KR102256285B1 - 한방 천연소재 추출물의 복합물을 유효성분으로 함유하는 여드름 및 피지개선용 화장품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목향, 원지 및 황련 추출물의 복합물을 유효성분으로 하는 여드름 및 피지개선 화장품 조성물을 제공함으로써, 기능성 천연 원료인 원지(Polygala tenuifolia willdenow)의 피지생성 억제 기능과 항균 활성이 우수한 황련(Coptis chinensis), 항염증 기능이 우수한 목향(Aucklandia lappa decne)의 조합으로 기존 화학성분이 포함된 화장품에 비하여 부작용이 없고 최소의 용량으로도 생리활성이 우수한 성분이 다량 포함되는 효과가 있다.

Description

한방 천연소재 추출물의 복합물을 유효성분으로 함유하는 여드름 및 피지개선용 화장품 조성물 {Natural complex cosmetic composition}

본 발명은 천연 소재인 황련, 원지, 목향 중 어느 하나를 포함하는 한방 천연 소재 추출물을 함유하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 피지 생성을 근본적으로 억제 할 수 있는 천연 소재를 이용하여 과다 피지 분비 또는 유분를 갖는 지성 피부에 적용 가능한 한방 천연소재 추출물의 복합물을 유효성분으로 함유하는 여드름 및 피지개선용 화장품 조성물에 관한 것이다.

여드름이란, 털 피지선 샘 단위의 만성 염증질환으로 면포(모낭 속에 고여 딱딱해진 피지), 구진(1cm 미만 크기의 솟아 오른 피부병변), 고름물집, 결절 등 다양한 피부 변화가 나타나고 이에 따른 후유증으로 오목한 흉터 또는 확대된 흉터를 남기기도 한다. 또한, 피지선이 모여 있는 얼굴, 목, 가슴 등에 많이 발생하며 털을 만드는 모낭에 붙어있는 피지선에 염증이 발생하는 질환도 포함한다.

여드름 발생 원인으로는 세균성 여드름과 남성 호르몬에 의한 피지 분비 증가, 과각화된 모낭벽의 증가 등이 있다. 세균성 여드름 중 피부 상재균 중 하나인 여드름 유발균인 Propionibacterium acnes (P.acnes)은 협기성 환경을 갖고 있는 모낭 내 지방에서 증식이 잘 되는 지방 친화성을 갖는 미생물로서 과대 증식으로 인해 여드름 유발, Staphylococus aureus(S. aureus)와 S. epidermidis은 여드름 발생으로 생성된 염증을 가속화 하고 여드름을 확산 시킨다.

남성 호르몬인 testosterone은 피부내에 있는 5a-reductase에 의해 Dihydrotestosterone(DHT)으로 변환 되는데, DHT 는 피지선 세포의 DNA 와 결합하여 피지선 세포의 증식을 유발하는 상관관계를 갖고 있어 청소년기에 호르몬 분비의 불균형으로 지방세포의 활성화를 통해 피지의 생성이 과대하게 증가 하게 되어 P.acne 증식과 염증 유발의 근본적인 원인으로 작동한다.

과각화된 모낭벽의 증가는 모낭벽의 각질 형성세포가 급격히 증가하면서 각질세포가 정상적으로 벗겨지지 않고 서로 달라붙어 쌓여 모낭에 산소가 공급 되지 못하도록 막혀 협기성 상태의 환경이 조성 되고 또한 모낭내로 분비된 피지가 밖으로 분비되지 못하여 모낭 내에 쌓이는 현상으로 인해 여드름이 악화된다. 염증성 여드름은 구진(papules-pimples)성, 농포(pustules)성, 결절(nodules)성, 낭포(cyst)성 여드름으로 분류될 수 있다.

구진성 여드름은 통증이 심한 형태로 오래된 면포가 주의에 유발한 염증이거나 여드름 제거 시 세균감염으로 나타난다. 낭포성 여드름은 여드름이 여러 개로 번진 상태로 피지선의 염증이 뭉쳐 피부에서 긴 자루 모양의 낭포를 형성하며 오래된 낭포는 수술이 필요하고 피부세포의 손상이 심해 켈로이드 흉터를 남길 수 있다.

여드름 치료는 크게 염증반응을 감소시키고, 세균성장을 억제하며, 면포생성을 억제하는 것에 초점을 두고 있으며, 항생제, 소염제, 과도한 피지 생성 억제제 등 이 있다. 여드름 치료제 시장은 크게 약물요법과 화장용 요법을 나눌 수 있다.

통상적으로 약물요법 제품이 높게 인정받고 있지만 대부분의 약물요법의 여드름 치료제는 그 성분으로 어리스로마이신, 이소트레티노닌, 벤조일 페록사이드 등의 성분을 포함하고 있어 각종 부작용 및 항생제 내성 균주의 출현 등의 문제점을 내포 하고 있고 단비 병변을 50% 가량 감소시킬 뿐, 질환의 완전한 치료나 재발 억제는 불가능하여 여드름 개선 화장품을 사용하는 것이 소비자가 가장 선호하는 방법이다.

세정용 화장품으로는 클랜징폼 및 세정제등이 있고, 기타 크림, 토너, 에센스등 여드름 개선을 위한 여러 제품군이 존재한다. 여드름 화장품에 사용되는 일반적인 원료들로는 살리실산(Salicylic acid, BHA), 트리클로산(Triclosan)등 여러 물질이 사용되고 있다. 그러나, 인체 피부에 대한 유해성과 사용상의 문제점이 대두되고 있어 높은 농도로 사용하지 못하는 문제점이 있다.

국내 식품의약품안전처에서는 여드름 관련 기능성 화장품을 인체세정용 제품류로 한정하여 기능성을 인정해 주고 있다. 식품의약안전처의 기능성 인증이 가능 하나 아직까지 인적적용 시험 가이드라인(2017년 개정)이 정한 방법이 정상인의 등부위에 여드름 유발 물질 도포 후 48시간, 72시간이 경과한 다음 폐치 제거 및 시료 세척, 시료 재도포, 패치 재첩포를 반복하여 시험부위를 폐쇄 첩포하는 방법을 고시하고 있다.

이에 따라 피험자는 일주일에 3번 방문하여 4주 과정동안 반복해 12회 시험을 진행하는 가이드라인으로 제시하고 있으나 실제 인체적용 시험 연구소에서는 실험의 효용성과 효과성이 증명 되지 않고, 재현성이 높지 않아 식약청의 기준에 준하여 인체적용 시험이 매우 어려워 현재 비영리 인체시험연구기관인 한국 화학융합연구원(KTR)에서도 여드름 개선 기능성 인체적용시험을 실시하지 못하고 있다.

이에 현재 여드름 관련 소비재 시장에서는 부작용에 대한 염려와 우려를 잠식 시킬 수 있는 천연물, 특히 국내에서 자생하는 각종 생약 등의 추출물을 이용하여 피지생성 억제(지방세포 분화) 효능이 있는 기능성 물질 개발이 지속적으로 요구되고 있으며, 지방세포 분화 억제 기전 기능성 물질을 개발함으로서 근본적인 여드름 발생의 원인을 제거 할 수 있도록 체계적인 연구결과를 정립하고 천연 추출물의 지표물질을 선정하여 표준화한 성공적인 제품 개발이 필요하다.

본 발명은 지방세포 분화 억제 효능이 탁월한 것으로 밝혀진 원지추출물을 핵심성분으로 하고 각 피부유형에 맞게 개발한 수성의 조성물을 혼합하여 염증성 개선 및 P.acne 균 제어함으로써 여드름으로부터 유발된 문제성 피부를 근본적으로 치료 또는 예방하여 국내외 보건에 기여할 수 있는 한방 천연소재 추출물의 복합물을 유효성분으로 함유하는 여드름 및 피지개선 화장품 조성물을 제공하고자 한다.

국내 등록특허번호 제10-1942009호에는 플라즈마에 의해 생성된 음이온이 처리된 천연 오일 및 천연 추출물의 복합물을 유효성분으로 함유하는 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해바라기씨 오일, 들깨 오일 및 살구씨 오일의 혼합 오일에 작약, 상백피, 당귀, 고삼, 치자, 인진쑥, 삼백초, 어성초, 오가나무, 원지 및 승마로 이루어진 혼합 추출물을 혼합한 후 플라즈마에 의해 생성된 음이온을 처리한 복합물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 LPS에 의해 유도된 산화질소(Nitric Oxide, NO)의 생성을 감소시키고, 염증성 사이토카인인 iNOS 및 IL-1β의 발현을 감소시키는 효과가 우수한 플라즈마에 의해 생성된 음이온이 처리된 천연 오일 및 천연 추출물의 복합물을 유효성분으로 함유하는 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1947705호에는 목향 추출물, 소목 추출물, 모링가 오일 및 블랙커민시드 오일을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진 용 화장료 조성물, 약학 조성물 및 식품 조성물에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2009-0029022호에는 피부 손상의 대표적인 원인 중의 하나인 자외선이 피부 각질세포(keratinocyte)에 조사된 경우 유도되는 세포독성을 완화하는 활성을 가질 뿐 아니라, 염증을 매개하는 효소들의 발현 및 염증유발 활성산물의 생성을 억제하는 효과를 나타내어, 결과적으로 자외선으로 인한 피부 손상과 염증을 예방하고 증상을 개선하는 기능성 화장품 조성물로 사용될 수 있는 황련 추출물을 유효성분으로 하는 자외선으로 인한 피부질환 예방 및 치료용 조성물 및 이를 포함하는 화장품에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2016-0076126호에는 감초, 상백피, 황련, 황금, 황백, 황기, 당귀, 작약, 박하, 적작약, 토복령, 녹용, 인삼 추출물, 전복 펩타이드를 포함하는 한약재를 추출하여 화장품 베이스와 배합하여 여드름 압출부위에 도포함으로써 염증발생의 효소인 COX-2(콕스-2)의 생성을 차단하여 염증세포의 활성화 및 피부 노화를 억제하고, Propionibacterium acnes을 포함하는 단계별 처방이 가능한 한방 여드름 화장품에 관하여 개시하고 있다.

본 발명은 기존의 천연 추출물의 지표물질이 선정하여 표준화한 여드름 전용 화장품이 요구를 맞추기 위하여 지방세포 분화 억제 효능이 탁월한 것으로 밝혀진 원지추출물을 핵심성분으로 하고 각 피부유형에 맞게 개발한 수성의 조성물을 혼합하여 염증성 개선 및 P.acne 균 제어함으로써 여드름으로부터 유발된 문제성 피부를 근본적으로 치료 또는 예방하여 국내외 보건에 기여할 수 있는 한방 천연소재 추출물의 복합물을 유효성분으로 함유하는 여드름 및 피지개선 화장품 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 목향 및 원지 추출물의 복합물을 유효성분으로 하는 여드름 및 피지개선 화장품 조성물을 제공하는 것일 수 있다. 본발명의 추출물은 목향 및 원지를 0.1 내지 1.0mm 크기로 분쇄하여 분말상으로 만들고 물, 에탄올, 물과 에탄올의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 상기 분말에 각각의 부피 대비 10배로 첨가하여 9시간 동안 50 내지 70℃ 온도에서 용매추출한 것일 수 있다. 상기 복합물추출은 상기 목향 및 원지 추출물을 부피비를 기준으로 3:7로 혼합한 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 복합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.75 내지 1.5 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면 목향, 원지 및 황련 추출물의 복합물을 유효성분으로 하는 여드름 및 피지개선 화장품 조성물을 제공하는 것일 수 있다. 상기 추출물은 목향, 원지 및 황련을 0.1 내지 1.0mm 크기로 분쇄하여 분말상으로 만들고 물, 에탄올, 물과 에탄올의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 상기 분말에 각각의 부피 대비 10배로 첨가하여 9시간 동안 50 내지 70℃온도에서 용매추출한 것일 수 있다. 상기 복합물은 상기 목향 및 원지 추출물을 부피비를 기준으로 5:1:5로 혼합한 것일 수 있다.

본 발명은 기능성 천연 원료인 원지(Polygala tenuifolia willdenow)의 피지생성 억제 기능과 항균 활성이 우수한 황련(Coptis chinensis), 항염증 기능이 우수한 목향(Aucklandia lappa decne)의 조합으로 기존 화학성분이 포함된 화장품에 비하여 부작용이 없고 최소의 용량으로도 생리활성이 우수한 성분이 다량 포함되는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 한방 천연 소재 추출물을 나타낸다.
도 2는 황련 추출물의 추출 시간별 용매 증발량과 최종 황련 추출 효율 측정 결과를 나타낸다.
도 3은 황련, 원지, 목향 추출물의 흡광도 스캐닝 결과를 나타낸다.
도 4는 황련뿌리추출물의 농도별 흡광도 차이를 비교 분석한 그래프를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실험예 3에 따른 RAW264.7 세포를 나타낸다.
도 6은 실험예 3에 따른 천연 소재 추출물의 세포독성 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 세포독성(M1~M43)실험 결과를 나타낸다.
도 8은 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 세포독성(M1~M43)실험 결과를 나타낸다.
도 9는 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 세포독성(M1~M43)실험 결과를 나타낸다.
도 10은 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 세포독성(M1~M43)실험 결과를 나타낸다.
도 11은 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 세포독성(M1~M43)실험 결과를 나타낸다.
도 12는 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 세포독성(M1~M43)실험 결과를 나타낸다.
도 13은 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 Griess assay결과를 나타낸다.
도 14는 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 Griess assay(M1~M43) 결과를 나타낸다.
도 15는 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 Griess assay(M1~M43) 결과를 나타낸다.
도 16은 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 Griess assay(M1~M43) 결과를 나타낸다.
도 17은 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 Griess assay(M1~M43) 결과를 나타낸다.
도 18은 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 Griess assay(M1~M43) 결과를 나타낸다.
도 19는 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 Griess assay(M1~M43) 결과를 나타낸다.
도 22는 M19 혼합물에 대한 β-actin, IL-1β, Cox-2, IL-10, TNF-α iNOS, IL-6의 발현률 확인(RT-PCR) 결과를 나타낸다.
도 23은 M19 혼합물에 대한 β-actin, IL-1β, Cox-2, IL-10, TNF-α iNOS, IL-6의 발현률 확인(RT-PCR) 결과를 나타낸다.
도 24는 혼합물(M19, M40)에 대한 항염증 지표 단백질(IL-1b) 발현 억제 효과와 지표 단백질(TNF-a) 발현 억제 효과 확인결과를 나타낸다.
도 25는 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 대한 주요 천연 소재인 황련, 원지, 목향추출물에 대한 세포 독성 및 세포성장률의 XTT assay결과를 나타낸다.
도 26은 실험예 3에 따라 선정된 M19, M40 혼합물에 대한 세포 독성 및 세포성장률의 XTT assay 결과를 나타낸다.
도 27 은 황련의 지방전구세포 3T3-L1 (adipocyte) in vitro 분화 실험 결과이다.
도 28은 원지의 지방전구세포 3T3-L1 (adipocyte) in vitro 분화 실험 결과이다.
도 29는 목향의 지방전구세포 3T3-L1 (adipocyte) in vitro 분화 실험결과이다.
도 30은 선정된 M19 혼합물의 지방전구세포 3T3-L1 (adipocyte) in vitro 분화 실험 결과를 나타낸다.
도 31은 선정된 M 40 혼합물의 마우스 지방전구세포(3T3-L1)의 증식 및 분화 촉진 결과를 현미경 사진을 나타낸다.
도 32는 BCA 분석 결과를 나타낸다.
도 33은 단백질 분석 결과를 나타낸다.
도 34는 지방생성 지표 단백질인 Adiponectin 에 대한 western bloting 실시 및 결과를 나타낸다.
도 35는 지방생성 지표 단백질인 Fatty Acid Synthase(FAS) 에 대한 western bloting을 나타낸다.
도 36은 E.Coli, B.subtilis, S.aureus, P.aeruginosa에 대한 항균 활성 및 저해 효과 확인결과를 나타낸다.

본 발명의 한방 천연소재 추출물의 복합물을 유효성분으로 함유하는 여드름 및 피지개선 화장품 조성물은 천연소재 중 원지, 황련, 목향으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 함유하는 것일 수 있다. 도 1은 본 발명의 한방 천연 소재 추출물을 나타낸다. 본 발명에서 지칭하는 용어, 원지(遠志;Polygala tenuifolia Willdenow)는 원지과에 속한 다년생 초본인 원지의 뿌리를 건조한 것을 지칭할 수 있다. 본 발명에서 지칭하는 용어, 황련(Coptidis rhizoma, Coptidis japonica Makino)은 미나리아재비과의 여러해살이 초본식물로 중국이 원산이며, 한방에서는 11월경에 5-6년 된 황련, 일황련의 뿌리를 채취하여 햇볕에 말린 것을 지칭할 수 있다. 본 발명에서 지칭하는 용어, 목향은 국화과의 다년생 식물인 Saussurea lappa Clarke의 말린 뿌리로 현재 한의학에서 구토, 설사, 및 호흡기 질병 치료 등에 널리 사용되고 있는 한약재를 지칭할 수 있다. 본 발명의 한방 천연소재는 원지, 황련, 목향으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 선택하여 각각 세절하고 분쇄하여 분말상으로 만든 다음, 물, 에탄올, 물과 에탈올의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 상기 분말에 각각의 부피대비 10배로 첨가하여 추출한 것일 수 있다. 더 구체적으로 상기 용매는 70% 주정 알콜(EtOH)인 것일 수 있다.

실시예 1. 한방 천연소재의 준비

본 발명의 실시예 1에 따른 한방 천연소재 추출물의 복합물을 유효성분으로 함유하는 여드름 및 피지개선 화장품 조성물은 원지, 황련, 목향으로 이루어진 소재 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 황련 천연소재는 잘 건조된 황련뿌리 약재를 화순한약재 유통센터로부터 구입 하였다. 황련뿌리 약재를 추출 효율을 높이기 위해 믹서기를 이용하여 잘게 분쇄 하였다. 미세한 분말 형태가 될 수 있도록 곱게 분쇄한다. 이후, 분쇄물은 무게를 측정하여 부직포에 담아 보관한다.

본 발명의 실시예 1에 따른 원지 및 목향 천연 소재는 잘 건조된 원지 및 목향뿌리 약재를 화순한약재 유통센터로부터 구입 한 후 상기 황련 천연소재와 동일한 과정을 거쳐 준비하였다.

실시예 2. 한방 천연소재 추출물의 용매 추출조건

통상적으로 천연 소재에는 다양한 물질이 존재 하고 특히 열에 의해 변성 될 수 있는 소지가 많아 천연 소재가 가지고 있는 생리활성 성분이 고유의 활성이 유지되어 추출 될 수 있도록 추출 조건을 확인하였다. 실시예 2에 따른 추출은 저온, 고압 추출기를 이용하여 추출 조건을 확인하였다.

천연소재 추출을 위한 보편적인 용매로는 물을 이용할 수 있겠고 다음으로는 유기용매를 사용할 수 있을 것이다. 천연물 내에는 많은 flavonoid 계열의 물질과 acid, phenol 화합물들이 다량 포함되어 있다. 이러한 물질을 효과적으로 추출하기 위해서는 유기 용매를 적정한 농도(50~80%)로 이용함이 효과적이다.

본 발명의 실시예 2에 따른 용매는 물을 포함하여 추출용매를 주정알콜 (EtOH)을 이용하였다. 용매를 물로 사용 했을 때와 주정 알콜을 사용 했을 때의 추출 되는 성질의 물질이 서로 다른 성질을 갖고 있고, 천연물의 polyphenol 성분을 효과적으로 추출하기 위해서는 유기 용매를 이용하는 것이 효과적이다.

천연 추출물을 획득하기 위해 일반적으로 사용되는 메탄올(MeOH)의 경우 세포에 대한 독성과 동물에 대한 독성이 있어 특히 화장품 원료 또는 식품의 원료로 사용할 경우에는 사용에 대한 제한이 있기 때문에 모든 원료의 추출은 매우 안전한 주정알콜을 이용하여 추출을 실시하였다.

추출용매 배수는 용질인 실시예 1에 따라 준비된 천연소재(황련, 목향, 원지) 200그램 정량 하고, 용질 4리터로 침지시켜서 추출 하였다. 부피비를 기준으로 용질과 용매는 1:10의 부피비로 추출을 진행 하였다. 모든 시료(용질)를 같은 추출용매 배수인 10배수로 통일 하여 추출을 시행 하였다.

통상적으로 추출온도는 매우 중요한 추출조건 요인(factor)으로 작동할 수 있고, 온도에 의하여 천연물에 포함되어 있는 compound들의 구성과 분자 구조가 변화 할 수 있기 때문이다. 특히, 천연 추출물을 추출함에 있어서 온도 설정이 매우 중요하기 때문에 본 발명의 실시예에 따라 유용한 천연 화합물(compound)의 기능성을 유지 시키면서 추출하는 방법 및 Phenolic acids의 최적 효능물질의 함량을 정성 및 정량하여 최적의 용매조건을 확인하였다.

이에 실시예 2에 따른 추출온도는 공지된 천연 추출물의 유용성분이 파괴되지 않도록 70℃ 이상의 조건이 되지 않도록 설정하였다. polyphenol 계통의 phenolic acids의 경우 약 80℃이상의 온도에서 장시간 추출하게 되는 고유의 Phenolic acids의 항산화 능력이나 구조의 변화를 야기 하는 것으로 알려져 있어 온도는 70℃이하로 고정 하여 추출 조건을 확립 하였다. 추출기 시행 온도 범위 (50℃~80℃)에서 시행 하고 최적의 추출 온도 조건을 65 ±5℃로 확정 하여 모든 시료를 추출 시행 하였다.

추출 효율 측정은 EP tube의 각각의 무게를 개별적으로 측정하고 각 tube에 1ml의 시료를 마이크로 파이펫을 활용하여 적정하고 분주하여 heat block을 80℃의 온도로 셋팅하여 약 5시간 동안 건조 시켜 용매가 모두 증발 할 수 있는 조건으로 만들고 시간별로 증발된 용매의 양을 정밀저울을 이용하여 측정 하여 최종 건조 중량을 확인 할 수 있는 시간과 최종 추출 효율을 확인 할 수 있는 최종 추출물의 무게를 측정 하였다.

추출 시간은 3시간 6시간 9시간 12시간, 24시간별로 샘플을 채취하여 추출 농도를 비교 하고 추출된 추출물량을 건조된 추출물을 측량하여 추출 수율을 확인 하였다. 도 2는 황련 추출물의 추출 시간별 용매 증발량과 최종 황련 추출 효율 측정 결과를 나타낸다.

그 결과, 시간이 길수록 추출 수율이 높아지나 9시간과 12시간 24시간 추출 시간에 증가에 따른 추출량 변화가 크지 않아 유효성분의 안전성을 고려하여 9시간 추출 시간을 가장 효율적인 시간으로 결정하여 모든 천연 시료의 추출 시간을 9시간으로 고정하여 추출을 시행 하였다.

무게 측정은 상기와 같은 방법으로 목향 및 원지 추출물의 함량을 측정 하였으며 천연 시료의 종류에 따라 추출 효율이 차이가 있음을 확인 할 수 있었다. 황련 추출물은 11.2% 추출 효율을 보여주는 반면 목향 추출 시료는 약 79.81%의 높은 추출 수율을 보여주고 있었고, 원지 추출물 또한 45.08%의 추출 수율로서 높은 추출 수율을 나타내었다.

황련 목향, 원지 시료별 추출 효율

시료종류	용매 알코올 %	남은용액	tube 무게	Total 무게	무게차이	환산단위	원액 100ml당	원액 1ml당	효율
황련	70	50	12.971	13.195	0.224	224 mg	1120 mg	11.2 mg	11.20%
목향	70	55	13.009	14.46	1.451	1451 mg	7981 mg	79.8 mg	79.81%
원지	70	51	12.944	13.828	0.884	884 mg	4508 mg	45.1 mg	45.08%

<실험예 1. 천연소재 크기에 따른 추출효율 확인>

최대한 짧은 시간에 원료로부터 최대 많은 추출물을 얻기 위해서 추출 시간을 최소화하기 위해서는 원료의 크기가 중요한 요인(factor)으로 작용하고, 원료의 표면적을 최대로 늘려주기 위해 원료를 세절(0.1mm 이하로 미세분말화) 하는 것이 적절하다.

이에 본 발명의 실험예 1은 실시예 1에 따라 준비된 한방 천연소재를 1.0mm, 0.5mm, 0.1mm 등의 미세분말 형태로 각각을 추출하였다. 추출은 통상적인 저온 및 고압 추출기를 이용하여 실시하였다.

또한, 추출조건은 용매 70% 주정알콜 사용하여 65℃에서 9시간 추출 실시 후 Heat block을 이용하여 건조 중량 확인을 통해 추출 효율 측정을 실시하였다. 하기 표 2는 천연소재 크기 및 추출효율 결과를 나타낸다. 추출률에 대한 검증한 결과 시료의 크기가 가장 작은 형태의 시료가 가장 높은 추출 효율을 나타내었다.

천연 소재의 크기에 따른 추출 효율 비교

황련뿌리 원료 물질
크기	1.0	0.5	0.1	미세분말
추출효율	5.9±0.2%	6.7±0.3%	8.1±0.2%	11.3±0.3%

<실험예 2. 천연소재별 흡광도 측정>

천연소재가 가지고 있는 고유의 성분이 있고 이러한 성분들의 함량에 따라 색상이 상이한 점을 활용하여 흡광도의 측정만으로 액상에 포함 되어 있는 최종 추출물 함량을 예측 할 수 있다.

도 3은 황련, 원지, 목향 추출물의 흡광도 스캐닝 결과를 나타낸다. 본 발명의 천연재소재인 황련, 원지, 목향에 추출물에 대한 고유의 흡광도를 확인하기 위하여 microplate leader기인 Tecan ifinite M200을 이용하여 각 시료를 230nm부터 1000nm까지의 파장으로 각각을 읽어 주었을 때 황련은 444nm파장에서 높은 흡광도를 보여주었고 그 이후부터 점차 흡광도가 낮아짐을 확인 할 수 있었고, 원지의 경우는 최대파장이 370nm의 파장에서 가장 높은 흡광도를 보여주다 그 이후로 점차 흡광도가 낮아짐을 그래프에서 보여 주고 있다.

또한 목향의 최대파장이 370nm로 나타났고 또한 목향의 경우에는 황련이나 원지 추출물에 비해 특정 파장이후에 급격한 흡광도 완화율을 보이지 않고 완만한 곡선을 그리듯 흡광율이 줄어듬을 확인 할 수 있었다.

추출물의 최대파장 측정을 3반복 실험을 통해 측정 되었고, 그 평균값으로 환산하여 결정하였다. 그럼으로 이러한 간편한 측정법으로 추출물의 최종 추출량을 간편하게 확인 할 수 있는 시스템을 구축 할 가능성을 확인할 수 있었다.

황련뿌리추출물 원물을 Heat block을 이용하여 높은 온도인 80도씨에서 셋팅하고 또한 황련뿌리추출물을 담을 EP tube의 각각의 무게를 미리 측정하여 원물과 튜브 무게의 차를 측정하여 추출물의 함량을 예측하였다.

시간별(10분 ~60분까지)로 무게를 측정하여 용매의 증발량을 확인 하였고 또한 동시에 각 시간별 시료를 따로 분주하여 Tecan infinite M200을 이용하여 540nm의 파장을 이용하여 그 값을 읽어 주었다.

도 4는 황련뿌리추출물의 농도별 흡광도 차이를 비교 분석한 그래프를 나타낸다. 이를 증발된 용매의 양에 따른 값과 비교 하였을 때, 추출물의 함량이 높아질수록 540nm의 흡광도가 높아짐을 확인 할 수 있었다.

실시예 3. 천연 천연소재 추출물의 배합비율 설정

본 발명의 실시예 3은 기능성 천연 소재로서 황련뿌리추출물, 원지추출물, 목향추출물을 대상으로 항염증효능, 지방생성억제(피지생성억제), 항산화, 항균 등의 효과를 확인하고자 하였다.

또한, 각 원료의 특성과 배합비율에 따른 원 추출물이 갖는 효능 효과와 비교 할 수 있는 근거를 확보 하고 원료의 최소 사용으로 최대의 기능을 나타 낼 수 있는 배합비를 확인하였다. 하기의 표 3은 실시예 1 내지 2에 따라 제조한 원지, 목향, 황련 추출물의 농도별 혼합한 배합비율을 나타낸다.

원지, 목향, 황련 추출물의 농도별 혼합한 배합비율

number	목향	원지	황련	number	목향	원지	황련
M1	10	10	10	M23	40	80	40
M2	10	50	50	M24	40	20	20
M3	10	100	50	M25	40	0	0
M4	10	50	100	M26	30	60	0
M5	10	20	20	M27	30	0	30
M6	20	30	30	M28	30	50	50
M7	20	60	120	M29	0	50	50
M8	20	90	90	M30	0	70	0
M9	20	120	60	M31	30	100	70
M10	20	0	30	M32	40	100	60
M11	30	10	10	M33	50	100	50
M12	30	25	25	M34	100	50	50
M13	30	50	0	M35	100	40	60
M14	30	0	50	M36	100	30	70
M15	30	80	50	M37	20	80	100
M16	50	10	10	M38	30	70	100
M17	50	30	30	M39	20	80	0
M18	50	50	10	M40	30	70	0
M19	50	10	50	M41	40	60	0
M20	50	80	40	M42	50	50	0
M21	40	0	80	M43	60	40	0
M22	40	0	40

각 추출물의 배합비에 사용되는 원료는 20mg/ml 농도의 추출원물을 사용하여 제조하여 효능 효과를 확인하는 시료로 사용하였다. 이하, 본 발명에서 지칭하는 복합물은 상기 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 황련, 원지, 목향 추출물 중 어느 하나 선택하여 포함하는 혼합물을 지칭할 수 있다.

< 실험예 3. In vitro 대식세포를 활용한 함염증 효능 확인>

실시예 3에 따라 제조한 시료의 In vitro 대식세포를 활용한 함염증 효능 확인을 실시하였다. 동물세포 일반 배양 조건은 액체 질소에 보관되어 있는 RAW264.7 mouse 대식세포를 미리 37℃로 셋팅해둔 water bath에서 세포를 신속히 해동 한여 100파이 culture dish에 배양 한다. 배양배지는 DMEM high glucose 배지에 Fetal bovine serum 10%, Pen/Str 1%되게 제조하여 complete media 제조하여 사용하였다.

도 5는 본 발명의 실험예 3에 따른 RAW264.7 세포를 나타낸다. 보관된 RAW264.7 세포는 passage number가 5번으로 매우 어린 세포로서 대식세포의 특성이 우수한 세포주를 실험에 사용 하였다.

대식세포 RAW264.7세포에 음성대조군과 양성대조군(LPS 처리군)을 각각을 비교 하여 항염증(anti-inflammation)연구에 사용하기 적당한 세포인지에 대한 현미경상에서의 세포 모양과 반응성에 대한 조사를 실시하였고 상기 세포 사진에서 보여 주듯이 negative control의 RAW264.7세포는 매우 둥굴고 매끈한 세포 표면을 보여주고 있고, Lipopolyscharide(LPS) 200ng/ml을 처리한 positive control 군에서는 표면이 둥글지 못하고 뽀족한 다리가 형성되는 것을 세포표면에 나타나고 있음을 보여주고 있다.

3-1. XTT assay 세포 독성실험

천연 추출물 혼합물의 항염증 활성 효능 확인 (NO Production)하고자 XTT assay 세포 독성실험을 실시하였다. Raw264.7 세포를 96well plate에 5 X 10⁴ cells로 계수하여 분주 한다. 세포가 안정화 될 수 있도록 약 24시간 동안 Co2 incubator에서 정치하여 둔다. 실시예 3에 따라 준비된 천연 소재 추출 시료(원지, 목향, 황련)를 20mg/ml의 농도로 제조하여 세포에 처리할 샘플로 준비하였다.

원지 및 황련뿌리 추출물 시료의 농도는 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.75, 1.875ug/ml 처리하여 24시간 후 EZ-Cytox 시약을 100ul/5ul씩 처리하여 ELISA leader기에서 450nm의 파장으로 세포 생존률을 확인하였다.

목향 추출물 시료는 다른 시료 보다 낮은 농도부터 세포에 처리 하였다. 처리 시료의 농도는 50, 25, 12.5, 6.25, 3.75, 1.875, 0.94, 0.46ug/ml 처리하여 24시간 후 EZ-Cytox 시약을 100ul/5ul씩 처리하여 ELISA leader기에서 450nm의 파장으로 세포 생존률을 확인하였다.

도 6은 실험예 3에 따른 천연 소재 추출물의 세포독성 실험 결과를 나타낸다. 목향 시료의 70% EtOH 추출물은 세포 독성이 높게 나타나는 경향을 나타내고 있어 12.5ug/ml 농도에서 80%의 세포 생존률이 확인 되었다.

원지 시료의 70% EtOH 추출물은 세포 독성이 다른 시료에 비해 낮게 나타나는 경향을 나타내고 있어 최고농도인 200.0ug/ml 농도에서 80%의 세포생존률이 확인 되었다. 황련 시료의 70% EtOH 추출물의 세포 독성을 확인한 결과 100ug/ml 이하에서는 세포 독성이 낮게 형성되고 있다.

실시예 2에 따라 제조된 목향, 황련, 원지 추출물을 일정 비율로 혼합한 혼합물(M1~M43)을 준비된 세포에 처리하여 항염증 효능에 대한 검증을 실시하였다. 도 7 내지 도 12는 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 세포독성(M1~M43)실험 결과를 나타낸다.

혼합 시료를 대식세포에 대한 세포 독성 확인을 XTT assay 방법을 통해 진행 하였고, 대부분의 혼합 시료는 3% 농도에서는 독성을 나타내나 1.5% 처리 농도에서는 약 65%이상의 세포 생존률을 보여 주고 있고 0.75%이상에서는 80~90%이상의 세포 생존률을 확인 할 수 있어 거의 모든 시료가 0.75%에서는 세포독성이 없는 것으로 확인 되었다.

3-2. Griess Assay (Nitro-oxide(NO)production)

mouse의 대식세포인 RAW264.7에 천연 추출물(원지, 황련, 목향 등)의 농도별로 처리하고 inflammatory factor인 LPS(Lipopolysaccaride)을 처리하여 NO(Nitro-oxide)을 측정하였다.

RAW264.7 대식세포를 96 well culture plate에 각 Well 당 5 X 10⁴개 세포씩 배양 하고 24시간 동안 안정화 시킨 후 NO가 분비 되는 조건을 주기 위하여 염증 유발 물질인 LPS를 처리하고 여기에 시료농도 별로 각각 같이 처리하여24시간 동안 노출 후 배양된 배지를 수집하여 배양배지와 Griess reagent를 섞어준 후 상온에서 15분간 반응 후 TECAN Elisa leader 장비를 이용하여 흡광도 540nm에서 측정하여 그 값을 확인 하였다.

도 13은 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 Griess assay결과를 나타낸다. 목향 70% EtOH 추출물은 세포 독성이 높게 나타나는 경향을 보였고 10ug/ml 이상의 농도에서는 세포 독성이 보였으나 그 이하의 농도에서는 세포 독성이 나타나지 않았고 적정 세포생존률이 확인된 농도인 6.25ug/ml에서는 positive control(LPS) 100% 대비 75.2%의 NO 농도가 측정 되었으며 이것은 negative control(52.0%)보다 높은 항염증 효능 효과의 결과가 관측 되었다.

황련 70% EtOH 추출물은 목향에 비해 상대적으로 낮은 세포 독성이 나타나고 100ug/ml 이상의 농도에서는 세포 독성이 보였으나 그 이하의 농도에서는 세포 독성이 나타나지 않았고 적정 세포 생존률이 확인된 농도인 100ug/ml에서는 positive control(LPS) 100% 대비 82.7%의 NO 농도가 측정되었으며 이것은 negative control(52.0%)보다 높은 항염증 효능 효과의 결과가 관측 되었다.

원지 70% EtOH 추출물은 세포 독성이 낮게 나타나는 경향을 보였고 200ug/ml 이상의 농도에서는 세포 독성이 보였으나, 그 이하의 농도에서는 세포 독성이 나타나지 않았고 적정 세포 생존률이 확인된 농도인 100ug/ml에서는 positive control(LPS) 100% 대비 67.0%의 NO 농도가 측정 되었으며 이것은 negative control(52.0%)보다 높은 항염증 효능 효과의 결과가 관측 되었다.

도 14 내지 도 19는 천연 소재 추출물(원지,목향,황련)의 배합비율에 따른 Griess assay(M1~M43) 결과를 나타낸다. 목향, 원지, 황련추출시 용매로 EtOH(70%)을 이용하여 추출한 추출물을 다양한 비율로 혼합한 시료를 제작 하였으며 혼합물(M1~43)에 대한 마우스 대식세포에 대한 항염증 효능 확인 실험을 Griess assay 시험을 통해 수행 하였다.

본 발명의 3가지 추출물 중, 목향 추출물이 가장 높은 항염증 효력을 나타남을 확인 할 수 있었다. 배합비중에서 목향 추출물의 함량이 높을수록 세포 독성이 높아지고 있음을 XTT assay 결과로 확인 할 수 있었고, NO 발생 억제 효과에 대한 실험에서도 목향 추출물 함량이 높은 배합비 M16~M28에서 효능이 높게 나타남을 확인 할 수 있었다.

대부분의 배합 혼합물은 본 과제의 최종 목표 70%이하(Positive control(100%) 대비)의 수치를 보여 주고 있고 특정 배합비에서는 Negative control 수준까지 염증을 억제 시키는 결과를 보여주고 있었다.

상기 Nitro-oxide(NO) test을 통해 많은 항염증 혼합물을 선정 할 수 있었다. 본사는 wash off 제품(클렌저)에 적용한 화장품 원료와 live on제품(세럼)에 적용 가능한 항염증 우수 혼합비를 결정 하였다. 도 20 내지 도 21은 본 발명의 실험예 3에 따라 선정된 한방소재 추출물 혼합물 M19 및 M40을 나타낸다.

M19 혼합물은 목향 50ul, 원지 10ul, 황련 50ul씩 혼합하여 최종 200ul volume으로 제조 하였다. 황련이 갖는 고유의 노란색으로 인해 M19 혼합물의 전체적인 주요한 색상은 진한 노란색 띄게 된다.

각 추출물은 20mg/ml로 제조된 단독 추출물을 사용 하였다. 즉 M19포함된 각 추출물의 최종농도는 목향 50ug, 원지 10ug, 황련 50ug 씩 포함되어진 혼합물로 구성 되었다. M19 복합물의 1ul에는 목향 0.25ug, 원지 0.05ug, 황련이 0.25ug이 포함되어져 있다.

M19 혼합물은 세포 독성에 있어서 1.5%이하의 농도인 0.75%부터 세포 독성이 관찰 되지 않고 항염증 억제 효능은 0.1%이상의 매우 낮은 농도부터 효과가 있는 것으로 확인되었다.

M40 혼합물은 목향 30ul, 원지 70ul, 황련 0.0ul씩 혼합하여 최종 200ul volume으로 제조 하였다. M40 혼합물의 전체적인 미색의 갈색 띄게 된다. 각 추출물은 20mg/ml로 제조된 단독 추출물을 사용 하였다. 즉 M40 포함된 각 추출물의 최종농도는 목향 30ug, 원지 70ug씩 포함되어진 혼합물로 구성 되었다. M40 복합물은 1ul에는 목향 0.15ug, 원지 0.35ug, 황련이 0.00ug이 포함되어져 있다.

M40 혼합물은 세포 독성에 있어서 M19에 비해 낮은 독성으로 1.5%의 농도에서도 약 75%이상의 세포 생존률을 나타내고 있고 0.75%부터는 세포 독성이 관찰 되지 않고 항염증 억제 효능은 0.1% 이상의 매우 낮은 농도부터 효과가 있는 것으로 확인되었다.

<실험예 4. 선정 혼합물에 대한 항염증 기작 확인 (RT-PCR)>

본 발명의 실험예 4는 실험예 3에 따라 선정된 한방 소재 혼합물에 대한 항염증 기작을 확인하고자 하였다. 이하, 본 발명에서 지칭하는 선정 혼합물은 실험예 3에 따라 배합된 한방 소재 추출물인 M19 및 M40 혼합물을 지칭하는 것일 수 있다.

RAW264.7 대식세포를 6well plate에 배양하고 시료를 LPS 처리 1시간 전에 먼저 처리하고, LPS를 처리하여 6시간 동안 배양하여 Trizol(QIAGEN)시약을 이용하여 세포의 totla RNA를 추출하였다.

추출된 total RNA를 reverse transcriptase와 oligo dT를 이용하여 cDNA를 합성한다. cDNA는 특정유전자의 primer (β-actin, IL-1β, Cox-2, IL-10, TNF-α iNOS, IL-6)를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)를 시행하고 1.5% agarose gel에 전기 영동하여 특정 유전자의 발현 수준을 확인하였다.

도 22는 내지 도 23은 M19 혼합물에 대한 β-actin, IL-1β, Cox-2, IL-10, TNF-α iNOS, IL-6의 발현률 확인(RT-PCR) 결과를 나타낸다. 상기 그래프는 internal Control인 beta-acitn으로 IL-1b의 발현을 나누어 발현 값을 확인한 것으로 Positive control(PC) 100%를 기준으로 하였을 때 Negative control(NC)는 18.68%의 발현률을 나타내었고, M19 혼합물 1.5% 고농도에서는 50.3%의 발현을 나타내었고, M-19-1.0%에서는 54.98%, M-19-0.5%에서는 74.32% M-19-0.25%에서는 68.25%의 발현률을 보여 주고 있어 M19 추출물은 IL-1b 발현을 억제 하는 항염증 효과가 있음을 보여주었다.

상기 그래프는 internal Control인 beta-acitn으로 iNOS의 발현을 나누어 발현 값을 확인한 것으로 Positive control(PC) 100%를 기준으로 하였을 때 Negative control(NC)는 2.54%의 발현률을 나타내었고, M19 혼합물 1.5% 고농도에서는 9.73%의 발현을 나타내었고, M-19-1.0%에서는 28.83%, M-19-0.5%에서는 79.76% M-19-0.25%에서는 77.44%의 발현률을 보여 주고 있어 M19 추출물은 iNOS 발현을 억제 하는 항염증 효과가 있음을 보여주었다.

Cox-2 발현률 확인(RT-PCR) 결과, internal Control인 beta-acitn으로 Cox-2의 발현을 나누어 발현 값을 확인한 것으로 Positive control(PC) 100%를 기준으로 하였을 때 Negative control(NC)는 7.01%의 발현률을 나타내었고, M19 혼합물 1.5% 고농도에서는 53.17%의 발현을 나타내었고, M-19-1.0%에서는 58.15%, M-19-0.5%에서는 83.14% M-19-0.25%에서는 79.83%의 발현률을 보여 주고 있어 M19 추출물은 Cox-2 발현을 억제 하는 항염증 효과가 있음을 보여주었다.

TNF-a 발현률 확인(RT-PCR)확인 결과, 상기 그래프는 internal Control인 beta-acitn으로 TNF-a의 발현을 나누어 발현 값을 확인한 것으로 Positive control(PC) 100%를 기준으로 하였을 때 Negative control(NC)는 46.65%의 발현률을 나타내었고, M19 혼합물 1.5% 고농도에서는 95.87%의 발현을 나타내었고, M-19-1.0%에서는 73.05%, M-19-0.5%에서는 97.35% M-19-0.25%에서는 106.70%의 발현률을 보여 주고 있어 M19 추출물은 TNF-a 발현을 억제 하는 항염증 효과가 있는 것으로 사료된다. 또한, TNF-a는 early stage expression protein으로 다른 cytokine인보다 값이 높게 나타나는 경향을 나타내었다.

IL-10 발현률 확인(RT-PCR)결과, 상기 그래프는 internal Control인 beta-acitn으로 IL-10의 발현을 나누어 발현 값을 확인한 것으로 Positive control(PC) 100%를 기준으로 하였을 때 Negative control(NC)는 0.0%의 발현률을 나타내었고, M19 혼합물 1.5% 고농도에서는 10.80%의 발현을 나타내었고, M-19-1.0%에서는 16.52%, M-19-0.5%에서는 67.46% M-19-0.25%에서는 40.59%의 발현률을 보여 주고 있어 M19 추출물은 IL-10 발현을 억제 하는 항염증 효과가 있는 것으로 사료된다.

IL-6 발현률 확인(RT-PCR)결과, 상기 그래프는 internal Control인 beta-acitn으로 IL-6의 발현을 나누어 발현 값을 확인한 것으로 Positive control(PC) 100%를 기준으로 하였을 때 Negative control(NC)는 0.14%의 발현률을 나타내었고, M19 혼합물 1.5% 고농도에서는 0.048%의 발현을 나타내었고, M-19-1.0%에서는 5.42%, M-19-0.5%에서는 34.72% M-19-0.25%에서는 42.19%의 발현률을 보여 주고 있어 M19 추출물은 IL-6 발현을 억제 하는 항염증 효과가 있는 것으로 사료된다.

IL-27 발현률 확인(RT-PCR)결과, 상기 그래프는 internal Control인 beta-acitn으로 IL-27의 발현을 나누어 발현 값을 확인한 것으로 Positive control(PC) 100%를 기준으로 하였을 때 Negative control(NC)는 2.54%의 발현률을 나타내었고, M19 혼합물 1.5% 고농도에서는 4.92%의 발현을 나타내었고, M-19-1.0%에서는 51.42%, M-19-0.5%에서는 91.82% M-19-0.25%에서는 100.71%의 발현률을 보여 주고 있어 M19 추출물은 IL-27 발현을 억제 하는 항염증 효과가 있는 것으로 사료된다.

선정 혼합물에 세포배양 배지에서의 IL-1b, TNF-a cytokine의 발현률 ELISA assay (ELISA ASSAY -단백질 발현 연구)를 실시하였다. 12well culture dish에서 배양한 RAW264.7 세포에 염증 유발 물질인 LPS를 처리하고 항염증 효과 물질인 M19, M40을 농도별로(1.5, 1.0, 0.5, 0.25%) 처리 하고 24시간 동안 Co2 incubator에서 배양 한 후 배양 배지를 채취하여 샘플로 준비한다. 대조군으로는 염증유발 물질이 처리되지 않는 음성 대조군과 염증유발 물질인 LPS(200ng/ml)만을 처리한 양성 대조군으로 구분하여 준비 하였다.

R&D systems의 Quantikine ELISA assay kit의 manual book의 절차에 따라 실험을 실행 하고 microplate leader기의 450nm의 파장으로 결과를 확인하였다. 도 24는 혼합물(M19, M40)에 대한 항염증 지표 단백질(IL-1b) 발현 억제 효과와 지표 단백질(TNF-a) 발현 억제 효과 확인결과를 나타낸다.

혼합물 M19는 강력한 항염증 효력을 발휘 하여 1.5% 처리군에서 양성대조군(100%) 대비 31.39% 정도 발현 하였고, 1.0% 처리군에서는 35.88%, 0.5%에서 35.14%의 발현, 최소 농도인 0.25%에서는 63.02%의 발현률을 보여 주어 높은 농도부터 낮은 농도까지 항염증 지표단백질의 발현 억제 효과를 보여 주고 있다.

혼합물 M40는 강력한 항염증 효력을 발휘 하여 1.5% 처리군에서 양성대조군(100%) 대비 34.0% 정도 발현 하였고, 1.0% 처리군에서는 38.58%, 0.5%에서 65.40%의 발현, 최소 농도인 0.25%에서는 84.48%의 발현률을 보여 주어 높은 농도부터 낮은 농도까지 항염증 지표단백질의 발현 억제 효과를 보여 주고 있다.

혼합물(M19, M40)에 대한 항염증 지표 단백질(TNF-a) 발현 억제 효과 확인, 혼합물 M19는 강력한 항염증 효력을 발휘 하여 1.5% 처리군에서 양성대조군(100%) 대비 28.62% 정도 발현 하였고, 1.0% 처리군에서는 79.62%, 0.5%에서 98.76%의 발현, 최소 농도인 0.25%에서는 105.26%의 발현률을 보여 주어 높은 농도에서 항염증 지표단백질의 발현 억제 효과를 보여 주고 있다.

혼합물 M40는 1.5% 처리군에서 양성대조군(100%) 대비 72.46% 정도 발현 하였고, 1.0% 처리군에서는 99.82%, 0.5%에서 104.35%의 발현, 최소 농도인 0.25%에서는 106.2%의 발현률을 보여 주어 높은 농도에서 항염증 지표단백질의 발현 억제 효과를 보여 주고 있다. TNF-a 단백질은 early stage 발현 단백질로서 Quantikine ELISA 시행시 시료를 더욱 많이 희석해서 사용할 필요가 있다.

< 실험예 5. 3T3-L1 지방세포 분화 억제를 통한 피지 과다 분비 조절 확인>

본 발명의 실험예 5에 따른 세포배양은 3T3-L1 mouse의 지방전구세포(pre-adipocyte)를 DMEM 배지와 FBS(Fetal Bovine Serum) 10%와 anti-biotics(pen-strep)를 포함하는 배지에서 5% Co2와 37℃의 Co² incubator에서 배양한다. 지방전구세포는 culture plate에서 세포 confluence 가 80%가 넘지 않도록 유지 하며 키운다.

5-1. 세포독성 및 세포 성장률 측정

세포 독성 및 세포 성장률 측정하기 위해 96well plate에 3T3-L1 지방전구세포를 5 X 10³개 세포 수로 각 well에 분주한 후 24시간 동안 배양하고 시료를 농도별로(10㎍/mL~300㎍/mL) 세분화 하여 저농도부터 고농도 까지 처리하고 다시 48시간 동안 노출 시켰다. Tetrazolium salt를 이용한 dehydrogeanse assay (XTT assay) 방법을 이용하여 세포 독성 및 성장률을 측정 하였다.

또한, 황련추출물, 원지추출물, 목향추출물과 항염증 효능 효과가 우수한 배합비를 갖는 상기 실험예 3에 따른 혼합물을 대상으로 3T3-L1 지방전구세포에 대한 세포 독성 및 세포 성장률에 대한 시험을 시행 하였다.

도 25는 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 대한 주요 천연 소재인 황련, 원지, 목향추출물에 대한 세포 독성 및 세포성장률의 XTT assay결과를 나타낸다. 황련 추출물은 300ug/ml의 농도에서는 51.83%의 세포 생존률을 보여주고 있어 세포 독성이 있는 농도로 평가 되었다 그러나 0.75%(150ug/ml)처리한 농도에서는 114.14%의 세포 생존률을 확인 할 수 있어 지방전구세포의 독성이 없는 농도는 150ug/ml 이하 농도에서는 세포 독성이 없고 일부 세포 성장에 도움을 주는 것으로 확인 되었다.

원지 추출물은 1.5%(300ug/ml)에서 세포생존률 25.17%로 확연한 독성이 확인 되었으며, 150ug/ml의 농도에서는 90.65%의 세포 생존률을 확인 되어 원지 추출물 또한 150ug/ml 이하의 농도에서 지방 분화 진행이 가능 할 것으로 판단 되었다.

목향 추출물은 RAW264.7 대식세포에 대한 세포 독성(10ug/ml)이 높아 지방전구세포에서도 높은 독성이 나타날 것으로 예상 되었으나 150ug/ml의 농도에서 25.4%의 생존률 확인으로 150ug/ml에서는 독성이 보이나 75ug/ml의 농도에서 105.41%의 세포 생존률이 확인 되어 목향 추출물은 상대적으로 지방전구세포에 대한 저항성이 있는 것으로 판단되었으며 목향 추출물의 적정 처리 농도는 75ug/ml의 농도가 될 것이다.

도 26은 실험예 3에 따라 선정된 M19, M40 혼합물에 대한 세포 독성 및 세포성장률의 XTT assay 결과를 나타낸다. 항염증 효능 효과가 우수한 천연 혼합물중에 최종 결정된 혼합물은 M19의 경우 지방 전구세포에 3%의 농도로 세포에 처리 하였을 경우 42.25%의 세포 생존를을 보이고 있어 M19 3%농도는 세포 독성이 나타나는 농도로 사용이 어려움이 있을 것으로 판단되나 1.5%의 농도에서는 113.37%의 세포 생존률을 보여주고 있었으며 0.75%의 농도에서는 105%의 세포생존률을 확인 할 수 있어 M19 적정 처리 농도는 1.5%이하의 농도가 적당 할 것으로 판단되어 진다.

M40 혼합물의 경우는 3%농도에서 세포 생존률은 24.66%로 M19보다 높은 독성을 나타내나 1.5% 농도에서는 102.64%의 세포 생존률을 보여주고 있어 1.5% 농도 이하에서는 지방전구세포에 대한 독성이 나타나지 않는 것으로 확인 되었다.

5-2. 지방세포 분화자극 및 분화 진행 확인

하기의 표 4는 지방세포 분화 자극 및 분화 진행을 위한 3T3-L1 adipocyte 분화 스케줄을 나타낸다. 분화 배지 교환 2일 전(D-2) 지방전구세포 3T3-L1세포를 12well plate 분주하여 2일간 더 배양하여 plate 상에서 모든 지방전구세포의 세포간 간격을 없애 주도록 (Confluence 100% 상태)하였다. D0 지방분화 배지(Dex + IBMX + Insulin (5ug/ml)) DMEM FBS(10%)로 배지 교환(12 wells -1ml)하였다. Adipocyte Maturation 단계에서는 2일마다 배지를 교체하는데, 이때 기존의 배지를 전부 suction 하여 교체하는 것이 아니라 50%만 suction 하여 제거하고 새로운 배지를 동량 첨가한다. (ex : 2 ml의 경우 1ml 만 suction 하고 새로운 배지 1 ml 첨가)

3T3-L1 adipocyte differentiation schedule (분화 스케줄)

predipocyte culture		post Confluency	Adipocyte Differentiation	Adipocyte Maturation
Day 1	Day 2	48h	Day 0~3 (72h)	Day 4
Feed Complete Media			Feed Differentiation Media	Feed Maturation Media in every 2 days

D1 -세포가 안정화 된 후 M19, M40 혼합물을 각각의 농도에 따라 처리하였고, D2 DMEM (FBS 10% + Insulin(10ug/ml) 배지로 교환하였다. 배지교환 후, M19, M40 혼합물을 각각의 농도에 따라 처리하였고, 최종 sample(천연물) 처리 시간은 3일간 처리하였다.

D4 DMEM (FBS 10% + Insulin(10ug/ml) 배지 교환을 위해 기존의 배지(12 well- 0.5ml) 제거 하고, 새로운 배지를 첨가(12 well -1ml(total 1.5ml))하였다.

D6 DMEM (FBS 10% + Insulin(10ug/ml) 배지 교환을 위해 기존의 배지(12 well- 1ml) 제거 하고, 새로운 배지를 첨가(12 well -1ml(total 1.5ml)) 하였다.

Phage-contrast photomicrograph를 이용하여 황련 추출물 200ug/ml, 150ug/ml, 100ug/ml, 50ug/ml 4가지 농도로 분화 배지(FBS 10%, insuline(10ug/ml)로 7일간 배양하여 지방세포 분화 정도를 확인한 결과, 마우스 지방전구세포(3T3-L1)의 증식 및 분화 촉진 결과를 현미경 사진을 통해 알아보았다.

도 27 은 황련의 지방전구세포 3T3-L1 (adipocyte) in vitro 분화 실험 결과를 나타낸다. 황련뿌리추출물의 농도가 높아질수록 지방세포의 분화가 억제 되고 있음을 증명 되었다. 특히, 50㎍/ml 이상의 농도에서 강력한 지방분화 억제효력을 발휘 하였다. 일반 지방세포 분화 배지를 사용한 positive control과 비교 하였을 때 10%만 분화가 일어났음이 확인 되었다. 이에 황련 추출물은 고농도에서 독성을 보이나, 저농도에서도 분화가 거의 일어나지 않은 것으로 보아 피지억제(항비만) 효능이 강하다고 판단된다.

Phage-contrast photomicrograph를 이용하여 원지 추출물 100ug/ml, 60ug/ml, 40ug/ml, 20ug/ml 4가지 농도로 분화 배지(FBS 10%, insuline(10ug/ml)로 7일간 배양하여 지방세포 분화 정도를 확인한 결과. 마우스 지방전구세포(3T3-L1)의 증식 및 분화 촉진 결과를 현미경 사진을 통해 알아보았다.

도 28은 원지의 지방전구세포 3T3-L1 (adipocyte) in vitro 분화 실험 결과를 나타낸다. 원지추출물의 농도가 높아질수록 지방세포의 분화가 억제 되고 있음을 증명 되었다. 특히, 60㎍/ml(지방세포로 분화율 15%), 100ug/ml(지방세포로 분화율 7%이하) 이상의 농도에서 강력한 지방분화 억제 효력을 발휘 하였다. 지방세포 분화 배지만을 이용하여 배양한 positive control과 비교 하였을 때 20% 미만으로 분화가 일어났음이 확인 되었다. 이에 원지는 고농도에서 독성을 보이나, 전체적으로 PC보다 분화률이 낮으며,농도가 높아짐에 따라 분화된 세포의 수가 점점 줄어드는 것으로 보아 원지는 약하지만 피지억제 효능이 있는 것으로 판단된다.

Phage-contrast photomicrograph를 이용하여 목향 추출물 200ug/ml, 150ug/ml, 100ug/ml, 50ug/ml 4가지 농도로 분화 배지(FBS 10%, insuline(10ug/ml)로 7일간 배양하여 지방세포 분화 정도를 확인한 결과를 나타낸다.

도 29는 목향의 지방전구세포 3T3-L1 (adipocyte) in vitro 분화 실험결과를 나타낸다. 목향추출물의 농도가 높아질수록 지방세포의 분화가 억제 되고 있음을 확인하였다. 특히, 100㎍/ml(지방세포로 분화율 15%), 150ug/ml(지방세포로 분화율 7%이하) 이상의 농도에서 강력한 지방분화 억제 효력을 발휘 하였다. 지방세포 분화 배지만을 이용하여 배양한 positive control과 비교 하였을 때 20% 미만으로 분화가 일어났음이 확인 되었다.

이에 목향 추출물은 고농도에서는 NC와 비슷하지만 저농도에서 분화가 PC과 유사하게 일어난 것과 높은 농도에서는 세포가 천연물의 독성에 의해 사멸한점과 높은 농도에서도 지방세포 분화가 일부 일어난 것으로 보아 천연물 자체의 피지억제 효능은 거의 없다고 판단된다.

Phage-contrast photomicrograph를 이용하여 M19 혼합물 200ug/ml, 150ug/ml, 100ug/ml, 50ug/ml 4가지 농도로 분화 배지(FBS 10%, insuline(10ug/ml)로 7일간 배양하여 지방세포 분화 정도를 확인하였다.

도 30은 선정된 M19 혼합물의 지방전구세포 3T3-L1 (adipocyte) in vitro 분화 실험 결과를 나타낸다. M19 혼합물의 농도가 높아질수록 지방세포의 분화가 억제 되고 있음을 증명 되었다. 특히 100㎍/ml(지방세포로 분화율 17%), 150ug/ml(지방세포로 분화율 5%이하), 200ug/ml(지방세포로 분화율 2%이하) 이상의 농도에서 강력한 지방분화 억제 효력을 발휘 하였다. 지방세포 분화 배지만을 이용하여 배양한 positive control과 비교 하였을 때 20% 미만으로 분화가 일어났음이 확인 되었다. 이에 고농도에서는 NC와 비슷한 경향이 보이며, 저농도에서도 PC보다 분화률이 확연히 낮다. M19는 다른 천연물에 비해 독성이 낮음에도 불구하고 분화률이 현저히 낮은 것으로 보아 피지억제 효능이 강한 것으로 보인다. 또한, 지방생성 지표 단백질인 FAS, Adiponectin의 발현을 억제 함이 확인 되어 피지 생성 억제 효능이 우수한 것으로 사료된다.

Phage-contrast photomicrograph를 이용하여 M40 혼합물의 200ug/ml, 150ug/ml, 100ug/ml, 50ug/ml 4가지 농도로 분화 배지(FBS 10%, insuline(10ug/ml)로 7일간 배양하여 지방세포 분화 정도를 확인하였다.

도 31은 선정된 M 40 혼합물의 마우스 지방전구세포(3T3-L1)의 증식 및 분화 촉진 결과를 현미경 사진을 나타낸다. M40 혼합물의 농도가 높아질수록 지방세포의 분화가 억제 되고 있음을 증명 되었다. 특히 150㎍/ml(지방세포로 분화율 18%), 200ug/ml(지방세포로 분화율 6%이하) 이상의 농도에서 강력한 지방분화 억제 효력을 발휘 하였다. 지방세포 분화 배지만을 이용하여 배양한 positive control과 비교 하였을 때 20% 미만으로 분화가 일어났음이 확인 되었다.

이에 M40 혼합물은 농도가 높아짐에 따라 분화률이 점점 줄어드는 것으로 보아 항비만 효능이 있는 것으로 보이지만 강한 독성을 가지고 있기 때문에, 항비만 효능에 독성의 영향도 있다고 판단되기 때문에 피지억제 효능이 약할 것으로 추측된다. 또한, 지방생성 지표 단백질인 FAS, Adiponectin의 발현을 억제 함이 확인 되어 피지 생성 억제 효능이 우수한 것으로 사료된다.

5-3. 설정 혼합물의 농도별 지방세포 분화 억제관련 단백질 발현 확인

지방분화 단백질 발현 양상 확인하기 위해 분화 배지 교환 2일 전(D-2) 지방전구세포 3T3-L1세포를 6well plate 분주하여 2일간 더 배양하여 plate 상에서 모든 지방전구세포의 세포간 간격을 없애 주도록 (Confluence 100% 상태)하였다.

D0 지방분화 배지(Dex + IBMX + Insulin (5ug/ml)) DMEM FBS(10%)로 배지 교환(6 wells -2ml)하였고, D1 -세포가 안정화 된 후 M19, M40 혼합물을 각각의 농도에 따라 처리하였다. D2 DMEM (FBS 10% + Insulin(10ug/ml) 배지로 교환한 후, M19 및 M40 혼합물을 각각의 농도에 따라 처리하였다. 최종 sample(천연물)은 3일간 처리하였다. D4 DMEM (FBS 10% + Insulin(10ug/ml) 배지 교환을 위해 기존의 배지(6 well- 2.0ml) 제거 하고, 새로운 배지를 첨가(6 well -1.5ml(total 3ml)하였다.

D7 지방분화 시험 종료 후, culture media 제거 하고 세포를 수집한다. 수집된 지방세포를 ice에 올려놓고 lysis buffer (RIPA buffer)를 100-200 μl를 넣고 cell suspension 하여 풀어준 후, cell을 ice에서 30-40 min 동안 incubation 하면서 5~10 min에 한번씩 vortexing, incubation이 끝난 후 4℃로 cooling 된 microcentrifuge에서 15000 rpm에 15 min 동안 centrifuge 하여 상등액만을 수집 하여 준비 하여 단백질 정량(BCA assay kit 이용)을 진행 한다.

도 32는 BCA 분석 결과를 나타내고, 도 33은 단백질 분석 결과를 나타낸다. 도 34는 지방생성 지표 단백질인 Adiponectin 에 대한 western bloting 실시 및 결과를 나타낸다. 혼합물인 M19, M40 샘플이 지방생성에 관여 하는 Adiponetin 단백질 발현을 효과적으로 차단 하여 세포의 지방 축적을 억제 하여 결과적으로 피지생성을 억제 하게 된다. M19 혼합물에 의해 지방생성 지표 단백질의 발현을 더 효과적으로 제어 되고 있다.

도 35는 지방생성 지표 단백질인 Fatty Acid Synthase(FAS) 에 대한 western bloting을 나타낸다. 혼합물인 M19, M40 샘플이 지방생성에 관여 하는 Fatty Acid Synthase(FAS) 단백질 발현을 효과적으로 차단하여 세포의 지방 축적을 억제 하여 결과적으로 피지생성을 억제 하게 된다. M19 혼합물에 의해 지방생성 지표 단백질의 발현을 더 효과적으로 제어 되고 있다.

< 실험예 6. 설정 혼합물의 항균 활성 효능 확인>

최종 결정 혼합물(M19, M40)에 대한 항균 활성 실험을 다음과 같이 실시하였다. Seed Culture는 병원성 균주가 OD 0.1이 될 때까지 배양한다. (37℃, 200rpm)천연물 처리 시기 설정은 천연물에 의해 균이 자라지 못하는지, 균이 죽는지를 모두 테스트 할 수 있는 시기 탐색한다. log phage인 OD 0.08~0.34 는 약 OD 0.1로 설정하였다.

Main Culture는 본배양액 10 ml에 seed culture broth를 1 ul 분주한다. 천연물(M19, M40)을 해당 배지에 10% 접종한 후, 잘 섞어준다. Standing 하여 24~48h 배양한다. (37℃, 200rpm)

현탁도를 확인하고, control 과 sample을 비교한다. (OD 600 nm) 균 성장이 억제되어 보이는 sample만 선택하여 agar plate에 100 ul spreading 한 후, 천연물의 작용 기작을 파악한다. 구현예로서 상기 작용 기작은 병원성 균주를 완전히 죽였는지, 일부만 죽였는지, 일시적인 성장 억제인자를 확인하였다.

도 36은 E.Coli, B.subtilis, S.aureus, P.aeruginosa에 대한 항균 활성 및 저해 효과 확인결과를 나타낸다. E.coli에 18 h은 천연물만 처리하였을 때 OD 값이 증가하였음에도 균주에 천연물을 처리하였을 때 OD값이 32% 이상 감소된 것을 보아 M19, M40이 E.coli의 성장을 저해한다고 판단되고 42 h처리도 18 h 처리 한 결과와 큰 차이가 없었다. 또한, M19, M40을 처리하여 배양한 후 현탁도를 확인한 결과, 항균 활성이 없다고 판단된다.

B.subtilis에 M19, M40을 처리하여 18 h, 42hr 배양한 후 현탁도를 확인한 결과 M19, M40 모두 항균활성이 있는 것으로 사료된다. 18 h 천연물을 처리한 Sample의 OD 값이 Control과 유사하게 나왔고 M19, M40가 Bacillus subtilis의 성장을 억제하거나, 사멸시키는 것으로 확인되어 M19와 M40은 B.subtilis에 항균활성이 있는 것으로 사료된다. 42 h처리 샘플은 M19를 처리한 Sample은 여전히 항균력이 뛰어나지만 M40 을 처리한 샘플은 항균력이 일시적이고, 42 h 처리한 결과 OD값이 18 h 보다 8배 증가하였다.

S.aureus에 M19, M40을 처리하여 배양한 후 현탁도를 확인한 결과, 18hr 동안 배양액 상태에서 M19가 S.aureus 에 대한 항균활성이 있는 것으로 여겨졌으나 48hr 동안 배양한 배양액의 현탁도가 높아져 항균 활성이 없는 것으로 사료된다. 18 h처리 샘플은 OD 값으로는 천연물이 S.aureus의 성장에 영향을 끼치지 못하나 육안으로는 TSB (S.aureus, M19 10%)의 현탁도와 TSB (M19 10%)의 현탁도가 비슷한 것으로 보여 2차 test가 필요하다고 판단된다. 42 h 처리 샘플은 균 성장 억제력이 있다고 판단되고, M19, M40 둘 다 항균 저해력이 나타났으며, 특히 M19는 OD 값이 Control보다 약 65% 낮아졌다.

P.aeruginosa 에 M19, M40을 처리하여 배양한 후 현탁도를 확인한 결과, 항균 활성이 없다고 사료된다. 18 h 처리 샘플은 천연물만 처리하였을 때 OD 값이 증가하였음에도 균주에 천연물을 처리하였을 때 OD값이 감소하는 것으로 보아 M19, M40 둘 다 P.aeruginosa의 성장 속도를 늦추는 것으로 사료된다. 42 h 처리 샘플을 여전히 항균력이 있었고, OD 값이 감소하긴 하였지만, 천연물을 18 h 처리하였을 때와 큰 차이가 없었다.

이에 M19 추출 혼합물은 E.coli 에 대한 항균활성은 약하지만 시간에 따른 차이가 없이 그 활성능이 유지된다. B.subtilis 의 성장을 완전히 저해하지는 못하지만, 균주의 성장이 control에 비해 10배 이상 억제된 것으로 보아 M19는 B.subtilis 에 대한 항균활성능이 크다고 판단된다. S.aureus에 대한 항균활성이 없는 것으로 보였지만 반응 시간이 길어질수록 항균 활성능이 증가하는 것이 확인 되었다.P.aeruginosa에 대한 항균활성은 있으며, 시간에 따른 변화는 없이 그 활성능이 유지되었다.

M40 추출 혼합물은 E.coli 에 대한 항균활성은 약하지만 시간에 따른 차이가 없이 그 활성능이 유지된다. B.subtilis 에 대한 항균활성이 강하다고 판단되었지만, 42 h 까지 반응시켰을 때, 그 활성능이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. S.aureus에 대한 항균활성이 없는 것으로 보였지만 반응 시간이 길어질수록 항균 활성능이 증가하는 것이 확인되었다. P.aeruginosa에 대한 항균활성은 있으며, 시간에 따른 변화는 없이 그 활성능이 유지된다.

본 발명은 여드름의 원인으로 작동하는 피지생성을 근본적으로 억제하는 기전을 이용한 천연 소재를 선별하고 최적의 활성 노도를 결정하고 표준화 하여 피부에 적절한 제품을 제공하여 보다 기존의 화학적 치료방법보다 부작용이 덜하고 균 살균에 있어 최대한의 효과를 거둘 수 있어 관련 산업인의 이익제고에 보탬이 됨으로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (5)

1. 목향과 원지 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 목향 및 원지 추출물은 부피비를 기준으로 3:7로 혼합한 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장품 조성물
2. 목향과 원지 및 황련 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 목향과 원지 및 황련 추출물은 부피비를 기준으로 5:1:5로 혼합한 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장품 조성물
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추출물은 원재료를 0.1 내지 1.0mm 크기로 분쇄하여 분말상으로 만들고 에탄올 70% 용매를 상기 분말에 각각의 부피 대비 10배로 첨가하여 9시간 동안 50 내지 70℃ 온도에서 추출한 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장품 조성물
4. 삭제
5. 삭제

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