 것을 확인하였다. 나아가 뉴트라아제-판크레아틴 효소 조합과 판크레아틴-프로타멕스 효소 조합을 이용하여 복합 효소 가수분해물을 제조하였을 때 라디칼 소거능이 단독 효소 가수분해물보다 증가하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물은 항산화용 화장료 또는 기능성 식품 소재로 이용될 수 있다.
도 1은 탈지 난황 단백 가수분해물의 SDS-PAGE (15%) 전기영동 결과이다(M: 단백질 마커, 1: 탈지 난황, 2: 알칼라아제(Alcalase) 가수분해물, 3: 브로멜라인(Bromelain) 가수분해물, 4: 플라보자임(Flavourzyme) 가수분해물, 5: 뉴트라아제(Neutrase) 가수분해물, 6: 판크레아틴(Pancreatin) 가수분해물, 7: 파파인(Papain) 가수분해물, 8: 펩신(Pepsin) 가수분해물 및 9: 프로타멕스(Protamex) 가수분해물)
도 2는 탈지 난황 단백 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 데이터이다.
도 3은 탈지 난황 단백 가수분해물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 데이터이다.
도 4는 탈지 난황 단백 가수분해물의 히드록실 라디칼(Hydroxyl radical) 소거능을 측정한 데이터이다.
도 5는 탈지 난황 복합 효소 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 데이터이다.
도 6은 탈지 난황 복합 효소 가수분해물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 데이터이다.
도 7은 탈지 난황 복합 효소 가수분해물의 히드록실 라디칼(Hydroxyl radical) 소거능을 측정한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 천연의 항산화제를 찾기 위해 단백질을 가수분해하여, 항산화 활성을 가지는 펩타이드를 제조하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
이에, 본 발명에서는 탈지 난황 단백질을 가수분해함으로써 항산화 효능이 높은 물질을 선별하고자 하였다. 탈지 난황에 알칼라아제(Alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 브로멜라인(Bromelain), 플라보자임(Flavourzyme), 판크레아틴(Pancreatin), 파파인(Papain), 펩신(Pepsin) 및 프로타멕스(Protamex)로 구성된 하나 이상의 단백질 분해효소를 처리하여 탈지 난황 단백질 가수분해물을 제조하였으며, 이 중 뉴트라아제(Neutrase), 플라보자임(Flavourzyme) 및 프로타멕스(Protamex)를 이용한 경우 200% 이상의 가수분해율을 보이는 것을 확인하였으며, 판크레아틴(Pancreatin), 뉴트라아제(Neutrase), 알칼라아제(Alcalase) 및 프로타멕스(Protamex) 효소 가수분해물 등이 우수한 항산화 활성을 보이는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, 탈지 난황에 알칼라아제(Alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 판크레아틴(Pancreatin) 및 프로타멕스(Protamex)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 탈지 난황 단백질 가수분해물의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 단백질 분해효소는 뉴트라아제-판크레아틴 혼합 효소 또는 판크레아틴-프로타멕스 혼합효소일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탈지 난황은 (a) 계란으로부터 난황 및 난백을 분리한 후, 난황을 45 ~ 65 ℃에서 1 ~ 2시간 동안 진공 건조하여 분쇄하는 단계; (b) 상기 분쇄한 건조 난황에 80% ~ 99% 에탄올을 첨가하여 45 ~ 65 ℃에서 1 ~ 2시간 동안 추출 한 후, 1 ~ 5μm 필터로 여과하는 단계; 및 (c) 상기 여과된 고형물을 60 ~ 80 ℃에서 2 ~ 4시간 건조하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 계란으로부터 난황과 난백을 분리한 후, 난황을 50 ℃이상에서 진공 건조를 실시하여 분쇄한 다음, 5배 이상의 95% 에탄올을 처리하여 50 ℃이상, 1 시간 이상 추출한 후, 1 μm 필터로 여과하였으며, 여과 고형물을 70 ℃에서 건조하여 탈지 난황을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 알칼라아제(Alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 판크레아틴(Pancreatin) 및 프로타멕스(Protamex)로 구성된 하나 이상의 단백질 분해효소를 pH 6.5 ~7.5, 45 ~ 55 ℃조건에서 3 ~ 5시간 동안 반응시켜 탈지난황을 가수분해 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 단백질 분해효소를 불활성화 시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 탈지 난황 가수분해 효율이 높고, 제조된 탈지 난황 가수분해물의 항산화 활성이 높을 효소를 선별하고자, 8종의 단백질 분해효소를 처리하여 제조한 각각의 탈지 난황 단백질 가수분해물에 대한 가수분해율을 측정하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 모든 가수분해물에서 37kDa의 가장 큰 단백질이 모두 분해된 것을 확인하였으며, 펩신을 제외하고는 대부분 10kDa 이하로 가수분해된 것을 확인하였다. 알칼라아제 가수분해물의 경우, 10kDa 이하에서 진한 밴드가 확인되었으며, 브로멜라인 가수분해물의 경우, 10kDa 부근에서 밴드를 확인하였다. 플라보자임, 뉴트라아제, 판크레아틴 및 프로타멕스 가수분해물의 경우 다른 가수분해물과 비교하였을 때, 밴드의 진하기가 연한 것으로 보아, 다른 단백질 분해효소에 비해 가수분해율이 높은 것을 확인할 수 있었다.
가수분해율을 수치로 나타낸 표 1에 나타난 바와 같이, 판크레아틴 가수분해율이 가장 높은 것을 확인하였으며, 판크레아틴, 뉴트라아제 및 플라보자임 가수분해물 등이 200%가 넘는 가수분해율을 보여 다른 가수분해물들에 비해 가수분해가 잘 진행되었음을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 실시예에서, 8종의 단백질 분해효소를 처리하여 제조한 각각의 탈지 난황 단백질 가수분해물에 대한 항산화 활성을 측정하였다.
DPPH 라디칼 소거능을 이용하여 가수분해물의 항산화 활성을 측정한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대부분의 가수분해물 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, 판크레아틴(43.25%), 뉴트라아제(41.92%), 프로타멕스(38.77%) 및 알칼라아제(37.61%) 가수분해물이 2 ㎎/㎖에서 30%가 넘는 DPPH 라디칼 소거능을 보여, 가수분해물 중 활성이 우수한 것을 확인하였다. 나머지 효소 가수분해물들 역시 탈지 난황에 비교해 DPPH 라디칼 소거능이 증가한 것을 확인하였다.
ABTS 라디칼 소거능을 이용하여 가수분해물의 항산화 활성을 측정한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 도 2의 DPPH 라디칼 소거능 활성 결과와 유사한 것을 확인하였다. 판크레아틴 가수분해물의 경우, 0.5, 1 및 2 ㎎/㎖에서 각각 12.85, 27.31 및 49.22% ABTS 라디칼 소거능을 보여 8종의 효소 가수분해물 중 가장 효과가 우수한 것을 확인하였으며, 이 외에 뉴트라아제, 알칼라아제 및 프로타멕스 가수분해물의 ABTS 라디칼 소거능이 우수한 것을 확인하였다.
또한, 히드록실 라디칼(Hydroxyl radical) 소거능을 이용하여 가수분해물의 항산화 활성을 측정한 결과, 다른 두 가지 라디칼 소거능 실험 결과의 경우, 효소를 이용한 가수분해를 통해 라디칼 소거능이 증가하는 결과를 얻었었지만 히드록실 라디칼 소거능의 경우에는 판크레아틴 가수분해물(2 ㎎/㎖에서 29.95%의 히드록실 라디칼 소거능을 보임)을 제외하고는 탈지 난황과 큰 효과 차이가 없는 것을 확인하였다.
결과적으로, 탈지 난황 단백 가수분해물의 항산화 활성을 세 가지 각기 다른 라디칼 소거능 실험을 통해 확인한 결과, 판크레아틴, 뉴트라아제, 알칼라아제 및 프로타멕스 효소 가수분해물 등이 라디칼 소거능에서 우수한 활성을 보여 항산화를 위한 화장료 조성물 및 건강 기능성 식품 소재로 이용될 수 있음을 확인하였다.
나아가, 본 발명의 구체적인 또 다른 실시예에서, 알칼라아제, 뉴트라아제, 판크레아틴, 프로타멕스를 이용하여 알칼라아제-뉴트라아제 가수분해물, 알칼라아제-판크레아틴 가수분해물, 알칼라아제-프로타멕스 가수분해물, 뉴트라아제-판크레아틴 가수분해물, 뉴트라아제-프로타멕스 가수분해물 및 판크레아틴-프로타멕스 가수분해물을 제조하고, 이들의 탈지난황에 대한 가수분해율 및 항산화 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 5 내지 도 7 및 표 5 내지 표 7에 나타난 바와 같이, 뉴트라아제-판크레아틴 효소 조합과 판크레아틴-프로타멕스 효소 조합을 이용하여 복합 효소 가수분해물을 제조하였을 때 라디칼 소거능이 단독 효소 가수분해물보다 증가하는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 탈지 난황을 이용한 효소 단독 가수분해물 혹은 복합 효소 가수분해물을 항산화를 위한 화장료 조성물 및 건강 기능성 식품 소재로 이용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물 또는 항산화용 건강 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물은, 전체 화장료 중량의 0.00001 중량 % 내지 50 중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다, 본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 건강 기능성 식품 조성물은, 전체 식품 중량의 0.00001 중량 % 내지 50 중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다, 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있으나, 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서 건강 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 기능성 식품은 항산화 효과에 관한 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
탈지 난황 제조
탈지 난황은 계란(누리웰)으로부터 난황을 난백과 분리한 후, 진공건조기를 이용해 50 ℃이상에서 진공건조를 실시하여 분쇄하였다. 분쇄한 건조난황에 5배 이상의 주정(95% 에탄올)을 가하여 50 ℃이상에서 1시간 이상 추출한 후 1 μm 필터로 여과하였다. 여과된 고형분을 70 ℃드라이 오븐에서 3시간 건조한 후 실험에 사용하였다.
탈지 난황 단백질 가수분해물의 제조
본 발명에서는 탈지 난황 가수분해물의 제조를 위해 총 8종의 단백질 분해효소(알칼라아제(Alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 브로멜라인(Bromelain), 플라보자임(Flavourzyme), 판크레아틴(Pancreatin), 파파인(Papain), 펩신(Pepsin) 및 프로타멕스(Protamex))를 이용하였다. 알칼라아제, 플라보자임, 뉴트라아제, 플라보자임, 파파인, 프로타멕스는 대종상사로부터 구입하였으며, 브로멜라인, 판크레아틴, 펩신은 (주)비전바이오켐으로부터 구입하여 사용하였다.
탈지 난황을 증류수에 녹여 1M NaOH를 이용하여 pH 7로 조정한 뒤, 2%의 비율로 총 6종의 단백질 분해효소(알칼라아제, 뉴트라아제, 브로멜라인, 플라보자임, 판크레아틴 및 프로타멕스)를 각각 처리하여 50 ℃항온수조(water bath)에서 4시간 반응하였다. 펩신 단백질 분해효소의 경우, 파파인(pH 6.5)은 2% 비율로 탈지 난황에 처리한 다음, 65 ℃항온수조에서 4시간 동안 가수분해 반응을 시키고, 펩신(pH 2)은 2% 비율로 탈지 난황에 처리한 다음, 50 ℃항온수조 조건에서 4시간 동안 가수분해 반응을 시켰다. 반응이 종료 된 후 100 ℃에서 10 분간 효소의 불활성화 단계를 거쳤으며, 3,000Х20 분간 원심분리를 한 후, 상등액을 동결건조하여 실험에 사용하였다. 대조군으로는 효소 처리를 하지 않고 위와 같은 공정을 거친 뒤 동결건조하여 얻은 시료를 탈지 난황으로 실험에 사용하였다.
탈지 난황 가수분해물의 가수분해율 측정
본 발명에서는 8종의 탈지 난황 단백 가수분해물의 가수분해율을 측정하기 위하여 OPA법을 사용하였으며, 공지된 방법에 따라 수행하였다 (Shavandi, A. et al., Food Chemistry, 227:194, 2017).
OPA법은 OPA(o-phthaldialdehyde, Sigma Chemical Co.; 미국) 시약이 가수분해 된 펩타이드의 N-말단과 반응하여 흡광을 내는 원리를 이용한 것으로 흡광도가 증가하였다는 것은 OPA와 반응하는 N-말단이 증가하였다는 것이고, 이는 해당 시료의 가수분해가 잘 되었다는 것을 의미한다. 실험에 사용한 OPA 시약은 2.5 ㎖의 SDS (20% w/v), 25 ㎖의 100 mM 사붕산나트륨(sodium tetraborate, Sigma Chemical Co.; 미국), 1 ㎖의 OPA (40 ㎎ OPA/㎖ 메탄올) 및 100 ㎕의 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)을 잘 혼합한 후, 증류수를 이용하여 50 ㎖로 용량을 맞추어서 사용하였다. 탈지 난황 단백 가수분해물 20 ㎕와 제조한 OPA 시약 150 ㎕를 혼합하고 상온에서 2분간 반응 뒤 340 nm에서 흡광도를 측정하여 탈지 난황과 비교 분석 하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 먼저 탈지 난황의 경우, 37 kDa 부근에 큰 사이즈의 단백질이 존재함을 확인할 수 있었으며, 20 kDa, 15 kDa 부근과 10 kDa 부근의 밴드를 확인하여 다양한 크기의 단백질이 존재함을 확인할 수 있었다. 8종의 효소를 이용하여 가수분해를 진행한 가수분해물들의 경우, 모든 효소 가수분해물에서 37 kDa의 가장 큰 단백질이 모두 분해된 것을 확인할 수 있었으며, 펩신 가수분해물을 제외하고는 대부분 10 kDa 이하로 가수분해가 됐음을 확인할 수 있었다.
알칼라아제 가수분해물의 경우, 10 kDa 이하에서 진한 밴드가 확인되었으며, 브로멜라인 가수분해물의 경우, 10 kDa 부근에서 밴드를 확인할 수 있었다. 플라보자임, 뉴트라아제, 판크레아틴 및 프로타멕스 가수분해물의 경우 다른 효소 가수분해물과 비교하였을 때, 같은 농도 (10 ㎎/㎖)로 전기영동을 실시하였음에도 불구하고 밴드의 진하기가 연한 것을 보아 (판크레아틴 가수분해물의 밴드가 가장 연한 것을 확인하였음) 다른 시료에 비해 가수분해가 더 잘 진행되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 위 4가지 효소 가수분해물들 모두 10 kDa 이하에서 밴드가 확인되었다. 펩신 가수분해물의 경우, 탈지 난황에 존재하던 10 kDa 부근의 밴드는 가수분해가 되지 않은 것을 확인할 수 있었고, 다른 효소 가수분해물들과 같이 10 kDa 이하 부근에 주된 밴드를 확인할 수 있었다.
OPA법을 이용한 탈지 난황 단백질 가수분해물의 가수분해율
단백질 분해효소 가수분해물 흡광도(340 nm) 가수분해율 (%)*
탈지 난황(EYE) 0.988 ± 0.067 100
알칼라아제 가수분해물 1.760 ± 0.053 176.12
브로멜라인 가수분해물 1.437 ± 0.048 143.72
플라보자임 가수분해물 2.153 ± 0.061 215.36
뉴트라아제 가수분해물 2.058 ± 0.093 205.94
판크레아틴 가수분해물 2.259 ± 0.090 226.00
파파인 가수분해물 1.099 ± 0.043 109.99
펩신 가수분해물 1.257 ± 0.063 125.74
프로타멕스 가수분해물 1.808 ± 0.045 180.89
*가수분해율 (%) = 100 × (각 시료 흡광도/탈지 난황 흡광도)
표 1에 나타난 바와 같이, 판크레아틴 가수분해율이 가장 높은 것을 확인하였으며, 판크레아틴, 뉴트라아제 및 플라보자임 가수분해물 등이 200%가 넘는 가수분해율을 보여 다른 가수분해물들에 비해 가수분해가 잘 진행되었음을 확인하였다. 즉, 다양한 효소를 사용함에 따라 수득한 탈지 난황 가수분해물의 분자량 패턴과 가수분해 정도가 다름을 확인하였다.
DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity) 측정
본 발명에서는 상기 실시예 2에서 제조한 탈지 난황 단백질 가수분해물의 항산화 활성을 확인하기 위해, 먼저 탈지 난황 단백질 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다. DPPH 라디칼 소거능은 에탄올에 용해된 DPPH 라디칼을 항산화 물질의 전자 공여능으로 환원시키는 원리로, 공지된 방법에 따라 수행하였다 (Lee, J. H. et al., Journal of the Science of Food and Agriculture, 97:4857, 2017).
먼저, 실시예 2에서 제조한 탈지 난황 단백 가수분해물을 농도별로(0.5, 1, 2 ㎎/㎖) 0.5 ㎖씩 시험관에 첨가한 다음, 에탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma Chemical Co.; 미국) 1 ㎖씩 첨가하고, 잘 혼합하여 37 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군(negative control)으로는 증류수를 사용하였으며, 하기 수학식 1을 이용하여 DPPH 라디칼 소거능(%)을 측정하였다.
[수학식 1]
DPPH 라디칼 소거능(%) = [1-(시료 흡광도/음성대조군 흡광도)] Х 100
탈지 난황 단백질 가수분해물에 따른 DPPH 라디칼 소거능
탈지 난황 단백 가수분해물 농도 (㎎/㎖)
0.5 1 2
탈지 난황(EYE) -* - -
알칼라아제 가수분해물 10.47 ± 1.20 21.52 ± 1.90 37.61 ± 4.19
브로멜라인 가수분해물 9.37 ± 1.28 17.32 ± 4.88 27.82 ± 4.74
플라보자임 가수분해물 5.14 ± 0.88 13.58 ± 0.66 19.45 ± 4.97
뉴트라아제 가수분해물 12.55 ± 0.73 24.15 ± 1.19 41.92 ± 1.88
판크레아틴 가수분해물 9.96 ± 1.08 22.45 ± 1.44 43.25 ± 2.99
파파인 가수분해물 4.13 ± 1.49 7.27 ± 3.86 7.93 ± 4.31
펩신 가수분해물 11.08 ± 1.26 14.73 ± 1.76 15.43 ± 2.53
프로타멕스 가수분해물 12.84 ± 1.49 22.25 ± 2.49 38.77 ± 2.25
*수학식 1의 따라 계산한 결과 음의 값을 나타냄.
도 2 및 표 2에 나타난 바와 같이, 대부분의 가수분해물 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, 특히, 판크레아틴(43.25%), 뉴트라아제(41.92%), 프로타멕스(38.77%) 및 알칼라아제(37.61%) 가수분해물이 2 ㎎/㎖에서 30%가 넘는 DPPH 라디칼 소거능을 보여, 가수분해물 중 활성이 우수한 것을 확인하였다. 이 외에도 브로멜라인 가수분해물의 경우 27.82% DPPH 라디칼 소거능을 보였으며, 나머지 효소 가수분해물들 역시 탈지 난황에 비교해 DPPH 라디칼 소거능이 증가한 것을 확인하였다.
ABTS 라디칼 소거능(ABTS radical scavenging activity) 측정
본 발명에서는 상기 실시예 2에서 제조한 탈지 난황 단백질 가수분해물의 항산화 활성을 확인하기 위해, 두 번째로 탈지 난황 단백질 가수분해물의 ABTS 라디칼 소거능을 확인하였다. ABTS 라디칼 소거능은 공지된 방법을 변형하여 측정하였다 (Aloglu, H. S., and Z. Oner., Journal of Dairy Science, 94:5305, 2011)
먼저, 실험을 진행하기 12 ~ 16시간 이전에, 1 ㎖의 인산 완충액(phosphate buffer; 0.1M, pH 7.4)에 녹인 7 mM ABTS 용액(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, Sigma Chemical Co.; 미국)에 1 ㎖의 황산칼슘(potassium sulfate, Sigma Chemical Co.; 미국) 첨가하여 스탁 솔루션(stock solution)을 제조하였다. 일정 시간 후, 734 nm에서 흡광도 0.70 ± 0.02이 되도록 스탁 솔루션을 희석하였다. 제조된 스탁 솔루션 1 ㎖에 탈지 난황 단백 가수분해물이 각각 0.5, 1 및 2 ㎎/㎖이 되도록 10 ㎕씩 처리한 다음, 10분간 37 ℃에서 반응 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
음성대조군 (negative control)으로는 증류수를 사용하였으며, 하기 수학식 2를 이용하여 ABTS 라디칼 소거능(%)을 측정하였다.
[수학식 2]
ABTS 라디칼 소거능(%) = [1-(시료 흡광도/음성대조군 흡광도)] Х 100
탈지 난황 단백질 가수분해물에 따른 ABTS 라디칼 소거능
탈지 난황 단백 가수분해물 농도 (㎎/㎖)
0.5 1 2
탈지 난황(EYE) 2.67 ± 1.75 3.12 ± 1.84 6.64 ± 3.03
알칼라아제 가수분해물 7.20 ± 4.53 14.70 ± 3.73 33.26 ± 3.90
브로멜라인 가수분해물 6.39 ± 3.70 12.33 ± 3.73 25.98 ± 4.49
플라보자임 가수분해물 9.36 ± 3.52 12.05 ± 3.57 25.68 ± 3.05
뉴트라아제 가수분해물 8.39 ± 2.64 22.09 ± 3.97 43.88 ± 7.04
판크레아틴 가수분해물 12.85 ± 4.14 27.31 ± 4.38 49.22 ± 6.40
파파인 가수분해물 3.80 ± 3.15 7.02 ± 3.45 16.69 ± 4.50
펩신 가수분해물 6.01 ± 0.97 10.20 ± 1.21 25.21 ± 3.81
프로타멕스 가수분해물 9.09 ± 1.00 17.03 ± 4.07 38.07 ± 4.65
도 3 및 표 3에 나타난 바와 같이, 탈지 난황 단백질 가수분해물에 따른 ABTS 라디칼 소거능은 DPPH 라디칼 소거능 활성 결과와 유사한 것을 확인하였다. 탈지 난황의 경우, DPPH와 마찬가지로 실험을 진행한 모든 농도에서 10% 미만의 ABTS 라디칼 소거능을 보였으나 8종의 효소를 이용하여 가수분해를 진행한 가수분해물 시료에서는 ABTS 라디칼 소거능이 증가하는 것을 확인하였다.
판크레아틴 가수분해물의 경우, 0.5, 1 및 2 ㎎/㎖에서 각각 12.85, 27.31 및 49.22% ABTS 라디칼 소거능을 보여 8종의 효소 가수분해물 중 가장 효과가 우수한 것을 확인하였으며, 이 외에 뉴트라아제, 알칼라아제 및 프로타멕스 가수분해물의 ABTS 라디칼 소거능이 우수한 것을 확인하였다.
히드록실 라디칼 라디칼 소거능(Hydroxyl radical scavenging activity) 측정
본 발명에서는 상기 실시예 2에서 제조한 탈지 난황 단백질 가수분해물의 항산화 활성을 확인하기 위해, 마지막으로 탈지 난황 단백질 가수분해물의 히드록실 라디칼 소거능을 확인하였다. 히드록실 라디칼 소거능은 과산화수소(hydrogen peroxide) 및 제이철 이온(ferrous ion)과의 펜톤 반응(Fenton reaction)으로부터 발생된 히드록실라디칼을 이용하여 측정하였다 (Leung, R., et al., Food Chemistry, 254:165, 2018).
먼저, 96 웰 플레이트(96 well plate)에 상기 실시예 2에서 제조된 탈지 난황 단백 가수분해물을 각각 0.5, 1 및 2 ㎎/㎖이 되도록 50 ㎕씩 분주한 다음, 각 웰마다 50 ㎕의 3 mM 1,10-페난트롤린(1,10-Phenanthroline, Sigma Chemical Co.; 미국) 및 50 ㎕의 3 mM 황산제이철(iron(Ⅱsulfate, Sigma Chemical Co.; 미국)을 각각 첨가하였다. 그 후, 0.03% 과산화수소(hydrogen peroxide (H2O2), Sigma Chemical Co.; 미국)를 50 ㎕씩 각 웰에 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 반응시킨 다음, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
음성대조군 (negative control)으로는 증류수를 사용하였으며, 과산화수소를 처리하지 않은 군을 블랭크(blank)로 사용하였다. 하기 수학식 3을 이용하여 히드록실 라디칼 소거능(%)을 측정하였다.
[수학식 3]
히드록실 라디칼 소거능(%) = [(시료 흡광도-음성대조군 흡광도)/(블랭크 흡광도-음성대조군 흡광도)] Х 100
탈지 난황 단백질 가수분해물에 따른 히드록실 라디칼 소거능
탈지 난황 단백 가수분해물 농도 (㎎/㎖)
0.5 1 2
탈지 난황(EYE) 2.26 ± 1.21 7.64 ± 2.37 21.46 ± 5.93
알칼라아제 가수분해물 5.41 ± 1.93 10.36 ± 4.05 22.29 ± 7.54
브로멜라인 가수분해물 4.40 ± 1.52 8.73 ± 2.76 21.75 ± 5.61
플라보자임 가수분해물 5.13 ± 1.94 8.18 ± 3.18 20.16 ± 6.97
뉴트라아제 가수분해물 4.04 ± 1.20 8.71 ± 4.06 20.67 ± 8.00
판크레아틴 가수분해물 4.48 ± 1.40 10.47 ± 2.03 29.95 ± 5.12
파파인 가수분해물 4.30 ± 1.13 7.64 ± 1.74 17.52 ± 2.58
펩신 가수분해물 7.04 ± 1.53 10.58 ± 0.93 20.98 ± 2.68
프로타멕스 가수분해물 4.47 ± 1.21 8.18 ± 2.06 18.53 ± 5.34
도 4 및 표 4에 나타난 바와 같이, 탈지 난황 단백질 가수분해물에 따른 히드록실 라디칼 소거능은 상기 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능 결과와는 상이한 결과를 보이는 것을 확인하였다.
탈지 난황의 경우, 다른 두 가지 도 4 및 표 4에 나타난 바와 같이, 탈지 난황 단백질 가수분해물에 따른 히드록실 라디칼 소거능은 상기 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능 결과와는 상이한 결과를 보이는 것을 확인하였다.
탈지 난황의 경우, 다른 두 가지 라디칼 소거능 실험에서는 10% 미만의 라디칼 소거능을 보인 반면에, 히드록실 라디칼의 경우 2 ㎎/㎖에서 21.46%의 라디칼 소거능을 확인하였다. 또한 다른 두 가지 라디칼 소거능 실험 결과의 경우, 효소를 이용한 가수분해를 통해 라디칼 소거능이 증가하는 결과를 얻었었지만 히드록실 라디칼 소거능의 경우에는 판크레아틴 가수분해물(2 ㎎/㎖에서 29.95%의 히드록실 라디칼 소거능을 보임)을 제외하고는 탈지 난황과 큰 효과 차이가 없는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 많은 항산화 활성을 검증하는 연구에서 확인되는 것으로 각 실험법 마다 라디칼 종류의 차이 및 실험 방법에 차이에 기인하는 것으로 보여진다.
결과적으로, 탈지 난황 단백 가수분해물의 항산화 활성을 세 가지 각기 다른 라디칼 소거능 실험을 통해 확인한 결과, 판크레아틴, 뉴트라아제, 알칼라아제 및 프로타멕스 효소 가수분해물 등이 라디칼 소거능에서 우수한 활성을 보여 항산화를 위한 화장료 조성물 및 건강 기능성 식품 소재로 이용될 수 있음을 확인하였다.
탈지 난황 복합 효소 가수분해물 제조 및 활성 확인
7-1 : 탈지 난황 복합 효소 가수분해물 제조
본 발명에서는 탈지난황 효소 가수분해물 제조에 가장 적합한 효소 처리 조건을 확립하기 위해, 항산화 활성 효과가 높은 알칼라아제, 뉴트라아제, 판크레아틴, 프로타멕스를 이용하여 복합 효소 가수분해물을 제조하였다
탈지 난황을 증류수에 녹여 각 효소마다 pH 7로 조정한 뒤, 2%의 비율로 1차 효소를 처리하였다. 4시간 동안 최적 온도에서 가수분해를 진행한 뒤, 2차 효소를 2%의 비율로 처리하여 4시간 동안 추가 가수분해를 진행하였고, 100 ℃에서 10 분간 효소의 불활성화 단계를 거쳤으며, 3,000 × g, 20 분간 원심분리를 한 후, 상등액을 동결건조하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 복합 효소 가수분해물은 다음과 같다:
알칼라아제-뉴트라아제 가수분해물, 알칼라아제-판크레아틴 가수분해물, 알칼라아제-프로타멕스 가수분해물, 뉴트라아제-판크레아틴 가수분해물, 뉴트라아제-프로타멕스 가수분해물, 판크레아틴-프로타멕스 가수분해물 (총 6종).
7-2 : DPPH 라디칼 소거능 확인
상기 실시예 7-1에서 제조한 탈지 난황 복합 효소 가수분해물에 대한 DPPH 라디칼 소거능을 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하고 결과값을 하기 표 5 및 도 5에 나타내었다.
탈지 난황 복합 효소 가수분해물에 따른 DPPH 라디칼 소거능
탈지 난황 단백 가수분해물 농도 (㎎/㎖)
0.5 1 2
탈지 난황(EYE) -* - -
알칼라아제-뉴트라아제
가수분해물		 14.85 ± 2.05 23.89 ± 1.57 40.97 ± 1.79
알칼라아제-판크레아틴
가수분해물		 12.84 ± 3.00 21.99 ± 2.28 40.76 ± 3.40
알칼라아제-프로타멕스
가수분해물		 15.88 ± 3.12 22.93 ± 3.27 39.18 ± 1.45
뉴트라아제-판크레아틴
가수분해물		 12.66 ± 2.57 24.09 ± 2.79 49.83 ± 2.29
뉴트라아제-프로타멕스
가수분해물		 15.28 ± 2.53 26.04 ± 3.34 41.63 ± 3.19
판크레아틴-프로타멕스
가수분해물		 10.98 ± 3.80 21.98 ± 4.90 46.81 ± 3.02
*수학식 1의 따라 계산한 결과 음의 값을 나타냄.
복합 효소 가수분해물의 경우(도 5 및 표 5), 알칼라아제-판크레아틴 가수분해물을 제외한 5종의 시료에서 모두 40 %가 넘는 DPPH 라디칼 소거능을 보였으며, 이는 단독 효소 가수분해물에서 가장 효과가 좋았던 판크레아틴 가수분해물과 비슷한 수치임을 확인할 수 있었다. 가장 효과가 좋았던 복합 효소 가수분해물은 뉴트라아제-판크레아틴 가수분해물과 판크레아틴-프로타멕스 가수분해물로 각각 49.83%, 46.81%의 DPPH 라디칼 소거능을 보이는 것을 확인하였다.
7-3 : ABTS 라디칼 소거능 확인
상기 실시예 7-1에서 제조한 탈지 난황 복합 효소 가수분해물에 대한 ABTS 라디칼 소거능을 실시예 5와 동일한 방법으로 측정하고 결과값을 하기 표 6 및 도 6에 나타내었다.
탈지 난황 복합 효소 가수분해물에 따른 ABTS 라디칼 소거능
탈지 난황 단백 가수분해물 농도 (㎎/㎖)
0.5 1 2
탈지 난황(EYE) 2.67 ± 1.75 3.12 ± 1.84 6.64 ± 3.03
알칼라아제-뉴트라아제 가수분해물 11.17 ± 1.30 26.10 ± 4.90 54.75 ± 7.30
알칼라아제-판크레아틴 가수분해물 13.20 ± 1.18 28.78 ± 3.62 58.31 ± 4.03
알칼라아제-프로타멕스 가수분해물 12.11 ± 0.38 26.37 ± 0.83 57.27 ± 5.67
뉴트라아제-판크레아틴 가수분해물 21.02 ± 5.65 37.37 ± 2.55 68.90 ± 5.25
뉴트라아제-프로타멕스 가수분해물 9.65 ± 2.26 21.79 ± 5.43 46.96 ± 0.69
판크레아틴-프로타멕스 가수분해물 17.41 ± 2.80 42.62 ± 4.31 75.78 ± 7.07
복합 효소 가수분해물의 경우(도 6 및 표 3), 모든 복합 효소 가수분해물에서 단독 효소 가수분해물보다 우수한 라디칼 소거능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 2 mg/mL에서 뉴트라아제-프로타멕스 가수분해물을 제외한 5종의 가수분해물 모두 50%가 넘는 라디칼 소거능을 보였으며, 판크레아틴-프로타멕스 가수분해물의 경우 75.78%로 가장 우수한 높은 라디칼 소거능을 보이는 것을 확인하였고, 다음으로는 뉴트라아제-판크레아틴 가수분해물이 68.90%의 라디칼 소거능을 보였다.
7-4 : 히드록실 라디칼 소거능 확인
상기 실시예 7-1에서 제조한 탈지 난황 복합 효소 가수분해물에 대한 히드록실 라디칼 소거능을 실시예 6와 동일한 방법으로 측정하고 결과값을 하기 표 7 및 도 7에 나타내었다.
탈지 난황 복합 효소 가수분해물에 따른 히드록실 라디칼 소거능
탈지 난황 단백 가수분해물 농도 (㎎/㎖)
0.5 1 2
탈지 난황(EYE) 2.26 ± 1.21 7.64 ± 2.37 21.46 ± 5.93
알칼라아제-뉴트라아제 가수분해물 4.69 ± 4.23 9.52 ± 5.91 18.35 ± 4.86
알칼라아제-판크레아틴 가수분해물 1.13 ± 2.41 4.92 ± 3.87 16.90 ± 5.84
알칼라아제-프로타멕스 가수분해물 4.14 ± 2.85 6.05 ± 3.31 22.96 ± 3.39
뉴트라아제-판크레아틴 가수분해물 1.31 ± 2.61 2.51 ± 2.47 27.15 ± 2.94
뉴트라아제-프로타멕스 가수분해물 1.69 ± 2.96 4.57 ± 1.94 23.60 ± 3.04
판크레아틴-프로타멕스 가수분해물 2.76 ± 3.31 3.84 ± 3.58 17.06 ± 0.78
복합 효소 가수분해물의 경우, 다른 두 가지 라디칼 소거능과는 다르게 단독 효소 가수분해물 혹은 탈지 난황과의 라디칼 소거능의 차이를 보이지 않았다. 단독 효소 가수분해물과 비슷한 수준의 20% 내외의 라디칼 소거능을 보이는 것을 확인하였다.
결과적으로, 복합 효소 가수분해를 진행하였을 때, 뉴트라아제-판크레아틴 효소 조합과 판크레아틴-프로타멕스 효소 조합을 이용하여 복합 효소 가수분해물을 제조하였을 때 라디칼 소거능이 단독 효소 가수분해물보다 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 탈지 난황을 이용한 효소 단독 가수분해물 혹은 복합 효소 가수분해물을 항산화를 위한 화장료 조성물 및 건강 기능성 식품 소재로 이용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 탈지 난황에 뉴트라아제(Neutrase), 판크레아틴(Pancreatin) 및 프로타멕스(Protamex)로 구성된 군에서 선택된 두 개 이상의 단백질 분해효소를 처리하는 단계를 포함하고,
    상기 탈지 난황은
    (a) 계란으로부터 난황 및 난백을 분리한 후, 난황을 45 ~ 65 ℃에서 1 ~ 2시간 동안 진공건조하여 분쇄하는 단계;
    (b) 상기 분쇄한 건조 난황에 80% ~ 99% 에탄올을 첨가하여 45 ~ 65 ℃에서 1 ~ 2시간 동안 추출한 후, 1 ~ 5μm 필터로 여과하는 단계; 및
    (c) 상기 여과된 고형물을 60 ~ 80 ℃에서 2 ~ 4시간 건조하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는,
    탈지 난황 단백질 가수분해물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 뉴트라아제 및 판크레아틴 혼합 효소 또는 판크레아틴 및 프로타멕스 혼합 효소인 것을 특징으로 하는, 탈지 난황 단백질 가수분해물의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소를 pH 6.5 ~7.5, 45 ~ 55 ℃ 조건에서 3 ~ 5시간 동안 처리하여 탈지난황을 가수분해시키는 것을 특징으로 하는, 탈지 난황 단백질 가수분해물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 단백질 분해효소를 불활성화 시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 탈지 난황 단백질 가수분해물의 제조방법.
  6. 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물.
  7. 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 탈지 난황 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 건강 기능성 식품 조성물.
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