KR102274521B1 - 유기인 신경작용제 분해를 위한 재조합 pon1-oph 융합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

유기인 신경작용제 분해를 위한 재조합 pon1-oph 융합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경작용제의 분해를 위해 G-계열 유기인 신경작용제를 분해하는 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질 및 V-계열 유기인 신경작용제를 분해하는 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질을 결합시켜 융합 단백질(fusion-hybrid) 형태를 갖는 재조합 PON1-OPH 융합체로 광범위하게 유기인 신경작용제(OPNAs)를 가수분해함으로써, 유기인 신경작용제로부터 유발되는 질병을 예방 또는 치료하기 위해 각종 의약품의 성분으로 활용될 수 있는 유기인 신경작용제 분해를 위한 재조합 PON1-OPH 융합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

유기인 신경작용제 분해를 위한 재조합 PON1-OPH 융합체 및 이의 제조방법{RECOMBINANT PON1-OPH HYBRID FOR CATALYTIC ORGANOPHOSPHORUS NERVE ARGENT AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 유기인 신경작용제의 분해에 대해 높은 활성과 광범위하게 적용할 수 있는 유기인 신경작용제(OPNAs) 분해의 생체 촉매 효소인 융합 단백질로서 재조합 PON1-OPH 융합체 및 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법에 관한 것이다.
유기인 화합물(organophosphorus compounds, OPs)은 살충제와 제초제로서 화학 농약에 널리 사용되고, 방위 산업 분야에서도 생화학 무기로서 사용되고 있다. 이러한 유기인 화합물로 유기인 신경작용제(organophosphorus nerve agents, OPNAs)는 인간의 체내에 유입되면 신경 전달 효수인 아세트콜린에스터라아제(acertylcholinesterase, AChE)의 활성 저해작용을 일으켜서 근육성 진통을 포함하는 만성적인 합병증 유발 및 생명에 위협을 주는 물질로 밝혀졌다.
신경작용제는 치환기의 종류에 따라 G-계열(G-type)과 V-계열(V-type)으로 구분되며, G-계열 신경작용제에는 사린(Sarin, GB), 소만(Soman, GD), 타분(Tabun, GA) 등이 있고, V-계열 신경작용제로는 VX와 VR 등이 있다. 이들 유기인 신경작용제는 인체에 독성을 미칠 뿐만 아니라 군사 장비 등도 오염시킬 수 있으므로 병사들의 생존성과 전투력에 큰 손실을 줄 수 있다.
이러한 유기인 신경작용제(OPNAs)로부터 유발되는 질병을 예방 또는 치료하기 위해 유기인 신경작용제(OPNAs)를 가수분해할 수 있는 생물 제거제(bioscavenger)의 개발이 이루어지고 있으나, 생물 제거제의 낮은 촉매 활성 및 저 특이성으로 인해 그 활용이 제한적이다.
대한민국공개특허 제10-2010-0128890호
따라서 상기와 같은 점을 감안한 본 발명은 유기인 신경작용제(OPNAs)를 높은 활성으로 분해하여 광범위한 유기인 신경작용제(OPNAs) 중독에 대한 생물 제거제(bioscavenger)로 사용될 수 있도록 재조합 인간 유래 파라옥소나아제1(recombinant human paraoxonase1, rePON1) 돌연변이 단백질과 세균성 유기인 화합물 가수분해효소(bacterial organophosphorus hydrolase, OPH) 돌연변이 단백질을 융합 단백질(fusion-hybrid) 형태를 갖는 재조합 PON1-OPH 융합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체(recombinant PON1-OPH hybrid)는 G-계열 유기인 신경작용제를 분해하는 재조합 파라옥소나제1(recombinant paraoxonase1) 돌연변이 단백질, 및 V-계열 유기인 신경작용제를 분해하는 세균성 유기인 화합물 가수분해효소(bacterial organophosphorus hydrolase) 돌연변이 단백질을 결합시킨 것이다.
본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체에서 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질 및 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질 사이가 링커 서열로 연결된 것이다. 바람직하게는 상기 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질의 아미노산 서열에서 C-말단에 링커 서열 일측 말단이 결합되고, 이 링커 서열 타측 말단에 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 형태를 갖는다.
상기 링커 서열은 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체에서 상기 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질은 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 둘 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 것으로, 이 중에서 아미노산이 치환된 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체에서 상기 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질은 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 둘 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 것으로, 이 중에서 아미노산이 치환된 것이 바람직하다.
또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법은, (a) 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론을 제조하는 단계, (b) 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론을 제조하는 단계, (c) 상기 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론과 상기 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론이 결합하여 이루어진 재조합 PON1-OPH 융합체 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계, (d) 상기 재조합 발현 벡터를 목적 단백질 발현 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 단계, (e) 상기 (d) 단계에서 형질전환된 목적 단백질 발현 숙주세포를 배양하는 단계, 및 (f) 상기 (e) 단계의 배양액으로부터 발현된 목적 단백질인 재조합 PON1-OPH 융합체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법에서 상기 (a) 단계는, 인간 유래 파라옥소나아제1 유전자에 돌연변이(mutation)을 유발시켜 조작된 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론을 제조할 수 있다.
본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법에서 상기 (b) 단계는, 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 유전자에 돌연변이(mutation)을 유발시켜 조작된 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론을 제조할 수 있다.
상기 인간 유래 파라옥소나아제1 유전자와 상기 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 유전자에 돌연변이(mutation)를 유발시키는 방법으로는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 기반 반응으로서, PCR-기반 부위 지정 돌연변이 유발 방법(PCR-based site-directed mutagenesis)이나 실수유발 PCR(Error-prone PCR)을 통한 점 돌연변이(point mutation)으로 무작위로 변형시키는 것이 바람직하나 이에 반드시 한정된 것은 아니며, 이 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 돌연변이 유발 방법을 사용하여 목적하는 단백질을 발현하는 유전자를 제조할 수 있다.
본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법에서 상기 (c) 단계는, 상기 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론이 링커 서열을 통해 상기 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론과 연결되도록 이루어진 재조합 PON1-OPH 융합체 유전자를 함유하는 제조합 발현벡터를 제조할 수 있다.
상기 재조합 PON1-OPH 융합체 유전자는 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질의 아미노산 서열 C-말단에서 링커 서열 일측 말단이 결합되고, 이 링커서열의 타측 말단에 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질이 결합된 형태의 재조합 PON1-OPH 융합체가 코딩하는 유전자이다.
본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법에서 상기 목적 단백질 발현 숙주세포는 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하고, 바람직하게는 대장균을 사용할 수 있으며, 상기 대장균으로는 E. coli BL21(DE3)을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법에서 상기 (f) 단계는, 상기 재조합 PON1-OPH 융합체를 컬럼 크로마토그래피를 통해 배양액으로부터 회수할 수 있다.
상기 컬럼 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피, 겔-여과 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 흡착 크로마토그래피 및 친화성(affinity) 컬럼 크로마토그래피 등을 단독 또는 병용하여 분리 및 정제를 수행할 수 있다.
본 발명의 단백질의 회수 방법은 이에 한정하지 않고 당해 분야에서 공지된 다양한 분리 및 정제방법을 통해 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각(cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올, 이소프로필 알콜 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다.
본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체는 유기인 신경작용제(OPNAs)에 대한 높은 촉매 활성을 갖고, 다양한 계열(type)로 그 종류가 많은 유기인 신경작용제(OPNAs)에 광범위하게 적용되어 분해할 수 있는 효과가 있다.
따라서 본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체를 통해 유기인 신경작용제(OPNAs)로부터 유발되는 질병을 예방 또는 치료하기 위해 각종 의약품의 성분으로 활용되어 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않는다. 언급되지 않은 또 다른 효과는 이하의 상세한 설명으로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 PON1-OPH 융합체 구성을 나타낸 모식도이다.
도 2는 G-계열 신경작용제의 화학 구조식이다.
도 3은 V-계열 신경작용제의 화학 구조식이다.
도 4는 G-계열 신경작용제 유사체의 화학 구조식이다.
도 5는 V-계열 신경작용제 유사체의 화학 구조식이다.
이하 본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체 및 이의 제조방법에 대한 실시예를 첨부된 예시 도면을 참조로 상세히 설명하며, 이러한 실시예는 일례로서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자가 여러 가지 상이한 형태로 구현할 수 있다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 포함한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니므로, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 명세서에서 "돌연변이(mutation)"라는 용어는 본 발명에서 이용되는 야생형의 재조합 파라옥소나제1(rePON1)나, 유기인 화합물 가수분해효소(OPH)를 코딩하는 염기서열에서 발생하는 하나 또는 둘 이상의 염기의 결실, 치환 또는 부가된 서열과 같은 변이가 일어나 단백질을 합성을 할 때 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 지정되도록 하는 변이를 의미한다.
본 발명은 유기인 신경작용제(OPNAs)에 대한 높은 촉매 활성과 광범위하게 적용되어 분해할 수 있는 생물 제거제(bioscavenger)로서, 신경작용제를 분해하는 효소 활성을 갖는 인간 유래 파라옥소나제1(PON1)와 유기인 화합물을 가수분해하는 세균성 유기인 화합물 가수분해효소(OPH)이 결합된 재조합 PON1-OPH 융합체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하며, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명의 바람직한 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정된 것은 아니다.
실시예 1은 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질을 코딩하는 유전자인 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론을 제조에 관한 것이다.
G-계열 유기인 신경작용제(G-type OPNAs)에 대한 재조합 파라옥소나제1(rePON1)의 촉매 활성을 개선하기 위해 야생형 인간 유래 PON1의 아미노산 서열 중 아미노산 16번 내지 355번의 아미노산 서열인 서열번호 1로 표시되는 활성부위(active region)를 PCR 증폭하여 pMTa-hygro-PON1-hFc 플라스미드에 클로닝하고, 상기 클로닝된 pMTa-hygro-PON1-hFc 플라스미드를 pET-21b 벡터에 서브클로닝(subcloning)하여 재조합 파라옥소나제1 발현 유전자를 포함하는 rePON1-4E9 클론을 제조한다. 상기 rePON1-4E9 클론의 재조합 파라옥소나제1 발현 유전자에 돌연변이(mutation)를 유발시키는 방법으로 실수유발 PCR(Error-prone PCR)을 통해 점 돌연변이(point mutation)으로 특정 단백질의 아미노산 서열을 무작위로 변형시켜 최종적으로 생성된 재조합 PON1 돌연변이 클론 중에서 야생형의 재조합 파라옥소나제1인(rePON1-G0) 대비 1.5배 이상 높은 가수분해 활성을 가진 13개의 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론을 선별하였으며, 이를 rePON1-G1 내지 rePON1-G13이라 명명하였다.
실시예 2는 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질을 코딩하는 유전자인 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론을 제조에 관한 것이다.
V-계열 유기인 신경작용제(V-type OPNAs)에 대한 유기인 화합물 가수분해효소(OPH)의 촉매 활성을 개선하기 위해 서열번호 2로 표시되는 Flavobacterium sp. 유래 유기인 화합물 가수분해효소(OPH)에 대한 아미노산 서열 29 내지 365번 아미노산까지의 활성부위(active region) 서열을 PCR 증폭하여 pET-21b 벡터에 클로닝하여 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 발현 유전자를 포함하는 세균성 OPH-L271/Y309A 클론 또는 OPH-11M 클론을 제조한다. 상기 세균성 OPH-L271/Y309A 클론 또는 OPH-11M 클론의 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 발현 유전자에 돌연변이(mutation)를 유발시키는 방법으로 PCR-기반 부위 지정 돌연변이 유발 방법(PCR-based site-directed mutagenesis)에 의해 생성된 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론 중에서 야생형의 유기인 화합물 가수분해효소(OPH-V0) 대비 1.5배 이상 높은 가수분해 활성을 가진 6개의 돌연변이 클론을 선별하여 V1 내지 V6으로 명명되는 6개의 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론을 수득하였다.
실시예 3은 재조합 PON1-OPH 융합체 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제조에 관한 것이다.
상기 실시예 1에서 제조된 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론 중 하나와 상기 실시예 2에서 제조된 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론 중 하나가 유연한 링커(flexible linker)를 사용하여 말단 융합(end-to-end fusion)을 통해 G-계열과 V-계열 유기인 신경 작용제를 보다 효율적으로 가수분해할 수 있는 GV-하이브리드 효소(GV-hybrid enzyme)인 재조합 PON1-OPH 융합체가 코딩된 유전자가 pET-21 벡터에 클로닝하여, 최종적으로 재조합 PON1-OPH 융합체를 발현하는 재조합 발현벡터를 제조한다.
즉, 상기 재조합 발현벡터에 포함되는 재조합 PON1-OPH 융합체 유전자는 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질의 아미노산 서열 C-말단에서 서열번호 3으로 표시되는 링커 서열 일측 말단이 결합되고, 이 링커서열의 타측 말단에 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질이 결합된 형태의 재조합 PON1-OPH 융합체가 코딩한다.
실시예 4는 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조된 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론, 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론, 및 재조합 PON1-OPH 융합체 유전자를 목적 단백질 발현 숙주세포에 도입하여 형질전환하여 각각 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질, 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질, 및 재조합 PON1-OPH 융합체를 발현하는 목적 단백질 발현 숙주세포를 제조하며, 이때 상기 숙주세포는 대장균으로 E. Coli BL21(DE3)을 사용한다.
실시예 5는 상기 실시예 4에서 형질전환된 목적 단백질 발현 숙주세포에서 목적 단백질을 발현시키고, 발현되는 목적 단백질을 분리 및 정제에 관한 것이다.
상기 실시예 4에서 형질전환된 목적 단백질 발현 숙주세포에 0.1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 30℃에서 3시간 동안 처리하여 목적 단백질인 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질, 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질, 및 재조합 PON1-OPH 융합체 각각의 단백질 발현을 유도한다. 단백질이 유도된 숙주세포는 원심분리를 통해 수득하여 초음파분쇄를 한 후, Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 수행한 후, 최종 투석 정제 공정을 통해 Ni-NTA 컬럼으로부터 목적 단백질을 분리 및 정제한다.
투석 정제 공정에서 Ni-NTA 컬럼으로부터 목적 단백질로 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질을 분리 및 정제할 경우, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 1 mM CaCl2의 조성을 갖는 PON1 버퍼(PON1 buffer)를 이용하여 4℃의 온도로 24시간 동안 투석한다.
투석 정제 공정에서 Ni-NTA 컬럼으로부터 목적 단백질로 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질을 분리 및 정제할 경우, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 0.2 mM ZnCl2의 조성을 갖는 OPH 버퍼(OPH buffer)를 이용하여 4℃의 온도로 24시간 동안 투석한다.
투석 정제 공정에서 Ni-NTA 컬럼으로부터 목적 단백질로 재조합 PON1-OPH 융합체를 분리 및 정제할 경우, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.2 mM ZnCl2의 조성을 갖는 GV 버퍼(GV buffer)를 이용하여 4℃의 온도로 24시간 동안 투석한다.
상기 실시예 5에 따라 분리 및 정제된 목적 단백질로 조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질, 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질, 및 재조합 PON1-OPH 융합체가 제대로 발현되어 분리 및 정제되었는지 확인하기 위해 상기 실시예 5를 통해 제조된 단백질을 10% SDS-PAGE 전기영동(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용하여 분리한 뒤, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue, CBB) 염색법으로 염색하였으며, Protein Assay Kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다.
그 결과 본 발명에 도면에 도시되지 않았으나, 본 발명의 실시예를 통해 분리 정제된 단백질은 99% 이상의 순도로 정제됨을 확인할 수 있었다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 PON1-OPH 융합체 구성을 나타낸 모식도이다.
도 1에 도시된 바와 같이 G-계열 유기인 신경작용제를 분해할 수 있는 재조합 파라옥소나제1(rePON1) 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal)에는 V-계열 유기인 신경작용제를 분해할 수 있는 세균성 유기인 화합물 가수분해효소(OPH)를 유연성 링커(flexible linker)인 서열번호 3의 2×(G4S)로 연결함으로써 재조합 PON1-OPH 융합체 구성한다.
실험예 1은 앞서 실시예들을 통해 제조된 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질, 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질, 및 재조합 PON1-OPH 융합체에 대한 유기인 신경작용제 유사체에서의 효소 활성을 측정하기 위해서 실험을 수행한 것이다.
도 2에서처럼 G-계열 신경작용제로는 사린(Sarin, GB), 소만(Soman, GD), 타분(Tabun, GA)와 유사한 화학 구조식을 가진 신경작용제 유사체로서 도 4에 도시된 것과 같은 파라옥손(paraoxon), P-니트로페닐디페닐인산(PNPDPP), 및 다이아이소프로필플루오로인산(diisopropylfluorophosphate, DFP)가 있으며, 도 3에서처럼 V-계열 신경작용제로는 VX와 VR의 화학 구조식과 유사한 화학 구조식을 가진 신경 작용제 유사체로서 도 5에 도시된 것과 같은 디메톤-S-메틸(Demeton-S-methyl, DSM), 말라티온(Malathion)이 있다.
본원발명의 실험예에서 사용된 유기인 신경작용제 유사체로 파라옥손(paraoxon), 다이아이소프로필플루오로인산(DFP), 및 디메톤-S-메틸(DSM)을 포함한 사용되는 대부분 화학물질은 시그마알드리치 사(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, P-니트로페닐디페닐인산(PNPDPP)은 국방과학 연구소로부터 제공받아 사용하였다.
파라옥손(paraoxon)에 대한 본 발명의 목적 단백질의 효소 활성을 측정방법은 상기 실시예들에 따라 분리 정제된 목적 단백질을 96-well plate에서 최종부피가 200 ul 부피가 되도록 0.02mM 내지 0.8mM 파라옥손과 0.1㎍의 정제된 목적 단백질이 반응 용액(50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM CaCl2, 0.2 mM ZnCl2)에 첨가한 후, 5분 동안 25℃ 온도조건으로 412nm 파장에서 흡광도를 측정하여 효소 활성반응을 측정한다. 이때, 412nm의 파장에서 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 흡광계수는 17,100 M-1cm-1이었다.
또 다른 효소 활성 측정 방법으로 다이아이소프로필플루오로인산(DFP)에 대한 목적 단백질의 효소 활성 측정방법은 상기 실시예들에 따라 분리 정제된 목적 단백질을 96-well plate에서 최종부피가 200 ul 부피가 되도록 0.05mM 내지 1mM DFP와 0.5㎍의 정제된 목적 단백질이 0.004% 페놀레드(phenol red), 2.0 mM HEPES(pH 8.0), 2 mM CaCl2 조성을 갖는 반응용액을 넣고, 422nm 파장에서 흡광도를 측정하여 25℃ 온도에서 5분 동안 효소 활성을 측정하였다.
또 다른 효소 활성 측정 방법으로 P-니트로페닐디페닐인산(PNPDPP)에 대한 목적 단백질의 효소 활성 측정방법은 상기 실시예들에 따라 분리 정제된 목적 단백질을 96-well plate에서 최종부피가 200 ul 부피가 되도록 0.005mM 내지 0.1mM P-니트로페닐디페닐인산(PNPDPP)과 0.3㎍의 정제된 목적 단백질이 반응 용액(50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 % DMSO, 10 mM CaCl2, 0.2 mM ZnCl2)에 첨가한 후, 5분 동안 25℃ 온도조건으로 412nm 파장에서 흡광도를 측정하여 효소 활성반응을 측정한다. 이때, 412nm의 파장에서 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 흡광계수는 17,100 M-1cm-1이었다.
또 다른 효소 활성 측정 방법으로 디메톤-S-메틸(DSM)에 대한 목적 단백질의 효소 활성 측정 방법은 상기 실시예들에 따라 분리 정제된 목적 단백질을 96-well plate에서 최종부피가 200 ul 부피가 되도록 0.6mM 내지 3.6mM DSM과 5.0㎍의 정제된 목적 단백질이 반응 용액(50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 100 mM NaCl, 0.5 mM 5´,5´-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), 10 mM CaCl2, 0.2 mM ZnCl2)에 첨가한 후, 5분 동안 25℃ 온도조건으로 412nm 파장에서 흡광도를 측정하여 효소 활성반응을 측정한다. 412nm의 파장에서 2-nitro-5-thiobenzonate의 흡광계수는 13,600 M-1cm-1이었다.
그리고 효소의 Kcat/Km값은 상기 효소활성도를 측정한 후 얻어진 흡광도 값 데이터로부터 미하엘리스-멘텐 방정식(Michaelis-Menten equation)을 이용하여 Kcat값, Km값, 및 Kcat/Km값을 계산하였으며, 그 결과 값은 하기 표 1 내지 표 12에 나타내었다.
이하 표들에서 설명하는 ‘WT’는 야생형(Wild type)을 의미하고, ‘없음’은 측정 값 없음을 나타낸다. 또한 돌연변이 구성은 본 실시예의 재조합 PON1 돌연변이 단백질 및 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이의 위치를 나타낸 것으로, 예를 들어 H251Q은 아미노산 서열 중 251번째 아미노산 히스티딘(Histidine, H)가 글루타민(Glutamine, Q)으로 치환된 것을 의미하며, 하기 표들에서 나타낸 돌연변이 구성들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
표 1 내지 표 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리 정제된 재조합 PON1 돌연변이 단백질을 이용하여 G-계열 신경작용제 유사체에 대한 분해율을 통해 효소활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
표 1은 G-계열 신경작용제 유사체로 파라옥손(paraoxon)의 분해율이고, 표 2는 P-니트로페닐디페닐인산(PNPDPP)의 분해율이며, 표 3은 디아이소프로필플루오로인산(DFP)의 분해율을 나타낸다.
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00001
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00002
(μM)
Figure 112020018260463-pat00003
/
Figure 112020018260463-pat00004

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to WT)		 Fold
증가
(to G0)
WT 4.7±0.13 1682±96.5 0.003±0.0001 1.0
G0 (rePON1-4E9) 6.3±0.09 52.4±1.5 0.12±0.01 42.9 1.0
G1 H251Q 7.6±0.14 40.3±0.7 0.19±0.01 67.9 1.6
G2 N43K/Q329H 2.6±0.12 39.6±6.0 0.07±0.01 25.0 0.6
G3 S193A 10.6±0.09 54.8±2.3 0.19±0.01 67.9 1.6
G4 F264L 8.3±0.06 25.6±0.7 0.32±0.01 114.3 2.7
G5 T257A 8.6±0.32 39.9±3.1 0.22±0.01 78.6 1.8
G6 S193A/F264L 8.0±0.25 18.3±5.5 0.43±0.12 153.6 3.6
G7 S193A/H251Q 9.8±0.60 32.9±0.2 0.30±0.02 107.1 2.5
G8 H251Q/F264L 7.6±0.36 21.3±4.7 0.36±0.06 128.6 3.0
G9 S193A/H251Q/F264L 19.3±0.19 33.6±0.2 0.57±0.01 203.6 4.8
G10 S193A/T257A/F264L 19.6±0.79 37.0±5.0 0.53±0.05 189.3 4.4
G11 S193A/H251Q/T257A 16.1±0.35 40.4±6.3 0.40±0.07 142.8 3.3
G12 H251Q/T257A/F264L 21.8±0.22 67.7±8.9 0.32±0.04 114.3 2.7
G13 S193A/H251Q/T257A/F264L 16.6±0.08 33.2±0.8 0.50±0.01 178.6 4.2
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00005
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00006
(μM)
Figure 112020018260463-pat00007
/
Figure 112020018260463-pat00008

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to WT)		 Fold
증가
(to G0)
WT 없음 없음 없음 없음
G0 (rePON1-4E9) 4.2±0.12 18.9±1.8 0.23±0.01 없음 1.0
G1 H251Q 3.4±0.11 12.9±1.0 0.26±0.01 없음 1.2
G2 N43K/Q329H 없음 없음 없음 없음 없음
G3 S193A 6.8±0.06 18.6±0.6 0.37±0.02 없음 1.6
G4 F264L 5.4±0.08 12.1±0.3 0.45±0.02 없음 2.0
G5 T257A 5.0±0.01 15.2±1.7 0.33±0.04 없음 1.5
G6 S193A/F264L 3.3±0.10 7.9±0.1 0.41±0.01 없음 1.8
G7 S193A/H251Q 6.0±0.19 16.3±0.9 0.37±0.01 없음 1.6
G8 H251Q/F264L 4.7±0.01 10.8±0.1 0.44±0.01 없음 1.9
G9 S193A/H251Q/F264L 12.9±0.26 9.9±0.6 1.31±0.11 없음 5.8
G10 S193A/T257A/F264L 15.3±0.02 11.8±0.2 1.30±0.03 없음 5.8
G11 S193A/H251Q/T257A 12.4±0.13 12.7±0.1 0.98±0.01 없음 4.4
G12 H251Q/T257A/F264L 10.1±0.81 17.8±2.6 0.57±0.04 없음 2.5
G13 S193A/H251Q/T257A/F264L 17.4±0.24 16.5±0.2 1.05±0.01 없음 4.7
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00009
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00010
(μM)
Figure 112020018260463-pat00011
/
Figure 112020018260463-pat00012

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to WT)		 Fold
증가
(to G0)
WT 406.5±16.7 1717.0±25.5 0.24±0.01 1.00
G0 (rePON1-4E9) 155.3±6.1 111.1±11.2 1.40±0.09 5.93 1.00
G1 H251Q 144.6±0.3 126.0±60.5 1.30±0.62 5.43 0.92
G2 N43K/Q329H 없음 없음 없음 없음 없음
G3 S193A 180.0±21.2 131.3±31.5 1.39±0.17 5.88 0.99
G4 F264L 195.6±9.8 158.4±21.1 1.25±0.23 5.28 0.89
G5 T257A 242.9±24.5 281.4±23.5 0.86±0.01 3.64 0.62
G6 S193A/F264L 없음 없음 없음 없음 없음
G7 S193A/H251Q 163.8±31.1 370.9±24.4 0.53±0.26 2.23 0.38
G8 H251Q/F264L 132.9±15.0 170.5±18.1 0.79±0.17 3.33 0.56
G9 S193A/H251Q/F264L 347.3±12.0 181.2±12.2 1.92±0.20 8.13 1.37
G10 S193A/T257A/F264L 238.7±28.4 169.9±46.2 1.44±0.22 6.07 1.02
G11 S193A/H251Q/T257A 289.1±10.4 212.2±33.5 1.38±0.17 5.81 0.98
G12 H251Q/T257A/F264L 299.1±8.7 304.4±14.8 0.98±0.02 4.16 0.70
G13 S193A/H251Q/T257A/F264L 318.9±15.6 235.6±53.3 1.38±0.25 5.84 0.99
상기 표 1 내지 표 3에 도시된 바와 같이 재조합 PON1 돌연변이 단백질의 G-계열 유기인 신경작용제 유사체의 분해 활성을 측정한 결과, 파라옥손(paraoxon)과 P-니트로페닐디페닐인산(PNPDPP)에서 개선된 분해 활성 효율을 보였으나, 상대적으로 표 3에 나타낸 바와 같이 디아이소프로필플루오로인산(DFP)의 분해율은 가수분해에 영향을 미치지 않는 것이 관찰되었다.
표 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리 정제된 재조합 PON1 돌연변이 단백질을 이용하여 V-계열 신경작용제 유사체로 DSM의 분해율을 나타낸다.
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00013
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00014
(μM)
Figure 112020018260463-pat00015
/
Figure 112020018260463-pat00016

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to WT)		 Fold
증가
(to G0)
WT 없음 없음 없음 없음
G0 (rePON1-4E9) 0.027±0.003 1161±272 23.3±2.99 없음 1.00
G10 S193A/T257A/F264L 없음 없음 없음 없음 없음
G11 S193A/H251Q/T257A 없음 없음 없음 없음 없음
G12 H251Q/T257A/F264L 0.038±0.004 1700±412 22.6±2.85 없음 0.97
G13 S193A/H251Q/T257A/F264L 없음 없음 없음 없음 없음
상기 표 4에 나타낸 바와 같이 재조합 PON1 돌연변이 단백질은 V-계열 신경작용제 유사체인 DSM의 가수분해에 영향을 미치지 않는 것이 관찰되었다.
표 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리 정제된 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질를 이용하여 V-계열 신경작용제 유사체로 DSM의 분해율을 나타낸다.
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00017
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00018
(μ
Figure 112020018260463-pat00019
/
Figure 112020018260463-pat00020

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to WT)		 Fold
증가
(to V0)
WT 없음 없음 없음
V0 (OPH-11M) 0.13±0.01 1513.5±108.2 83.5±2.0 없음 1.00
V1 K159E/T117A 0.49±0.05 2946.0±277.7 165.9±2.6 없음 1.99
V2 K77A/K159E/T177A 0.37±0.01 1580.5±303.3 237.3±37.3 없음 2.84
V3 K159E/T173N/T177A 0.29±0.02 1058.0±128.7 193.3±6.3 없음 2.32
V4 K159E/T177A/H254G 0.69±0.08 7425.5±245.2 93.2±4.2 없음 1.12
V5 K159E/T173N/T177A/H254G 없음 없음 없음 없음 없음
V6 K77A/K159E/T173N/T177A/H254G 없음 없음 없음 없음 없음
상기 표 5에 나타낸 바와 같이 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질은 V-계열 신경작용제 유사체인 DSM의 분해 효율이 상기 표 4에 나타낸 것과 비교하였을 때 향상된 것을 확인할 수 있다.
표 6 내지 표 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리 정제된 OPH 변이체를 이용하여 G-계열 신경작용제 유사체에 대한 분해율을 통해 효소활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 표 6은 G-계열 신경작용제 유사체로 파라옥손(paraoxon)의 분해율이고, 표 7은 P-니트로페닐디페닐인산(PNPDPP)의 분해율이며, 표 8은 다이아이소프로필플루오로인산(DFP)의 분해율을 나타낸다.
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00021
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00022
(μM)
Figure 112020018260463-pat00023
/
Figure 112020018260463-pat00024

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to WT)		 Fold
증가
(to V0)
WT 2353.2±92.6 204.7±17.0 11.5±0.5 1.00
V0 (OPH-11M) 752.1±42.3 250.8±26.7 3.5±0.2 0.26 1.00
V1 K159E/T117A 2245.3±242.5 510.7±12.4 4.5±0.6 0.39 1.49
V2 K77A/K159E/T177A 3092.8±27.6 580.2±10.5 5.3±0.1 0.46 1.77
V3 K159E/T173N/T177A 1595.7±4.9 328.9±21.5 4.9±0.3 0.42 1.632
V4 K159E/T177A/H254G 703.6±6.9 262.7±6.9 2.7±0.1 0.23 0.89
V5 K159E/T173N/T177A/H254G 763.2±2.2 349.0±15.9 2.2±0.1 0.19 0.73
V6 K77A/K159E/T173N/T177A/H254G 1148.0±118.3 691.5±64.3 1.7±0.1 0.14 0.55
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00025
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00026
(μM)
Figure 112020018260463-pat00027
/
Figure 112020018260463-pat00028

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to WT)		 Fold
증가
(to V0)
WT 83.8±2.7 51.3±1.4 1.6±0.01 1.00
V0 (OPH-11M) 28.7±0.3 28.7±0.8 1.0±0.02 0.61 1.00
V1 K159E/T117A 46.8±0.1 11.6±0.1 4.0±0.03 2.46 4.02
V2 K77A/K159E/T177A 67.2±2.2 17.5±1.9 3.0±0.16 1.87 3.05
V3 K159E/T173N/T177A 48.5±1.4 22.1±1.9 3.5±0.37 2.15 3.50
V4 K159E/T177A/H254G 33.3±0.1 18.0±0.4 3.6±0.14 2.23 3.65
V5 K159E/T173N/T177A/H254G 34.5±4.7 13.9±2.9 2.3±0.04 1.42 2.31
V6 K77A/K159E/T173N/T177A/H254G 19.1±0.1 11.0±1.1 2.2±0.27 1.36 2.22
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00029
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00030
(μM)
Figure 112020018260463-pat00031
/
Figure 112020018260463-pat00032

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to WT)		 Fold
증가
(to V0)
WT 5008.7±22.1 262.3±8.1 19.1±0.5 1.00
V0 (OPH-11M) 562.1±5.8 31.7±2.8 17.8±1.4 0.93 1.00
V1 K159E/T117A 875.3±1.4 33.0±0.3 26.5±0.3 1.39 1.49
V2 K77A/K159E/T177A 822.1±3.0 22.1±0.1 37.2±0.3 1.95 2.09
V3 K159E/T173N/T177A 794.7±5.8 19.9±0.9 39.9±1.5 2.09 2.25
V4 K159E/T177A/H254G 4829.9±674.6 461.5±159.7 10.9±2.3 0.57 0.61
V5 K159E/T173N/T177A/H254G 4263.7±866.5 1758.2±127.8 2.8±0.9 0.14 0.16
V6 K77A/K159E/T173N/T177A/H254G 2132.7±327.1 1615.5±355.7 1.3±0.1 0.07 0.07
상기 표 6 내지 표 8에 나타낸 바와 같이 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질의 G-계열 유기인 신경작용제 유사체의 분해 활성을 측정한 결과, P-니트로페닐디페닐인산(PNPDPP)에서 개선된 분해 활성 효율을 보였으나, 파라옥손(paraoxon)과 디아이소프로필플루오로인산(DFP)의 분해율은 가수분해에 영향을 미치지 않는 것이 관찰되었다.
표 9 내지 표 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리 정제된 재조합 PON1-OPH 융합체(GV-hybrid)를 이용하여 G-계열 신경작용제 유사체에 대한 분해율을 통해 효소활성(Catalytic rate)을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 표 9은 G-계열 신경작용제 유사체로 파라옥손(paraoxon)의 분해율이고, 표 10은 PNPDPP의 분해율이며, 표 11은 다이아이소프로필플루오로인산(DFP)의 분해율을 나타낸다.
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00033
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00034
(μM)
Figure 112020018260463-pat00035
/
Figure 112020018260463-pat00036

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to G0)		 Fold
증가
(to V0)		 Fold
증가
(to GV0)
G0 (rePON1-4E9) 9.1±0.01 29.4±0.6 0.3±0.01 1.0
V0 (OPH-11M) 705.3±16.59 220.4±1.1 3.2±0.06 10.4 1.0
GV0 G0-V0 hybrid 146.1±8.26 27.7±4.7 5.3±0.59 17.2 1.7 1.0
GV1 G0-V1 hybrid 3024.7±99.40 214.4±9.0 14.1±0.13 45.7 4.4 2.7
GV2 G9-V2 hybrid 3271.3±47.17 247.9±4.7 13.2±0.06 42.7 4.1 2.5
GV3 G9-V3 hybrid 2366.3±35.38 219.3±6.7 10.8±0.49 35.0 3.4 2.0
GV4 G10-V2 hybrid 3061.6±29.20 184.9±12.5 16.6±0.96 53.7 5.2 3.1
GV5 G10-V3 hybrid 1541.1±25.27 105.3±4.7 14.7±0.42 47.5 4.6 2.8
GV6 G11-V2 hybrid 1676.6±59.53 105.3±13.0 16.0±1.41 51.8 5.0 3.0
GV7 G11-V3 hybrid 3258.6±51.67 54.5±0.9 59.8±0.06 193.7 18.7 11.3
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00037
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00038
(μM)
Figure 112020018260463-pat00039
/
Figure 112020018260463-pat00040

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to G0)		 Fold
증가
(to V0)		 Fold
증가
(to GV0)
G0 (rePON1-4E9) 4.0±0.2 23.0±2.5 0.2±0.01 1.0
V0 (OPH-11M) 29.0±2.3 31.1±5.3 0.9±0.09 5.4 1.0
GV0 G0-V0 hybrid 17.0±0.3 3.0±0.1 5.7±0.20 33.0 6.2 1.0
GV1 G0-V1 hybrid 73.0±1.0 16.7±2.1 4.4±0.48 25.0 4.7 0.8
GV2 G9-V2 hybrid 96.3±3.0 29.2±0.8 3.3±0.20 18.8 3.5 0.6
GV3 G9-V3 hybrid 68.6±2.2 37.4±2.5 2.1±0.88 12.1 2.3 0.4
GV4 G10-V2 hybrid 81.9±1.6 21.7±5.4 3.8±0.47 21.8 4.1 0.7
GV5 G10-V3 hybrid 65.3±4.6 16.0±5.6 4.3±1.22 24.4 4.6 0.8
GV6 G11-V2 hybrid 98.0±7.2 21.6±3.6 4.6±0.42 26.0 4.9 0.8
GV7 G11-V3 hybrid 155.5±3.7 29.7±0.6 5.2±0.02 29.8 5.6 0.9
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00041
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00042
(μM)
Figure 112020018260463-pat00043
/
Figure 112020018260463-pat00044

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to G0)		 Fold
증가
(to V0)		 Fold
증가
(to GV0)
G0 (rePON1-4E9) 176.8±17.3 86.5±30.1 2.1±0.5 1.0
V0 (OPH-11M) 556.2±9.1 31.1±1.9 17.9±0.8 8.4 1.0
GV0 G0-V0 hybrid 621.5±6.8 519.5±31.7 1.2±0.1 0.6 0.1 1.0
GV1 G0-V1 hybrid 882.4±27.0 29.6±4.6 30.1±3.7 14.1 1.7 25.1
GV2 G9-V2 hybrid 825.2±13.5 22.3±4.3 37.9±7.8 17.8 2.1 31.6
GV3 G9-V3 hybrid 685.6±60.7 140.7±42.6 5.0±1.1 2.4 0.3 4.2
GV4 G10-V2 hybrid 908.6±2.2 31.5±3.2 29.0±3.0 13.6 1.6 24.2
GV5 G10-V3 hybrid 899.4±1.7 19.4±5.9 48.7±14.9 22.8 2.7 40.6
GV6 G11-V2 hybrid 838.3±32.0 35.6±9.1 24.2±5.3 11.3 1.4 20.2
GV7 G11-V3 hybrid 1039.2±2.8 22.3±2.9 47.0±6.0 22.0 2.6 39.2
상기 표 9 내지 표 11에 나타낸 바와 같이 재조합 PON1-OPH 융합체의 G-계열 유기인 신경작용제 유사체의 분해 활성을 측정한 결과, 파라옥손(paraoxon), P-니트로페닐디페닐인산(PNPDPP), 디아이소프로필플루오로인산(DFP) 모두에서 앞서 표 1 내지 표 3, 표 6 내지 표 8에서 나타낸 G-계열 유기인 신경작용제 유사체 분해율 보다 높은 가수분해 효소 활성이 관찰되었다.
표 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리 정제된 재조합 PON1-OPH 변이체(GV-hybrid)를 이용하여 V-계열 신경작용제 유사체인 DSM에 대한 분해율을 통해 효소활성(Catalytic rate)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
Clone 돌연변이 구성
Figure 112020018260463-pat00045
(min-1)
Figure 112020018260463-pat00046
(μM)
Figure 112020018260463-pat00047
/
Figure 112020018260463-pat00048

(×106M-1min-1)		 Fold
증가
(to G0)		 Fold
증가
(to V0)		 Fold
증가
(to GV0)
G0 (rePON1-4E9) 0.02±0.01 1054.6±934.1 14.6±1.9 1.0
V0 (OPH-11M) 0.13±0.01 1637.5±252.4 77.5±9.8 5.6 1.0
GV0 G0-V0 hybrid 0.06±0.09 1210.6±612.9 5.0±1.1 0.3 0.1 1.0
GV1 G0-V1 hybrid 0.22±0.01 748.9±181.4 295.6±52.9 20.3 3.8 59.1
GV2 G9-V2 hybrid 0.17±0.02 832.2±236.8 214.0±38.4 14.7 2.8 42.8
GV3 G9-V3 hybrid 0.12±0.01 680.1±345.4 206.6±90.1 14.2 2.7 41.3
GV4 G10-V2 hybrid 0.23±0.01 708.6±99.5 324.0±28.9 22.2 4.2 64.8
GV5 G10-V3 hybrid 0.29±0.12 10964.5±5736.8 28.1±5.1 1.9 0.4 5.6
GV6 G11-V2 hybrid 0.14±0.02 593.8±159.8 234.8±37.9 16.1 3.0 46.9
GV7 G11-V3 hybrid 0.22±0.01 432.5±45.7 504.3±48.5 34.6 6.5 100.9
상기 표 12에 나타낸 바와 같이 재조합 PON1-OPH 융합체의 V-계열 유기인 신경작용제 유사체의 분해 활성을 측정한 결과, 상기 표 4와 표 5에 나타낸 V-계열 신경작용제 유사체인 DSM의 분해율 보다 높은 가수분해 효소 활성이 관찰되었다.
따라서 본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체는 앞서 실험예의 유기인 신경작용제 유사체의 분해 활성을 확인한 결과로부터 G-계열 유기인 신경작용제 유사체 및 V-계열 유기인 신경작용제 유사체 모두에서 분해 활성이 월등히 향상된 것을 알 수 있다.
상기 실험예에서는 유기인 신경작용제 유사체(simulants)를 사용하여 실험을 수행하였지만 결과적으로 이는 실제 유기인 신경작용제에서도 동일하거나 유사한 분해 활성을 나타낼 것으로 기술 분야의 통상의 지식을 가진자에게 충분히 예측되며, 따라서 본 발명의 재조합 PON1-OPH 융합체가 유기인 신경작용제(OPNAs)에 광범위하게 적용되어 분해하는 보다 적합한 생물 제거제(bioscavenger)의 성분으로서 유기인 신경작용제(OPNAs)로부터 유발되는 질병을 예방 또는 치료하기 위해 각종 의약품의 성분으로 활용될 수 있다.
앞서 살펴본 실시 예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자(이하 '당업자'라 한다)가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하는 바람직한 실시 예일 뿐, 전술한 실시 예 및 첨부한 도면에 한정되는 것은 아니므로 이로 인해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다. 따라서 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것이 당업자에게 있어 명백할 것이며, 당업자에 의해 용이하게 변경 가능한 부분도 본 발명의 권리범위에 포함됨은 자명하다.
<110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT <120> RECOMBINANT PON1-OPH HYBRID FOR CATALYTIC ORGANOPHOSPHORUS NERVE ARGENT AND MANUFACTURING METHOD THEREOF <130> AD190085 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> paraoxonase 1 <400> 1 Met Leu Phe Arg Asn His Gln Ser Ser Tyr Gln Thr Arg Leu Asn Ala 1 5 10 15 Leu Arg Glu Val Gln Pro Val Glu Leu Pro Asn Cys Asn Leu Val Lys 20 25 30 Gly Ile Glu Thr Gly Ser Glu Asp Leu Glu Ile Leu Pro Asn Gly Leu 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Leu Lys Tyr Pro Gly Ile Lys Ser Phe Asn 50 55 60 Pro Asn Ser Pro Gly Lys Ile Leu Leu Met Asp Leu Asn Glu Glu Asp 65 70 75 80 Pro Thr Val Leu Glu Leu Gly Ile Thr Gly Ser Lys Phe Asp Val Ser 85 90 95 Ser Phe Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Thr Asp Glu Asp Asn Ala 100 105 110 Met Tyr Leu Leu Val Val Asn His Pro Asp Ala Lys Ser Thr Val Glu 115 120 125 Leu Phe Lys Phe Gln Glu Glu Glu Lys Ser Leu Leu His Leu Lys Thr 130 135 140 Ile Arg His Lys Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asp Ile Val Ala Val Gly 145 150 155 160 Pro Glu His Phe Tyr Gly Thr Asn Asp His Tyr Phe Leu Asp Pro Tyr 165 170 175 Leu Gln Ser Trp Glu Met Tyr Leu Gly Leu Ala Trp Ser Tyr Val Val 180 185 190 Tyr Tyr Ser Pro Ser Glu Val Arg Val Val Ala Glu Gly Phe Asp Phe 195 200 205 Ala Asn Gly Ile Asn Ile Ser Pro Asp Gly Lys Tyr Val Tyr Ile Ala 210 215 220 Glu Leu Leu Ala His Lys Ile His Val Tyr Glu Lys His Ala Asn Trp 225 230 235 240 Thr Leu Thr Pro Leu Lys Ser Leu Asp Phe Asn Thr Leu Val Asp Asn 245 250 255 Ile Ser Val Asp Pro Glu Thr Gly Asp Leu Trp Val Gly Cys His Pro 260 265 270 Asn Gly Met Lys Ile Phe Phe Tyr Asp Ser Glu Asn Pro Pro Ala Ser 275 280 285 Glu Val Leu Arg Ile Gln Asn Ile Leu Thr Glu Glu Pro Lys Val Thr 290 295 300 Gln Val Tyr Ala Glu Asn Gly Thr Val Leu Gln Gly Ser Thr Val Ala 305 310 315 320 Ser Val Tyr Lys Gly Lys Leu Leu Ile Gly Thr Val Phe His Lys Ala 325 330 335 Leu Tyr Cys Glu Leu 340 <210> 2 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> organophosphorus hydrolase <400> 2 Met Gln Thr Arg Arg Val Val Leu Lys Ser Ala Ala Ala Ala Gly Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Leu Ala Gly Cys Ala Ser Val Ala Gly Ser Ile Gly 20 25 30 Thr Gly Asp Arg Ile Asn Thr Val Arg Gly Pro Ile Thr Ile Ser Glu 35 40 45 Ala Gly Phe Thr Leu Thr His Glu His Ile Cys Gly Ser Ser Ala Gly 50 55 60 Phe Leu Arg Ala Trp Pro Glu Phe Phe Gly Ser Arg Lys Ala Leu Ala 65 70 75 80 Glu Lys Ala Val Arg Gly Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala Gly Val Arg 85 90 95 Thr Ile Val Asp Val Ser Thr Phe Asp Ile Gly Arg Asp Val Ser Leu 100 105 110 Leu Ala Glu Val Ser Arg Ala Ala Asp Val His Ile Val Ala Ala Thr 115 120 125 Gly Leu Trp Phe Asp Pro Pro Leu Ser Met Arg Leu Arg Ser Val Glu 130 135 140 Glu Leu Thr Gln Phe Phe Leu Arg Glu Ile Gln Tyr Gly Ile Lys Asp 145 150 155 160 Thr Gly Ile Arg Ala Gly Ile Ile Lys Val Ala Thr Thr Gly Lys Ala 165 170 175 Thr Pro Phe Gln Glu Leu Val Leu Lys Ala Ala Ala Arg Ala Ser Leu 180 185 190 Ala Thr Gly Val Pro Val Thr Thr His Thr Ala Ala Ser Gln Arg Asp 195 200 205 Gly Glu Gln Gln Ala Ala Ile Phe Glu Ser Glu Gly Leu Ser Pro Ser 210 215 220 Arg Val Cys Ile Gly His Ser Asp Asp Thr Asp Asp Leu Ser Tyr Leu 225 230 235 240 Thr Ala Leu Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Ile Gly Leu Asp His Ile Pro 245 250 255 His Ser Ala Ile Gly Leu Glu Asp Asn Ala Ser Ala Ser Ala Leu Leu 260 265 270 Gly Ile Arg Ser Trp Gln Thr Arg Ala Leu Leu Ile Lys Ala Leu Ile 275 280 285 Asp Gln Gly Tyr Met Lys Gln Ile Leu Val Ser Asn Asp Trp Leu Phe 290 295 300 Gly Phe Ser Ser Tyr Val Thr Asn Ile Met Asp Val Met Asp Arg Val 305 310 315 320 Asn Pro Asp Gly Met Ala Phe Ile Pro Leu Arg Val Ile Pro Phe Leu 325 330 335 Arg Glu Lys Gly Val Pro Gln Glu Thr Leu Ala Gly Ile Thr Val Thr 340 345 350 Asn Pro Ala Arg Phe Leu Ser Pro Thr Leu Arg Ala Ser 355 360 365 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 S193A/H251Q/F264L, S193A/T257A/F264L 및 S193A/H251Q/T257A 중 선택되는 어느 하나로 치환이 일어난 아미노산 서열로 이루어진 G-계열 유기인 신경작용제를 분해하는 재조합 파라옥소나제1(recombinant paraoxonase1) 돌연변이 단백질; 및
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 K159E/T117A, K77A/K159E/T177A 및 K159E/T173N/T177A 중 선택되는 어느 하나로 치환이 일어난 아미노산 서열로 이루어진 V-계열 유기인 신경작용제를 분해하는 세균성 유기인 화합물 가수분해효소(bacterial organophosphorus hydrolase) 돌연변이 단백질을 결합시킨 것을 특징으로 하는 재조합 PON1-OPH 융합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질 및 상기 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질 사이가 링커 서열로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 PON1-OPH 융합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 링커 서열은 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 PON1-OPH 융합체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. (a) 인간 유래 파라옥소나아제1 유전자에 돌연변이를 유발시켜 조작된 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론을 제조하는 단계;
    (b) 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 유전자에 돌연변이를 유발시켜 조작된 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론을 제조하는 단계;
    (c) 상기 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론과 상기 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론이 결합하여 이루어진 재조합 PON1-OPH 융합체 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    (d) 상기 재조합 발현벡터를 이용하여 재조합 PON1-OPH 융합체 유전자를 목적 단백질 발현 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 형질전환된 목적 단백질 발현 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계의 배양액으로부터 발현된 목적 단백질인 재조합 PON1-OPH 융합체를 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 재조합 PON1-OPH 융합체는,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 S193A/H251Q/F264L, S193A/T257A/F264L 및 S193A/H251Q/T257A 중 선택되는 어느 하나로 치환이 일어난 아미노산 서열로 이루어진 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 단백질; 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 K159E/T117A, K77A/K159E/T177A 및 K159E/T173N/T177A 중 선택되는 어느 하나로 치환이 일어난 아미노산 서열로 이루어진 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 단백질;이 결합하여 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서,
    상기 (c) 단계는,
    상기 재조합 파라옥소나제1 돌연변이 클론이 링커 서열을 통해 상기 세균성 유기인 화합물 가수분해효소 돌연변이 클론과 연결되도록 이루어진 재조합 PON1-OPH 융합체 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제조하는 것을 특징으로 하는 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 목적 단백질 발현 숙주세포는 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 (f) 단계는,
    상기 재조합 PON1-OPH 융합체를 컬럼 크로마토그래피를 통해 배양액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 재조합 PON1-OPH 융합체 제조방법.
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