KR102011566B1

KR102011566B1 - 효율적으로 펩티드 사슬을 절단하는 효소에 감응하는 나노입자 표면 분자체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102011566B1
Application number: KR1020170099169A
Authority: KR
Inventors: 김성지; 정상화; 송재중; 이원석
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2019-08-16
Also published as: KR20190015685A

Abstract

본 발명은 효율적으로 펩티드 사슬을 절단하는 효소에 감응하는 나노입자 표면 분자체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

효율적으로 펩티드 사슬을 절단하는 효소에 감응하는 나노입자 표면 분자체 및 그 제조방법{DESIGNED SURFACE MOLECULES OF NANOPARTICLES EFFICIENTLY RESPONDOING TO PROTEOLYTIC ENZYME AND MANUFACTURING MEHTODS THEREOF}

무기 형광나노입자, 금속 나노입자, 란탄족 나노입자와 같이 나노미터 (nanometer = 10^-9 m) 크기를 가지며 특징적인 광학 성질을 가지는 나노입자들은 광학 형광 이미징, 광열 치료와 같이 다양한 생체 응용 가능성을 가지고 있다(Michalet et al., Science 2005, 307, 538. 2. De et al., Adv . Mater. 2008, 20, 4225를 참조하라).

이와 같은 나노입자들을 생체 환경에 응용하기 위해서는 나노입자의 표면을 생체 친화적으로 개질할 필요가 있으며, 목적에 따라 다양한 표면 물질이 사용된다.

분자 이미징에 활용되는 나노입자 프로브를 제작하기 위해서는. 나노입자를 제작하는 기술뿐만이 아니라, 나노입자의 표면 물질을 목적에 맞게 개질하는 기술이 중요하다.

한편, 단백질을 분해하는 펩티드 사슬 절단효소는 다양한 종류가 생명체 내에서 존재하며, 생명체의 소화 작용, 생리현상 조절, 암 성장과 같은 다양한 생명 현상을 조절하는데 중요한 역할을 담당하고 있으므로, 펩티드 사슬 절단효소의 활성을 고민감도로 추적하기 위하여 다양한 나노입자 기반 프로브들이 연구되어 왔다.

예를 들어, 2012년 Impeiral College of London 의 Steven Molly 교수 연구팀은 형광나노입자과 금 나노입자를 펩티드 사슬로 연결한 형광나노입자-금 나노입자 복합체를 제작하고, 이를 이용해 urokinase-type plasminogen activator (uPA) 의 효소 활성을 감지하여 형광 세기가 증가하는 생체 환경 감응형 발광 형광나노입자 프로브를 개발하였다.(Lowe et al., ACS Nano 2012, 6, 851)

이 방식은 유방암 진단자로 사용되는 uPA 의 효소 활성에 의해 특이적으로 끊어지는 펩티드 사슬로 형광나노입자과 금 나노입자를 연결하는 것으로, 정상 상태에서는 형광나노입자 가까이에 존재하는 금 나노입자에 의해 형광나노입자의 형광이 소광(quench) 되며 uPA 고활성 환경에서는 펩티드 사슬이 끊어지며. 형광나노입자과 금 나노입자 사이 거리가 멀어지며, 형광나노입자 형광이 회복되며 형광 세기가 증가하는 것으로 uPA 의 활성을 정량할 수 있었다.

이와 같이, 나노입자 복합체 프로브가 고민감도로 효소 활성과 같은 생체 활성을 감지하기 위해서는 소광체가 발광 물질의 형광을 고효율로 소광시켜야 하고, 효소가 나노 입자 표면에 쉽게 접근할 수 있어야 하며, 발광 물질과 소광체 사이 결합이 끊어진 후 발광 물질과 소광체가 효율적으로 멀어져야 한다.

현재까지 대부분의 연구는 소광체 특성 조절 및 발광 물질과 소광체 간 거리 조절을 통해 소광 효율을 높이는데 집중하였으나, 나노 입자의 표면 조절을 통해 효소의 접근성을 향상시킬 수 있는 기술 및 소광체와 발광 물질간 사이 거리가 끊어진 이후에 대해서는 기술 개발이 거의 이루어지지 않고 있다.

이에 따라서, 효소의 접근성을 향상시키고, 소광체와 발광 물질 사이의 거리를 효과적인 늘릴 수 있는 방안에 대한 요구가 계속되고 있다.

본원 발명에서 해결하고자 하는 과제는 형광 나노입자와 소광체를 연결하는 표면 분자체에 대한 절단용 효소 접근성을 향상시키는 것이다.

본원 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 절단용 효소 접근성이 향상된 형광 나노입자와 소광체를 연결하는 표면 분자체를 제공하는 것이다.

본원 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 과제는 형광 나노입자와 소광체를 연결하는 표면 분자체에 대한 절단용 효소 접근성을 향상시키고, 절단 후 소광체와 형광 나노입자의 이격 속도를 향상시키는 것이다.

본원 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 형광 나노입자와 소광체 사이의 절단성 분자체에 대한 절단용 효소 접근성이 향상되고, 절단 후 된 소광체와 형광 나노입자 사이의 이격 속도가 향상되는 형광 나노입자 복합체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은

형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분, 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체부분, 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체를 제공한다.

본 발명은 일 측면에서,

형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분, 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체부분, 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체가 결합된 형광나노입자를 제공한다.

본 발명은 다른 일 측면에 있어서,

형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분, 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체부분, 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체가 결합된 형광나노입자를 소정 위치에 위치시키고, 상기 펩티드 부분을 효소 특이적으로 절단시켜 상기 형광나노입자를 형광시키는 것을 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 측면에서,

형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분, 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체부분, 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체가 결합된 형광나노입자를 소정 위치에 위치시키고, 상기 펩티드 부분을 효소 특이적으로 절단시켜 상기 형광나노입자를 형광시키고, 상기 형광을 이용하여 촬영, 치료, 및 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서,

형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분, 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체부분, 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체가 결합된 형광나노입자를 포함하는 치료, 진단, 촬영용 발광 물질을 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 측면에서,

형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분, 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체를 포함하는 분자체를 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 측면에서,

형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체부분, 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체가 결합된 형광나노입자를 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 측면에서,

나노입자에 절단되는 영역을 포함하는 분자체를 결합시키고, 상기 분자체의 절단 영역을 절단한 후, 절단 영역을 나노입자와의 정전기적 척력에 의해서 제거하는 것을 특징으로 하는 절단영역의 제거 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 형광 나노입자는 양자점, 금속 나노입자, 란탄족 나노입자, graphene oxide, carbon dot 일 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 상기 양자점은 I형 또는 II형 양자점일 수 있으며, 바람직하게는 양자점이 빛을 흡수해서 만들어진 전자/정공쌍이 핵 또는 껍질 구조에 공간적으로 분리된 II-형 양자점을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시에 있어서, 상기 II형 양자점은 핵과 껍질의 전도대가 비슷한 에너지 준위에 위치하며, 껍질의 원자가전자대는 핵의 원자가 전자대 보다 더 낮은 에너지 준위에 위치하여, 전자가 양자점의 외부로 쉽게 이동할 수 있는 pseudo II-형 양자점일 수 있다. 예를 들어, CdTe/CdSe 핵/껍질, CdSe/ZnTe 핵/껍질, ZnTe/ZnSe 핵/껍질, CuInS2/CdS 핵/껍질, GaSb/GaAs 핵/껍질, InAs/GaAs 핵/껍질 양자점일 수 있다. 상기 pesudo II-형 양자점들은 최외곽에 단일층 정도의 얇은 층으로 존재하여 광유발 전자 이동을 방해하지 않으면서, 양자점 표면 결함을 제거할 수 있는 ZnS와 같은 껍질층을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 형광 나노입자, 바람직하게 양자점은 분산성을 향상시킬 수 있도록 표면이 양쪽성 이온으로 개질된 양자점일 수 있다. 상기 양쪽성 이온은 본원 발명에서 전체로 참고문헌으로 인용되는 김성지 등에게 허여된 대한민국 특허 제1276693호에 개시된 양쪽성 이온들을 사용할 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 표면 결합 영역은 나노 입자의 표면에 강하게 결합할 수 있는 능력을 가진 부분으로써, 나노입자의 표면에 안정적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 싸이올기(-SH), 다이싸이올기(-CS2, -PS2, -CH(SH)(CH2CH2SH)), 아민기(-NH2, -NH), 포스포네이트기(-PO3H), 포스파이드기(-P), 포스핀옥사이드기 (-P=O), 카르복시기 (-COOH), 하이드록시기 (-OH), 이미다졸기 (-imidazole), 다이올기 (-diole)등이 있다. 상기 연결 영역은 표면 결합 영역과 작용기 영역을 효과적으로 연결 시켜주는 부분으로써, 일예로 아미드 결합 (-CONH-), 탄소 결합 (-(CH2)n-), 폴리에틸렌글리콜 (-(CH2CH2O)n-), 트리아졸 (triazole)등이 있다. 상기 작용기 영역은 작용기 영역은 나노 입자를 분산시킬 용매에 안정하게 분산 시킬 수 있는 능력을 가지며 이를 연결 영역과 화학적으로 결합시킨 부분으로써, 양쪽성 이온으로 술포베테인기 (-N+(CH3)2CH2CH2CH2SO3-), 카르보베테인기 (-N+(CH3)2CH2CH2CH2COO-), 포스포릴콜린기 (-PO4-CH2CH2N+)등을 사용할 수 있다. 상기 양쪽성 이온은 바람직하게는 하기 화학식 (I)로 표현될 수 있다.

(I)

본 발명에 있어서, 상기 형광 나노입자, 바람직하게 상기 양자점은 소광체에 결합된 전하를 띠는 부분과 동일한 전하를 띠는 분자체로 개질될 수 있다. 상기 전하를 띠는 분자체는 양이온 또는 음이온을 띨 수 있으며, 특별한 제한은 없다.

본 발명의 실시에 있어서, 상기 분자체는 음이온 또는 음전하를 띠는 분자체일 수 있으며, 일 예로 본원 발명에서 전체로 참고문헌으로 인용되는 김성지 등이 출원한 대한민국 특허출원공개 제10-2016-0046933호에 개시된 분자체일 수 있다.

상기 분자체는 부착영역, 연결 영역 및 전하를 띠는 영역으로 이루어지며, 여기서 상기 부착 영역은 싸이올기(-SH), 다이싸이올기(-CS2, -PS2, -CH(SH)(CH2CH2SH)), 아민기(-NH2, -NH), 포스포네이트기(-PO3H), 포스파이드기(-P), 포스핀옥사이드기 (-P=O), 카르복시기 (-COOH), 하이드록시기 (-OH), 이미다졸기 (-imidazole), 다이올기 (-diole)에서 선택되고, 상기 연결 영역은 아미드 결합 (-CONH-), 탄소 결합 (-(CH2)n-), 폴리에틸렌글리콜 (-(CH2CH2O)n-), 트리아졸 (triazole)에서 선택되며, 그리고, 상기 전하를 띠는 영역은 카르복실기일 수 있다. 일 예로 상기 분자체는 하기 화학식 (2)로 표현될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 소광체를 포함하는 분자체에서 형광 나노입자 결합부분은 나노 입자의 표면에 강하게 결합할 수 있는 능력을 가진 부분으로써, 나노입자의 표면에 안정적으로 결합할 수 있는한 특별한 제한은 없다. 예를 들어 싸이올기(-SH), 다이싸이올기(-CS2, -PS2, -CH(SH)(CH2CH2SH)), 아민기(-NH2, -NH), 포스포네이트기(-PO3H), 포스파이드기(-P), 포스핀옥사이드기 (-P=O), 카르복시기 (-COOH), 하이드록시기 (-OH), 이미다졸기 (-imidazole), 다이올기 (-diole)등이 있다. 바람직하게는 실시예에서 부착영역은 아민기이다.

본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 펩티드 부분과 형광 나노 입자 사이의 거리를 증가시켜, 절단 효소의 효율을 증가시킬 수 있는 부분을 의미한다. 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 스페이서는 펩티드 부분과 형광 나노 입자 사이의 거리를 늘려줌으로서, 펩티드 부분과 형광 나노 입자의 거리가 가까워 절단용 효소의 접근성이 저하되는 것을 방지하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 스페이서 부분은 바람직하게는 상기 형광나노입자와 절단영역 사이의 거리를 3 nm 에서 6 nm 정도 증가시키게 된다. 형광나노입자와 절단영역 사이의 거리가 너무 가까우면 효소가 절단 영역을 인식하지 못하며, 너무 멀면 형광나노입자의 형광 변조 능력이 감소하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 스페이서 부분은 탄소 결합 (-(CH2)n-), 폴리에틸렌글리콜 (-(CH₂OCH₂O)n-), -(CH₂OCH₂O-CH₂-CO-NH)n- 과 같은 부분들을 사용할 수 있다. 여기서 n은 2-100, 바람직하게는 3-50, 보다 바람직하게는 4-10의 정수의 반복단위일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펩티드 부분은 절단 효소에 의해서 특이적으로 분해될 수 있는 생체 분자체를 사용할 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 절단 효소는 발광이 필요한 영역에서 과발현되는 효소에 의해서 절단되는 펩티드일 수 있다. 일 예로, 쥐의 대장암 영역에서 과발현되는 matrix metalloproteinase (MMP)에 의해서 절단될 수 있는 -PLGVR- 부부을 포함하는 펩티드일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 소광체는 형광 나노 입자의 형광을 흡광할 수 있는한 특별한 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시에 있어서, 상기 소광체는 포스터 공명 에너지 전이(Forster resonance energy transfer) 타입의 소광일 수 있다. 이 경우, 상기 형광 나노 입자의 형광 파장과 동일한 파장을 흡수하는 흡광체를 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 실시에 있어서, 전자 받게 형태의 소광체 일 수 있다. 이 경우, 상기 나노 입자는 pseudo II형 양자점이며, 전자 받게 형태의 소광체는 양자점이 가지고 있는 전도대 보다 더 낮은 에너지 준위에 위치하는 최저 비점유 분자 오비탈 (lowest unoccupied molecular orbital, LUMO)을 가진 전자 받게일 수 있다. 발명의 바람직한 일 실시에 있어서, 상기 소광체는 메틸렌 블루를 포함하는 소광체일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분은 음전하 또는 양전하를 띠는 말단의 펩티드일 수 있다. 형광나노입자가 양전하를 띠는 경우 정전기적 척력이 작용하도록 양전하를 띨 수 있으며, 형광나노입자가 음전하를 띠는 경우 정전기적 척력이 작용하도록 음전하를 띨 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 상기 전하를 띠는 펩티드는 -(D)m, 여기서 m은 1 이상의 정수, 바람직하게는 2~10의 정수, 보다 바람직하게는 3~5의 정수, 가장 바람직하게는 4일 수 있다.

본 발명에 의해서, 펩티드 분해효소인 MMP 에 의해 발광 신호가 조절되는 나노입자 내 상호작용을 나노입자 표면 물질의 화학적 개질을 통해 조절하고, 이를 통해 효율적으로 MMP 의 활성에 감응하는 발광 프로브 및 그 제작 방법이 개발되었다.

구체적으로, (1) 효소 특이적 펩티드 사슬과 발광 나노입자인 양자점 간 거리 조절을 통해 효소 접근성이 향상되었으며, (2) 소광체 연결된 양자점 복합체 프로브의 전하 조절을 통해 효소 반응 후 소광체와 양자점 간 반발작용을 이용해 더 효율적으로 효소 활성을 감지할 수 있게 되었다.

종양 특이적으로 과발현 되는 MMP 의 활성에 반응하여 발광 신호가 조절되는 고효율의 생체 환경 감응형 프로브 제작이 가능하며, 기존의 나노입자 기반 기술과 접합하여 기존 MMP 활성 감응형 나노입자 프로브의 효율을 향상시킬 수 있다. MMP 뿐만이 아니라 펩티드 분해 반응을 일으키는 다양한 효소의 활성에 감응하는 나노입자 복합체 개발 시 응용될 수 있으며, 본 특허에서는 나노입자의 한 예로 양자점을 이용했으나, 다른 나노입자들의 펩티드 분해 효소 활성 감응형 발광 프로브 응용시에도 적용될 수 있다.

도 1은 펩티드 분해 효소 활성 감응형 형광 신호 조절 양자점 복합체 표면의 펩티드 사슬과 양자점 사이의 거리 조절을 통하여 효소 접근성을 조절하는 모식도. 펩티드 분해 효소에 의해 인식되는 펩티드 사슬과 양자점 표면 사이에 PEG 기반 spacer 를 화학 개질 함으로써 효소가 펩티드 사슬을 더 쉽게 인식하게 된다.
도 2는 펩티드 분해 효소 활성 감응형 형광 신호 조절 양자점 복합체 표면의 소광체 분자체의 전하 상태 조절을 통해, 펩티드 사슬 분해 반응 후 양자점과 소광체의 정전기적 상호작용을 조절하는 모식도. 음전하 표면을 가진 양자점과 같은 전하를 가지는 음전하 소광체는 정전기적 척력으로 반발하며, 양전하 소광체는 정전기적 인력이 작용한다.
도 3은 (A) PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점의 투과 전자 현미경 이미지 (transmission electron microscope). (B) PbS/CdS/ZnS 양자점의 흡광 스펙트럼. (C) PbS/CdS/ZnS 양자점의 형광 스펙트럼. (D) PbS/CdS/ZnS 양자점의 energy dispersive X-ray spectroscopy 스펙트럼이다.
도 4는 (A) PEG-GGPLGVRGGCDDDD, mi-MB, dihydrolipoic acid, zwitterionic charged lipoic acid derivative 의 구조. (B) PEG-GGPLGVRGGCDDDD 와 mi-MB 의 결합을 통한 PEG-GGPLGVRGGC(C-MB)DDDD 제작 모식도. (C) 수용액 분산 양자점과 PEG-GGPLGVRGGC(C-MB)DDDD 의 결합을 통한 양자점 복합체 1번 제작 모식도이다.
도 5는 양자점 복합체 1 번에 matrix metalloprotenaise-2 를 특정 농도 혼합 함에 따라 시간에 따라 변화하는 양자점 형광 세기 그래프. MMP-In : MMP-2 inhibitor이다.
도 6은 (A) PEG-GGPLGVRGGC(C-MB)DDDD 와 (B) GGPLGVRGGC(C-MB)DDDD 의 구조 모식도이다.
도 7은 (A) 동일 농도 양자점 복합체 1, 2 번의 흡광 스펙트럼. 620 nm 와 670 nm 의 peak 은 형광 소광체인 methylene blue 의 흡수를 반영함. (B) 동일 농도 양자점 복합체 1,2 번의 양자점 형광 스펙트럼. 양자점 복합체 1 번은 PEG spacer 가 존재하며, 양자점 2번은 PEG spacer 가 없음.
도 8은 양자점 복합체 1,2 번 용액에 MMP-2 을 20 μ으로 혼합 후 시간에 따른 양자점 형광 세기 그래프이다.
도 9는 (A) PEG-GGPLGVRGGC(C-MB)DDDD, (B) PEG-GGPLGVRGGC(C-MB)DD, (C) PEG-GGPLGVRGGC(C-MB) 의 구조 모식도. (D) PEG-GGPLGVRGGC(C-MB)DDDD, PEG-GGPLGVRGGC(C-MB)DD, PEG-GGPLGVRGGC(C-MB) 의 agarose gel electrophoresis 결과이다.
도 10은 (A) 양자점 복합체 1,3,4 번에 결합한 소광체 분자체 개수에 따른 양자점 형광 양자 효율 (photoluminescence quantum yield, PLQY) 감소 그래프. (B) 양자점 복합체 1,3,4 번에 matrix metalloprotenaise-2 를 20 μ농도로 혼합 함에 따라 시간에 따라 변화하는 양자점 형광 세기 그래프. 양자점 복합체 1 번은 음전하 소광체 분자체, 3번은 net charge = 0 소광체 분자체, 4번은 양전하 소광체 분자체를 가지고 있다.
도 11은 (A) 양자점 복합체 1 번 용액을 분사한 대장암 발현된 쥐 대장 조직의 가시광선 이미지와, 분사 후 시간에 따른 양자점 형광 이미지. T1, T2, T3 : 대장암 발현 조직. N : 일반 대장 조직. (B) T1,T2,T3, N 구역의 분사 후 시간에 따른 양자점 형광 세기 변화 그래프이다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니며, 본 발명을 예시하기 위한 것이다.

<실시예 1> 수용액 분산된 발광 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점 제작

PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점은 PbS 양자점 합성, PbS/CdS 핵/껍질 양자점으로의 양이온 치환 반응, ZnS 껍질층 형성을 통한 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점 완성의 세가지 단계로 이루어진다.

(1) PbS 양자점 합성:

4 mmol 의 lead (II) acetate을 20 mL 의 oleic acid (OA) 와 20 mL 의 1-octadecene (ODE) 와 섞고 교반함. 이 용액은 100℃ 온도에서 진공 환경에서 30 분 동안 가열하여 용액 내에 남아있는 물 분자 및 산소 분자 등을 제거하였다. 이 용액을 질소 분위기에서 180℃로 가열하고 1시간 동안 가열하여 투명한 용액을 얻었다. 이 투명한 용액을 lead precursor 용액으로 명명하였다. 이 용액을 질소 분위기에서 100℃로 온도를 내리고, 진공 환경에서 30 분 동안 추가적으로 가열하였다. 15 mmol 의 sulfur powder 와 15 mL 의 ODE를 섞고, 질소 분위기에서 교반하며 180℃로 온도를 올려 1시간 동안 가열하였다. 이 용액을 상온으로 식힌 후, 질소 분위기에서 이 용액에서 3.2 mL를 소분하여 16.8 mL 의 ODE 와 0.8 mmol 의 bis(trimethylsilyl)sulfur 와 섞었다. 이 용액을 sulfur precursor 용액으로 명명함. lead precursor을 질소 분위기에서 175℃로 가열하고, 빠르게 sulfur precursor 용액을 주입한 후 1분 동안 교반 상태로 놔 두었다. 1 분 후 4 mL 의 trioctylphosphine (TOP) 와 20 mL 의 toluene을 차례대로 용액에 주입하여 온도를 떨어뜨린 후, 상온으로 천천히 식혔다. 이 경우 약 7 nm ~ 8 nm 정도의 지름을 가지는 구형의 PbS 양자점이 합성되었다. 이후, methanol 과 섞어 원심분리기에서 돌려 가라앉은 양자점을 hexane 용액에 녹여 반응하지 않은 유기 물질 및 lead, sulfur precursor 와 양자점을 서로 분리하였다.

(2) PbS/CdS 핵/껍질 양자점 제작:

6 mmol cadmium (II) oxide 와 9 mL 의 OA 와 20 mL 의 ODE를 섞고 교반하였다. 질소 분위기에서 이 혼합 용액을 교반하면서 255℃까지 가열하고, 2시간 동안 255℃에서 가열하였다. 용액을 100℃로 낮추고, 진공 상태에서 30 분 동안 교반하였다. 이 용액을 cadmium precursor 용액으로 명명함. hexane 에 녹은 200 nmol 의 PbS 양자점을 35 mL 의 ODE 와 섞고, 진공 상태에서 hexane을 증발시켰다. 교반 중인 PbS 양자점 용액에 5 mL 의 cadmium precursor 용액을 주입하고, 질소 분위기에서 천천히 100℃로 가열하였다. 100℃에서 1 시간 동안 가열한 후, 1 시간에 걸쳐 240℃로 가열하고, 240℃에서 20 분을 유지하였다. 이 시점에서 양이온 치환 반응이 완료되어 PbS/CdS 핵/껍질 양자점으로 변환되었다. 천천히 양자점 용액을 상온으로 떨어뜨리고, methanol 과 섞어 원심분리기에서 돌려 가라앉은 양자점을 hexane 용액에 녹여 반응하지 않은 유기 물질 및 cadmium precursor 와 양자점을 서로 분리하였다.

(3) PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점 제작:

7.5 mmol 의 zinc (II) oxide를 9.5 mL 의 OA 와 5.5 mL 의 ODE 와 섞은 후 교반하였다. 이 용액을 질소 분위기에서 100℃로 가열한 후, 진공 상태에서 30 분 동안 가열하였다. 이후, 질소 분위기로 바꾼 후 200℃로 가열 하고, 1 시간 동안 가열을 유지하였다. 질소 분위기에서 140℃로 온도를 떨어뜨린 상태로 유지하였다. 이 용액을 zinc precursor 라 명명함. 이후, 7.5 mmol 의 sulfur powder 와 15 mL 의 ODE을 섞고 교반 한 후, 질소 분위기에서 180℃로 가열하고 1시간 동안 가열을 유지하였다. 이후, 100℃로 온도를 떨어뜨린 상태로 유지하였다. 이 용액을 sulfur precursor라 명명함. 60 nmol 의 PbS/CdS 양자점 hexane 에 분산시킨 후, 12 mL 의 ODE 와 섞고 hexane을 증발시켜 제거하였다. 이 용액을 교반하며 질소 분위기에서 100℃로 가열한 후, 100℃에서 진공 상태로 30 분 동안 가열하였다. 이 용액을 질소 분위기에서 240℃로 가열하였다. 이 용액에 5 분 간격으로 0.14 mL 의 zinc precursor 와 0.14 mL 의 sulfur precursor를 3번씩 주입함. 맨 처음에는 zinc precursor을 주입하고, 5 분 후 sulfur precursor을 주입하고, 다시 5 분 후에는 zinc precursor를 주입하였다. 마지막 sulfur precursor을 주입 하고 5 분 후, 용액을 천천히 상온으로 식혔다. 용액을 methanol 과 섞어 원심분리기에서 돌려 가라앉은 양자점을 hexane 용액에 녹여 반응하지 않은 유기 물질 및 precursor 와 양자점을 서로 분리하였다. 이 분리 과정을 5번 반복하였다. 이를 통해 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점을 얻을 수 있었다. 합성된 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점은 노란색 용액이며 투과 전자 현미경으로 분석하였을 때 약 8 nm 지름의 구형 형상을 확인할 수 있었다 (도 3A).

PbS, PbS/CdS, PbS/CdS/ZnS 양자점는 근적외선부터 자외선 영역까지 넓은 영역을 흡수하고, 제2 근적외선 영역에서 발광한다(도 3B,C).

PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점을 Energy dispersive X-ray spectroscopy 방법으로 분석한 결과, 본 나노물질내 금속 이온의 몰 비율은 4% 의 Pb, 80% 의 Cd, 16% 의 Zn 로 구성되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 3D).

(4) 표면 물질 치환을 통한 수용액 분산 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점 제작: 유기 용매에서 합성한 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점은 소수성 표면 물질을 가지고 있기 때문에, 소수성 유기 용매에 잘 분산되지만 수용액 상에서는 분산되지 않았다. PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점를 수용액 상에서 분산되기 위하여 lipoic acid (LA) 와 zwitterionic-modified lipoic acid (ZW-LA)⁵으로 양자점의 소수성 표면 물질을 치환하여, 수용액 분산 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점을 제작하였음. 2개의 thiol 작용기를 가진 LA 는 양자점 표면에 직접 결합하는 표면 결합 작용기로 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점 표면에 직접 결합하여 수용액 분산 양자점을 만들었다. 0.5 mmol 의 LA 와 0.5 mmol 의 ZW-LA를 2 mL 의 증류수와 섞었다. 이 용액에 2.2 mmol 의 sodium borohydride를 넣고, 20 분 동안 격렬하게 교반하였다. 이를 표면 물질 용액으로 명명함. 10 nmol 의 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점을 1 mL 의 chloroform 용액에 분산시키고, 표면 물질 용액과 섞고 50℃의 온도에서 1 시간 동안 격렬하게 교반하였다. 1시간 후, chloroform 층에 분산되어있던 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점이 수용액 층으로 이동한 것을 수용액의 색이 노란색으로 변하는 것을 통해 확인할 수 있었다. 수용액 층을 따로 분리하여 용기에 보관한 후, 진공 상태에서 남아있는 chloroform을 제거하였다. 뭉쳐있는 양자점 등을 제거하기 위하여 200 nm 의 pore size를 가지고 있는 syringe filter 인 Whatman 의 puradisc 13을 이용하여 PbS/CdS/ZnS 핵/껍질/껍질 양자점 용액을 투과시켰다. 용액에 남아있는 과량의 표면 물질을 제거하기 위하여 Amicon 50kDa MW cutoff centrifugal filter 에 양자점 용액을 담지하고 원심분리기로 dialysis 하여, filter 위에 남은 농축된 수용액 분산 양자점 용액을 얻었다.

<실시예 2> MMP 효소 활성에 감응하여 발광 신호 변조되는 양자점 복합체 프로브 제작

양자점 가까이 존재할 때 양자점의 적외선 형광을 소광시키는 유기 분자체를 MMP 효소에 의해 분해되는 펩티드 사슬을 통해 양자점 표면에 접합시켜 양자점 복합체 프로브를 제작하였다.

양자점 적외선 형광을 광유발 전자 이동을 통해 소광시키는 maleimide-modified methylene blue (mi-MB) 는 독일의 ATTO-Tec 으로부터 구입 가능하다. 펩티드 사슬은 MMP 에 의해 선택적으로 분해되는 -PLGVR- 사슬 구조를 포함한 GGPLGVRGGCDDDD을 사용하고, 이 펩티드 사슬의 amine terminal 에 네 개의 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid 분자가 연속적인 amide bond 로 연결시켰다. (G: glycine, P: proline, L: leucine, V: valine, R: arginine, C: cystein, D: aspartic acid) 이 분자체를 PEG-GGPLGVRGGCDDDD 으로 명명하고, 분자 구조는 도 4 에 표시한다. PEG-GGPLGVRGGCDDDD 와 mi-MB 는 cystein 의 thiol 과 maleic amide 사이의 thioester bond 형성으로 결합시킨다. mi-MB 는 dimethyl sulfoxide (DMSO) 용매에 녹였다. PEG-GGPLGVRGGCDDDD 는 pH 7.0 의 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 버퍼 용액에 녹임. mi-MB:PEG-GGPLGVRGGCDDDD를 1.3:1의 몰비로 섞고, 4 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 후 용액을 molecular cutoff = 700 Da 의 size exclusion chromatography column 에 통과시키고 먼저 나오는 푸른색 용액만을 수집함으로써, 반응 하지 않고 남아있는 mi-MB 와 PEG-GGPLGVRGGCDDDD를 제거하였다. 수집된 푸른색 용액은 PEG-GGPLGVRGGCDDDD 의 cystein 에 mi-MB 가 thioester bond 로 연결되어 있으며, 이를 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD 로 명명함.

수용액 분산 양자점과 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD을 화학적으로 결합시키는 것으로 MMP 활성에 감응하여 발광 신호 변조되는 양자점 복합체 프로브를 제작할 수 있다. PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD 의 N-terminal amine group 과 수용액 분산 양자점 표면의 DHLA 에 존재하는 carboxylic acid를 amide bond 생성 화학 반응 결합을 통해 연결하였다. 먼저 수용액 분산 양자점 용액에 여분의 LA 물질이 남아있지 않도록 dialysis를 통해 제거하였다. 5 μM 농도의 수용액 분산 양자점 용액 1 mL 에 양자점 개수 대비 200 배의 1-Ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide (EDC) 를 섞고, 그 후 양자점 개수 대비 400 배의 N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (S-NHS) 를 섞었다. 여분의 EDC 와 S-NHS를 제거하기 위하여 50 mM 의 pH 6.5 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer 용액을 이용하여 dialysis 하고, 양자점 농도를 5 μM 까지 농축 시킴. PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD 는 100 mM 의 pH 7.4 phosphate buffer saline (PBS) buffer 에 1 mM 농도로 녹여서 준비하였다. 양자점 대비 40 배 몰 수의 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD를 양자점 용액에 섞고, 용액의 pH 가 7.4 가 되도록 조절함. 혼합 용액을 vortexer에서 교반하면서 상온에서 2시간 방치하였다. 반응 후, 반응하지 않고 남아있는 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD를 제거하기 위하여 Amicon 50kDa MW cutoff centrifugal filter 에 혼합 용액을 담지하고 원심분리기로 dialysis 하여, filter 위에 남은 농축된 양자점 용액을 얻었다. 수용액 분산 양자점에 비특이적으로 약하게 결합된 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD을 제거 하기 위하여, 반응 후 용액에 환원된 LA 와 zw-LA 의 혼합 용액 (LA:zw-LA=1:1 %mol)을 추가하였다. 0.5 M 의 LA 와 zw-LA 혼합 수용액에 LA 과 zw-LA 물질 양 대비 2.2 배의 sodium borohydride를 넣고 20 분간 교반하였다.

filter 위에 남은 농축된 양자점 용액에 양자점 개수 대비 1만배의 LA 와 zw-LA 혼합 물질을 섞고 1 시간 동안 vortexer 위에 방치하였다. 여분의 LA 와 zw-LA 혼합 물질을 제거 하기 위하여 이 용액을 Amicon 50kDa MW cutoff centrifugal filter을 이용하여 dialysis 하여, MMP 효소 활성에 감응하여 발광 신호 변조되는 양자점 복합체 프로브 (양자점 복합체 1번)을 제작하였다.

양자점 복합체 1번은 MMP 효소 활성에 의해 특이적으로 형광 신호 세기가 효율적으로 증가하는 특성을 보인다. 이를 확인하기 위하여 200 nM 농도의 양자점 복합체 1 번 50 μL 용액을 준비하였다. 1 μg 의 MMP-2 효소가 분산된 버퍼 용액 (50 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, 20 mM Zn(NO3)2 pH 7.5 Tris buffer) 50 μL을 마찬가지로 준비함. 최종 MMP-2 효소의 농도가 10, 20, 30 μg/mL 이 되도록 양자점 복합체 1 번과 MMP-2 효소 용액을 섞고, 시간에 따라 양자점의 형광 신호 세기를 관찰할 경우, 시간 경과에 따라 양자점의 형광 신호 세기가 증가하는 것을 관찰할 수 있다.(도 5) 양자점 형광 신호 세기 증가 폭은 MMP-2 효소의 농도가 증가할수록 증가하며, 이는 용액 내 MMP-2 효소 활성이 클수록 양자점 복합체 1번 표면의 펩티드 사슬이 더 많이 끊어지며, 더 많은 양자점 형광 소광체가 양자점으로부터 멀어지며 양자점의 형광 신호가 회복되는 것을 보여주었다. 반대로 MMP-2 효소 활성을 억제하는 inhibitor (N-isobutyl-N-(4-methoxyphenylsulfonyl)glycyl hydroxamic acid)를 10 μM 농도로 혼합하였을 때는 양자점의 형광 신호가 회복되지 않는 것으로 MMP-2 효소 활성에 의하여 양자점 복합체의 펩티드 사슬이 끊어지며, 양자점의 형광 신호가 회복되는 것을 확인 수 있었다.

<실시예 3> 양자점과 효소에 의해 분해되는 펩티드 사슬 간 거리 조절을 통한 MMP 효소 활성 감응 효율 증대

양자점 표면에 접합한 소광체 결합된 펩티드 사슬과 양자점 사이에 flexible 한 분자체로 거리를 늘림으로써, 양자점 복합체의 형광 신호가 MMP 효소 활성에 의해 더 효율적으로 조절되는 것을 보였다. 양자점 복합체 1번에 사용하였던 소광체 포함 펩티드 사슬 구조인 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD 와 달리, 펩티드의 amine terminal 에 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid 가 존재하지 않는 GGPLGCRGG(C-MB)DDDD을 (도 6) 수용액 분산 양자점 표면에 접합시켜 양자점 복합체 2번을 제작하였다. GGPLGCRGG(C-MB)DDDD 는 GGPLGVRGGCDDDD 펩티드 사슬에 mi-MB를 <실시예 2>에서 사용한 방법과 동일한 방법으로 접합시켜 제작하였다. 양자점 복합체 1번은 MMP 에 의해 인식/분해되는 펩티드 사슬 구조인 -PLGVR- 과 양자점 표면 사이 거리가 먼 반면, 양자점 복합체 2번은 상대적으로 거리가 짧다. 양자점 복합체 1번에 비해 양자점 복합체 2번의 경우 MMP 효소가 인식하는 펩티드 사슬 구조가 단단한 양자점 표면 가까이 위치하기 때문에, 펩티드 사슬 구조 인식 중 효소 구조 변성(denature)과 같은 영향에 의하여 MMP 효소의 활성이 저해될 수 있다. (도 1)　이러한 효소 활성 저해를 막기 위하여 양자점 복합체 1번과 같이 양자점과 효소에 의해 인식되는 펩티드 사슬 간 거리를 증가시킴으로써 MMP 효소 활성에 의한 양자점 복합체의 형광 신호 변조를 더욱 효율적으로 행할 수 있다. 부수적으로, 동일한 양의 소광체 분자체를 접합시킨 양자점 복합체 1번과 양자점 복합체 2번은 거의 동일한 비율로 양자점 형광 신호를 소광시키는 것을 확인할 수 있었다. (도 7) 같은 개수의 소광체 분자체를 접합시킨 양자점 복합체 1번과 양자점 복합체 2번에 MMP-2 효소 용액을 혼합할 경우, 양자점과 펩티드 사슬 간 거리가 먼 양자점 복합체 1번의 경우 양자점의 형광 신호가 시간에 따라 증가하는데 비하여 양자점과 펩티드 사슬 간 거리가 가까운 양자점 복합체 2번의 경우 효소에 의한 형광 신호 증가가 확인되지 않았다. (도 8) 양자점 표면에 접합된 펩티드 사슬과 양자점 표면 간의 거리는 MMP 효소에 의해 표면 접합된 펩티드 사슬이 분해되는지의 여부를 결정하는 중요한 요인으로서 작용하는 것을 확인하였다.

<실시예 4> 소광체의 정전기적 특성 조절을 통한 MMP 효소 활성 감응 효율 증대

본 특허의 양자점 복합체는, MMP 효소에 의하여 양자점 복합체 표면에 존재하는 소광체 분자체의 펩티드 사슬이 끊어지며 양자점과 형광을 소광시키는 유기 분자체 간 거리가 멀어지며 양자점의 형광 신호가 회복되는 원리이다. 허나, 효소에 의해 펩티드 사슬이 끊어진 이후에도 비특이적으로 형광을 소광시키는 유기 분자체가 양자점 표면에 흡착될 수 있으며, 이러한 원하지 않은 비특이적 흡착은 양자점의 형광 회복을 저해시킨다.

MMP 효소 반응 이후에 일어나는 끊어진 소광체 분자체와 양자점 간의 비특이적인 흡착을 감소시키기 위하여, 소광체 분자체를 화학적으로 개질하여 소광체 분자체와 양자점 표면이 같은 정전기적 전하를 가지도록 만들어, 서로 정전기적으로 반발하여, 형광을 소광시키는 유기 분자체가 양자점에 비특이적 흡착하지 못하도록 방지할 수 있었다. 양자점 복합체 1번에 사용된 소광체 분자체인 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD 은 생체 조건에서 net charge = -2을 가지며, 표면 물질로 LA를 가지고 있는 수용액 분산 양자점 역시 음전하를 가지기 때문에 정전기적으로 반발하였다. 대조군으로 생체 조건에서 net charge = 0을 가지는 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DD을 소광체 분자체로 사용할 경우 정전기적으로 반발하지 않으며, 이를 이용하여 양자점 복합체를 제작할 경우 상대적으로 MMP 효소 반응 후 형광을 소광시키는 유기 분자체의 비특이적 결합이 증가할 것이다. 또 다른 대조군으로 생체 조건에서 net charge = +2를 가지는 PEG-GGPLGVRGG(C-MB) 의 경우 양자점 표면의 음전하와 정전기적 인력이 작용하여 비특이적 결합이 더욱 증가할 것이다. PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD. PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DD, PEG-GGPLGVRGG(C-MB) 의 생체 조건 내 net charge 는 gel electrophoresis를 통해 확인할 수 있다. (도 9) agarose gel electrophoresis 분석에서 음전하를 가지는 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD 는 양극으로 움직이고, net charge = 0 인 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DD 는 움직이지 않으며, 양전하를 가지는 PEG-GGPLGVRGG(C-MB) 는 음극으로 움직인다. <실시예 2>에서 사용한 방법과 같은 방법으로 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DD을 수용액 분산 양자점에 접합시켜 양자점 복합체 3번을 제작하고, PEG-GGPLGVRGG(C-MB)을 수용액 분산 양자점에 접합시켜 양자점 복합체 4번을 제작하였다. 수용액 분산 양자점에 접합된 소광체 분자체 개수에 따라 양자점 형광이 소광되는 정도는 PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DDDD. PEG-GGPLGVRGG(C-MB)DD, PEG-GGPLGVRGG(C-MB) 모두 비슷 하였다 (도 10A). 양자점 당 12 개의 소광체 분자체가 접합된 양자점 복합체 1번 (음전하 소광체 분자체 접합됨), 양자점 복합체 3번 (net charge = 0 인 소광체 분자체 접합됨). 양자점 복합체 4번 (양전하 소광체 분자체 접합됨) 용액에 <실시예 2> 와 같이 MMP-2 효소를 10 μg/mL 농도로 섞어 주었을 때, 양자점 복합체 1번, 3번, 4번은 서로 다른 양자점 형광 신호 세기 회복 양상을 보임. (도 10B) 양자점 복합체 1번은 MMP-2 효소 섞은 후 60분 동안 초기 형광 세기의 1.4 배 까지 형광 세기가 증가하는 반면, 양자점 복합체 3번은 60분 동안 초기 형광 세기의 1.2 배 까지 형광 세기가 증가하는데에 그침. 또한, 양자점 복합체 4번은 10분 까지 초기 형광 세기의 1.15 배로 형광 세기가 증가하고 그 이후로는 오히려 형광 세기가 감소하는 양상을 보였다. 수용액 분산 양자점 표면이 음전하를 띄기 때문에 양자점 복합체 4번의 경우 양전하를 가진 소광체 분자체가 효소 반응으로 끊어진 이후 정전기적 인력을 포함한 비특이적인 힘으로 양자점 표면에 다시 흡착 하는 것으로 생각됨. 양자점 복합체 3번의 경우 소광체 분자체의 net charge = 0 이기 때문에 수용액 분산 양자점과 정전기적 인력은 가지지 않으나, 소광체 분자체와 수용액 분산 양자점이 정전기적 척력을 가지는 양자점 복합체 1번에 비해서는 양자점 형광 세기 증가 폭이 작았다. 이와 같이 양자점 표면에 접합된 소광체 분자체의 정전기적 특성을 조절하는 것으로 단백질 분해 효소인 MMP 활성에 의해 양자점 형광 신호가 조절되는 양자점 복합체의 형광 신호 변조 효율을 조절할 수 있음을 보였다.

<실시예 5> 쥐 대장암 모델에서 MMP 효소 활성 감응형 양자점 복합체 프로브 작동 검증

azoxymethane 과 dextran sulfate sodium을 이용해 대장암 유발된 쥐 모델을 준비하였다. 대장암 조직의 종양 미세 환경에서는 MMP 가 과발현되는 것으로 알려져 있기 때문에, 쥐 대장 중 대장암 발현 조직에서 특이적으로 양자점 복합체의 형광 신호가 증대될 것으로 예상하였다. 대장암 발현된 쥐의 대장을 적출하고 세로로 잘라 내부 점막을 위쪽으로 노출 시켜 유리 판 위에 올려두었다. 100 mM PBS buffer at pH 7.4 에 분산된 1 μM 의 양자점 복합체 1번을 준비하였다. 양자점 복합체 50-100 μL를 대장 전체에 균일하게 분사하였다. 분사 1 분후 흘러넘친 용액을 닦아내고, 38 도로 유지되는 온도 조절 장치 위에 올려 놓고 InGaAs 카메라 (SC-2500, FLIR)를 이용하여 쥐 대장의 형광 신호를 시간에 따라 관찰하였다. 양자점은 200 mW/cm² 의 910 nm 레이저를 이용해 여기시켰다. 양자점 복합체 1 번을 분사 한 후 시간에 따라 양자점 형광 신호를 관찰하면, 대장암이 발현된 장소 (T1, T2, T3) 에서는 양자점 형광 신호가 증가하는데 비하여 대장암이 발현되지 않은 일반 대장 조직 (N) 에서는 형광 신호에 시간에 따라 변하지 않았다. (도 11) 이를 통해 MMP 효소 활성 감응형 양자점 복합체가 시험관 내에서 뿐만이 아니라 실제 생체 조직 내에서도 효소 활성에 감응하여 형광 신호가 조절됨을 볼 수 있었다.

Claims

형광나노입자 결합부분과; 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분; 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분; 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체 부분; 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체가 결합된 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 형광 나노입자는 양자점, 금속 나노입자, 란탄족 나노입자, 그래피옥사이드, 카본닷(carbon dot)으로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 형광 나노 입자는 핵/껍질 또는 핵/껍질/껍질로 이루어진 양자점인 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제3항에 있어서, 상기 양자점은 CdTe/CdSe, CdSe/ZnTe, ZnTe/ZnSe, CuInS2/CdS, GaSb/GaAs, InAs/GaAs, CdTe/CdSe/ZnS, CdSe/ZnTe/ZnS, ZnTe/ZnSe/ZnS, CuInS2/CdS/ZnS, GaSb/GaAs/ZnS, InAs/GaAs/ZnS로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 형광 나노 입자는 표면에 양쪽성 이온 분자체가 결합된 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 형광 나노 입자는 표면에 상기 소광체에 결합된 전하를 띠는 부분과 동일한 전하를 띠는 이온성 분자체가 결합된 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제6항에 있어서, 상기 이온성 분자체는 하기 화학식 (2)로 표현되는 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 형광 나노입자 결합부분은 싸이올기(-SH), 다이싸이올기(-CS2, -PS2, -CH(SH)(CH2CH2SH)), 아민기(-NH2, -NH), 포스포네이트기(-PO3H), 포스파이드기(-P), 포스핀옥사이드기 (-P=O), 카르복시기 (-COOH), 하이드록시기 (-OH), 이미다졸기 (-imidazole), 다이올기 (-diole)로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제8항에 있어서, 상기 결합 부분은 아민기인 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 스페이서 부분은 탄소 결합 (-(CH2)n-), 폴리에틸렌글리콜 (-(CH₂OCH₂O)n-), -(CH₂OCH₂O-CH₂-CO-NH)n-으로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되며, 여기서 n은 2-100의 정수인 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부부은 특정 영역에서 과발현되는 효소에 의해서 특이적 절단되는 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분은 -PLGVR- 부부을 포함하는 펩티드인 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 효소는 matrix metalloproteinase (MMP)효소인 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 소광체는 메틸렌 블루를 포함하는 소광체인 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분은 음전하를 띠는 펩티드인 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 전하를 띠는 펩티드는 -(D)m, 여기서 m은 4~10의 정수인 것을 특징으로 하는 형광 나노 입자.
형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분, 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체부분, 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체.
형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분, 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체부분, 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체가 결합된 형광나노입자를 소정 위치에 위치시키고, 상기 펩티드 부분을 효소 특이적으로 절단시켜 상기 형광나노입자를 형광시키는 것을 방법.
형광나노입자 결합부분과, 일측이 상기 형광나노입자 결합 부분에 결합되고, 효소 접근성을 향상시키는 스페이서 부분, 일측이 효소 접근성을 향상시키는 상기 스페이서 부분에 결합되고, 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분, 일측이 효소 특이적으로 절단되는 펩티드 부분에 결합되고, 형광나노입자의 형광을 소광시키는 소광체부분, 및 일측이 소광체부분에 결합되고, 형광나노입자와 정전기적 척력을 가지는 전하를 띠는 부분을 포함하는 분자체가 결합된 형광나노입자를 포함하는 진단, 또는 촬영용 발광 물질.
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나노입자에 절단되는 영역을 포함하는 분자체를 결합시키고, 상기 분자체의 절단 영역을 절단한 후, 절단 영역이 나노입자와의 정전기적 척력에 의해서 나노입자에 흡착되는 않도록 하는 것을 특징으로 하는 절단영역의 흡착 방지 방법.