KR102268194B1 - 엑소좀-접합된 양자점 나노입자들 및 이를 이용한 엑소좀 및 암 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리간드에 접합된 복수의 양자점 나노입자, 특히 각각의 나노입자가 엑소좀 - 특이 결합 리간드에 접합된 복수의 양자점 나노입자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 복수의 접합된 양자점 나노입자를 제조하는 방법, 이러한 복수의 접합된 양자점 나노입자를 사용하여 엑소좀을 검출하는 방법 및 이러한 복수의 접합된 양자점 나노입자를 사용하여 엑소좀을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

엑소좀-접합된 양자점 나노입자들 및 이를 이용한 엑소좀 및 암 검출 방법
여기에 개시된 실시 예들은 리간드들에 접합된 양자점 나노입자들에 대한 것으로서, 특히 각각의 나노입자가 엑소좀 특이 결합 리간드에 접합된 양자점 나노입자들에 관한 것이다. 실시 예들은 또한 이러한 접합된 양자점 나노입자들을 제조하는 방법, 이러한 접합된 양자점 나노입자들을 사용하여 엑소좀을 검출하는 방법 및 이러한 접합된 양자점 나노입자들을 사용하여 엑소좀을 검출하는 방법을 포함한다.
암은 현저하게 혼란스럽고 예측할 수 없는 질환이라는 것이 잘 알려져있다. 일단 잠복기가 지나면 기하급수적으로 성장하고 침범한다. 따라서 암, 특히 불량한 예후를 가진 암의 조기 진단은 생존율 및 관해에 대한 주요 결정 요인이다. 췌장 관 선암은 5년간의 진단 후 사망률이 발생률과 거의 일치하는 나쁜 예후를 보이는 종양의 전형적인 예이다. 최근 몇 년 동안 연구자들은 다양한 세포 유형과 조직에서 방출된 100 ~ 200nm 크기의 소낭(vesicle)인 엑소좀(excosome)이 전통적으로 생각했던 것처럼 단순히 "세포 파편"이 아니라는 사실에 주목했다. 엑소좀은 세포 통신, 항상성 및 종양 형성에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 많은 연구에 따르면 염증성 또는 종양 조직에서 방출된 엑소좀은 특정 화물(cargo) 및 표면 조성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 질병 조직에서 분비되는 엑소좀의 검출은 보편적인 진단 도구로서 연구되고 있다. 그러나 주요 과제는 농축, 분리 및 검출을 위한 쉬운 방법의 부재이다.
현재의 분리 및 검출 방법은 한외 여과 및 원심 분리의 여러 단계에 기초한다. 이러한 단계들 이후에 면역 분석을 사용한 검출이 이어진다. 추가적인 도전 과제는 다양한 조직의 대부분의 엑소좀들이 중복성 마커를 공유하여 특이성이 결핍되고 높은 수준의 신호 잡음이 발생한다는 사실과 관련이 있다. 이러한 어려움은 엑소좀에 기반한 진단 키트의 개발과 실현을 늦추고 있다.
예를 들어 종종 양자점 또는 나노결정으로 지칭되는 2 내지 50nm 범위의 치수를 갖는 입자의 제조 및 특성화에 상당한 관심이 있어왔다. 양자점(QD)은 넓은 범위의 여기, 크기-조정가능 방출, 좁은 방출 대역폭, 향상된 밝기 (높은 흡광 계수로 인한), 광 안정성, 다중화 기능 및 단일 여기 원을 사용한 동시 다발성 방출을 포함하여 고유한 광학 특성을 갖는 형광 나노입자이다. 일반 형광 염료와 달리 QD의 고유한 특성은, 만족되지 않았던 진단, 임상적 영상화, 표적화된 약물 전달 및 광역학 요법을 비롯한 여러 가지 잠재적 의료 응용을 가능하게 한다.
생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 (예를 들어, 실시간으로) 엑소좀을 검출하고 암을 검출하기 위한 새로운 방법이 필요하다.
개시된 실시 예들은 엑소좀을 검출하고 암 (예를 들어, 췌장암, 폐암, 방광암)을 검출하는데 사용될 수 있는 양자점 나노입자들을 포함한다.
개시된 실시 예들은 복수의 양자점 나노입자를 포함하며, 각각의 나노입자는 엑소좀 - 특이 결합 리간드에 (이온 쌍 혹은 반데르발스 상호작용에 의해) 공유 결합 또는 물리적 결합되고, 그 결합은 양자점 나노입자의 무기 표면 상에 직접적으로 혹은 양자점 나노입자를 수용성 및 생체적합성이 되게 하는데 사용되는 유기 코로나 층(organic corona layer) 상에 아미드, 에스테르, 티오에스테르 또는 티올 고정기에 의한다. 수용성 양자점 나노입자는 어떤 실시 예들에서는 하나의 반도체 물질에 의한 코어와 다른 반도체 물질에 의한 적어도 하나의 쉘을 포함하는 한편 다른 실시 예들에서 조성 구배의 합금(compositionally graded alloying)에 의해 외측으로 갈수록 밴드갭 값이 증가하는 합금 반도체 물질을 포함한다. 이 실시 예들은 생체외(시험관내) 및 생체내에서 (예를 들어 실시간으로) 암을 검출하는데 엑소좀을 검출하는데 유용하다.
어떤 실시 예들에서, 광 반응 양자점(QD)은 리간드 상호 작용제(ligand interactive agent) 및 표면 개질 리간드(surface modifying ligand)를 갖는 수용성 QD 나노입자를 포함한다. 수용성 QD 나노입자는 헥사메톡시메틸멜라민(hexamethoxymethylmelamine)을 포함하는 용액에서 QD에 대한 리간드 상호 작용제 및 표면 개질 리간드의 화학적 첨가에 의해 형성될 수 있다. 특정 실시 예들에서, 리간드 상호 작용제는 C8-C20 지방산, 콜레스테롤 또는 이의 에스테르이고, 표면 개질 리간드는 모노메톡시폴리에틸렌 옥사이드(monomethoxypolyethylene oxide)이다.
일 실시 예에서, 각각의 양자점 나노입자는 양자점의 형광 파장 (예를 들어, 녹색, 황색 또는 적색)에 기초하여 특정 엑소좀 - 특이 결합 리간드(exosome-specific binding ligand)에 접합(conjugate)된다. 특정 엑소좀에 결합되면, 형광에 따라 특정 엑소좀이 방출되는 암의 유형 및 그 유형의 엑소좀과 관련될 수 있는 고유 방출 코드(고유 방출 지문)가 획득될 것이다.
일 실시 예에서, 본원에 기재된 양자점 나노입자들에서 각 양자점 나노입자는 아미드 결합을 통해 엑소좀 - 특이 결합 리간드에 공유 결합된다.
일 실시 예에서, 양자점 나노입자들에서 각각의 양자점 나노입자는 코어 반도체 물질 및 외층(outer layer)을 포함하며, 여기서 외층은 입자를 수용성 및 생체적합성으로 되게 하는 유기 코팅(기능화 유기 코팅) 코로나 및 엑소좀 - 특이 결합 리간드를 포함한다. 일 실시 예에서, 각각의 양자점 나노입자는 반도체 물질에 의한 복수의 쉘을 포함하고, 외부 쉘은 외층을 포함하며, 외층은 입자를 수용성 및 생체적합성으로 되게 하는 유기 코팅(기능화 유기 코팅) 코로나 및 엑소좀 - 특이 결합 리간드를 포함한다.
일 실시 예에서, 양자점 나노입자들의 각각의 양자점 나노입자는 합금된 양자점 및 엑소좀 - 특이 결합 리간드를 포함한다.
일 실시 예에서, 양자점 나노입자들의 각각의 양자점 나노입자는 도핑된 양자점 및 엑소좀 - 특이 결합 리간드를 포함한다.
일 실시 예에서, 엑소좀 - 특이 결합 리간드는 임의의 합성 또는 천연 발생 엑소좀 - 특이 결합제일 수 있다. 예를 들어, 엑소좀 - 특이 결합 리간드는 항체, 항체 단편, 합성 펩타이드, 앱타머(aptamer), 합성 핵산 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 적합한 엑소좀 - 특이 결합 리간드는 Glypican-1, CEA, CA 19-9, 메소텔린(mesothelin), PD-L1, 텔로머라아제(telomerase) 및 이들의 임의 조합에 대한 (예를 들어, 이들에 특이적인) 리간드를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일 실시 예에서, 엑소좀 - 특이 결합 리간드는 Glypican-1 항체, Glypican-1 태깅 분자(tagging molecule) 또는 이들의 조합이다.
일 실시 예에서, 양자점 나노입자들의 각각의 양자점 나노입자는 양자점의 형광 파장 (예를 들어, 녹색, 황색 또는 적색)에 기초하여 특정 엑소좀 - 특이 결합 리간드에 접합된다. 양자점 나노입자들의 각각의 양자점 나노입자는 전체 가시 스펙트럼에 걸쳐 특정 파장에서 방출하도록 개별적으로 조정될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 기재된 양자점 나노입자들의 임의의 양자점 나노입자의 일 실시 예에서, 나노입자는 II-VI 물질, III-V 물질 또는 I-III-IV 물질 또는 이들의 합금 또는 도핑된 유도체를 포함한다.
일 실시 예에서, 본원에 기재된 양자점 나노입자들 중 임의의 양자점 나노입자는 약 350 nm 내지 약 1000 nm 범위의 방출 스펙트럼과 연관된다.
일 실시 예에서, 본원에 기재된 양자점 나노입자들 중 임의의 것은 약 450nm 내지 약 800 nm 범위의 방출 스펙트럼과 연관된다.
추가의 실시 예에서, 본원에 기재된 양자점 나노입자들 중 임의의 것은 세포내 흡수 증강제(cellular uptake enhancer), 세포-침투 펩타이드(cell-penetrating peptide, CCP)( TAT, RGD, 또는 폴리 아르기닌 같은 CCP), 조직 침투 증강제(예를 들어 사포닌, 양이온성 지질(cationic lipid), 스테렙토리신 O(SLO)), 또는 이들의 임의의 조합을 더 포함할 수 있다. 세포내 흡수 증강제의 예로서 예를 들어 트랜스 - 활성화 전사 활성제(trans-activating transcriptional activator, TAT), Arg-Gly-Asp(RGD) 트리-펩타이드 또는 폴리 아르기닌 펩타이드가 있다. 리간드-나노입자 접합체(ligand-nanoparticle conjugate)은 예를 들어 사포닌, 양이온성 리포좀(liposome), 또는 스트렙토리신 O 같은 세포내 흡수를 향상시킬 수 있는 제제를 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시 예에서, 생체외 또는 생체내 (예를 들어, 실시간으로) 엑소좀을 검출하는 방법이 제공된다. 일 실시 예에서, 상기 방법은 i) 본원에 기술된 실시 예들 중 임의의 실시 예에 따른 복수의 리간드 나노입자 접합체 (예: 리간드 나노입자 접합체 패널)를 엑소좀과 접촉하고, ii) 복수의 나노입자 접합체에 의해 광 방출 또는 광 흡수를 검출함을 포함한다. 실시 예의 다른 측면에서, 복수의 양자점 나노입자는 광원으로 여기된다 (예: 형광). 일 실시 예에서, 그 유형의 엑소좀과 연관될 수 있는 고유 방출 코드 (지문)가 얻어진다. 일 실시 예에서, 방출 코드 (신호)는 예를 들어 임의의 휴대용 광원(hand-held light source) (예를 들어, 휴대용 자외선 (UV) 광원)을 사용하여 육안으로 판독된다. 다른 실시 예에서, 방출 코드 (신호)는 디지털 영상화 시스템에 의해 판독된다.
또 다른 실시 예에서, 생체외 또는 생체내에서 (예를 들어, 실시간으로) 암 (예를 들어, 췌장암, 방광, 폐암)을 검출하는 방법이 제공된다. 일 실시 예에서, 상기 방법은 i) 본원에 기술된 실시 예들 중 임의의 실시 예에 따른 복수의 리간드 나노입자 접합체 (예: 리간드 나노입자 접합체 패널)를 엑소좀과 접촉하고, ii) 복수의 나노입자 접합체에 의해 광 방출 또는 광 흡수를 검출함을 포함한다. 실시 예의 다른 측면에서, 복수의 양자점 나노입자는 (예를 들어, 형광을 유도하기 위해) 광원으로 여기된다. 일 실시 예에서, 특정 엑소좀이 방출되는 암의 유형과 연관될 수 있는 고유 방출 코드 (지문)가 얻어진다. 일 실시 예에서, 방출 코드 (신호)는 예를 들어 임의의 휴대용 광원 (예를 들어, 휴대용 자외선 (UV) 광원)을 사용하여 육안에 의해 판독된다. 다른 실시 예에서, 방출 코드 (신호)는 디지털 영상화 시스템에 의해 판독된다. 일 실시 예에서, 상기 방법은 췌장암의 조기 검출/병기(detection/staging)와 같은 암의 조기 검출에 사용된다.
본원에 기술된 임의의 방법의 일 실시 예에서, 복수의 양자점은 다중 - 광자 (예를 들어, 2 - 광자 여기)를 사용하여 여기된다. 이러한 실시 예에서, 2개 이상의 광선의 결합된 에너지는 특정 양자점 나노입자를 여기시키기 위해 사용된다.
본원에 기술된 임의의 방법의 일 실시 예에서, 양자점 나노입자에 결합된 엑소좀은 붕괴되고 엑소좀 화물 단백질(exsome cargo protein)이 검출된다.
본원에 기술된 임의의 방법의 일 실시 예에서, 복수의 접합체는 예를 들어, 간단한 현장 진단(point-of-care detection)에 사용될 수 있는 측방 유동 시험 장치 (딥 - 스틱 형(deep-stick type))와 같은 진단 시스템에서 생체외에서 사용된다. 측방 유동 시험은 경쟁 분석(competitive assay) 또는 샌드위치 분석으로 작동할 수 있다. 한 실시 예에서, 진단 시스템은 각 형광 마커의 역가(titer)를 측정하여, 췌장암과 같은 암의 적절한 병기(proper staging of cancer)를 가능하게 한다.
일 실시 예에서, 본원에 기술된 임의의 방법은 체액 (예를 들어, 혈액, 췌액, 혈장, 미세 바늘 흡인물) 및/또는 조직 샘플에서 생체내(예: 실시간으로) 수행된다. 한 실시 예에서, 본원에 기술된 임의의 방법은 채취 및 검사된 체액 및/또는 조직 샘플에서 생체외에서 수행된다.
일 실시 예에서, 샘플은 분석 전에 농축된다. 예를 들어, 샘플은 겔 여과 스핀 컬럼을 사용하여 농축되거나 측방 유동 크로마토그래피 장치에 내장될 수 있다.
일 실시 예에서, 샘플은 고정된 조직 샘플이다. 또 다른 실시 예에서, 샘플은 세포 배양물에서 배양된 살아있는 세포에 존재한다. 또 다른 실시 예에서, 복수의 리간드 - 나노입자 접합체는 생체 조직에 도입된다. 또 다른 실시 예에서, 복수의 리간드 - 나노입자 접합체는 암의 실시간 검출을 위해 포유류에 도입된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 생체내 및/또는 생체외에서 엑소좀의 검출에 사용하기 위한, 본원에 기술된 임의의 실시 예에 따른 복수의 리간드 - 나노입자 접합체의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어 생체내 및/또는 생체외에서 암의 검출에 사용하기 위한, 본원에 기술된 임의의 실시 예에 따른 복수의 리간드 - 나노입자 접합체의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 실시 예에 따른 복수의 리간드 - 나노입자 접합체를 포함하는, 생체내 및/또는 생체외에서 엑소좀을 검출하기 위한 키트 (예를 들어, 진단 키트)를 제공한다 .
또 다른 양태에서, 본 발명은 생체내 및/또는 생체외에서 암 (예를 들어, 췌장암, 방광, 폐암)을 검출하기 위한 키트 (예: 진단 키트)를 제공하며, 상기 키트는 본원에 기술된 임의의 실시 예에 따른 복수의 리간드 - 나노입자 접합체를 포함한다.
도 1은 적색 양자점 - 스트렙타비딘 접합체를 제조하고 이를 사용하여 비오틴화된 중합체 구체 표적(biotinylated polymer sphere target)의 특이 표지를 나타내는 예시적인 검출 도식을 도시한다.
도 2는 적색 및 녹색 QD - 스트렙타비딘 접합체를 갖는 비오틴화된 모델 중합체 구체의 염색을 도시한다.
QD에 의한 광자 방출을 야기하는 조건하에서 QD의 자극시 검출될 수 있는 능력을 갖는 엑소좀 특이 결합 리간드(exosome specific binding ligand)와 접합된(conjugated) 양자점(QD)들이 개시된다. 또한, 높은 안전성 및 생체적합성 프로파일을 특징으로 하며, 엑소좀 특이 리간드와 접합된 양자점 나노입자들을 제공하는 실시 예들이 본원에 개시된다. 어떤 실시 예들에서, QD는 생체 적합성, 무독성, 형광 양자점 나노입자(QD) 접합체(conjugate)로 조작된다.
약자: 본 발명의 이해를 돕기 위해, 그리고 본원의 청구항을 해석함에 있어 의심의 여지를 피하기 위해, 복수의 용어가 이하에서 정의된다. 본원에서 정의된 용어는 본 발명과 관련된 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 발명의 특정 실시 예들을 설명하기 위해 사용된 용어는 청구범위에서 약술된 것을 제외하고는 본 발명을 한정하지 않는다.
약자: 다음의 약어가 본 출원 전반에 걸쳐 사용된다:
DCC 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)
DCM 디클로로메탄(dichloromethane)
DIC 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide)
EDC 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 (1-ethyl-3-(-3-dimethylamino prophyl)carbodiimide hydrochloride)
HMMM 헥사메톡시메틸멜라민(hexamethoxymethylmelamine)
In(MA)3 인듐미리스테이트(indium myristate)
QD 양자점
sulfo-NHS N-하이드록시숙신이미드의 술포 유도체(sulfo derivative of N-hydroxysuccinimide)
SMCC 숙신이미딜4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)
(TMS)3P 트리스(트리메틸실일)포스핀)(tris(trimethylsilyl)phosphine)
어떤 구성(단어)를 언급함에 있어 명시적으로 그렇게 정의되지 않는 한 단수 의미(단일 개체)를 가리키는 것은 아니며, 설명을 위해 특정 예가 사용될 수 있는 복수 의미(일반 부류)를 포함한다. 청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"과 함께 사용되는 어떤 구성(단어)의 경우 하나를 의미할 수 있고 또한 하나 이상을 또는 적어도 하나 및/또는 둘 이상을 의미할 수 있다.
청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은 대안을 상호 배타적이라고 지칭하지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 따라서 달리 명시하지 않는 한, 대안 그룹의 "또는"은 그룹의 구성원 중 임의의 하나 또는 그룹의 대안들의 임의의 조합을 의미한다. 또한, 대안을 상호 배타적이라고 명시적으로 나타내지 않는 한, "A, B 및/또는 C"라는 문구는 구성원 A 단독, 구성원 B 단독, 구성원 C 단독, 또는 구성원 A, B 및 C의 임의의 조합을 의미한다.
유사하게, 의심의 여지를 피하기 위해 그리고 대안을 상호 배타적이라고 명시적으로 나타내지 않는 한, 항목 목록(list)과 함께 사용된 "적어도 하나"라는 문구는 목록의 단일 항목 또는 목록의 항목들의 임의의 조합을 의미한다. 예를 들어, 달리 정의되지 않는 한, "A, B 및 C 중 적어도 하나"는 "A, B, C"에서 선택되는 적어도 하나 또는 A, B 및 C의 임의의 조합을 의미한다. 따라서, 달리 정의되지 않는 한, 이 문구에는 목록에 있는 항목들 중 하나 이상을 의미하며 반드시 전부를 의미하는 것은 아닐 수도 있다.
"포함하다" (및 "포함하다"의 임의의 문법적 활용형 "포함한다", "포함하는", "포함하고" 등), "가지다"( 및 임의의 문법적 활용형 "가지는", "갖는" 등), "구비하다" (및 임의의 문법적 활용형 "구비하는", "구비하고" 등) 또는 "함유하다" (및 임의의 문법적 활용형 "함유하는", "함유하고" 등)는 포괄적이거나 제한이 없으며 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
명세서 및 청구범위에서 사용된 용어 "유효"는 목적하는, 예상된 또는 의도된 결과를 제공하거나 달성하기에 적절한 것을 의미한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 통상의 기술자에게 이해되는 것과 같이 근접한 것으로 정의되며, 하나의 비-한정적인 예로서 이 용어는 10% 이내, 5% 이내, 1% 이내로 정의되며, 어떤 양태에서는 0.5% 이내로 정의된다.
어떤 실시 예들에서, 엑소좀 특이 결합 리간드는 엑소좀 에피토프(epitope)를 인식하는 항체이다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 완전(intact) 면역글로불린 분자뿐만 아니라 완전 면역글로불린의 부분, 단편(fragment) 및 그 유도체 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fsc, CDR 영역 또는 이중 특이적(bi-specific)이거나 또는 항체 유래의 항원 결합 도메인을 다른 유형의 폴리펩타이드와 결합시키는 키메라 항체를 포함하는 에피토프 또는 항원에 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분을 포함한다. 항체라는 용어는 단일클론성 항체(monoclonal antibody)(mAb), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody)뿐만 아니라 효소적 절단 및 재조합 기술을 포함하는 임의의 공지된 기술에 의해 제공되는 항체의 단편, 부분, 영역 또는 유도체를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 또한 중쇄(heavy-chain) 항체의 단일 단량체 가변 항체 도메인(single monomeric variable antibody domain)(VH)을 갖는 단일 도메인 항체(single-domain antibody)(sdAb) 및 이의 단편을 포함한다. 가변 단쇄 (VL) 및 불변 단쇄 (CL) 도메인이 없는 sdAb는 원래 낙타 (VHH) 및 연골 어류(VNAR)에서 발견되며 라마에서 특이 항원 결합 sdAbFMF를 개발한 제약 회사 Ablynx에 의해 때때로 "나노바디"(Nanobody)로 언급된다. 수식어 "단일클론성(monoclonal)"은 실질적으로 균질한 항체 군으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
QD는 고유의 광학 특성을 갖는 형광 반도체 나노입자이다. QD는 입자의 크기와 모양이 빛 여기시 양자 역학 효과를 초래하는 매우 작은 크기의 반도체 물질을 나타낸다. 일반적으로 5-6nm의 반경을 갖는 더 큰 QD는 주황색 또는 적색 방출 색상에서 보다 긴 파장을 방출하고 반경 2-3nm의 보다 작은 QD는 청색 및 녹색 색상에서 더 짧은 파장을 방출하지만, 특정 색상 및 크기는 QD의 조성에 달렸다. 양자 점은 기존의 형광 염료(예를 들어 인도시아닌 그린(indocyanine green (ICG))보다 약 20배 더 밝게 빛나고 몇 배나 더 광 안정성이 있다. 중요하게도 QD 체류 시간은 화학적 성질과 나노 크기로 인해 더 길다. QD는 훨씬 강한 빛의 강도를 흡수하고 방출할 수 있다. 어떤 실시 예들에서, QD는 둘 이상의 결합 태그(binding tag)를 가져 2개- 또는 3개-특이 나노 소자(bi- or tri-specific nano device)를 형성할 수 있다. QD의 고유한 특성으로 인해, 충족되지 않았던 요구 사항을 충족하는 여러 의료 응용 사용할 수 있다.
본원에 제시된 실시 예에서, QD는 수성 환경에서 QD의 사용을 허용하는 친수성 외층 또는 코로나를 제공하도록 기능화 되고, 예를 들어 생체내 및 생체외에서의 살아있는 세포에 적용될 수 있다. 이러한 QD는 수용성 QD로 불린다.
일 실시 예에서, QD는 접합(conjugation) 가능한 기능 (COOH, OH, NH2, SH, 아지드, 알킨)이 표면에 구비될 수 있다. 일 예시된 실시 예에서, 수용성 무독성 QD는 기능화된 카르복실이거나 카르복실 기능화된다. 예를 들어, COOH-QD는 수용성 1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 사용하는 카르보디이미드 연결(linking) 기술을 사용하여 표적 항체(targeting antibody)의 아민 말단에 연결될 수 있다. 카르복실 기능화된 QD는 EDC와 혼합되어 활성 O-아실이소우레아(O-acyliosurea) 중간체를 형성하고, 이어서 반응 혼합물 중 단일클론성 항체상의 1차 아미노기로부터의 친핵성 공격에 의해 치환된다. 원한다면, N-하이드록시숙신이미드의 술포 유도체 (sulfo-NHS)가 1차 아민-함유 항체와의 반응 동안 첨가된다. sulfo-NHS의 첨가로, EDC는 NHS를 카르복실과 결합시켜 O-아실이소우레아 중간체보다 더 안정한 NHS 에스테르를 형성하면서 생리학적 pH에서 1차 아민과의 효율적인 접합을 가능하게 한다. 두 경우 모두 결과는 QD와 항체 사이의 공유 결합이다. 스즈키-미야우라 교차-결합(cross-coupling), (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트)(SMCC) 또는 알데히드 기반 반응과 같은 다른 화학이 대안적으로 사용될 수 있다.
코어 나노입자 및 코어-쉘 나노입자를 합성하는 방법은 예를 들어 본 출원인에 의한 미국 특허 제7,867,556호, 제7,867,557호, 제7,803,423호, 제7,588,828호 및 제6,379,635호에 개시되어 있다. 상기 각각의 특허의 내용은 본원에 참조에 의해 전체적으로 포함된다. 미국 특허 제9,115,097호, 제8,062,703호, 제7,985,446호, 제7,803,423호, 및 제7,588,828호, 및 미국 공개 특허 공보 제2010/0283005호, 제2014/0264196호, 제2014/0277297호 및 제2014/0370690호는 각각 다량의 고품질 단분산 양자점을 생성하는 방법을 서술하며, 참조에 의해 본원에 전체적으로 포함된다.
일 실시 예에서, 뚜렷하게 상이한 반도체 조성들의 하나 이상의 외층 또는 쉘에 매립되거나(buried) 코팅된 적어도 하나의 반도체 조성의 중심 영역 또는 코어를 갖는 코어/쉘 입자가 이용된다. 예를 들어, 코어는 In, P, Zn 및 S의 합금으로 구성될 수 있으며, 예를 들어 ZnS 분자 클러스터에 대한 인듐-기반 QD의 분자 시드(seed) 및 그 뒤의 ZnS 쉘의 형성을 포함하는 실시 예 1에 의해 형성될 수 있다.
또 다른 실시 예들에서, 사용된 수용성 QD 나노입자는 코어/쉘 QD의 제조 대신에 조성적으로 등급화된(조성 구배) 합금화에 의해 외측으로 갈수록 증가하는 밴드 갭 값 또는 에너지 (Eg)를 갖는 합금 반도체 물질을 포함한다. 밴드 갭 에너지(Eg)는 바닥 상태의 원자가 에너지 밴드에서 빈전도 에너지 밴드로 전자를 여기시키는 데 필요한 최소 에너지이다.
등급화된 합금 QD 조성은 이산 쉘층에 의해 중첩된 이산 코어로서 형성되기보다는 입자의 중심 또는 중심 부근으로부터 QD의 최외측 표면까지 원소 조성에서 "등급화"(조성 구배)된 것으로 여겨진다. 예를 들어 In1-xP1-yZnxSy, 등급화된 합금 QD가 있는데, 여기서 x와 y는 QD의 중심에서 표면으로 0에서 1까지 점차적으로 증가한다. 이러한 예에서, QD의 밴드 갭은 중심의 순수 InP의 밴드 갭으로부터 표면의 순수한 ZnS의 더 큰 밴드 값의 밴드 갭으로 점차로 변할 것이다. 밴드 갭은 입자 크기에 의존하지만, ZnS의 밴드 갭은 InP의 밴드 갭보다 넓어서 등급화된 합금의 밴드 갭이 QD의 안쪽에서 표면으로 서서히 증가 할 것이다.
원-팟(one-pot) 합성 방법은 본원의 실시 예 1에 기재된 분자 시딩(molecular seeding) 공정의 변형으로서 사용될 수 있다. 이것은 실시 예 1의 "코어" 생성을 위해 기술된 공정 중에 아연 및 황 전구체의 양을 증가시키면서 첨가는 반면, 반응 용액에 첨가되는 인듐 미리스테이트 및 (TMS)3P의 양을 점진적으로 감소시켜 입자 성장을 유지하는 것에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 일 예에서, 디부틸 에스테르(dibutyl ester) 및 포화 지방산을 반응 플라스크에 넣고 가열하면서 탈기시킨다. 질소를 도입하고 온도를 증가시킨다. 예를 들어 ZnS 분자 클러스터 [Et3NH]4[Zn10S4(SPh)16]와 같은 분자 클러스터를 교반하면서 첨가한다. 점진적으로 감소하는 농도의 제 1 반도체 물질의 첨가 및 점진적으로 증가하는 농도의 제 2 반도체 물질의 첨가를 수반하는 램핑 프로토콜(ramping protocol)에 따라 등급화된 합금 전구체 용액이 첨가됨에 따라 온도가 증가된다. 예를 들어, 램핑 프로토콜은 디카르복실산 에스테르(예를 들어 디-n-부틸 세바케이트 에스테르)에 용해된 인듐 미리스테이트(In(MA)3) 및 트리스(트리메틸실일) 포스핀((TMS)3P))의 첨가로 시작되며 이때 첨가되는 (In(MA)3) 및 (TMS)3P)의 양은 시간이 지남에 따라 점차 감소하고 황 및 아연 화합물 예를 들어 (TMS)2S 및 아연 아세테이트(zinc acetate)의 농도는 점차로 증가한다. 첨가되는 (In(MA)3) 및 (TMS)3P)의 양이 감소하면서, 포화 지방산(예를 들어 미리스트산 또는 올레산)에 용해된 점차로 증가하는 양의 (TMS)2S 와 디카르복실산 에스테르(예를 들어 디-n-부틸 세바케이트 에스테르)가 아연 아세테이트와 함께 첨가된다. 다음 반응은 ZnS 화합물의 생성 증가로 이어질 것이다. 첨가가 계속됨에 따라, 파장이 점진적으로 증가하는 방출 최대(emission maximum)를 갖는 원하는 크기의 QD 입자가 형성되고, 여기서 InP 및 ZnS의 농도는 등급화 되어 QD 입자의 중심을 향해서 InP가 최고 농도를 나타내고 QD 입자의 외층 상에서 ZnS이 최고 농도를 나타낸다. 원하는 방출 최대가 얻어지면 반응에 대한 첨가가 중단되고, 그 결과로 얻어진 등급화된 합금 입자는 어닐링 된 후 침전 및 세척에 의해 분리된다.
나노입자의 응집, 광 산화 및/또는 켄칭(quenching)에 대한 나노입자의 감수성뿐만 아니라 매질(medium)과의 나노입자의 상용성(compatibility)은 나노입자의 표면 조성에 의해 크게 영향을 받는다. 코어, 코어-쉘 또는 코어-멀티 쉘 나노입자의 최종 무기 표면 원자에 대한 배위는 불완전할 수 있으며, 입자 응집으로 이어질 수 있는, "불완전 결합"(dangling bond)이 입자 표면에 있다. 이 문제는 본원에서 캡핑 리간드(capping ligand) 또는 캡핑제(capping agent)로 언급되는 보호 유기기(protecting organic group)로 민표면(bare surface) 원자를 보호(캡핑)함으로써 해결된다. 입자의 캡핑 또는 보호(passivating)는 입자 응집의 발생을 방지할 뿐만 아니라 주변 화학적 환경으로부터 입자를 보호하고, 코어 물질의 경우 입자에 전자 안정화(보호)를 제공한다. 캡핑 리간드는 입자의 가장 외측의 무기층의 표면 금속 원자에 결합된 루이스 염기 일 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다. 캡핑 리간드의 특성은 나노입자와 특정 매질의 상용성을 크게 결정한다. 캡핑 리간드는 원하는 특성에 따라 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 캡핑 리간드의 유형은 티올기, 카르복실, 아민, 포스핀, 포스핀 옥사이드(phosphine oxide), 포스폰산(phosphonic acid), 포스핀산(phosphinic acid), 이미다졸, OH, 티오 에테르 및 칼릭사렌기를 포함한다. 칼릭사렌(calixarene)을 제외하고는, 이들 모든 캡핑 리간드는 입자 표면 상의 캡핑 리간드를 위한 고정 중심(anchoring center)을 형성할 수 있는 헤드기(head group)를 갖는다. 캡핑 리간드의 몸체(body)는 선형 사슬, 고리형 또는 방향족 일 수 있다. 캡핑 리간드 자체는 크거나 작거나, 올리고머 또는 여러 자리(polydentate) 리간드일 수 있다. 리간드 몸체의 성질 및 입자에 결합되지 않은 측면 돌출부는 함께 리간드가 친수성, 소수성, 양친매성, 음이온, 양이온 또는 양쪽성 인온인지를 결정한다.
많은 양자점 물질에서, 캡핑 리간드는 소수성 (예를 들어, 알킬 티올, 지방산, 알킬 포스핀, 알킬 포스핀 옥사이드 등)이다. 따라서, 나노입자는 일반적으로 나노입자의 합성 및 분리 후에 톨루엔과 같은 소수성 용매에 분산된다. 이러한 캡핑된 나노입자는 전형적으로 더 많은 극성 매질에서 분산되지 않는다. QD의 표면 개질이 필요한 경우 가장 널리 사용되는 절차는 리간드 교환으로 알려져있다. 코어 합성 및/또는 쉘 공정 중에 나노입자의 표면에 배위되는 친유성 리간드 분자는 이어서 극성/하전된 리간드 화합물로 교환될 수 있다. 대안의 표면 개질 전략은 극성/하전된 분자들 또는 중합체 분자들을 이미 나노입자의 표면에 배위된 리간드 분자들에 삽입(intercalation)하는 것이다. 그러나 어떤 리간드 교환 및 삽입 과정이 나노입자를 수성 매질과 보다 잘 상용되도록 하지만, 대응하는 비-개질 나노입자보다 낮은 양자 수율 (QY) 및/또는 실질적으로 더 큰 크기의 물질을 생성할 수 있다.
생체내 및 생체외 목적에서, 요구되지 않는다면 낮은 독성 프로파일을 갖는 QD가 바람직하다. 따라서, 몇몇 목적을 위해, 양자점 나노입자는 카드뮴, 납 및 비소와 같은 독성 중금속을 실질적으로 함유하지 않거나(예를 들어, 5 wt.% 미만, 예를 들어 4 wt.% 미만, 3 wt.% 미만, 2 wt.% 미만, 1 wt.% 미만, 0.5 wt.% 미만, 0.1 wt.% 미만, 0.05 wt.% 미만 또는 0.01 wt.% 미만의 카드뮴, 납 및 비소와 같은 중금속을 함유하거나) 또는 카드뮴, 납 및 비소와 같은 중금속이 없는 것이 바람직하다. 일 실시 예에서, 카드뮴, 납 및 비소와 같은 중금속이 없는 독성이 감소한 QD가 제공된다.
QD의 고유한 특성은 살아있는 세포에서 충족되지 못한 생체외 및 생체내 진단을 포함하여 몇 가지 잠재적인 의학적 적용을 가능하게 한다. QD의 의학적 적용에 관한 주요 관심사 중 하나는 대부분의 연구가 카드뮴, 납 또는 비소와 같은 독성 중금속이 함유된 QD에 초점을 맞추고 있다는 것이다. 본원에 기술된 생체 적합성 및 수용성 중금속이 함유되지 않은 QD는 생체외 및 생체내에서의 의료 응용 분야에 안전하게 사용될 수 있다. 어떤 실시 예들에서, (전체 IgG2 항체의 치수 크기의 범위 내에서) 10-20 nm의 유체 역학적 크기를 갖는 생체내 적합성 수 분산성 카드뮴 없는 QD가 제공된다. 일 실시 예에서, 생체내 적합성 수 분산성 카드뮴 없는 QD는 본원의 실시 예 1 및 2에 개시된 절차에 따라 제조된다. 어떤 실시 예들에서, 생체내 적합성 수 분산성 카드뮴 없는 QD는 카르복실 기능화되고 리간드 결합 모이티(moiety)로 추가로 유도체화된다.
카드뮴, 납 및 비소가 없는 나노입자의 예로는 ZnS, ZnSe, ZnTe, InP, InSb, AlP, AlS, AlSb, GaN, GaP, GaSb, PbS, PbSe, AgInS2, CuInS2, Si, Ge 및 이들의 합금 및 도핑된 유도체와 같은 반도체 물질을 포함하는 나노입자, 특히 이들 열거된 물질 중 하나의 코어 및 이들 열거된 물질 중 코어 물질과는 다른 하나 이상의 쉘을 포함하는 나노입자를 포함한다.
어떤 실시 예들에서, 무독성 QD 나노입자는 그 표면이 개질되어 수용성이 될 수 있고, 리간드 상호작용제(ligand interactive agent)와 양자점 표면의 연관(association)을 위해 QD 나노입자를 리간드 상호장용제에 노출시키는 것에 의한 유도체화((derivatization)를 허용하는 표면 모이티를 가질 수 있다. 리간드 상호작용제는 사슬 부분(chain portion)과 기능기(functional group)를 포함할 수 있으며 기능기는 후술하는 바와 같이, 연결/가교제(linking/corslinking agent)에 특이 친화성 또는 특이 반응성을 가진다. 사슬 부분은 예를 들어 알칸 사슬 일 수 있다. 기능기의 예로는 티오기, 하이드록실기, 카르복사미드기(carboxamide group), 에스테르기 및 카르복실기와 같은 친핵체가 포함된다. 리간드 상호작용제는 QD의 표면에 대해 친화성을 갖는 모이티를 포함할 수도 있고, 갖지 않을 수도 있다. 이러한 모이티의 예로는 티올, 아민, 카르복실기 및 포스핀이 포함된다. 리간드 상호작용제가 그러한 모이티를 포함하지 않는다면, 리간드 상호작용제를 캡핑 리간드들에 삽입함으로써 나노입자의 표면과 연관될 수 있다. 리간드 상호작용제의 예는 C8-20 지방산 및 이의 에스테르, 예를 들어 이소프로필 미리스테이트를 포함한다.
리간드 상호작용제는 나노입자의 합성에 사용된 공정의 결과로서 간단히 QD 나노입자와 연관될 수 있으며, 추가 량의 리간드 상호작용제에 나노입자를 노출시킬 필요성이 없다. 그러한 경우에, 나노입자와 추가의 리간드 상호작용제를 연관시킬 필요가 없을 수 있다. 대안으로서 또는 부가적으로, QD 나노입자는 나노입자가 합성되고 분리된 후에 리간드 상호작용제에 노출될 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 일정 시간 동안 리간드 상호작용제를 함유하는 용액에서 배양될 수 있다. 이러한 배양 또는 배양 기간의 일부는 리간드 상호작용제와 나노입자의 표면과의 연관을 용이하게 하기 위해 상승된 온도 일 수 있다. 리간드 상호작용제와 나노입자의 표면과의 연관 이후에, QD 나노입자는 연결/가교제 및 표면 개질 리간드에 노출된다. 연결/가교제는 리간드 상호작용제 및 표면 개질 리간드의 기들에 대해 특이적 친화성을 갖는 작용기들을 포함한다. 리간드 상호작용제-나노입자 연관 복합체(complex)는 연결/가교제 및 표면 개질 리간드에 순차적으로 노출될 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 일정 기간 동안 연결/가교제에 노출되어 가교결합을 일으키고 이어서 표면 개질 리간드에 노출되어 나노입자의 리간드 쉘에 혼입(incorporattion) 시킬 수 있다. 대안적으로, 나노입자는 연결/가교제 및 표면 개질 리간드의 혼합물에 노출되어 단일 단계로 가교결합을 일으키고 표면 개질 리간드를 혼입 시킬 수 있다.
일 실시 예에서, 양자점 전구체는 분자 클러스터 화합물의 존재하에서 제공되는데, 분자 클러스터의 완전성(integrity)이 유지되고 화학 전구체와 반응하는 핵 형성 중심을 제공하기 위해 잘 정의된 미리 제조된 시드 또는 템플릿으로서 작용하는 조건 하에서 분자 클러스터 화합물의 존재하에 제공되어 산업 응용을 위한 충분히 큰 규모로 고품질 나노입자를 생산한다.
본 발명에 유용한 적합한 유형의 양자점 나노입자는 다음 유형 (이들의 임의의 조합 또는 합금 또는 도핑 유도체를 포함)을 포함하는 코어 물질을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다:
주기율표 2족에서 선택된 제 1 원소 및 주기율표 16족에서 선택된 제 2 원소를 포함하는 IIA-VIB (2-16) 물질, 또한 3원계(ternary) 및 4원계(quaternary) 물질 및 도핑 물질을 포함. 적합한 나노입자 물질은 MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe를 포함하지만 이에 제한되지 않는다;
주기율표 12족으로부터의 제 1 원소와 주기율표 15족으로부터의 제 2 원소를 포함하는 II-V 물질, 또한 3원계 및 4원계 물질 및 도핑 된 물질을 포함. 적합한 나노입자 물질은 Zn3P2, Zn3As2, Cd3P2, Cd3As2, Cd3N2, Zn3N2를 포함 하나 이에 한정되지 않는다;
주기율표 12족으로부터의 제 1 원소와 주기율표 16족으로부터의 제 2 원소를 포함하는 II-VI 물질, 또한 3원계 및 4원계 물질 및 도핑된 물질을 포함. 적합한 나노입자 물질은 CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, ZnO, HgS, HgSe, HgTe, CdSeS, CdSeTe, CdSTe, ZnSeS, ZnSeTe, ZnSTe, HgSeS, HgSeTe, HgSTe, CdZnS, CdZnSe, CdZnTe, CdHgSe, CdHgTe, HgZnS, HgZnSe, HgZnTe, CdZnSeS, CdZnSeTe, CdHgSeS, CdHgSeTe, CdHgSTe, HgZnSeS 및 HgZnSeTe를 포함 하나 이에 한정되지 않는다;
주기율표의 13족으로부터의 제 1 원소와 주기율표 15족으로부터의 제 2 원소를 포함하는 III-V 물질, 또한 3원계 및 4원계 물질 및 도핑 된 물질을 포함. 적합한 나노입자 물질은 BP, AlP, AlAs, AlS; GaN, GaP, GaAs, GaSb; InN, InP, InAs, InSb, AlN 및 BN을 포함 하나 이에 한정되지 않는다;
주기율표의 13족으로부터의 제 1 원소 및 주기율표의 14족으로부터의 제 2 원소를 포함하는 III-IV 물질, 또한 3원계 및 4원계 물질 및 도핑 된 물질을 포함. 적합한 나노입자 물질은 B4C, Al4C3, Ga4C, Si 및 SiC를 포함하지만 이에 제한되지 않는다;
주기율표의 13족으로부터의 제 1 원소와 주기율표의 16족으로부터의 제 2 원소를 포함하는 III-VI 물질, 또한 3원계 및 4원계 물질을 포함. 적합한 나노입자 물질은 Al2S3, Al2Se3, Al2Te3, Ga2S3, Ga2Se3, GeTe; In2S3, In2Se3, Ga2Te3, In2Te3 및 InTe를 포함하나 이에 한정되지 않는다;
주기율표 14족으로부터의 제 1 원소 및 주기율표 16족으로부터의 제 2 원소를 포함하는 IV-VI 물질, 또한 3원계 및 4원계 물질 및 도핑 된 물질을 포함한다. 적합한 나노입자 물질은 PbS, PbSe, PbTe, Sb2Te3, SnS, SnSe, SnTe를 포함 하나 이에 한정되지 않는다;
주기율표의 전이금속 중 임의의 그룹으로부터의 제 1 원소 및 주기율표의 16족으로부터의 제 2 원소를 포함하는 나노입자 물질, 또한 3원계 및 4원계 물질 및 도핑 된 물질을 포함. 적합한 나노입자 물질은 NiS, CrS, AgS, 또는 I-III-VI 물질, 예를 들어, CuInS2, CuInSe2, CuGaS2, AgInS2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
발명의 설명 및 특허청구범위를 위한 '도핑된 나노입자'(doped nanoparticle)라는 용어는 상기 예들 들어 열거한 물질 및 하나 이상의 주요 그룹 또는 희토류 원소를 포함하는 도펀트(dopant)의 나노입자를 지칭하며, 이것은 가장 흔히는 전이금속 또는 희토류 원소, 예를 들어 Mn+로 도핑된 ZnS 나노입자와 같은 망간을 갖는 아연 황화물(zinc sulfide)이며 여기에 제한되는 아니다.
일 실시 예에서, 양자점 나노입자는 카드뮴 같은 중금속을 실질적으로 함유하지 않는(예를 들어 4 wt.% 미만, 3 wt.% 미만, 2 wt.% 미만, 1 wt.% 미만, 0.5 wt.% 미만, 0.1 wt.% 미만, 0.05 wt.% 미만 또는 0.01 wt.% 미만 같이 5 wt.% 미만으로 함유하는) 나노입자 혹은 카듀뮴 같은 중금속을 함유하지 않는 나노입자이다.
생체내 적용에 있어서, 인듐 계 양자점, 예컨대 InP 및 그 합금 그리고 이들의 도핑된 유도체와 같은 중금속 비-함유 반도체 나노입자가 바람직하다.
일 실시 예에서, 본원에 기술된 임의의 나노입자는 나노입자 코어 상에 제공된 제 1 반도체 물질을 포함하는 제 1 층을 포함한다. 제 2 반도체 물질을 포함하는 제 2 층이 제 1 층 상에 제공 될 수 있다.
합성
하기 합성 단계가 접합에 사용될 수 있다. 연결제(linker)는 나노입자상의 카르복실 기능기와 엑소좀 - 특이 결합 리간드상의 아민 말단 기(amid end group) 사이에 아미드기를 형성하는데 사용될 수 있다. 양자점 나노입자의 무기 표면 상에 직접적으로 티올 고정기와 같은 공지 연결제가 사용될 수 있다. 표준 결합 조건(standard coupling condition)이 사용될 수 있고 통상의 기술자에게 알려진 것이다. 예를 들어, 적합한 결합제(coupling agent)는 디시클로헥실 카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 같은 카르보디이미드를 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 한 실시 예에서, 결합제는 EDC이다.
일 실시 예에서, 엑소좀 - 특이 결합 리간드 및 카르복실 말단 기를 갖는 양자점 나노입자는 용매 중에서 혼합될 수 있다. EDC와 같은 결합제가 혼합물에 첨가될 수 있다. 반응 혼합물은 배양될 수 있다. 조질(crude) 엑소좀 - 특이 결합 리간드 나노입자 접합체는 정제 그리고/또는 분리될 수 있다.
표준 고체 상태 정제 방법이 사용될 수 있다. 과량의 미반응 기능화된 리간드 그리고/또는 EDC를 제거하기 위해 적절한 용매를 사용하여 여과 및 세척하는 여러 사이클이 필요할 수 있다.
또 다른 양태에서, 일 실시 예는 본원에 기재된 임의의 실시 예들에 따라 리간드 나노입자 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시 예에서, 상기 방법은, i) 리간드-나노입자 접합체를 형성하기 위해 양자점 나노입자와 엑소좀 - 특이 결합 리간드를 결합하는 단계를 포함하며, 상기 나노입자는 코어 반도체 물질 및 외층을 포함하고, 상기 외층은 카르복실기를 포함한다. 일 실시 예에서, 결합 단계 i)는 (a) 상기 외층의 카르복실기를 카르보디이미드 연결제와 반응시켜 상기 카르복실기를 활성화시키고, (b) 상기 활성화된 카르복실기를 메틸화 - 특이 결합 리간드 (예: 리간드상의 말단)와 반응시키는 것을 포함한다.
추가 실시 예에서, 상기 방법은, ii) 상기 리간드 나노입자 접합체를 정제하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시 예에서, 상기 방법은, iii) 상기 리간드 나노입자 접합체를 분리하는 단계를 더 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 방법은 단계 i), ii) 및 iii)을 포함한다.
추가 실시 예에서, 상기 방법은, ⅱ) 양자점 나노입자를 정제하는 단계를 더 포함한다. 추가 실시 예에서, 상기 방법은 iii) 상기 특이 결합 나노입자 접합체를 분리하는 단계를 더 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 방법은 단계 i), ii) 및 iii)을 포함한다.
실시 예들
하기 실시 예들은 본 발명의 조성물 및 복합체(composite)를 제조하는 방법뿐만 아니라 본 발명의 조성물의 특정 특성을 제공하는 방법을 설명하고 개시의 완성을 위해 포함된다. 이들 실시 예는 본 개시의 범위 또는 교시를 제한하려는 것이 아니다.
실시 예 1
무독성 양자점 합성
분자 시딩 공정(seeding process)을 사용하여 무독성 양자점(QD)을 생성 하였다. 간단히 말하면, 500-700 nm 범위의 방출을 갖는 비-기능성 인듐계 양자점의 제조는 다음과 같이 수행되었다: 디부틸에스테르(대략 100ml) 및 미리스트산(MA)(10.06g)을 삼구 플라스크에 방치하고 1시간 동안 진공하에서 ~70℃에서 탈키시켰다. 이 기간 후에, 질소를 도입하고 온도를 ~ 90℃로 증가시켰다. 대략 4.7g의 ZnS 분자 클러스터 [Et3NH]4[Zn10S4(SPh)16]를 첨가하고, 그 결과 혼합물을 약 45분 동안 교반 하였다. 그 후 온도를 ~ 100℃로 증가시킨 후 In(MA)3(1M, 15ml)를 적하첨가 한 다음 트리스(트리메틸실일) 포스핀(TMS)3P(1M, 15ml)를 적하첨가 하였다. 온도를 약 140℃로 증가시키면서 반응 혼합물을 교반 하였다. 140℃에서, 디-n-부틸세바케이트 에스테르(1M, 35ml)에 용해된 인듐 미리스테이트(In(MA)3(5분 동안 교반) 및 디-n-부틸세바케이트 에스테르(1M, 35ml)에 용해된(TMS)3P를 적하첨가하였다. 이어서, 온도를 서서히 180℃로 증가시키고, 이어서 In(MA)3(1M, 15ml)와 (TMS)3P(1M, 40ml)를 차례로 적하첨가 하였다. 이와 같이 전구체를 첨가함으로써, 500nm에서 720nm까지 점차 증가하는 발광 최대(emission maximum)를 갖는 인듐계 입자가 형성되었다. 원하는 방출 최대 값이 얻어지면 반응을 멈추고 30분 동안 반응 온도에서 교반 하였다. 이 기간 후, 혼합물을 최대 대략 4일 동안 어닐링시켰다 (반응 온도보다 ~ 20 - 40℃ 낮은 온도에서). 어닐링을 돕기 위해 UV 램프도 이 단계에서 사용되었다.
캐뉼라 기술을 통해 건조 탈기된 메탄올(대략 200ml)을 첨가하여 입자를 분리 하였다. 침전물을 침강시킨 후, 필터 스틱을 사용하여 캐뉼라를 통해 메탄올을 제거 하였다. 건조 탈기된 클로로포름(대략 10ml)을 첨가하여 고형물(solid)를 세척 하였다. 고형물을 진공하에 1일 동안 건조되도록 방치 하였다. 방치 결과 ZnS 분자 클러스터 상에 인듐계 나노입자가 형성되었다. 추가 처리에서, 생성된 인듐계 나노입자의 양자 수율은 묽은 불화 수소산(HF)에서 세척함으로써 더 증가되었다. 인듐계 코어 물질의 양자 효율은 대략 25% - 50% 범위였다. 이 조성은 In, P, Zn 및 S를 포함하는 합금 구조로 간주된다.
ZnS 쉘의 성장: HF로 식각된 인듐계 코어 입자 20㎖를 삼구 플라스크에서 건조시켰다. 1.3g의 미리스트산 및 20ml의 디-n-부틸 세바케이트 에스테르를 첨가하고 30분 동안 탈기시켰다. 용액을 200℃로 가열하고, 1M (TMS)2S 2ml를 적하첨가 하였다(7.93ml/h의 속도로). 이 첨가가 완료된 후, 용액을 2분 동안 방치하고, 이어서 1.2g의 무수 아세트산 아연을 첨가 하였다. 용액을 200℃에서 1시간 동안 유지시킨 후 실온으로 냉각시켰다. 40ml의 무수 탈기 메탄올을 첨가하고 원심 분리하여 생성된 입자를 분리 하였다. 상청액을 버리고, 30ml의 무수 탈기된 헥산을 남아있는 고형물에 첨가 하였다. 용액을 5시간 동안 정치시킨 후 다시 원심 분리 하였다. 상청액을 수집하고 나머지 고형물은 버렸다. 최종 비-기능성 인듐계 나노입자 물질의 양자 효율은 유기 용매에서 대략 60%-90% 범위였다.
실시 예 2
수용성 표면 개질된 QD
약물 전달 매개체(vehicle)로서 멜라민 헥사메톡시메틸멜라민(HMMM) 개질된 형광 나노입자를 생성 및 사용하는 방법의 일 실시 예를 제공한다. 고유의 멜라민 기반 코팅은 우수한 생체적합성, 낮은 독성 및 매우 낮은 비-특이적 결합을 나타낸다. 이러한 고유한 특징은 생체외 및 생체내 모두에서 광범위한 생물의학 응용을 허용한다.
적합한 수용성 나노입자의 제조의 일 예는 다음과 같다: 실시 예 1에 서술된 바와 같은 Zn 함유 쉘을 갖는 인듐 및 인을 포함하는 합금을 코어 물질로서 갖는 608nm에서 적색 방출을 갖는 200mg의 카드뮴없는 양자점 나노입자가 (100마이크로리터) 이소프로필 미리스테이트(isopropyl myristate)와 톨루엔(1ml)에 분산시켰다. 이소프로필 미리스테이트는 리간드 상호작용제로서 포함되었다. 혼합물을 약 1 내지 2분 동안 50℃에서 가열한 다음, 실온에서 15시간 동안 천천히 흔들어 주었다. 모노메톡시 폴리에틸렌 옥사이드(CH3O-PEG2000-OH) (400mg), 살리실산(50mg) 및 헥사메톡시메틸멜라민(HMMM) (CYMEL 303, Cytec Industries, Inc., West Paterson, NJ)(400mg)의 톨루엔 용액(4ml)을 나노입자 분산액에 첨가 하였다. 기능화 반응에 포함되는 살리실산은 촉매, 가교제 및 COOH 공급원의 세 가지 역할을 한다. 부분적으로 OH기에 대한 HMMM의 선호 때문에, 살리실산에 의해 제공되는 많은 COOH기들이 가교결합 후에 QD상에서 유효하게 남아있다.
HMMM은 하기 구조를 갖는 멜라민계 연결/가교제이다:
Figure 112019023986800-pct00001
HMMM은 산 촉매 반응에서 반응하여 아미드, 카르복실기, 히드록실기 및 티올과 같은 다양한 기능기를 가교결합시킬 수 있다
혼합물을 마그네틱 교반기로 300rpm으로 교반하면서 130℃에서 처음 1시간 동안 탈기 및 환류시킨 다음 140℃에서 3시간 동안 탈기 및 환류시켰다. 처음 1시간 동안 HMMM과 친핵체(necleophil)의 반응에 의해 생성된 휘발성 부산물의 제거를 보장하기 위해 질소 스트림을 플라스크에 통과시켰다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 불활성 가스하에 저장 하였다. 표면 개질된 나노입자는 형광 양자 수율이 거의 또는 전혀 손실되지 않았으며, 개질되지 않은 나노입자와 비교하여 방출 피크 또는 반치전폭(FWHM) 값에서의 변화가 거의 나타나지 않았다. 표면 개질된 나노입자의 분액(aliquot)을 진공하에 건조시키고 탈이온수를 잔류물에 첨가 하였다. 표면 개질된 나노입자는 수성 매질에 잘 분산되고 영구적으로 분산된 상태로 남아 있다. 대조적으로, 개질되지 않은 나노입자는 수성 매질에 현탁(suspension)될 수 없었다. 상기 과정에 따른 표면 개질된 나노입자의 형광 양자 수율은 40 ~ 50%이다. 전형적인 배치(batch)에서, 47% ± 5%의 양자 수율이 얻어진다.
또 다른 실시 예에서, 608nm에서 적색 방출을 갖는 카드뮴이 없는 양자점 나노입자 (200mg)를 콜레스테롤(71.5mg)과 함께 톨루엔(1ml)에 분산시켰다. 혼합물을 약 1 내지 2분 동안 50℃에서 가열한 다음, 실온에서 15시간 동안 천천히 흔들어 주었다. 모노메톡시 폴리에틸렌 옥사이드(CH3O-PEG2000-OH)(400mg), 구아이페네신(100mg), 디클로로메탄 (DCM)(2mL), 살리실산(50mg) 및 HMMM(Cymel 303)(400mg)의 톨루엔 용액(4ml)을 나노입자 분산액에 첨가 하였다.
본원에서 사용된 화합물 "구아이페네신"(guaifenesin)은 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure 112019023986800-pct00002
본원에서 사용된 화합물 "살리실산"(salicylic acid)은 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure 112019023986800-pct00003
상기 혼합물을 마그네틱 교반기로 300rpm으로 교반하면서 4시간 동안 140℃에서 탈기 및 환류시켰다. 이전 절차와 마찬가지로, 처음 1시간 동안 질소 스트림을 플라스크에 통과시켜 HMMM과 친핵체의 반응에 의해 생성된 휘발성 부산물을 제거 하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 불활성 가스하에 저장 하였다. 표면 개질된 나노입자의 분액을 진공하에 건조시키고 탈이온수를 잔류물에 첨가 하였다. 100mM KOH 용액을 사용하여 용액의 pH를 6.5로 조정하고 과량의 비반응 물질을 Amicon 필터(30kD)[Merck KGAA, Frankfurter Strasse, 250 D-64293, Darmastadt, Germany]를 사용하여 3회 한외 여과하여 제거 하였다. 최종 수용액을 사용할 때까지 냉장 보관 하였다.
수용성을 증가시키기 위해 나노입자를 개질시키는 (예를 들어, 머캅토-기능화된 수용성 리간드와의 리간드 교환) 종래의 방법은 나노입자를 수용성으로 만드는 온화한 조건(mild condition) 하에서는 효과가 없다는 것이 주목할 만하다. 열 및 초음파 처리와 같은 더 가혹한 조건 하에서 수용성이 되는 분획(fraction)은 매우 낮은 양자 수율 (QY <20%)을 갖는다. 대조적으로, 본 발명의 방법은 높은 양자 수율을 갖는 수용성 나노입자를 제공한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 높은 양자 수율은 40% 이상이다. 어떤 실시 예들에서, 45% 이상의 높은 양자 수율이 얻어진다. 이 실시 예에서 제조된 표면 개질된 나노입자는 또한 잘 분산되고 에탄올, 프로판올, 아세톤, 메틸에틸케톤, 부탄올, 트리프로필메틸메타크릴레이트 또는 메틸메타크릴레이트를 비롯한 다른 극성 용매에 영구히 분산된 상태로 유지된다.
실시 예 3
표적화 리간드를 포함한 수용성 QD
어떤 실시 예들에서, 수용성 QD는 QD에 첨가되는 표적화 리간드(targeting ligand)를 포함하도록 개질된다. 따라서, 일 실시 예에서, 비독성 및 수용성 (생체 적합성)이고 접합 가능한 기능 (COOH, OH, NH2, SH, 아지드, 알킨)이 표면에 구비된 양자점 나노입자가 합성된다. QD에 부가될 수 있는 기능기(functional group), 예를 들어 본원의 실시 예 2에서 제공된 COOH 기능기에 의해, QD는 표적화 리간드를 포함하도록 개질 될 수 있으며, 표적화 리간드를 포함하여 QD가 샘플, 세포 및 조직에서 엑소좀을 선택적으로 동정(식별)하게 한다. 표적화 리간드 개질된 QD는 검출을 위해 조사되고 빛을 방출한다.
하나의 예시된 실시 예에서, 수용성 무독성 QD는 카르복실 기능화된 것이거나 또는 카르복실 기능화된다. COOH-QD는 예를 들어 수용성 1-에틸-3-(-3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 사용하는 카르보디이미드 연결 기술과 같은 화학적 방법을 사용하여 특정 항체와 같은 엑소좀 표적화 모이티(moiety)의 아민 말단과 연결된다. 카르복실 기능화된 QD는 EDC와 혼합되어 활성 O-아실이소우레아 중간체를 형성하고, 이는 이어서 반응 혼합물 중 단일클론성 항체상의 1차 아미노기로부터의 친핵성 공격에 의해 치환된다. 원한다면, N-하이드록시숙신이미드의 술포 유도체(sulfo-NHS)가 일차 아민-함유 항체와의 반응 동안 첨가된다. sulfo-NHS의 첨가로, 생리학적 pH에서 1차 아민과의 효율적인 접합을 가능하게 하면서, EDC는 NHS를 카르복실과 결합시켜 O-아실이소우레아 중간체보다 더 안정한 NHS 에스테르를 형성한다. 두 경우 모두 결과는 QD와 항체 사이의 공유 결합이다. 스즈키-미야우라 교차-결합(cross-coupling), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도 메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) 또는 알데히드 기반 반응과 같은 다른 화학이 대안적으로 사용될 수 있다.
한 실시 예에서, 무독성, 수용성 양자점은 예를 들어, Glypican-1, CA19-9, 메소텔린, PD-L1, 텔로머라아제(telomerase) 또는 이들의 임의의 조합에 특이적인 엑소좀 - 특이 결합 리간드와 같은 엑소좀 결합 부위에 대한 항체에 화학적으로 부착된다.
엑소좀 - 특이 결합 리간드를 갖는 생체 적합성 수 분산성 카드뮴없는 QD의 공유 접합: 에펜도르프 튜브에서 1mg의 카르복실 - 기능화된 수용성 양자점을 100μl MES 활성화 완충액과 혼합하였다(즉, 40mg/ml 스톡(stock)의 25μl를 100μl MES에 첨가). MES 완충액은 pH 4.5, 탈이온수 중 25mM 용액 (2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 헤미나트륨 염(MES), Sigma Aldrich)으로 제조된다. 여기에 새로운 EDC 용액 (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), DI 물 중 30mg/ml 스톡용액, 피셔 사이언 티픽(Fisher Scientific)) 33μl를 첨가하고 용액을 혼합한다. 새로운 sulfo-NHS (DI 물 중에, 100mg/ml 스톡 용액, ThermoFisher Scientific) 4μl를 첨가하여 혼합한다. NanoSep 300K 필터 (PALL NanoSep 300K Omega ultrafilters)는 100μl MES에서 사전 적셔졌다. MES/EDC/sulfo-NHS/QD 용액이 NanoSep 300K 필터에 첨가되고 충분한 MES로 마무리된다(topped off). 필터를 5000rpm/15분으로 원심 분리한다. 도트(dot)들을 50μl 활성화 완충액에 재 분산시키고 메틸화 특이 리간드 10μl를 함유하는 에펜도르프 튜브로 옮긴다. 용액을 잘 혼합하고 밤새 상온에서 배양 처리한다(약 16 - 18시간). 이 용액을 6-아미노 카프로산(6AC) (19.7mg/100 mM) 16μl로 급냉(quench)시킨다. 급랭은 1차 아민을 갖는 다른 화합물로 수행될 수 있지만, 6AC는 COOH를 가지며 생성물의 콜로이드 안정성을 유지할 수 있기 때문에 본 실시 예에서 선택된다. 용액은 미리 적셔진(pre-wetted) 300K 필터 (100μl 1x PBS)로 옮겨지며 1x PBS로 500μl 라인까지 채워진다(topped up). 초과 SAV는 Nanosep 300K 필터 및 1x PBS 완충액을 사용하여 3회 한외 여과하여 제거한다. 원심 분리의 각 사이클은, 매 사이클 후 ~ 400μl의 1x PBS로 재 분산하면서 5000rpm에서 20분 동안 실행된다. 최종 농축액을 100μl PBS에 재 분산시켰다.
실시 예 4
표준 접합 화학이 접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 나노입자 엑소좀 - 특이 결합 리간드 접합체를 제조하는 방법은 나노입자를 제공하는 단계, 결합제를 제공하는 단계, 엑소좀 - 특이 결합 리간드, 예를 들어, Glypican-1, CA19-9, 메소텔린, PD-L1, 텔로머라아제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 제공하는 단계, 그리고 나노입자 엑소좀 - 특이 결합 리간드 접합체를 형성하기 위해 혼합물을 배양(incubation) 하는 단계를 포함한다. 혼합물을 정제하고 분리하여 나노입자 엑소좀 - 특이 결합 리간드 접합체를 수득할 수 있다.
배양 조건은 아미드 또는 에스테르의 형성을 허용하도록 선택될 수 있다. 다른 결합이 형성될 수 있음을 이해해야 한다 (예를 들어, 공유 결합 및 비-공유 결합 모두). 엑소좀 - 특이 결합 리간드는 나노입자와 공유결합으로, 물리적으로, 이온 쌍으로 또는 반데르발스 상호작용으로 접합될 수 있다. 결합은 양자점 나노입자의 무기 표면 상에 직접적으로 또는 나노입자를 수용성 및 생체적합성으로 만드는데 사용되는 유기 코로나 층 상에 아미드, 에스테르, 티오에스테르 또는 티올 고정기에 의해 형성될 수 있다.
결합을 위해 표준 배양 조건을 사용할 수 있다. 예를 들어, 결합 조건은 0.5 내지 4시간 범위의 용액일 수 있다. 결합 조건의 온도 범위는 100℃ 내지 200℃ 범위일 수 있다. 결합 조건은 반응 동안 일정하거나 변화될 수 있다. 예를 들어, 반응 조건은 1시간 동안 130℃ 일 수 있고, 이어 3시간 동안 140℃로 상승될 수 있다.
연결제는 나노입자 상의 카르복실 기능기와 엑소좀 - 특이 결합 리간드 상의 카르복실 또는 아민 말단 기 사이에 아미드 또는 에스테르기를 형성하는데 사용될 수 있다. 연결제 또는 결합제는 벤조트리아졸일옥시트리스(디메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(benzotriazolyloxytris(dimethylamino)phosphonium Hexafluorophosphate, BOP) 및 카르보디이미드 예를 들어 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 포함할 수 있다. EDC는 아미드 결합제로서 사용하기에 바람직한 카르보디이미드이다.
예를 들어, 카르복실 말단 기를 갖는 양자점 나노입자 및 엑소좀 - 특이 결합 리간드는 용매 중에서 혼합될 수 있다. EDC와 같은 결합제가 혼합물에 첨가될 수 있다. 반응 혼합물을 배양할 수 있다. 조질 엑소좀 - 특이 결합 리간드 - QD 나노입자 접합체를 정제하여 접합된 QD 나노입자 접합체를 수득할 수 있다.
표준 고체 상태 정제 방법이 사용될 수 있다. 과량의 미반응 엑소좀 - 특이 결합 리간드 및 EDC를 제거하기 위해 적절한 용매로 여과하고 세척하는 여러 사이클이 필요할 수 있다.
나노입자 엑소좀 - 특이 결합 리간드 접합체는 이후 특정 엑소좀이 방출되는 특정 유형의 암을 결정하거나 진단하기 위해 실시간 영상 진단을 위해 포유동물 또는 조직에 도입될 수 있다. 예를 들어, 양자점 나노입자들 각각은 양자점의 방출 색 (예를 들어, 녹색, 황색 또는 적색)에 기초하여 특정 엑소좀 - 특이 결합 리간드에 접합될 수 있다. 특정 엑소좀에 결합되면 형광에 따라 특정 엑소좀이 방출되는 특정 유형의 암 및 그 유형의 엑소좀과 연관될 수 있는 고유 방출 코드 (고유 방출 지문)가 획득된다.
엑소좀 - 특이 결합 리간드 접합체의 투여는 장내 또는 비경구일 수 있다. 예를 들어, 엑소좀 - 특이 결합 리간드 접합체는 피하, 정맥 내, 근육 내, 국소 및 경구로 투여될 수 있다. 예로는 볼루스 주사(bolus injection) 또는 IV 주입이 있다.
임상 시료의 준비와 분석
췌장암 진단 및 췌장암 단계가 확인된 환자로부터 회수된 양성 체액(positive body fluid) 샘플은 적절한 환자 동의 및 승인 후에 준비된다. 초기에 췌장 주스, 바늘 흡인액, 담즙 브러싱(brushing) 및 혈장으로부터의 샘플을 조질 체액(crude body fluid)으로 사용하고 QD 접합체와 혼합하고 샘플을 QD - 엑소좀 또는 엑소좀 단백질 복합체를 포착하기 위해 고정된 2차 항체가 있는 도트 블롯 종이(dot blot paper)에 적용했다. 신호가 형광 검출 방법 (시각적, 현미경 또는 플레이트 판독기)을 사용하여 확인되면, 표본 유형을 측면 유동 분석 장치(lateral flow assay device)를 사용하여 추가 분석에 사용할 수 있다. 약한 신호가 관찰되면 겔 여과 스핀 컬럼(gel filtration spin column)을 사용하는 1 단계(one-step) 엑소좀 농축(enrichment) 단계를 사용할 수 있다. 추가 마커가 검출 시스템에 추가 될 수 있다.
또 다른 실시 예에서, 리간드 - 나노입자 접합체는 유기체에 생체내 도입된다. 그러한 유기체는 포유류를 포함한 원핵생물 또는 진핵 생물을 포함 할 수 있다. 리간드 - 나노입자 접합체의 적합한 엑소좀 결합 리간드는 Glypican-1, CA19-9, 메소텔린, PD-L1, 텔로머라아제 또는 이들의 임의의 조합에 대해 특이적인 엑소좀 - 특이 결합 리간드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 리간드 - 나노입자 접합체를 엑소좀과 접촉시킨다. 리간드 - 나노입자 접합체는 조직 샘플이 검출을 위해 유기체로부터 제거되면 생체내 또는 생체외로 광원에 의해 여기된다. 리간드 - 나노입자 접합체에 의한 발광 또는 흡광도를 측정하고 정량화한다. 검출은 실시간으로 수행될 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 이점은 상기 명세서로부터 통상의 기술자에게 명백 할 것이다. 예를 들어, 통상의 기술자는 특정 유형의 암에 대해 특이적인 서로 다른 형광 파장을 방출하는 복수의 엑소좀 리간드 - 접합된 QD가 포유동물 또는 그의 일부에 도입될 수 있음을 인식할 것이다; 예를 들어 적색으로 방출되는 QD는 췌장암에 특이적일 수 있지만 녹색으로 방출되는 QD는 다른 유형의 암에 특이적일 수 있다. 따라서, 통상의 기술자는 본 발명의 광범위한 발명 개념을 벗어나지 않고 상술한 실시 예에 변화 또는 수정을 가할 수 있음을 인식해야 한다. 본 발명은 본 명세서에 설명된 특정 실시 예에 한정되지 않고 본 발명의 범위 및 사상 내에 있는 모든 변경 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (20)

  1. 양자점 나노입자 접합체 패널로서,
    상기 패널은 양나점 나노입자 접합체들을 포함하고, 각 양자점 나노입자 접합체는 카드뮴없는 양자점과 상기 카드뮴없는 양자점에 연관되고 엑소좀 - 특이 결합 리간드에 연결된 리간드 상호 작용제를 포함하며,
    상기 패널은 Glypican-1, CEA, CA 19-9, 메소텔린(mesothelin), PD-L1 및 텔로머라아제(telomerase)에서 선택되는 적어도 두 개에 대해 특이성을 가지는 서로 다른 엑소좀 결합 양자점 나노입자 접합체들을 포함하며,
    상기 서로 다른 엑소좀 결합 양자점 나노입자 접합체들은 양자 수율이 40% 이상이고,
    상기 서로 다른 엑소좀 결합 양자점 나노입자 접합체들 각각은 특정 방출 색상을 가지며,
    상기 패널은 특정 엑소좀에 결합되고 여기 광에 노출되면 암의 특정 유형과 연관된 고유 방출 코드를 생성하는,
    양자점 나노입자 접합체 패널.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 양자점은 In1-xP1-yZnxSy 등급화된 합금 양자점으로서, 여기서 x와 y는 양자점의 중심에서 표면으로 갈수록 0에서 1까지 점차적으로 증가하는,
    양자점 나노입자 접합체 패널.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 리간드 상호 작용제는 C8-C20 지방산, 콜레스테롤 또는 이들의 에스테르인,
    양자점 나노입자 접합체 패널.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀 - 특이 결합 리간드는, 항체 및 항체 단편에서 선택되는,
    양자점 나노입자 접합체 패널.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀 - 특이 결합 리간드는, Glypican-1 항체, Glypican-1 태깅 분자(tagging molecule) 또는 이들의 조합인,
    양자점 나노입자 접합체 패널.
  7. 제1항에 있어서,
    각 양자점 나노입자는 II-VI, III-V 또는 I-III-VI 물질 또는 이들의 합금 또는 도핑된 유도체인,
    양자점 나노입자 접합체 패널.
  8. 제1항에 있어서,
    각 양자점 나노입자는 350nm 내지 1000nm 범위의 방출 스펙트럼과 연관된,
    양자점 나노입자 접합체 패널.
  9. 제1항에 있어서,
    각 양자점 나노입자는 세포내 흡수 증강제, 조직 침투 증강제 또는 이들의 조합을 더 포함하는,
    양자점 나노입자 접합체 패널.
  10. i) 제1항에 따른 양자점 나노입자 접합체 패널을 엑소좀과 접촉하고;
    ii) 광원으로 상기 패널의 양자점 나노입자 접합체들을 여기하고;
    iii) 상기 양자점 나노입자 접합체 패널의 광 방출 또는 광 흡수를 검출함을 포함하는,
    엑소좀 검출 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. i) 제1항에 따른 양자점 나노입자 접합체 패널을 암환자 또는 암세포로부터 획득한 엑소좀과 접촉하고;
    ii) 광원으로 상기 양자점 나노입자 접합체 패널의 양자점 나노입자 접합체들을 여기하고;
    iii) 상기 양자점 나노입자 접합체 패널의 광 방출 또는 광 흡수를 검출함을 포함하는,
    암의 유형 결정 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제13항에 있어서,
    상기 암은 췌장암, 방광암, 폐암 또는 이들의 조합인,
    암의 유형 결정 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 결정은 시험관내에서 수행되는,
    암의 유형 결정 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 결정은 세포 배양의 살아 있는 세포의 조직 또는 유체 샘플인 샘플 또는 고정된 조직 또는 유체 샘플인 샘플에서 수행되는,
    암의 유형 결정 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 결정은 측방 유동 분석 장치를 사용하여 수행되는,
    암의 유형 결정 방법.
  20. 제13항에 있어서,
    상기 결정은 실시간으로 수행되는,
    암의 유형 결정 방법.
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