CN117045563B - 云木香根提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种云木香根提取物及其制备方法和应用,所述云木香根提取物含有木香烃内酯,所述云木香根提取物是以云木香根为原料,所述云木香根经提取技术、大孔树脂纯化技术处理,制备得到云木香根提取物中木香烃内酯含量较高,本发明的制备方法转移率较高,得到的云木香根提取物具有较好的抑菌、抗炎和控油功效。
Description
技术领域
本发明属于化妆品应用开发领域,具体地涉及一种云木香根提取物及其制备方法和应用。
背景技术
头发与皮肤一样也有油性、中性和干性的分别,要视皮脂腺的分泌量而定。拥有一头闪亮滑润的头发,是每个人都盼望的事,因为柔亮的头发会给人明朗、健康的感觉。因此人们更注重头发的质量,护发也就随着现行社会所发展的时尚潮流而更受关注。
通常情况下,头皮产生的油脂和汗液结合后形成弱酸环境,既能够保护滋润头皮,还有抑制微生物繁殖的作用。头发的油脂中含有蜡质,使头发柔顺有光泽。但过量的油脂,容易使空气中的灰尘粘附在头发上,造成头发的黏腻和不美观,在微生物的作用下,可能会导致头皮炎症和毛囊堵塞的发生,造成头皮发炎和脱发。因此,如何减少头皮炎症和毛孔堵塞从而维持头皮健康和头发清爽是美容学领域讨论的重要课题。
目前,市面上有很多护发产品来解决这一问题。专利《一种具有去头屑效果的组合物及其制备方法和应用》(CN 106619352 B)中描述了一种具有去头屑效果的组合物,其中包含针砂、素馨花、木香、玉竹,具有去屑、控油、止痒、修复等多重功效,但抑菌去屑效果由组合物所产生,组合物制备工艺较为繁杂,且目标成分不明确,在实际生产中没有可控的量化指标。专利《一种去屑止痒的中药组合物及其制备方法》(CN 110339290 A)中由苍术、木香和黄精组成的中药组合物,具有抑菌止痒的功效,但抑菌止痒率无实验数据支持,且无功效数据可支撑去屑止痒的宣称。
因此本领域亟需开发一种制备工艺简单、主要成分明确,且具有抑菌、消炎和控油功效的护发产品,从而减少头皮炎症的发生。
发明内容
本发明旨在提供一种云木香根提取物及其制备方法和应用,所述云木香根提取物具有抑菌、抗炎和控油的功效。
在本发明的第一方面,提供了一种云木香根提取物的用途,用于制备控油的制剂或组合物,所述控油指减少皮脂腺细胞中的脂质含量和/或抑制中性脂质的分泌;所述云木香根提取物含有木香烃内酯,并且所述云木香根提取物是以云木香根为原料,经提取技术、大孔树脂纯化技术处理,制备得到云木香根提取物,其中,所述的云木香根提取物中木香烃内酯的含量为0.1%-5.0%,以云木香根提取物的干质量计。
在另一优选例中,所述控油指抑制皮脂腺细胞分泌中性脂质。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物用于抑制人皮脂腺细胞分泌脂质。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物用于减少皮脂腺细胞中的中性脂质含量。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物还用于抑制马拉色菌。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物不含额外的抗菌剂。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物中,针对的马拉色菌的抑菌活性来自于所述云木香根提取物。
在另一优选例中,所述的云木香根提取物对马拉色菌的抑菌率为99%-100%。
在另一优选例中,所述提取技术为乙醇提取。
在另一优选例中,所述云木香根可以是经粉碎的或未经粉碎的。
在另一优选例中,所述的云木香根提取物具有控油功效。
在另一优选例中,所述的云木香根提取物具有抗炎功效。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物还包括药学上或化妆品上所能接受的辅料。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物包括富含云木香根提取物的化妆品添加剂。
在另一优选例中,所述化妆品添加剂中,所述的云木香根提取物的含量≥10wt %,较佳地≥30wt %,更佳地≥50wt %,最佳地≥60wt %,如10wt%-90wt%或20wt%-80wt%。
在另一优选例中,所述的辅料选自下组:丁二醇、丙二醇、甘油、PEG40-氢化蓖麻油其中一个或多个。
在另一优选例中,所述的云木香根提取物用包括以下步骤的方法制备:
(S1)提供云木香根,将云木香根进行粉碎研磨得到云木香根粗粉;
(S2)称量云木香根粗粉和提取溶剂乙醇,在提取温度下云木香根粗粉经乙醇提取后,提取液滤去药渣,取滤液得到醇提后的滤液;和任选的步骤:
(S3)将醇提后的滤液减压抽滤,取滤液浓缩至投料量的2-4倍,即得云木香提取物浸膏。
在另一优选例中,步骤(S2)中所述提取溶剂乙醇为60v/v%-70v/v%乙醇
在另一优选例中,步骤(S2)中云木香根粗粉和提取溶剂乙醇的质量比为1:20-30。
在另一优选例中,步骤(S2)中所述温度T为50℃-70℃,较佳地为55℃-65℃,最佳地为58℃-62℃。
在另一优选例中,步骤(S2)中所述温度T为60℃。
在另一优选例中,步骤(S2)中所述提取时间t为1h-2h,较佳地为1.2h-1.8h。
在另一优选例中,步骤(S2)中所述提取时间t为1.5h。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤(S4):使用大孔树脂对云木香根提取物浸膏进行纯化。
在另一优选例中,步骤(S4)中所述大孔树脂为非极性或弱极性树脂。
在另一优选例中,步骤(S4)中所述大孔树脂选自下组:AB-8、HPD300。
在另一优选例中,步骤(S4)中所述大孔树脂选自AB-8。
在另一优选例中,步骤(S4)所述纯化包括步骤:
(S4a)取云木香根提取物浸膏,上样于大孔树脂;
(S4b)取V1体积的水对树脂进行水洗,从而去除水溶性杂质;
(S4c)取V2体积的乙醇对树脂进行醇洗,收集醇洗滤液,从而得到云木香根提取物;
任选地,所述的方法还包括步骤(S4d):将所述的云木香根提取物进行减压浓缩,浓缩后即得到云木香纯化浸膏。
在另一优选例中,所述云木香纯化浸膏中木香烃内酯的含量为0.1%-5.0%,以云木香根纯化浸膏的干质量计。
在另一优选例中,所述云木香纯化浸膏中木香烃内酯的转移率为50%-85%。
在另一优选例中,步骤(1)中所述云木香根提取物浸膏与树脂质量比2-4:1,以湿树脂质量计。
在另一优选例中,步骤(2)中所述水洗的体积V1为1.5BV-2.5BV,较佳地为1.8BV-2.2BV。
在另一优选例中,步骤(3)中所述醇洗的体积V2为2BV-4.5BV,较佳地为2.5BV-4.2BV。
在另一优选例中,步骤(3)中所述醇洗中的乙醇浓度为70v/v%-90v/v %,较佳地为75v/v %-88v/v %。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物具有抑菌、抗炎和控油的功效。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物为化妆品。
在另一优选例中,所述化妆品还含有额外的可用于化妆品的成分。
在另一优选例中,所述的制剂或组合物包括:洗发、护发类产品。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了云木香根提取物控油实验结果。
图2显示了云木香根提取物样品对Raw264.7细胞分泌TNF-α的影响。
图3显示了云木香根提取物样品对Raw264.7细胞分泌IL-6的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究,通过大量筛选,首次意外地开发了一种具有抑菌、抗炎和控油功效的云木香根提取物,所述云木香根提取物中木香烃内酯含量0.1%-5.0%,本发明所述云木香根提取物以云木香根为原料,以特定的醇浓度和优选的温度和提取时间下得到云木香根提取物,再经过特定的大孔树脂和优化的洗脱条件下,得到云木香纯化浸膏。本发明制备方法得到的云木香根提取物中木香烃内酯的转移率高达80%以上,木香烃内酯含量高,得到的云木香根提取物具有较好的抑菌、抗炎和控油功效。在此基础上完成了本发明。
术语说明
云木香
云木香(Saussurea costus(Falc.) Lipech.)为菊科植物,在我国云南、四川、贵州和广西一带有栽培,适宜生长在海拔2700-3300米的高寒山区,具有耐寒、喜肥、喜冷凉、湿润的生长特性。云木香常以根入药,有抑菌消炎、健脾胃、调气解郁、止痛、防治高血压等的功效,常用作临床用药、香料和化妆品原料等。
皮脂腺细胞(SZ95细胞)位于皮脂腺中,具有分泌脂质的作用,皮脂腺细胞分泌的主要是中性脂质,中性脂肪进入毛囊后,可在微生物的作用下分解成甘油和游离脂肪酸再到达体表成为皮脂,此外皮脂中还有一些蜡酯、角鲨烯等成分。适量的皮脂具有滋润皮肤和毛发,保护皮肤,防止皮肤水分蒸发,抑制和杀灭皮肤表面的细菌等的作用,但是由于皮肤环境的改变或疾病等因素的发生,可能造成皮脂腺细胞的过度活跃,造成皮脂的过度产生,可造成皮肤油腻、暗淡、易出汗、病原微生物的过度繁殖以及头面部痤疮的产生。在头皮表面,过量的油脂分泌,可能造成毛囊的堵塞和马拉色菌的大量分泌,产生毛囊炎、头皮过敏和脂溢性脱发。
马拉色菌
马拉色菌为人和动物皮肤表面的常见微生物,主要包括糠秕马拉色菌、合轴马拉色菌、球形马拉色菌、厚皮马拉色菌等。马拉色菌是一类嗜脂类真菌,在皮肤表面是一类条件致病菌,在某些致病因素的作用下,可引起脂溢性皮炎、马拉色菌毛囊炎、特应性皮炎和脂溢性脱发等病症,其异常活动也被认为是头屑形成的主要原因。许多去屑产品都通过添加杀菌剂来控制头部马拉色菌的生长,以此来改善头皮头屑问题。因此,有此类去屑效果的产品通常将对马拉色菌的抑菌情况作为样品去屑性能的一个评价指标。
本发明中“云木香根提取物”、“云木香根提取物浸膏”、“云木香纯化浸膏”可互换使用。
云木香根提取物的制备
在本发明中,以云木香根为原料经过醇提,再经大孔树脂纯化得到云木香根提取物,制备步骤如下:
醇提:
(1)提供云木香根,将云木香根进行粉碎研磨得到云木香根粗粉;
(2)称取云木香根粗粉50-200g进行投料,使用的提取溶剂为浓度65v/v%的乙醇,提取溶剂倍量为20-30倍的投料量,在60℃下提取1.5h,提取完成后滤去药渣,摇匀后滤过,取滤液,得到醇提后的滤液;
(3)将醇提后的滤液减压抽滤,滤液浓缩至投料量的2-4倍,即得云木香提取物浸膏。
纯化:
在树脂(以湿树脂质量计)中加入2-4倍量的云木香提取物浸膏,使用大孔树脂AB-8对云木香根提取物浸膏进行纯化,上样后以1.5h/BV的速度水洗2BV,85v/v %乙醇洗脱4BV,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,得到云木香纯化浸膏。
在本发明中,所述云木香纯化浸膏木香烃内酯的含量为0.1%-5.0%,以云木香根提取物的干质量计。
在本发明中,所述云木香纯化浸膏的转移率为50%-80%。
云木香纯化浸膏中木香烃内酯的转移率(提取率)
在前期研究中,发明人采用液相色谱方式测定云木香根原料中的木香烃内酯含量为1.0wt%-5.0wt%(详见实施例1),经过提取纯化后,本发明的产物云木香纯化浸膏中,木香烃内酯的转移率(即,提取得到木香烃内酯的含量:液相色谱计算得出的原料中木香烃内酯总含量)可以达到50%-85%。
云木香根提取物及应用
在本发明中,所述云木香根提取物为云木香纯化浸膏。
本发明制的云木香提取物浸膏经过优选的大孔树脂纯化后得到云木香纯化浸膏,所述云木香纯化浸膏的木香烃内酯的含量为0.1%-5.0%,以云木香根提取物的干质量计。云木香纯化浸膏中木香烃内酯的转移率达到50%-85%。
在本发明中,所述云木香纯化浸膏对马拉色菌的抑菌率的平均抑菌率达到99%以上,在具有抑菌控油功效的同时,具有抗炎的功效。
在本发明中,所述云木香纯化浸膏可用于制备含云木香根提取物的产品。
优选地,所述产品具有抑菌、抗炎和控油的功效。
在另一优选例中,所述产品为化妆品。
在另一优选例中,所述产品包括:洗发、护发类产品。
在另一优选例中,所述化妆品还含有额外的可用于化妆品的成分。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
1.在本发明优选的醇提条件下,云木香根提取物的提取率高达70%以上。
2.本发明制备的云木香根提取物浓度为5.0mg/mL、7.5mg/mL、10.0mg/mL时,对马拉色菌的抑菌率的平均抑菌率均能达到99%以上。
3.本发明的制备的云木香根提取物具有抑菌控油功效的同时,具有抗炎的功效。
4.本发明以云木香根提取物为主体成分,所述云木香根取物在化妆品运用中具有较好的抑菌、控油和抗炎功效。
5.本发明仅经过醇提、减压浓缩、树脂纯化简单的制备工艺,得到木香烃内酯提取率较高的云木香根提取物。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计。
实施例1 云木香根提取物的提取条件探索
在本实验中,以云木香根为原料,使用醇提法进行木香烃内酯的提取,使用大孔树脂进行木香烃内酯的纯化,得到云木香根提取物浸膏。
1.云木香根提取物的提取条件探索,测试过程如下:
1.1木香烃内酯的含量测定方法
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水(65∶35)为流动相;检测波长为225nm。理论板数按木香烃内酯峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备:取木香烃内酯对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL各含0.1mg的混合溶液,即得。
供试品溶液的制备:
1)云木香根药材样品溶液:取云木香根粗粉(过四号筛)约0.3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞,称定重量,放置过夜,超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2)提取物浸膏样品溶液:精密称取0.1-2.0g提取物浸膏,置10mL具塞比色管中,加甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3)提取液样品溶液:精密量取1-2mL提取液,置10mL具塞比色管中,加甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定方法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,即可计算得到云木香根中木香烃内酯的含量,结果如表1所示。
1.2提取温度对木香烃内酯提取率的影响
称取云木香根粗粉适量(过四号筛),醇浓度为75%,提取溶剂倍量为25倍投料量,提取温度分别设置为50℃、60℃、70℃和80℃,提取1.5h。提取液滤去药渣后摇匀,滤过,取滤液,即为待测样品液。按照1.1中的测定方法,进行提取液中木香烃内酯的含量测定以及提取率的计算,结果如表1所示。
1.3提取时间对木香烃内酯提取率的影响
称取云木香根粗粉适量(过四号筛),醇浓度为75%,提取溶剂倍量为25倍投料量,提取温度选取1.2中提取率最高的温度,提取时间分别设置为0.5h、1h、1.5h、2h和3h。提取液滤去药渣后摇匀,滤过,取滤液,即为待测样品液。按照1.1中的测定方法,进行提取液中木香烃内酯的含量测定以及提取率的计算,结果见表1所示。
1.4醇浓度对木香烃内酯提取率的影响
称取云木香根粗粉适量(过四号筛),提取溶剂倍量为25倍投料量,提取温度选取1.2中提取率最高的温度,提取时间选取1.3中提取率最高的时间,醇浓度分别设置为65%、75%、85%。提取液滤去药渣后摇匀,滤过,取滤液,即为待测样品液。按照1.1中的测定方法,进行提取液中木香烃内酯的含量测定以及提取率的计算,结果如表1所示。
表1 木香烃内酯含量测定结果
液相测定结果显示,云木香根中的木香烃内酯含量为3.28%;根据木香烃内酯的提取率,在60℃时进行木香烃内酯的提取的转移率(提取率)最高为82.49%,提取时间为1.5h时木香烃内酯转移率最高为75.34%,使用65%的乙醇进行提取时木香烃内酯转移率最高为70.88%。因此,木香烃内酯的提取条件可确定为使用65%的乙醇,在60℃提取1.5h时木香烃内酯的转移率最高。
2.云木香根提取物的纯化条件探索,过程如下:
2.1大孔树脂对木香烃内酯吸附率和解吸率的影响
选用非极性或弱极性树脂(AB-8、D101、HPD100、HPD300)进行木香烃内酯的纯化,提取液减压抽滤后,滤液浓缩至投料量的3倍,即得提取浸膏。在树脂(以湿树脂质量计)中加入3倍量的提取浸膏,密封后在水平摇床中180rpm/min吸附30min,吸附完成后滤去树脂,滤液使用甲醇进行稀释,作为吸附后溶液;滤干溶液的树脂中加入5倍量的纯化水,滤去树脂,在滤干水分的树脂中加入3倍量(以湿树脂质量计)的80%乙醇,密封后在水平摇床中180rpm/min解吸附30min。解吸附完成后滤去树脂,滤液使用甲醇进行稀释,作为解吸附溶液。按照下式进行吸附值、吸附率、解吸率和回收率的计算,结果如表2所示。
表2 不同树脂对木香烃内酯吸附值、吸附率、解吸率和回收率的影响
液相测定结果显示,AB-8树脂在四种树脂中对云木香根中的木香烃内酯的吸附率、解吸率和回收率最高,因此选择AB-8作为木香烃内酯提取浸膏的纯化树脂。
2.2洗脱醇浓度和倍量对木香烃内酯纯化的影响
选用AB-8进行提取浸膏的纯化,称取提取浸膏3倍量的树脂(以湿树脂质量计)。上样后以1.5h/BV的速度水洗2BV,60%乙醇洗脱2BV,最后以85%乙醇洗脱3BV,分别收集水洗液和醇洗液,使用甲醇进行稀释后作为待测液,检测结果如表3所示。
表3 AB-8树脂对木香烃内酯的纯化
液相测定结果显示,在AB-8树脂对云木香根中的木香烃内酯的纯化过程中,1BV水洗液、2BV水洗液和1BV 60%醇洗液中未检出木香烃内酯,1-2BV 85%醇洗液中木香烃内酯含量较高。因此在木香烃内酯的纯化中,2BV水洗可洗去除木香烃内酯外的大部分杂质,60%的乙醇洗出的木香烃内酯含量较少,在云木香根提取物的纯化过程中,高浓度的乙醇较适用于木香烃内酯的洗脱。
2.3AB-8树脂纯化木香烃内酯验证
选用AB-8进行提取浸膏的纯化,称取提取浸膏3倍量的树脂(以湿树脂质量计)。上样后以1.5h/BV的速度水洗2BV,以85%乙醇洗脱4BV,分别收集上样流出液、水洗液和醇洗液,使用甲醇进行稀释后作为待测液,检测结果如表4所示。
表4 AB-8树脂对木香烃内酯的纯化验证
液相测定结果显示,在AB-8树脂对云木香根中的木香烃内酯的纯化过程中,2BV水洗液中未检出木香烃内酯,2-3BV 85%醇洗液中木香烃内酯含量较高,因此在木香烃内酯的纯化中,85%的乙醇洗出的木香烃内酯含量较高。在云木香根提取物的纯化过程中,2BV水洗和4BV 85%乙醇可纯化出大部分的木香烃内酯,木香烃内酯的上样量为3565.51mg,纯化出的木香烃内酯总量为2057.12mg,吸附率为42.31%。
实施例2 云木香根提取物的制备
在本实验中,以云木香根为原料,使用醇提法进行木香烃内酯的提取,其中提取条件为实施例中优选条件,使用实施例1中筛选出的纯化条件对醇提后的浸膏进行纯化,得到云木香根提取物浸膏。实验步骤如下:
醇提:
(1)提供云木香根,将云木香根进行粉碎研磨得到云木香根粗粉;
(2)称取云木香根粗粉50-200g进行投料,使用的提取溶剂为浓度65%的乙醇,提取溶剂倍量为25倍的投料量,在60℃下提取1.5h,提取完成后滤去药渣,摇匀后滤过,取滤液,得到醇提后的滤液;
(3)将醇提后的滤液减压抽滤,滤液浓缩至投料量的3倍,即得提取浸膏;
纯化:
在树脂(以湿树脂质量计)中加入3倍量的云木香提取物浸膏,使用大孔树脂AB-8对云木香根提取物浸膏进行纯化,上样后以1.5h/BV的速度水洗2BV,85%乙醇洗脱4BV,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,得到云木香纯化浸膏。
实施例3 云木香根提取物的抑菌活性测试
3.1云木香根提取物对马拉色菌的抑菌活性
3.1.1培养基的准备
将橄榄油培养基配制好高温121℃灭菌15分钟,待培养基冷却至45℃时,倾入无菌平皿,待冷却凝固后,备用,培养基配方如表16所示。
表16:橄榄油培养基配方:
放线菌酮及氯霉素可以按照比例配成储备液,过滤除菌备用。其它成分充分溶解后,调节pH至6.0~6.4,置于121℃,灭菌15min~30min。使用前加入放线菌酮及氯霉素储备液。
3.1.2菌悬液的制备
刮取在橄榄油平板上生长5-7d的马拉色菌(马拉色菌Malasseziafurfur,购自广东微生物菌种保藏中心)菌落于无菌生理盐水中混匀。
3.1.3样品的制备
使用0.1%-0.5%的二甲基亚砜(DMSO)水溶液对实施例2制备得到的云木香纯化浸膏进行稀释。
3.1.4接种
将配制好的菌悬液准确吸取0.1mL均匀涂布在培养基上,在平板上放置3个已灭菌的牛津杯,在牛津杯中加入0.2mL样品稀释液,以加入0.1%-0.5%的DMSO水溶液作为阴性对照,以加入10%吡啶硫酮锌(ZPT)作为阳性对照。置于培养箱中35℃下厌氧培养5-7d,观察菌落生长状况,记录抑菌圈(扣除牛津杯直径8mm)大小,结果如表5所示。
表5 云木香根提取物对马拉色菌的抑制
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云木香根提取物对马拉色菌的抑制结果显示,阴性实验组无抑菌圈,表明抑菌实验所用DMSO水溶液不会对实验结果产生影响,阳性实验组的抑菌圈直径为12.5±0.5mm,表明10%ZPT具有较好的马拉色菌抑菌效果,云木香根提取物的抑菌圈直径为7.5±0.5mm,具有马拉色菌抑菌功效。
3.2云木香根提取物对马拉色菌的抑菌率
根据《去屑产品去屑功效测试方法》团体标准T/GDCA 010-2022的载体浸泡抑菌实验,进行云木香根提取物的马拉色菌去屑功效测试。
3.2.1培养基
培养基同3.1.1。
3.2.2菌种制备
刮取在橄榄油平板上生长5-7d的马拉色菌菌落,于PBS中混匀。并用PBS稀释至约5×106~5×107CFU/mL制成菌悬液备用。
3.2.3载体制备
载体为10mm×10mm脱脂白平纹布片,脱脂方法依照《消毒技术规范》(2002版)进行,使用前高压蒸汽灭菌备用。使用微量移液器滴染10μL菌悬液于灭菌载体上,36℃±1℃烘干或室温晾干备用。
3.2.4载体浸泡抑菌测试
将待测样品置于无菌平皿内,置20℃±1℃水浴5min,用无菌镊子取染菌载体,使载体完全浸没于待测样品中,立即计时5min。待染菌载体与样品相互作用至5min后,分别取染菌载体加入5.0mL PBS的试管中,混匀,充分振打,将试验菌洗下。按照菌液浓度,使用PBS进行10倍稀释,选取合适的稀释度,分别吸取1.0mL样液,放入灭菌平皿中,倒入培养基Leeming和Notman培养基,带凝固后翻转平板,置(28±2)℃,培养7天后计数。
取同批次PBS、培养基作阴性对照。5mL PBS作为阳性对照,方法同试验样。试验2平行,重复5次,计算每组抑菌率的平均值,测试结果见表6所示。
表6 云木香根提取物对马拉色菌的抑菌率
如表6所示,本申请制备得到的云木香根提取物浓度为5.0mg/mL、7.5mg/mL、10.0mg/mL时,对马拉色菌的抑菌率的平均抑菌率均能达到99%以上,因此本申请的云木香根提取物对马拉色菌具有优异的抑菌效果。
实施例4 云木香根提取物的安全性以及控油功效
在本实验中,使用实施例2制备得到的云木香纯化浸膏进行控油活性测试,测试过程如下:
4.1云木香根提取物对SZ95细胞(人皮脂腺细胞)活性测试
将细胞悬液接种于96孔细胞培养板,培养18-24h至细胞80%融合。弃去孔中原培养液,每孔加入100uL测试样品,使用细胞基础培养基进行云木香根提取物和控油组合物的稀释,稀释浓度设置如表7所示,培养箱孵育24±1h。取出培养板后每孔加入20μL MTT(噻唑蓝)溶液,培养箱孵育3-4h。去除孔中液体,每孔加入100μL DMSO试剂,置于振荡器振荡10-15min后,在酶标仪570 nm波长处测定吸光度,细胞活性以阴性对照组的细胞活性为100%,计算各组细胞相对活性,结果如表8所示。
表7 云木香根提取物对SZ95细胞安全浓度筛选浓度设置
表8 云木香根提取物对SZ95细胞活性的影响
表8结果显示,云木香根提取物浓度≤7.388×10-2μg/mL时,细胞活力>90%,以其作为最大安全浓度,在浓度≤7.388×10-2μg/mL下选取合适的浓度进行样品的细胞控油实验。
4.2云木香根提取物对SZ95细胞的控油功效测试
将细胞悬液接种于96孔细胞培养板,培养18-24h至细胞80%融合。加入各浓度待测样本及阳性对照(样本浓度设置如表9所示),孵育48h后弃上清,PBS清洗两遍后,实验组加入尼罗红染料,对照组加入FDA(荧光素双醋酸酯),孵育5min,释放的荧光在多功能酶标仪上进行检测。484nm,494nm激发波长和565nm,523nm吸收波长分别用于尼罗红和FDA荧光强度的检测。结果以尼罗红和FDA的比值(OD比值)确定:细胞内中性脂质百分比(%)=实验组OD比值/对照组OD比值×100%。统计学处理采用SPSS软件包,进行显著性检验。P<0.05认为差异有统计学意义,结果如表10所示。
表9 云木香根提取物对SZ95细胞控油功效测试浓度设置
表10 云木香根提取物控油实验结果
从表10和图1可以看到,在实验浓度下,云木香根提取物均具有控油功效,图中BC为空白对照组,培养基中不添加亚油酸;NC为阴性对照组,培养基中添加亚油酸;PC为阳性对照组,培养基中添加亚油酸和异维A酸;样品组在培养基中添加亚油酸和样品。阴性对照组(NC)与空白对照组(BC)相比,中性脂质相对含量显著升高(#P<0.05),阳性对照组(PC)与阴性对照组(NC)相比,中性脂质相对含量显著降低(*P<0.05),表明本次实验细胞模型构造成功。三个实验浓度下的云木香根提取物,均能显著降低中性脂质相对含量(*P<0.05),这提示其可通过减少性脂质相对含量,来抑制中性脂质的分泌,从而达到控油的作用。
实施例5 云木香根提取物的抗炎功效测试
5.1云木香根提取物对Raw 264.7细胞活性测试
1)接种:当细胞密度≥70%时,弃除旧培养基,加入5mL PBS清洗细胞后重新加入4mL DMEM基础培养基,移液枪吹打细胞致重悬,转移至2mL离心管中,1000rpm离心4分钟,弃上清;重新加入1mL完全培养基,吹打混匀后,稀释适当倍数并计数,根据计数的结果将细胞密度调整为8×104cell/mL,按照每孔200μL的体积接种细胞至96孔板中,放回培养箱孵育(37℃、5%CO2)。
2)实验分组:实验设置空白对照组与实验组,另设3个无细胞的孔作调零孔,实验组中每个样品设置6个浓度梯度,每个浓度梯度下设置3个复孔,如表11所示;
3)配液:按实验设计,用基础培养基配置不同浓度的受试物;
表11 云木香根提取物对Raw 264.7细胞安全浓度筛选浓度设置
4)给药:24h后取出96孔板,弃除旧培养基,调零孔和空白对照组每孔加200μL基础培养基,实验组每孔加200μL用基础培养基配制的样品,按照每组每个浓度3个复孔进行布板。然后放回培养箱培养(37℃,5% CO2);
5)检测:加药处理后24h,取出96孔板,每孔加入MTT工作液(5mg/mL)20μL,放回培养箱继续培养4h,然后弃除孔内液体,每孔重新加入150μL DMSO,振摇10min后于490nm波长处测定吸光度(OD值)。
6)细胞相对活力计算:细胞活力%=(实验组OD值-调零孔OD值)/(空白对照组OD值-调零组OD值)*100%,样品对细胞的相对活力影响结果见表13。
5.2云木香根提取物对LPS致巨噬细胞Raw264.7细胞分泌TNF-α、IL-6的影响实验
1)接种:当细胞密度≥70%时,弃除培养基,加入5mL PBS清洗细胞后重新加入4mLDMEM基础培养基,移液枪吹打细胞至重悬,转移至2mL离心管中,1000rpm离心4分钟,弃上清;重新加入1mL完全培养基,吹打混匀后,稀释适当倍数并计数,根据计数的结果将细胞密度调整为8×104cell/mL,按照每孔200uL的体积接种细胞至96孔板中,放回培养箱孵育(37℃、5%CO2)。
2)实验分组:实验设置空白对照组、阳性对照组、阴性对照组与实验组如表12所示,另设3个无细胞的孔作调零组,按照每组每个浓度4个复孔进行布板;
3)配液:根据5.1所得细胞活力测试结果,选择适宜的样品浓度为测试浓度并配置待测样品溶液;以地塞米松(100μg/mL)为阳性对照进行实验如表12。
表12 云木香根提取物对LPS致Raw264.7细胞分泌TNF-α、IL-6的影响实验分组
4)给药:24h后取出96孔板,弃除旧培养基,按照每组每个浓度4个复孔进行加样,调零孔、空白对照组(BC)和阴性对照组(NC)每组4个复孔,每孔加180uL基础培养基,阳性对照组每孔加180uL地塞米松(100ug/mL),实验组每个浓度4个复孔,每孔加180uL对应浓度样品,然后放回培养箱培养(37℃,5%CO2);1h后取出96孔板,调零孔、空白对照组(BC)每孔加20uL基础培养基,阴性对照组(NC)、阳性对照组(PC)和实验组每孔加20uL LPS(1ug/mL),然后放回培养行孵育。
5)细胞上清收集:给药24h后取出96孔板,分别收集各样品组对应的细胞上清液至离心管中,1000rpm离心10min,收集上清置于1.5mL离心管中,-20℃储存备用。
6)ELISA试剂盒测定细胞上清中TNF-α、IL-6浓度
测试前30min取出试剂盒及待测样品,放置于室温后使用,测试操作严格按照试剂盒说明书操作,测试结果见表13-15,图2-图3。
5.3云木香根提取物对Raw 264.7细胞抗炎功效测试结果
表13 云木香根提取物对Raw 264.7细胞活性的影响
表13结果显示,云木香根提取物浓度≤2.646×10-2μg/mL时,细胞活力>90%,以其作为最大安全浓度,在浓度≤2.646×10-2μg/mL下选取合适的浓度进行样品的细胞抗炎实验。
表14 云木香根提取物对Raw264.7细胞分泌TNF-α的影响
表14和图2结果显示:与空白对照组(BC)相比,LPS刺激(NC)后TNF-α浓度显著升高(###P<0.001),地塞米松(100μg/mL)可显著抑制TNF-α的分泌(***P<0.001),说明本次刺激条件有效;与NC相比,在5.292×10-2μg/mL浓度下,云木香根提取物均能显著降低细胞分泌的TNF-α浓度(*P<0.05),提示其可通过抑制炎症因子TNF-α的分泌从而达到抗炎舒缓的作用(图中BC为空白对照组,培养基中不添加脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS);NC为阴性对照组,培养基中添加LPS;PC为阳性对照组,培养基中添加LPS和地塞米松;样品组在培养基中添加LPS和样品)。
表15 云木香根提取物对Raw264.7细胞分泌IL-6的影响
表15和图3结果显示,与空白对照组(BC)相比,LPS刺激(NC)后IL-6浓度显著升高(###P<0.001),地塞米松(100μg/mL)可显著抑制IL-6的分泌(***P<0.001),说明本次刺激条件有效;与NC相比,在实验浓度下,云木香根提取物均对LPS致巨噬细胞Raw264.7细胞分泌的IL-6具有显著抑制作用(***P<0.001),提示其可通过抑制炎症因子IL-6的分泌从而达到抗炎舒缓的作用(图中BC为空白对照组,培养基中不添加LPS;NC为阴性对照组,培养基中添加LPS;PC为阳性对照组,培养基中添加LPS和地塞米松;实验组在培养基中添加LPS和样品)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种云木香根提取物的用途,其特征在于,用于制备用于控油的制剂或组合物,所述控油指减少皮脂腺细胞中的脂质含量和/或抑制中性脂质的分泌;所述云木香根提取物含有木香烃内酯,并且所述云木香根提取物是以云木香根为原料,经提取技术、大孔树脂纯化技术处理,制备得到云木香根提取物,其中,所述的云木香根提取物中木香烃内酯的含量为0.1%-5.0%,以云木香根提取物的干质量计;所述的提取技术包括步骤:
(S1)提供云木香根,将云木香根进行粉碎研磨得到云木香根粗粉;
(S2)称量云木香根粗粉和提取溶剂乙醇,在提取温度下云木香根粗粉经乙醇提取后,提取液滤去药渣,取滤液得到醇提后的滤液;
其中,步骤(S2)中所述提取溶剂乙醇为60v/v%-70v/v%乙醇;
步骤(S2)中云木香根粗粉和提取溶剂乙醇的质量比为1:20-30;
步骤(S2)中所述温度T为50℃-70℃。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述控油指抑制皮脂腺细胞分泌中性脂质。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的制剂或组合物用于抑制人皮脂腺细胞分泌脂质。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的制剂或组合物还用于抑制马拉色菌。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的制剂或组合物中,针对的马拉色菌的抑菌活性来自于所述云木香根提取物。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的制剂或组合物还包括药学上或化妆品上所能接受的辅料。
7.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的云木香根提取物用包括以下步骤的方法制备:
(S1)提供云木香根,将云木香根进行粉碎研磨得到云木香根粗粉;
(S2)称量云木香根粗粉和提取溶剂乙醇,在提取温度下云木香根粗粉经
乙醇提取后,提取液滤去药渣,得到醇提后的滤液;和步骤:
(S3)将醇提后的滤液减压抽滤,取滤液浓缩,得到云木香提取物浸膏;
其中,步骤(S2)中所述提取溶剂乙醇为60v/v%-70v/v%乙醇;
步骤(S2)中云木香根粗粉和提取溶剂乙醇的质量比为1:20-30;
步骤(S2)中所述温度T为50℃-70℃。
8.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述方法还包括步骤(S4):使用大孔树脂对云木香根提取物浸膏进行纯化。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,步骤(S4)所述纯化包括步骤:
(S4a)取云木香根提取物浸膏,上样于大孔树脂;
(S4b)首先使用纯化水对树脂进行水洗,从而去除水溶性杂质;
(S4c)随后使用乙醇对树脂进行醇洗,收集醇洗液,从而得到云木香根提取物;
任选地,所述的方法还包括步骤(S4d):将所述的云木香根提取物进行减压浓缩,浓缩后即得到云木香纯化浸膏。
10.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的制剂或组合物还用于抗炎。
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