KR102233232B1 - 암 검출을 위한 야누스 나노 입자, 이를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치 및 암 검출 방법 - Google Patents

암 검출을 위한 야누스 나노 입자, 이를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치 및 암 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엑소좀 검출용 렉틴 단백질이 결합된 야누스 나노 입자를 이용하여, 이를 포획하여 관측 할 수 있는 미세유체채널이 포함된 암 검출장치를 이용하여 암을 진단하는 방법에 관한 것으로, 엑소좀이 결합된 야누스 나노 입자에 작용기를 형성하여 효과적으로 포획함으로서 질병유래 엑소좀을 검량하여 암 진단 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

암 검출을 위한 야누스 나노 입자, 이를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치 및 암 검출 방법{JANUS NANOPARTICLES FOR CANCER DETECTION, DETECTION APPARATUS INCLUDING MICROFLUIDIC CHANNEL USING THE SAME, AND CANCER DETECTION METHOD}
본 발명은 암 검출을 위한 야누스 나노 입자, 이를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치 및 암 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 렉틴 단백질이 결합된 야누스 나노 입자에 엑소좀을 결합하여 미세유체채널을 포함하는 검출장치를 이용하여 암을 검출하는 야누스 나노 입자, 이를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치 및 암 검출 방법에 관한 것이다.
현대인의 생활습관의 변화에 따라 암의 발병률을 점차 높아지고 있다. 특히, 췌장암의 경우에는 약 27개의 암 종류 중에서 12번째로 발병률이 높은 암으로, 국내 기준으로는 매해 1000명 이상이 신규 환자로 등록되고 있으며 초기 자각 증상이 없어 조기 진단의 어려움으로 발병을 알아내지 못한 환자의 수까지 고려하면 그 수는 더욱 늘어날 것으로 예상된다. 현재는 의학의 발달로 대부분 암의 생존율을 50% 이상 높였지만, 췌장암의 경우 5년 생존율이 8% 미만으로 유일하게 한자리 수이다.
췌장암은 췌장의 장기 특성상 종래의 진단법인 초음파나 CT 촬영 등을 이용해도 관측이 어렵고, 기존의 화학요법 약물에 강한 내성을 가지고 있다. 또한, 경구 투여 및 정맥주사제와 같은 약물의 사용은 효율과 부작용에 대한 문제로 끊임 없이 논란을 가져오고 있으며, 더불어 췌장은 복잡한 혈관망, 신경구조를 가지고 있어 외과적인 수술을 통하여 일반조직으로 부터 암 조직만을 제거하기가 쉽지 않아 재발률이 높다. 이러한 특성상 조기 진단이 이루어지기가 쉽지 않아 췌장암의 치료가 점점 더 어려워지고 있는 실정이다,
최근 계속해서 췌장암에 대한 쉽고 빠른 진단을 위하여 종양표지 인자 및 종양유래 생체분자에 대한 다양한 연구가 시도되고 있으나, 암세포는 이형성(heterogeneity)으로 자라기 때문에 췌장암을 비롯한 암의 분자적 특징을 명확하게 규명하기는 어려우며, 아직까지 췌장암의 발병 유무를 정확히 분별 할 수 있는 표준화된 종양표지 인자가 없다. 다만, CA(carbohydrate antigen)19-9 라는 표지인자가 있어 치료 예후를 파악하는데 사용하고 있지만, 초기 진단 시 췌장암과의 발병 유무 상관관계를 완전히 규명하지 못했다.
췌장암의 조기 진단 필요성이 꾸준히 제기됨에 따라 최근에는 암 세포 유래 분비물(cell secretome)을 이용하여 췌장암을 진단하려는 연구가 이뤄지고 있으며, 대표적인 예로, 엑소좀(Exosome)이 있다. 엑소좀은 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체(membrane vesicle)로 엑소좀 안에는 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등과 같이 해당 세포의 특성과 정보를 지니는 물질이 포함되어 있는 것으로 알려져 있어 이를 이용한 암 진단 및 측정 개발에 대한 요구가 매우 높다.
본 발명의 일 목적은 검출 대상체로부터 수득된 엑소좀을 포획하기 위한 렉틴 단백질이 결합된 암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 화학적 조성물로 코팅된 검출장치를 이용하여 상기 야누스 나노 입자를 선택적으로 포획할 수 있는 상기 암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 검출을 위한 야누스 나노 입자 및 이를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치를 이용한 암 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 폴리스티렌으로 형성된 코어; 및 상기 코어의 적어도 일부분을 금속으로 덮고 있는 금속층을 포함하고, 상기 코어가 외부로 노출된 폴리스티렌 영역과, 금속층으로 덮혀있는 금속 영역으로 구분되고, 상기 폴리스티렌 영역 표면에 렉틴(Lectin) 단백질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 제공하는 것이다.
일 실시예에서, 상기 금속은 금(Au) 또는 크롬(Cr) 중 어느 하나일 수 있으며, 두 종류 전부일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 금속층의 두께는 10 내지 30 nm 일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 폴리스티렌 영역과 금속 영역의 표면적비는 2:3 내지 3:2 일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 렉틴 단백질은 콘카나발린 A(Concanavalin A), 삼부커스 니그라 응집소(Sambucus nigra agglutinin) 렉틴, 들주발버섯 렉틴(Aleuria aurantia lectin) 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9(carbohydrate antigen 19-9)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 렉틴 단백질은 폴리스티렌 영역 표면에 클릭 화학반응(click chemistry) 또는 가교 결합(cross-linking)에 의하여 결합된 것일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 렉틴 단백질은 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료의 엑소좀과 결합하는 것일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 금속 영역은 표면에 말레이미드(maleimide) 작용기를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 위한 야누스 나노 입자에 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료의 엑소좀이 결합된 야누스 나노 입자를 포함한 유체가 유입되는 제1 유입구; 엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 포함한 유체가 유입되는 제2 유입구; 및 상기 제1 유입구 및 제2 유입구에서 유입된 유체가 혼합되어 유동할 수 있는 미세유체채널을 포함하는 상부기판; 상기 상부기판과 연결되어 표면이 화학적으로 코팅 처리된 하부기판; 및 외부 유량 공급 전원 장치를 포함하는, 암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치를 제공하는 것이다.
일 실시예에서, 상기 상부기판에서 미세유체채널은 제1 유입구 및 제2 유입구에서 유입된 유체가 혼합되는 혼합부; 및 상기 혼합부와 연결되어 혼합부에서 혼합된 유체에서 암 발병을 판단하는 검출부를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검출부는 9개의 영역으로 구분될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 하부기판의 코팅 처리된 표면은 티올(Thiol) 작용기를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 야누스 나노 입자와 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료를 결합하여 엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 제조하는 단계; 상기 야누스 나노 입자에 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료의 엑소좀이 결합된 야누스 나노 입자를 포함한 유체가 유입되는 제1 유입구; 엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 포함한 유체가 유입되는 제2 유입구; 및 상기 제1 유입구 및 제2 유입구에서 유입된 유체가 혼합되어 유동할 수 있는 미세유체채널을 포함하는 상부기판; 상기 상부기판과 연결되어 표면이 화학적으로 코팅 처리된 하부기판; 및 외부 유량 공급 전원 장치를 포함하는, 암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치의 제1 유입구로 엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 주입하고, 제2 유입구로 엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 주입하는 단계; 상기 검출장치의 혼합부에서 제1 유입구로 주입된 엑소좀 결합 야누스 나노 입자에 제2 유입구로 주입된 엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 표지하여 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 제조하는 단계; 상기 검출장치에서 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 하부기판에 고정시키는 단계; 및 상기 검출장치의 검출부에서 하부기판에 고정된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 형광 현미경으로 관측하여 암의 발병 유무를 판단하는 단계를 포함하는, 야누스 나노 입자 및 검출장치를 이용한 암 검출 방법을 제공하는 것이다.
일 실시예에서, 상기 혼합부에서 결합된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 검출장치의 하부기판에 고정시키는 단계는 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 금속 영역 표면에 코팅된 말레이미드(maleimide) 작용기와 검출장치의 하부기판 표면에 코팅된 티올(Thiol) 작용기의 클릭 화학(click chemistry)반응을 통해 결합하여 검출장치의 하부기판에 고정될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 검출장치의 하부기판에 고정 시키는 단계는 1시간 내지 3시간일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검출장치의 상부기판에서 미세유체채널은 제1 유입구 및 제2 유입구에서 유입된 유체가 혼합되는 혼합부; 및 상기 혼합부와 연결되어 혼합부에서 혼합된 유체에서 암 발병을 판단하는 검출부를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검출장치의 검출부는 9개의 영역으로 구분될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검출장치의 하부기판의 코팅 처리된 표면은 티올(Thiol) 작용기를 가질 수 있다.
본 발명의 암 검출을 위한 야누스 나노 입자, 이를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치 및 상기 야누스 나노 입자 및 상기 검출장치를 이용한 암 검출 방법에 따르면, 렉틴 단백질이 결합된 야누스 나노 입자를 이용하여 선택적 엑소좀 결합하고, 이를 포획하는 미세유체채널 및 작용기를 갖는 하부기판을 포함하는 검출장치를 이용하여 암세포가 분비하는 엑소좀을 효과적으로 검측하고 정량화 할 수 있으므로 암 진단 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 검출장치의 미세유체채널의 도면 및 이의 배열로 구성된 검출장치를 나타내는 도면이다.
도 2는 미세유체채널을 제작하기 위한 주형틀을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 암 검출을 위한 야누스 나노 입자와 검출장치의 고정화를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 암의 발병 유무에 대해 지표화를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 1에 따라 제조되는 검출장치의 하부기판의 표면을 형성하는 과정을 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 1에 따라 제조된 검출장치의 코팅 처리된 하부기판을 나타내는 도면이다.
도 7은 검출장치의 코팅처리의 유무에 따른 야누스 입자의 표면 결합과 이의 형광 발현을 보여주는 도면이다.
도 8는 본 발명에 따른 화학적 구조를 이용하여 검출장치의 하부기판에 고정된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 형광 발현을 나타내는 도면이다.
도 9은 본 발명에 따른 화학적 구조를 이용하여 검출장치의 하부기판에 고정된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 형광 발현을 시간에 따라 나타낸 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 명세서에 개시된 엑소좀(exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질 및 RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것을 포함한다.
야누스 나노 입자
본 발명에 따른 야누스 나노 입자는 상기 입자의 표면의 일부분이 엑소좀을 포획할 수 있는 렉틴 단백질이 결합되어 있으며, 이를 이용하여 세포배양액 또는 환자유래 혈청으로부터 수득된 엑소좀을 포획하는 암 진단 또는 검출용 조성물이다.
본 발명에 따른 야누스 나노 입자는 폴리스티렌으로 형성된 코어 및 상기 코어의 표면상에 적어도 일부분을 금속으로 덮고 있는 금속층을 포함한다. 상기 금속층은 금속을 이용하여 증착시킨 층으로, 코어의 표면상에 연속적으로 덮고 있는 형태일 수 있다. 10 nm 내지 30 nm 로 형성될 수 있고, 바람직하게는, 20 nm 의 두께로 형성될 수 있다. 이때, 상기 금속층을 형성하는데 이용할 수 있는 금속은 이방성 금속일 수 있고, 금(Au) 또는 크롬(Cr) 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 금속층 형성에 의해, 상기 야누스 나노 입자는 코어가 외부로 노출된 폴리스티렌 영역과, 금속층으로 덮혀있는 금속 영역으로 구분된다. 상기 폴리스티렌 영역의 표면에는 렉틴 단백질이 결합되고, 상기 금속 영역은 표면에 말레이미드(maleimide) 작용기를 가질 수 있다.
먼저, 상기 야누스 나노 입자의 폴리스티렌 영역은, 상기 폴리스티렌 영역의 표면에는 렉틴 단백질이 결합될 수 있다. 상기 폴리스티렌 영역의 표면과 렉틴 단백질의 결합은 화학 또는 물리적 결합으로 결합될 수 있으며, 자세하게는, 화학반응(click chemistry) 또는 가교 결합(cross-linking)에 의하여 결합될 수 있다.
상기 렉틴 단백질은 콘카나발린 A(Concanavalin A), 삼부커스 니그라 응집소(Sambucus nigra agglutinin) 렉틴, 들주발버섯 렉틴(Aleuria aurantia lectin) 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9(carbohydrate antigen 19-9)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 일례로, 상기 렉틴은 딱총나무 및 버섯류로부터 분리할 수 있으며, 딱총나무 껍질(Sambucus nigra bark) 및 들주발버섯(Aleuria aurantia)에서 분리한 것이 바람직하다. 또한, 상기 렉틴은 시알릴루이스 (Sialyl Lewis), 푸코오즈(Fucose), 만노오즈 (Mannose) 당쇄에 특이적인 렉틴일 수 있으며, α2-6 시알산, α1-3 푸코오즈 특이적 렉틴일 수 있다.
또한, 상기 렉틴 단백질은 암 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료의 엑소좀과 결합할 수 있으며, 엑소좀의 표면 당쇄에 특이적으로 결합할 수 있는 바이오분자 또는 기타 화합물질 등을 포함할 수 있다.
상기 야누스 나노 입자의 금속 영역은, 상기 금속 영역의 표면에 말레이미드(maleimide) 작용기를 갖는 고분자가 코팅될 수 있고, 상기 말레이미드 작용기는 암 검출 장치 기판의 조성물과 반응하여 상기 야누스 나노 입자를 암 검출 장치의 기판에 고정할 수 있다. 상기 금속 영역의 표면에 말레이미드 작용기를 치환시킴으로서 상기 검출 장치의 특정 부분에서만 반응할 수 있도록 설계할 수 있다. 일례로, 상기 금속 영역에 부착된 말레이미드 작용기는 말레이미드 폴리에틸렌글리콜 아민(maleimide PEG amine) 및 N-하이드록시석신이미드 에스터 폴리에틸렌글리콜 티올(NHS ester PEG thiol) 화합물을 반응시켜 형성할 수 있다. 그러나, 일 실시예에서, 말레이미드 작용기 형성을 위해 이용하는 화학적 조성물은 상기와 같은 화합물에 국한되지 아니하며, 다른 조성물로 구성될 수 있다.
상기 야누스 나노 입자의 표면 전체 면적을 1로 할 때, 폴리스티렌 영역과 금속 영역의 표면적비는 2:3 내지 3:2 일 수 있으며, 바람직하게는, 폴리스티렌 영역과 금속 영역의 표면적비가 1:1일 수 있다. 상기 야누스 나노 입자의 표면 전체 면적 중 상기 폴리스티렌 영역이 40% 미만이고 상기 금속 영역이 60% 초과일 경우에는, 렉틴 단백질이 상기 폴리스티렌 영역 표면에 충분하게 결합될 수 없어 암 검출에 이용되는 엑소좀을 충분하게 포획하는 것이 어렵고, 상기 폴리스티렌 영역이 60% 초과이고 상기 금속 영역이 40% 미만일 경우에는, 암 검출장치의 하부 기판에 야누스 나노 입자를 고정시킬 수 있는 말레이미드 작용기의 효율이 감소하여 암 검출 시에 이용되는 상기 야누스 나노 입자의 확보가 어렵다.
이하에서, 본 발명의 "엑소좀 결합 야누스 나노 입자"는 엑소좀이 결합된 야누스 나노 입자를 의미하고, 본 발명의 "형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자"는 형광 염료가 표지된 엑소좀이 결합된 야누스 나노 입자를 의미한다.
미세유체채널을 포함하는 암 검출장치
도 1은 본 발명에 따른 검출장치의 미세유체채널의 도면 및 이의 배열로 구성된 검출장치를 나타내는 도면이다.
도 1를 참조하여, 본 발명의 미세유체채널을 포함하는 암 검출장치를 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치는 제1 유입구, 제2 유입구 및 상기 제1 유입구 및 제2 유입구에서 유입된 유체가 혼합되어 유동할 수 있는 미세유체채널을 포함하는 상부기판, 상기 상부기판과 연결되어 표면이 화학적으로 코팅 처리된 하부기판, 및 외부 유량 공급 전원 장치를 포함한다.
상기 검출장치의 제1 유입구는 본 발명에 따라 제조된 야누스 나노 입자에 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료의 엑소좀이 결합된 엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 포함하는 유체가 유입되고, 제2 유입구는 상기 제1 유입구로부터 유입된 유체에 존재하는 엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 포함하는 유체가 유입된다, 일례로, 상기 형광 염료는 CD63antibody-Alexa405 항체 형광염료일 수 있다.
상기 상부기판에서 미세유체채널은 제1 유입구 및 제2 유입구에서 각각 유입된 유체가 혼합되는 혼합부(Mixing area) 및 상기 혼합부와 연결되어 혼합부에서 혼합된 유체에서 암 발병을 판단하는 검출부(Detection area)를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 혼합부는 10 mm 길이로 설계될 수 있으며, 상기 검출부는 11.4 mm의 길이로 설계될 수 있다.
상기 혼합부(Mixing area) 입구에서 제1 유입구 및 제2 유입구에서 각각 유입된 유체가 만나 상기 혼합부(Mixing area)로 같이 유동하고, 상기 혼합부(Mixing area)에 존재하는 미세유체채널의 형상은 지그재그 방향으로 형성되어 혼합부(Mixing area)에서 유동하는 유체들이 서로 섞여 반응하게 된다. 일 실시예에서, 제1 유입구에서 유입된 엑소좀 결합 야누스 나노 입자에 제2 유입구에서 유입된 형광 염료로 인하여 상기 엑소좀에 형광 표지가 될 수 있다. 상기 혼합부(Mixing area)에서 일정한 유동으로 흐르는 유체들은 약 1시간 뒤에 상기와 같이 결합된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 형성하여 미세유체채널내의 검출부(Detection area)로 유입하게 된다.
도 3은 본 발명에 따른 암 검출을 위한 야누스 나노 입자와 검출장치의 고정화를 나타내는 도면이다.
도 3을 참조하여, 상기 검출부로 유입된 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 고정화를 상세히 설명한다.
상기 검출부(Detection area)는 유입된 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자가 9개의 영역으로 구분된 검출부(Detection area) 영역으로 유입되면서 검출장치의 하부기판에 고정화된다. 상기 고정화는 검출장치의 하부기판의 표면에 존재하는 티올(Thiol) 작용기와 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 말레이미드 작용기가 클릭 화학반응(click chemistry)을 통하여 서로 결합하여 이루어진다.
자세하게는, 상기 하부기판의 표면에는 조성물로 화학적 코팅 처리가 되어 있어, 하부기판의 코팅 처리된 표면은 티올(Thiol) 작용기를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 하부기판의 표면의 코팅에 사용하는 조성물은 티올 작용기를 갖는 3- 메르캅토프로필트리메톡시실란(3-mercaptopropyltrimethoxysilane)을 사용할 수 있다.
상기 검출장치는 유출구를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 검출부에서 반응하지 못한 시료들은 출입구로 나오게 되고, 상기 검출부에 고정화된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 현광 현미경으로 관측 및 분석하여 암을 검출할 수 있다.
암 검출 방법
본 발병의 암 검출 방법은 본 발명에 따른 암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치와 본 발명에 따른 암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 이용하여 상기 야누스 나노 입자 및 상기 검출장치를 이용한 암 검출 방법이다.
먼저, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 야누스 나노 입자와 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료를 결합하여 엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 제조하는 단계를 포함한다. 자세하게는, 상기 생물학적 시료를 상기 야누스 나노 입자와 접촉시켜 엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 제조하고, 상기 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료는 배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는, 배양액, 혈액 또는 혈청 인 것이 바람직하다.
이후에, 상기 암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치의 제1 유입구로 엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 포함하는 유체를 주입하고, 제2 유입구로 엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 포함하는 유체를 주입하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 형광 염료는 CD63 항체-알렉사405(CD63antibody-Alexa405) 항체 형광 염료일 수 있다.
상기 제1 유입구 및 제2 유입구에서 각각 유입된 유체들은 상기 검출장치의 혼합부 입구에서 만나 상기 혼합부로 같이 유동하고, 상기 혼합부의 지그재그 형태로 형성된 미세유체채널에 의하여 유동하는 유체들이 서로 섞여 반응하게 된다. 일 실시예에서, 상기 반응 시간은 30분 내지 90분 일 수 있고, 바람직하게는 60분일 수 있다. 상기 반응 시간이 90을 초과하는 경우에는, 상기 반응의 효율을 감소시킨다. 자세하게는, 엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 엑소좀에 형광 표지 부착 효율이 감소되는 문제점이 발생할 수 있다.
이와 같이, 상기 검출장치의 혼합부에서 제1 유입구로 주입된 엑소좀 결합 야누스 나노 입자에 제2 유입구로 주입된 엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 표지하여 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 제조하는 단계를 포함한다.
그 다음에, 상기 검출장치에서 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 하부기판에 고정시키는 단계를 포함한다. 자세하게는, 상기 혼합부에서 형성된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자는 상부기판의 미세유체채널 검출부로 유입하게 되고, 9개의 영역으로 구분된 검출부 각 영역에서 유동하는 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 금속 영역에 치환되어 있는 말레이미드 작용기와 검출장치의 하부기판 표면에 존재하는 티올(Thiol) 작용기가 반응하며 서로 결합하게 된다. 이와 같은 결합을 통해 검출 장치의 하부기판에 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자가 고정화된다.
이 때, 고정화는 말레이미드 작용기와 티올 작용기의 클릭 화학반응(click chemistry)을 통하여 반응을 통해 이루어 질 수 있고, 클릭 화학반응은 pH를 통해 조절할 수 있다. 바람직하게는, 클릭 화학반응이 수행되는 pH는 6.5 내지 7.5 일 수 있다.
상기 검출장치에서 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 하부기판에 고정시키는 단계의 반응 시간은 1시간 내지 3시간일 수 있고, 상기 반응 시간이 1시간 미만일 경우, 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자가 하부기판에 충분하게 고정이 될 수 없으며, 반응 시간이 3시간을 초과하는 경우, 오히려 상기 하부기판으로부터 형광-엑소좀 야누스 나노 입자가 분리되는 문제점이 발생할 수 있다.
고정화되지 못한 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자 유체는 검출장치의 유출구로 빠져나가게 되며, 상기 검출장치의 검출부에서 하부기판에 고정된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 형광 현미경으로 관측하여 암의 발병 유무를 판단하는 단계를 포함한다.
검출부에 고정화된 시료는 형광 현미경 관측을 통해 엑소좀에 표지되어 있는 형광 염료를 관측하고 형광이미지 분석을 통해 관측된 형광의 세기를 수치와 하여 나타낼 수 있다. 또한, 9개의 검출부 영역의 형광 세기에 대한 평균 또는 총합을 비교하여 암의 발병 유무에 대해 지표화 할 수 있다.
도 4는 암의 발병 유무에 대해 지표화를 나타내는 도면이다. 도 4를 참조하면, 상기 암의 발병 유무에 대한 지표화를 확인할 수 있다.
일례로, 췌장암 유래 엑소좀이 야누스 입자의 푸코오즈(fucose) 또는 시알산(sialic acid) 반응성 렉틴에 많이 결합되어 있을수록 형광 세기는 강해지므로 시료별 상대적 형광세기 비교를 통해 암의 유무를 판별 할 수 있다. 또한, 엑소좀과 결합하게 되는 야누스 나노 입자 표면 위 렉틴 단백질의 당 특이적 친화도 특성과 엑소좀의 종류에 따라 달라지는 표면 당 마커의 차이에 의해 렉틴과 엑소좀의 선택적 결합이 이뤄지고 엑소좀 결합률에 따른 형광발현 정도의 차이를 확인함으로써 암 발병 여부를 판발 할 수 있다.
본 발명에 따라 검출할 수 있는 암은 유방암, 갑상선암, 위암, 췌장암 및 담도암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
실시예 1: 검출장치의 코팅 처리된 하부기판
도 5는 실시예 1에 따라 제조되는 검출장치의 하부기판의 표면을 형성하는 과정을 나타내는 도면이다.
도 5를 참조하여, 본 발명에 따른 실시예 1을 상세히 설명한다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 검출장치의 하부기판으로 슬라이드 글라스(Slide glass)를 준비하였다. 준비된 슬라이드 글라스를 산소 플라즈마에 노출시켜 표면의 수산화(Hydroxylation) 과정을 통해, 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-Aminoprpyltriethoxysilane, APTES)을 이용하여 상기 슬라이드 글라스 표면에 아민(amine) 작용기를 형성 시키고,O-(3-카르복시프로필)-O′-[2-(3-머캅토프로피오닐아미노)에틸]-폴리에틸렌 글리콜(O-(3-Carboxypropyl)-O′-[2-(3-mercaptopropionylamino)ethyl]-polyethylene glycol)을 상기 슬라이드 글라스 표면의 아민(amine) 작용기와 EDC/NHS 가교 (EDC/NHS cross linking) 반응을 통해 결합시켜 최종적으로 슬라이드 글라스 표면상에 티올(thiol) 작용기를 형성시킨 검출장치의 코팅 처리된 하부기판을 얻었다.
도 6은 실시예 1에 따라 제조된 검출장치의 코팅처리된 하부기판을 나타내는 도면이다.
하부기판의 코팅 유무에 따른 야누스 나노 입자의 고정화 분석
도 7은 검출장치의 코팅처리의 유무에 따른 야누스 입자의 표면 결합과 이의 형광 발현을 보여주는 도면이다. 도 7에서 보는 것처럼, 티올 작용기가 하부 기판에 코팅되어 있을 경우, 화학적 코팅이 이루어진 검출부에서 엑소좀이 결합된 야누스 나노 입자가 고정되면서 형광 발현을 확인할 수 있었다.
야누스 나노 입자와 하부기판의 표면 고정 분석 평가
검출장치의 하부기판으로 유리기판을 이용하고, 본 발명에 따라 제조된 형광-엑소좀 결합 야누스 입자의 금속 영역과 상기 유리기판의 표면에 3- 메르캅토프로필트리메톡시실란(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane, 3MTS), 설포-에스엠씨씨(sulfo-SMCC, sulfosuccinimidyl 4-(N- maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate를 의미함), sulfo-SMCC) 또는 6-말레이미도헥사노익 애시드 N-하이드록시석신이미드 에스터(6-Maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester)를 코팅하여 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 입자의 금속 영역의 표면에 있는 말레이미드(maleimide) 작용기와, 상기 유리기판 상의 표면에 형성된 티올(thiol) 작용기를 말레이미드-티올 클릭 화학(maleimide-thiol cilck chemistry) 반응을 유도시켜 상기 유리기판위에 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 입자를 고정화시켰다. 그 다음에, 형광 현미경(IF.2453-PLPHF, euromex, 네덜란드)을 통해 관측하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타낸다.
도 8는 본 발명에 따른 화학적 구조를 이용하여 검출장치의 하부기판에 고정된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 형광 발현을 나타내는 도면이다.
도 8를 참조하면, 하부기판에 고정된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자는 녹색 또는 붉은색의 형광 발현을 나타낸다.
도 9은 본 발명에 따른 화학적 구조를 이용하여 검출장치의 하부기판에 고정된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 형광 발현을 시간에 따라 나타낸 도면이다.
도 9을 참조하면, 시간에 따른 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 고정화 정도를 확인할 수 있고, 자세하게는, 고정화된 시간이 증가할수록 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 녹색의 형광 발현이 더욱 뚜렷하게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

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  13. 폴리스티렌으로 형성된 코어; 및 상기 코어의 적어도 일부분을 금속으로 덮고 있는 금속층을 포함하고, 상기 코어가 외부로 노출된 폴리스티렌 영역과, 금속층으로 덮혀있는 금속 영역으로 구분되고, 상기 폴리스티렌 영역 표면에 렉틴(Lectin) 단백질이 결합되어 있는 야누스 나노 입자와 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료를 결합하여 엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 제조하는 단계;
    상기 야누스 나노 입자에 검출 대상체로부터 수득된 생물학적 시료의 엑소좀이 결합된 야누스 나노 입자를 포함한 유체가 유입되는 제1 유입구;
    엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 포함한 유체가 유입되는 제2 유입구; 및
    상기 제1 유입구 및 제2 유입구에서 유입된 유체가 혼합되어 유동할 수 있는 미세유체채널을 포함하는 상부기판;
    상기 상부기판과 연결되어 표면이 화학적으로 코팅 처리된 하부기판; 및
    외부 유량 공급 전원 장치를 포함하는,
    암 검출을 위한 야누스 나노 입자를 이용한 미세유체채널을 포함하는 검출장치의 제1 유입구로 엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 주입하고, 제2 유입구로 엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 주입하는 단계;
    상기 검출장치의 혼합부에서 제1 유입구로 주입된 엑소좀 결합 야누스 나노 입자에 제2 유입구로 주입된 엑소좀을 형광 표지할 수 있는 형광 염료를 표지하여 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 제조하는 단계;
    상기 검출장치에서 상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 하부기판에 고정시키는 단계; 및
    상기 검출장치의 검출부에서 하부기판에 고정된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 형광 현미경으로 관측하여 암의 발병 유무를 판단하는 단계를 포함하는,
    야누스 나노 입자 및 검출장치를 이용한 암 검출 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 혼합부에서 결합된 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 검출장치의 하부기판에 고정시키는 단계는 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자의 금속 영역 표면에 코팅된 말레이미드(maleimide) 작용기와 검출장치의 하부기판 표면에 코팅된 티올(Thiol) 작용기의 클릭 화학(click chemistry)반응을 통해 결합하여 검출장치의 하부기판에 고정되는 것을 특징으로 하는,
    야누스 나노 입자 및 검출장치를 이용한 암 검출 방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 형광-엑소좀 결합 야누스 나노 입자를 검출장치의 하부기판에 고정 시키는 단계는 1시간 내지 3시간인 것을 특징으로 하는,
    야누스 나노 입자 및 검출장치를 이용한 암 검출 방법.
  16. 제 13항에 있어서,
    상기 검출장치의 상부기판에서 미세유체채널은 제1 유입구 및 제2 유입구에서 유입된 유체가 혼합되는 혼합부; 및
    상기 혼합부와 연결되어 혼합부에서 혼합된 유체에서 암 발병을 판단하는 검출부를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    야누스 나노 입자 및 검출장치를 이용한 암 검출 방법.
  17. 제 13항에 있어서,
    상기 검출장치의 검출부는 9개의 영역으로 구분되는 것을 특징으로 하는,
    야누스 나노 입자 및 검출장치를 이용한 암 검출 방법.
  18. 제 13항에 있어서,
    상기 검출장치의 하부기판의 코팅 처리된 표면은 티올(Thiol) 작용기를 갖는 것을 특징으로 하는,
    야누스 나노 입자 및 검출장치를 이용한 암 검출 방법.
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