KR102231386B1 - 생물촉매성 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산업 및 다른 용도에서 단백질들과 단백질-유형 화합물들을 보호하는 수단 및 방법들에 관계된다. 특히, 본 발명은 보호 물질에 매립된 고정 운반체 표면에 고정된 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 이러한 조성물을 생산하는 방법 및 이의 용도 예를 들면, 치료 용도에 관계한다. 특히, 다양한 유형의 스트레스들에 대항하는 저항이 증가된 생물촉매성 조성물을 만들기 위하여 운반체의 표면에 효소들을 고정시키고 보호하기 위하여 이 시스템을 이용할 수 있다.

Description

생물촉매성 조성물{BIOCATALYTICAL COMPOSITION}

본 발명은 단백질들과 단백질 유형 화합물들의 보호에 관계한다. 더 구체적으로, 본 발명은 불리한 조건하에서 단백질들과 단백질 유형 화합물들의 보호를 허용하는 방법들과 조성물들에 관계한다.

단백질들과 단백질-유형 화합물들, 예를 들면 효소들은 이를 테면, 산업 용도에서, 치료용 진단제에서 빈번하게 요구된다.

이들 용도에서, 이를 테면, 효소가 이용되는 조건은 효소의 활성이 최대인 상태일 것이라고 확증할 수는 없다. 오히려, 실제 조건은 이를 테면, 온도, 오염물질들의 존재, 용매들에 있어서 최적 조건으로부터 상당히 벗어나는 것으로 예상된다. 따라서, 빈번하게, 상기 단백질들과 단백질-유형 화합물들은 사용시 또는 사용하기 전, 예를 들면 보관 동안 실질적인 스트레스를 받게된다. 이것은 이들 활성 또는 용도에 불리하게 영향을 줄 수 있는데, 특히 단백질들 또는 단백질-유형 화합물들은 흔히 고가이며, 따라서, 활성 물질 또는 활성의 상실은 비용이 상당히 증가되는 원인이 된다.

다양한 유형의 스트레스에 대하여 저항이 증가된 생물촉매성(biocatalytical) 조성물을 만들기 위하여, 운반체의 표면에 효소들을 고정시키기 전, 보호 물질 층으로 이들을 보호하는 것이 제안되었었다.

이점에 있어서, 산업 용도에 고정된 효소들의 사용으로 이들의 제거가 보증되며, 결과적으로 반응기의 기획 및 반응기 제어가 단순화된다(C. Mateo et al.). 많은 효소 고정 및 보호 방법들이 개발되어 왔었다(D. Brady and J. Jordaan). 이들 방법은 장점들, 예를 들면 고정된 효소의 재사용 가능성, 기계적인 스트레스 (기포), 화학적 스트레스 (pH 변화, 무질서 물질들) 및 생물학적 스트레스 (단백질분해효소)로부터 보호를 제공하지만, 그러나 지지대로부터 효소 누출, 단백질 3차/활성 구조의 상실, 기질 확산 (R.C. Rodrigues et al.) 그리고 다공성 물질 (이를 테면, 세파비드(sephabeads))의 경우 운반체의 막힘(clogging)과 같은 단점도 있다. 더욱이, 상기 효소가 지지대에 고정되도록 하기 위하여, 상기 효소는 가끔 유전적으로 변형된다 (H. R. Luckarift et al.).

Hanefeld et al.,는 효소 고정의 이해에 관한 보고서를 발표하였다. 이 작업은 상기 효소 (이를 테면, 크기, 안정성, 첨가제의 요구) 그리고 운반체 (화학적 그리고 기계적인 안정성, 다공성) 특징들의 중요성, 뿐만 아니라 반응 인자들, 예를 들면 몇 가지 말하자면, 확산 제한 및 효소 저해의 중요성에 집중된다(U. Hanefeld et al.).

Hartmann 및 Jung는 다공성물질 지지대상에 효소들의 고정으로 어떻게 이들의 작동 안정성을 강화시키고, 연속적인 공정들을 위한 이들의 재사용을 어떻게 가능하게 하는지를 보고하였다. Hilterhaus et al.,는 몇 가지 효소들 (엔도글루카네이즈, 데카르복실라제 및 리파제)을 세파비드(Sepabeads) 지지대에 고정 및 기포 기둥 반응기 뿐만 아니라 교반된 탱크 반응기에서 반복 사용의 장점을 보고하였다.

2005년 Naik et al.,는 생물규화작용(biosilicification)에 의한 효소 고정 방법의 특허 출원을 하였다. 상기 저자들은 상기 고정은 상기 효소, 규소 전구물질(precursor), 그리고 실라핀(silaffin) 펩티드를 혼합시켜 일어나고; 그리고 생성된 물질은 개선된 일시적 안정성을 가진 효소 활성을 유지시킨다고 설명하였다.

최근, Werchant는 고정된 효소의 준비를 설명하는 방법에 관한 특허를 제출하였다. 상기 시스템은 효소, 폴리머, 및 가교링커를 포함하는 네트워크로 구성된다. 상기 공유적으로 고정된 효소 시스템은 대기 조건에서 건조되고, 보관될 때 안정적인 활성을 유지시킨다 (S.A. Werchant).

US No. 2012 0 149 082 A1은 락카제(laccase), 리파제, 단백질분해효소, 에스테라제, 옥시니트릴라제, 니트릴라제, 아미노아실라제, 페니실린 아실라제, 리아제, 산화효소 그리고 환원효소의 고정을 위하여 특히, 가교연계된 효소-규소 응집물들의 합성을 설명한다. 상기 복합체는 용매 안에 상기 효소를 넣고, 상기 효소를 침전시키고, 그리고 알콕시실란을 추가하며, 물질, 예를 들면 글루타알데히드를 가교시킴으로써 준비된다.

Ostaszewski는 시아누르산 염화물에 의해 활성화된 아미노프로필-실란화된 규소 겔 상에 레보스태틴 에스테라제 효소를 고정시키는 방법에 관한 특허를 제출하였다.

US 7 642 077 B2는 유기 주형 분자 즉, 다시말해 폴리아민 또는 폴리펩티드의 작용을 통하여 규소 및/또는 유기 실리케이트 용액의 공-침전에 의해 효소 또는 세포 고정을 위한 또다른 방법을 공개한다.

Chung et al.,는 표적 항원 및 항원-특이적 2차 항체 각각의 고정을 위하여 자석 극미립자와 토실-기능화된 자석 규소 나노입자들을 이용하여 카스캐이드 효소-연계된 면역흡착 분석을 위한 특허를 제출하였다(S. J. Chung et al.).

다공성물질-규소 결합 히스티딘-테그된 단백질의 용도가 US 2010/0264188A1에서 제시되었다. 메소포러스(mesopours)-규소는 Fe 흡착에 의해 처음으로 만들어진 자석이며, 그리고 히스티딘으로 라벨된 특이적 단백질/효소의 결합이 가능하도록 Ni로 피복된다.

Auger et al.,는 표적 분자에 이온 및/또는 수소 비-공유 결합들을 마련하는 기들에 의해 기능화된 다공성 규소 나노입자들 (30-40 nm) 내부에 생물학적 거대분자들 (최소한 한 가지 단백질 또는 핵산)의 혼입을 위한 방법들을 공개하였다 (J.H. Chang et al., A. Auger et al.).

WO2011 06 0129 A1에서는 열적으로 반응성 폴리머 쉘(shell) 안에서 효소들을 공유적으로 고정시키고, 보호하기 위한 방법이 공개된다. 효소의 공유적 그라프팅(grafting)(이를 테면, 비닐 기 부착)은 상기 단백질이 상기 폴리머에 공유적 결합을 허용한다. 상기 폴리머 쉘은 최소한 한 가지 열반응성 폴리머, 예를 들면, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(이소프로필-N-비닐피롤리돈), 및/또는 N-이소프로필아크릴아미드, 및/또는 폴리스티렌 폴리머를 포함한다. 상기 포집화된(encapsulated) 효소는 30 ℃ 이상의 더 높은 온도에서 안정적이며, 화학적 개선, 약물 운반, 상처 치유 및 단백질 요법에 이용될 수 있다 (A. Auger et al.).

최근, Lant는 지질 에스테라제가 함유된 보호된 입자가 포함된 수성 용액으로 직물을 처리하는 방법에 관한 특허를 제출하였다. 더욱 상세하게, 보호된 입자들의 중심은 상기 효소와 기질을 포함하며, 기질을 또한 함유할 수 있는 지연-방출 피복 층들 (폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올 또는 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스를 포함)에 둘러싸여 있다. (N. J. Lant et al.).

상기 효소 보호 이외에, 기능성 단백질 마이크로어래이(microarrays) 및 바이오센서의 작제가 포함된 지지대 상에 단백질을 고정시키는 많은 중요한 적용은 상당히 중요한 것을 얻었다 (L.S. Wong et al.).

WO 2012/142625A2는 살아있는 표적 조직, 바람직하게는 종양 조직에 물질을 운반하기 위하여 이용될 수 있는 "나노입자-디바이스(nanoparticle-device)"의 제작 방법을 공개한다. 나노입자 디바이스는 내층 및 외층으로 만들어진 쉘 구조를 포함한다. 상기 내층은 운반가능한 물질을 함유하고, 구멍들을 가지고 있으며; 상기 외층은 다공성 물질에 의해 만들어지며, 상기 구멍들을 봉쇄한다. 조절된 조건에서, 상기 외층은 분해되며, 상기 나노입자-디바이스 안에 함유된 물질의 운반이 허용된다 (L.S. Wong et al.).

β-갈락토시다제는 β-갈락토사이드가 단당류가 되는 가수분해 반응을 촉매하는 효소 (가수분해효소)이다. 예를 들면, 이것은 락토오스가 포도당과 갈락토오스로 가수분해되도록 한다.

낙농업에서 β-갈락토시다제의 엄청난 중요성으로 인하여, 이의 고정(immobilization) 대하여 방대하게 연구되었으며, 상이한 전략들이 개발되어 왔었다(S. C. Esener et al.).

이미 1981년에 고체 지지대 상에 락타제의 고정에 관한 특허가 Sumitomo Chemical Company (EP 0 026 672 A2)에 의해 제출되었다. 이 문헌은 거대다공성 양쪽성 페놀-포름알데히드 유형 이온-교환 수지 상에 활성 락타제를 고정시키는 방법을 공개한다 (Q. Husain).

1998년 Giacomini et al.는 K 락티스(K.lactis)로부터 β-갈락토시다제를 상이한 2개의 다공성 지지대: 유기 운반체 실란-피복된 (CPC-규소) 및 아가로즈 상에 공유적 고정에 관하여 보고하였다(C. Giacomini et al.). CPC-규소는 글루타알데히드로 활성화되었고, 한편 아가로즈는 시아닐화(cyanylating) 물질을 통하여 활성화되었다. 다른 지지대와 비교하였을 때, 활성화된 CPC-규소에 더 많은 양의 β-갈락토시다제가 고정되었지만, 효소 활성의 단지 34% 만이 발현되었다. 상기 저자들은 이 결과는 고정 동안 효소의 비활성화가 발생되기 때문인 것으로 설명한다.

나중에, Tanriseven와 Dogan은 알긴산염과 젤라틴 섬유 상에 고정되고, 글루타알데히드로 경화된 아서퍼질러스 오리제(Asperigillus oryzae )의 β-갈락토시다제는 이의 초기 활성의 56 %가 유지되었다는 것을 보여주었다.

Mammarella 및 Rubiolo는 알긴산염-카라기난(carrageenan) 겔 비드에 클루베로미세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis )의 β-갈락토시다제 포집에 대하여 보고하였다. 카라기난의 존재는 상기 효소-촉매된 반응에 우호적인 영향을 가지는데, 그 이유는 상기 겔이 K⁺ 이온들 안에서 형성되는데, 이것이 상기 효소의 활성을 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 연속적인 반응들 동안 지지대로부터 관련 효소의 상당한 누출이 관찰되었다.

친수성 운반체들, 예를 들면 셀룰로오스, 아가로즈, 치토산, 덱스트란, 알긴산염, 젤라틴, 및 콜라겐은 상당한 활성을 유지하는 고정된-효소 지지대로 이용되어 왔었다 (E.J. Mammarella and A.C. Rubiolo, S. Rejikumar and S. Devi). 그러나, 이들 물질은 고정된 효소 적용에 항상 적합한 것은 아닌데, 그 이유는 가동 조건하에 또는 미생물 유기체의 존재하에 팽창 및/또는 분해될 수 있기 때문이다.

글루타알데히드와 가교-연계된 섬유성 폴리머 물질은 효소 고정을 위하여 또한 이용되어 왔지만, 이들의 이용은 낮은 고정 효과 및 작은 효소 활성으로 특징화된다. 갈락토-올리고사카라이드 (GOS)를 만들기 위하여, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae)의 β-갈락토시다제는 토실 염화물로 변형된 면 천위에 공유적으로 고정되었다 (N. Albayrak and S.T. Yang). 상기 저자들은 상기 고정된 효소가 50 ℃에서 50일의 반감기를 가지고, 40 ℃에서는 1년 이상의 반감기를 가진다고 보고하였다. 상기 면 섬유를 준비하는 과정은 지루하며, 유기 화학물의 사용이 관련되어 있다. 이러한 단점들을 극복하기 위하여, 폴리에틸렌이민으로 면을 변형시키는 새로운 전략이 개발되었다 (N. Albayrak and S. T. Yang). 이 기술의 주요 단점은 대규모 생산이 여전히 어렵다는 점이다.

Mateo et al.은 상이한 지지대: 에폭시-보로네이트 수지 (Eupergit), 글리옥실-아가로즈, 글루타알데히드-아가로즈 그리고 글루타알데히드-Eupergit 상에 고정된 K. 락티스(K. lactis)의 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 일반적으로, 고정된 효소의 활성은 유리(free) 효소보다 10 % 더 높다. 그럼에도 불구하고, 에폭시드 활성화된 지지대들은 지지대 상에서 상기 효소가 흡착되도록 흡착기로 표면 변형을 요구하는 주요 제약을 제기한다. 이들 상호작용은 촉매의 구조를 변경시킬 수 있고, 효소 특징 및 수행에 변화를 야기할 수 있다.

2000년 Ladero et al.는 APTES로 실란화되고, 글루타알데히드로 변형된 시판되는 규소-알루미나 지지대 상에 공유적으로 고정된 K.프라길리스(K. fragilis)의 β-갈락토시다제에 의한 락토오스 가수분해를 설명한다. 상기 고정된 효소는 유리 효소보다 50% 낮은 촉매 활성을 제시하였다. 추가적으로, 상기 활성은 우유 처리에 적합하지 않는 5℃ 내지 40 ℃ 사이의 온도 범위 안에서 제한되었다.

2007년 Betancor et al.는 실리콘 지지대에 부착된 대장균(E. coli )의 포획된 β-갈락토시다제가 함유된 규소 미소구(nanospheres)의 3차원 네트워크를 만들기 위한 새로운 전략을 보고하였다. 상기 고정된 β-갈락토시다제는 24℃에서 10일 후에 안정적이었으며, 초기 활성의 80% 이상이 유지되었다. 이 방법은 비록 성공적이었지만, 이 방식은 여전히 지루한 준비 공정이 요구되는 주요 단점과 대규모 생산의 난점이 있다.

규산염 물질에 상기 효소 고정의 주요 단점들중 하나는 규소-겔의 낮은 다공성 또는 메소포어 채널 안에 분자/효소 패킹이며, 이로인하여 유리 효소들보다 더 낮은 촉매 활성이 초래된다(Y. Kuwahara et al).

A. 오리제(A oryzae )의 β-갈락토시다제는 락토오스의 가수분해를 위하여 렌즈-모양의 PVA (폴리비닐 알코올) 히드로겔 캡슐, (직경 3-4 mm, 두께 200-400 μm) 안에 포집되었다. 상기 효소는 이의 고유 활성의 겨우 32 %만 유지하였다. 추가적으로, 효소 고정 후, 이의 기질에 대한 β-갈락토시다제 친화력의 전반적 감소가 관찰되었다. 저자는 매트릭스와 상호작용후 상기 효소의 가능한 구조적 변화와 히드로겔을 통한 기질 확산의 가능한 제한를 통하여 이를 설명하였다(Z. Grosova et al.).

Neri et al.는 폴리비닐 알코올 (PVA)과 폴리실옥산 (POS)의 글루타알데히드 활성화된 자석 비드 안에 K. 락티스(K. lactis)의 β-갈락토시다제 포획을 보고하였다. 상기 고정된 효소는 20회 재사용 후에도 이의 초기 활성의 약 절반을 유지하였다. 그러나, 상기 고정된 효소의 촉매 효과는 고유 효소에서 발견되는 것과 비교하였을 때, 단지 12 %뿐이었다. 이러한 감소된 촉매 활성은 지지대에 의해 유도된 효소의 입체형태적 변화일 수도 있고, 또는 기질의 입체적 난점 또는 제한된 확산으로 인한 것일 수도 있다.

비록 이들 방법은 꽤 흥미롭고, 전망있지만, 이들의 주요 제한은 상기 효소들의 고정 부위의 결핍으로 인하여, 지지대로부터 촉매의 가능한 누출, 또는 이의 미세환경으로부터 상기 효소의 부정확한 3차원 배열들로 구성된다. 추가적으로, 이들 방법의 대부분은 고비용이라는 단점으로 인하여, 산업적-대규모 생산에 부적절하다.

US 2010 196 985 A1는 소수성 기능화된 폴리머 지지대, 즉 다시말해, 음식 포장 물질 (이를 테면, 폴리(에틸렌), 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리스티렌/아크릴산 코폴리머)에 락타제의 공유적 연계를 위한 방법을 공개한다. 이 발명은 효소 고정 기술의 일반적인 단점들, 예를 들면 촉매 누출, 운반체 안정성 및 비용등의 단점 극복을 허용하지만, 효소 재사용 가능성의 주요 제약이 있다.

더욱이, WO 2005/ 056808 A2에서 주형-유도된 규산염 침전에 의한 생물촉매의 고정이 공지되어 있다. 이 문헌에서는 생물복합재료(biocomposite)를 제안하는데, 하나 또는 그 이상의 생물촉매들과 규소 또는 유기 실리케이트들이 공동-침전된다.

EP 2 431 742 A1에서, 분자 인지 요소(Recognition Element)의 준비가 공지되어 있다. 운반체 물질의 표면에 결합시키고, 인지 물질의 중합화를 개시시키고, 중합화를 중단시키고, 그리고 중합화된 인지 물질로부터 주형을 방출시키는 것이 제안된다. 선호되는 중합화는 수성 조건하에 규소 전구물질, 예를 들면 트리-알콕시-실란과 테트라-알콕시-실란의 폴리-축합에 기초될 수 있다고 명시하고 있다.

WO 93/07263에는 효소-함유된 과립이 공지되어 있는데, 이 과립은 비닐 폴리머 또는 코폴리머로 피복된 수용성 또는 분산가능한 물질을 보유한 코어, 하나 또는 그 이상의 효소와 비닐 폴리머 또는 코폴리머가 포함된 효소 층, 그리고 비닐 폴리머 또는 코폴리머가 포함된 외층 피복을 포함한다.

US 6,268,329B12에는 효소-함유된 과립이 공지되어 있는데, 여기에서 실질적인 양의 수용성 피복을 가진 피복이 포함된 효소-함유된 코어가 제공된다. It는 세제(detergent) 조성물 안에 이 과립의 사용을 제안하였다.

S. BHATTACHARYYA et al.,에서는 "거대분자들의 조절된 방출을 위한 폴리머-피복된 다공성물질 규소 나노입자들"이 공지되어 있다. BHATTACHARYYA는 "모델 단백질(model protein)"로 이용된 트립신 저해제의 고정을 위하여 준비된 다공성물질 규소 미소구를 이용하고, 그 다음 트립신 저해제-적하된 운반체의 표면에 PEG-아민의 박층을 공유적으로 부착시키는 것을 제안하며, 상기 PEG는 3kDa의 분자량을 가지며, 대략 68개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다.

Yong-Qing Xia et al의 "중개물(intermedium) 기질로써 치토산을 이용하여 규소 입자들 상에 단백질 인지"에서 분자 각인(imprinting) 방법은 헤모글로빈의 특이적 인지 부위들을 가진 이중-피복된 규소 입자들을 준비하는 것으로 공지되어 있다. 키토산은 상 역전 공정을 통하여 규소 입자들 상에 피복되는 중개물로 이용되었으며, 풍부한 노출된 아민 기들은 알데히드 기의 도입을 위한 활성 부위들이다. 알데히드 기들과 이민 결합들을 형성함으로써 헤모글로빈이 공유적으로 고정된 후, 그 다음 아크릴아미드는 치토산-피복된 규소 입자들 상에서 중합화되어, 인지 부위들이 형성된다.

P. Galliker et al., " 라카제-변형된 규소 나노입자들은 페놀 화합물들의 변형을 효과적으로 촉매한다"에 따르면, 락카제-변형된 규소 나노입자들에 기초된 시스템은 화학물, 4,4'-이소프로필리덴디페놀 (비스페놀 A)을 교환시키는 주요 엔도크린을 분해시키는 능력에 대하여 테스트되었다. 이를 위하여, Stoeber 방법을 이용하여 나노-입자들이 만들어졌고, 주사 전자 현미경, 역동적 광 분산 및 δ-전위 측정을 이용하여 특징화되었다. 이들 입자의 표면에 1차 아민기들의 도입은 유기-실란 (아미노-프로필-트리에톡시­실란)을 이용하여 영향을 받았다. 이-작용기성 결합제로써 글루타알데히드를 이용하면 코리오롭시스 폴리조나(Coriolopsis polyzona)의 락타제가 나노입자들의 표면에 접합되는 것이 허용되며, 이는 결합된 단백질들의 양과, 생성된 나노입자들의 -전위를 측정함으로써 모니터된다. 이렇게 생산된 생물-접합체의 산화 활성은 방사능활성 라벨된 비스페놀 A를 이용하여 테스트되었다. 고정된 효소의 특이적 촉매 활성의 감소가 측정되었지만, 생물-접합체의 활성은 페놀 오염물질들의 변환에 있어서 이들 시스템의 적용과 필적할 수준이다.

A.-M. Chiorcea-Paquim et al.의 "제자리(in situ) 전기중합화된 중화 산화환원 매개체 옥시실란 졸-겔 포집화된 포도당 산화효소 전기화학적 바이오센서의 AFM 나노메터 표면 형태학적 연구"에서 4가지 상이한 규소 졸-겔 필름: 고배향성 열분해 흑연 (HOPG) 상에 어셈블리된 메틸트리메톡시실란 (MTMOS), 테트라에톡시실란 (TEOS), 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTOS) 및 3-글리시드옥시프로필-트리메톡시실란 (GOPMOS)은 포도당 바이오센서 개발에 이들의 용도로 인하여 원자력 현미경 (AFM)으로 특징화되었다. 옥시실란 전구물질의 화학적 구조와 졸-겔 혼합물의 조성물은 졸-겔 필름에서 포어(pores)의 조도(roughness), 크기 및 분포에 영향을 주는 것으로 언급되며, 이는 효소 포획과 관련된다. 표면에 작은 50 nm 직경의 포어의 매우 조밀하고 균질한 분포를 가지는 것으로 주장된 매끈한 지형으로 인하여 GOPMOS 졸-겔 필름은 상기 효소의 양호한 포획을 위하여 요구되는 모든 형태학적 특징들을 만족시키는 것으로 언급된다. APTOS 및 MTMOS 졸-겔 필름은 효소들의 누출이 허용되는 300-400nm의 큰 포어와 함께 작은 포어를 발달시키는 것으로 언급되며, TEOS 필름은 효소 고정에는 다소 부적합한, 전극상에 거칠고 불완전한 네트워크를 형성하는 것으로 보고된다. AFM 결과는 시간에 있어서 안정성, 민감성의 변이를 설명하고, 그리고 산화환원 매개체와 함께 상이한 옥시실란 졸-겔 포집화된 포도당 산화효소 바이오센서로 획득된 탐지를 제한한다는 것으로 언급된다.

따라서, 단백질 또는 효소를 비활성화 또는 변성시킬 수 있는 비우호적 영향에 대항하여 단백질들 또는 단백질-유형 화합물들, 특히 효소들을 보호하기 위한 경제적이며, 사용이 용이한 시스템을 제공하는 것이 필요하다. 더욱이, 단백질 또는 효소를 대규모 상업적 용도에 사용이 허용되며, 단백질 또는 효소의 재사용을 허용하는 보호 시스템이 특별히 요구된다.

이러한 요구는 독립항들의 특징에 의해 한정되는 조성물 및 방법에 의해 본 발명의 범위내에서 충족된다. 바람직한 구체예들이 본 명세서에 공개되며 및/또는 종송항들의 주제이기도 한다.

여기에서, 제안되는 것은 그 중에서도 조성물을 생산하는 방법이며, 상기 조성물은 최소한 고체 운반체, 단백질과 단백질-유형 화합물로부터 선택된 기능성 성분, 그리고 기능성 성분을 최소한 부분적으로 박아넣음으로써, 상기 기능성 성분을 보호하는 보호 층을 포함하며, 여기에서 상기 방법은 첫째로 최소한 한 가지 기능성 성분을 고체 운반체의 표면 상에 고정시키는 단계, 그 다음 기능성 성분을 최소한 부분적으로 박아넣음으로써, 상기 기능성 성분을 보호하는 보호 층은 빌딩 블록과 함께 구축되는 단계를 포함하며, 이때 빌딩 블록의 최소한 일부분은 서로 그리고 고정된 기능성 성분과 모두 상호작용할 수 있는 단량체다.

이 방법은 기능성 성분의 매우 양호한 보호를 허용한다. 본 발명에 따라 획득가능한 양호한 결과는 다음의 이유 때문인 것으로 보인다. 보호 층을 형성하는 단량체들은 서로 그리고 기능성 성분과 모두 상호작용할 수 있을 것이며; 단량체들 서로의 상호작용은 자가-어셈블리로 이어지며, 이러한 이유로 따라서 폴리머 구축 반응과 이러한 폴리머는 기능성 성분 주변에서 만들어지며, 추가적인 상호작용으로 인하여 기능성 성분 주변에 단량체들이 가까이 배열된다. 단량체들의 서로 상호작용은 반드시 기능성 성분과 단량체들의 상호작용과 동일한 종류의 상호작용일 필요가 없으며, 이러한 상호작용이 동시에 시작되거나 또는 동시에 두드러질 필요가 없음을 주지할 수 있을 것이다. 보호 층을 형성하는 단량체들은 보통 서로 상호작용하기에 앞서 기능성 성분과 상호작용할 것이며; 서로간의 상호작용은 기능성 성분 주변에 폴리머 형성으로 이어지는 단량체 서로간의 반응일 것이며, 폴리머가 형성되는 동안 동시에, 단량체들은 이들간의 추가 상호작용으로 인하여 기능성 성분들 주변 가까이 배열된다(또는 유지된다). 이러한 보호되어야 하는 기능성 성분 주변 빌딩 블록의 근접 배열은 긴 폴리머가 이용된다면 발생되지 않을 것인데, 그 이유는 이로 인하여 기능성 성분과 상호작용, 이를 테면, 비-공유 결합할 수 있는 각 작용기들이 올바른 위치에 있지 않을 것으로 예상되기 때문이다. 이로 인하여 본 발명에 따른 포획이 더 조여질 것이다. 포획이 조여진다면, 상기 기능성 성분은 더 잘 보호될 것인데, 이를 테면, 기능성 성분의 입체형태가 더 잘 유지될 것이기 때문이다.

매립(Embedding)이란 기능성 성분(최소한 상당 부분 또는 다량의 분획물)이 사용전까지, 바람직하게는 사용 종료까지 매립상태로 유지되어, 씻겨나가지 않게 하거나, 또는 의도된 사용 동안 씻겨나감이 발생되지 않는 것이다. 이로 인하여, 기능성 성분의 제거가 의도되지 않고, 그리고 제거를 피해야만 한다. 본 발명에 따르면, 사용 전, 각인된 물질을 방출시키는 인지층으로만 기능을 하는 층으로부터 씻겨나간 기능성 성분의 단순 각인을 유지시키는 것은 의도되지 않거나 충분하지 않다. 공지의 방출 인지 층들과 대조적으로, 본 발명의 보호층은 사용하는 동안 유지 전술한 기능성 성분을 유지시키는 기능성 성분 유지 보호 층으로 안주될 수 있다.

조밀한 포획은 유지에 도움이 된다. 이 내용에 있어서, 본 명세서에서 이용된 "조밀한(tight)"이란 공간적으로 밀접한 상관관계를 지칭하는데 이용될 뿐만 아니라, 기능성 성분의 활성은 조밀성 척도, 구체적으로 특정 조건하에서 오랜 사용 후에서 기능성 성분의 활성의 조밀성 척도로써 이용될 수 있다.

더욱이, 고정 및 이로 인하여 기능성 성분이 이미 표면상에 있는 이후, 매립 층이 구축되기 때문에, 기능성 성분 아래에 보호물질이 있을 필요는 없다. 이점이 공-침전과 극명하게 대조적인 것으로써, 공-침전(co-precipitation)의 경우 실질적인 양의 보호 물질이 기능성 성분 아래, 따라서 기능성 성분과 운반체 사이에 있을 것이다. 따라서, 보호 층의 구축이 좀더 정확하게 제어될 수 있고, 특이적 성질을 가진 층이 더 용이하게 획득된다.

선호되는 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 만들기 위하여 본 명세서에서 공개된 방법에 관계하며, 여기에서 다공성 나노-환경의 두께는 원하는 두께의 보호층을 획득하기 위하여 특정 시점에 보호 물질의 자가-어셈블리 반응을 중단시킴으로써 제어된다.

층의 두께는 좀더 정확하게 제어되어야 하는 특이적 성질들중에 하나이기 때문에, 다량의 기능성 성분들 (구성분들)이 표적 분자에 의해 도달되는 층 안에 너무 깊이 매립되는 것을 피할 수 있고, 이로 인하여 조성물 생산에 이용되는 기능성 성분들을 더 잘 이용할 수 있게 된다. 따라서 두께의 조절은 더 큰 효소 축의 크기를 가진 최종 보호층을 획득할 가능성을 제공한다. 이러한 층은 균질한 층이 될 것이며, 보호 층안에 있는 모든 효소는 동일한 방식으로 활성이 있다.

따라서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 보호 층의 표적 크기를 사전정의하는 것과 관련될 것이다. 표적 크기의 사전정의(predefining)는 표적 두께의 사전정의를 포함하며, 운반체 물질의 표면 상에 보호 물질의 중합화는 중합화된 보호 물질이 사전정의된 표적 두께에 기본적으로 대등한 두께에 도달될 때 중단된다. 중합화된 보호 물질의 두께를 조절함으로써, 고체 운반체의 표면에 고정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 매립된 보호층의 크기는 의도된 용도에 맞게 편리하게 조정 및 최적화될 수 있다.

구체적으로, 중합화된 보호 물질의 두께를 조절함으로써, 보호 층의 성장이 1 내지 100 nm, 1 nm 내지 50 nm, 1 nm 내지 30 nm, 1 nm 내지 25 nm, 1 nm 내지 20 nm, 1 nm 내지 15 nm, 바람직하게는 5 nm 내지 15 nm 범위로 조절 및 조정될 수 있다. 이 범위 안에서, 중합화된 보호 물질의 정확한 성장 수준은 1 내지 10 nm, 1 nm 내지 5 nm, 1 nm 내지 4 nm, 1 nm 내지 3 nm, 1 nm 내지 2 nm, 바람직하게는 1 nm 범위 안에 있을 수 있다. 상기 두께는 현미경, 예를 들면 주사 전자 현미경 (SEM), 투과 전자 현미경 (TEM), 주사식 탐침 현미경 (SPM) 또는 광 분산 방법들을 이용하여 점검될 수 있다. 예를 들면, 당분야에 공지되어 있는 바와 같이, SEM은 래스터(raster) 주사 패턴에서 전자의 고-에너지 빔으로 시료를 주사함으로써, 시료의 표면을 영상화시키는 전자 현미경 형태이다. 전자는 시료를 구성하는 원자들과 상호작용하여, 표면 형태(이를 테면, 중합화된 보호 물질의 형태), 조성물 및 다른 성질들, 예를 들면 전기적 전도성에 대한 정보를 포함하는 신호를 생성한다. 분석 목적으로 이러한 현미경 유형을 실시하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.

중합화된 보호 물질의 두께가 기본적으로 미리정의된 표적 두께와 대등해질 때, 운반체 물질의 표면 상에 보호물질의 중합화의 중지로 보호층의 크기의 정확한 제어가 허용된다. 이와 관련하여, 주어진 조간에서 시간-의존적 방식으로 중합되는 보호 물질의 두께에 있어서 보호층의 성장을 위하여 성장 역학(growth kinetic)이 사전에 결정될 수 있다. 이러한 결정 결과는 중합화된 보호 물질이 미리정의된 층 두께에 일단 도달되었을 때 중합화 반응을 중단시키는데 이용될 수 있다.

한 측면에서, 중합화된 보호 물질의 표적 두께의 사전정의는 주어진 반응 조건하에 중합화 반응을 위한 목표 기간을 사전 정의하는 것을 포함한다. 운반체 물질의 표면 상에 보호 물질의 중합화는 이들 조건하에서 실행되며, 운반체 물질의 표면 상에 보호 물질의 중합화가 사전정의된 목표 두께와 기본적으로 대등하다고 결정되는 사전정의된 시간에 중단된다. 이 내용에서 용어 "조건(conditions)"은 보호 물질의 성장을 결정하는 매개변수들과 관련된다. 특히, 이는 보호 물질에 이용되는 단량체 빌딩 블록의 (초기) 농도와 조성, 중합화 온도, 압력 및/또는 습도와 관련될 수 있다. "단량체들이 서로 간에 상호작용"에 대하여 언급될 때, 그리고 이러한 상호작용이 중합화 반응일 때, 단량체들의 상호작용은 또한 중합화 동안 획득되는 중간생성물질과 단량체들의 상호작용을 또한 포함하는 것으로 이해될 것이다.

상기 과정으로 중합화된 보호 물질의 두께를 정확하게 조절가능하며, 따라서 보호 층의 두께, 특히 보호 물질 안에 매립된 고정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물 주변의 보호층 두께를 정확하게 조절가능하다. 예를 들면, 자가-어셈블링된 보호 물질의 두께를 조절함으로써, 전술한 보호 물질 안에 매립된 고정된 효소의 활성은 선택적으로 조정될 수 있다. 이 내용에 있어서, 주어진 조건에서 중합화되는 보호물질의 중합화 기간이 계산되는 중합화 보호 물질의 성장 역학 및 자가-어셈블링된 보호 물질의 두께에 의존적인 효소 활성이 사전 결정될 수 있다. 이러한 결정 결과로써, 상기 층 두께에 의존적인 선호되는 효소 활성에 도달될 때, 중합화 반응이 중단될 수 있다. 예를 들면, 효소 활성과 스트레스에 대한 효소 저항 간에 균형이 최적에 도달되면 중합화가 중단될 수 있다.

본 발명의 방법을 위하여 100% 순수한, 이량체- 및 올리고머 유리 단량체 조성물 또는 혼합물을 반드시 이용할 필요는 없지만, 빌딩 블록들로 이용되는 단량체들의 백분율은 양호한 결과를 획득하기 위하여 일반적으로 매우 높아야 할 것임을 주지해야 한다. 많은 빌딩 블록이 단량체들의 형태로 있을 때, 즉, 빌딩 블록들의 더 높은 비율이 단량체들에 의해 구성될 때, 효소 또는 다른 고정된 기능성 성분 주변 단량체들의 우수한 그리고 정확한 자가-소팅(self-sorting)과 조직화가 개선되며, 매립 층의 생성된 보호 성능이 특히 효과적이게 되는 기회가 더 높아지게 된다. 이량체들 또는 올리고머들이 이용될 때, 상기 최종 보호 층은 상기 효소 주변을 덜 단단하게 싸게 될 것이고, 따라서 보호 기능의 효과가 덜 할 것으로 예상된다.

그러나, 상업적으로 이용가능한 단량체들은 통상 본 발명의 요구를 충족시킬 것이다. 빌딩 블록들의 80% 이상이 단량체들의 형태일 것이며, 그리고 전형적으로 95% 이상의 빌딩 블록이 단량체들의 형태로 있다는 것을 예상할 수 있다.

이용되는 단량체들이 고체 운반체의 표면과 더 상호작용할 수 있다면, 보호 층이 운반체에 마찬가지로 결합하는 것이 확실하기 때문에, 보호 층이 충분히 단단하지 않게 되는 것을 방지하는 것이 유익하다.

흔히, 고체 운반체의 표면 상에 기능성 성분을 고정시키기 전, 표면 상에 기능성 성분의 고정이 개선되도록 고체 운반체가 변형된다.

따라서, 추가 구체예에서 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 생산하기 위하여 본 명세서에서 공개된 바와 같은 방법에 관계하는데, 여기에서 본 명세서에서 공개된 바와 같이 전술한 고체 운반체의 표면이 변형되어 고정점(anchoring point)으로써 최소한 한 가지 분자를 도입시킨다. 고정점으로써 이용된 전술한 최소한 한 가지 분자는 이-작용기성 가교-링커를 가진 고정점으로써 최소한 한 가지 분자의 화학적 반응을 유도함으로써 더 변형될 수 있다. 특히, 전술한 고정점은 아민 모이어티이며; 더욱 구체적으로 아미노-실란, 더욱 구체적으로 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTES)이다. 본 명세서에서 공개된 바와 같이 관심대상의 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물 그리고, 임의선택적으로, 본 명세서에서 공개된 바와 같이 최소한 한 가지 선택적 분자는 이-작용기성 가교-링커의 유리 활성 작용기를 통하여 변형된 운반체의 표면에 결합된다. 특히, 전술한 이-작용기성 가교-링커는 글루타알데히드이다. 이-작용기성 가교-링커의 다른 예들은 디숙시니미딜 타르트레이트, 비스[술포숙시니미딜] 수베레이트, 에틸렌 글리콜비스(술포숙시니미딜숙시네이트), 디메틸 아디피미데이트, 디메틸 피멜이미데이트, 술포숙시니미딜 (4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠, 활성화된 술프히드릴 (이를 테면, 술프히드릴-반응성 2-피리딜디티오)이다.

특이적 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 만들기 위하여 본 명세서에서 공개된 바와 같은 방법에 관계하며, 여기에서 이중기능성 가교-링커의 유리 활성 작용기는 알데히드, 카르복실산, 이미도에스테르, 및/또는 아릴 할로겐화물이다.

또다른 특이적 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 생산하기 위하여 본 명세서에서 공개된 바와 같은 방법에 관계하며, 여기에서 본 명세서에서 공개된 바와 같이, 단백질 또는 단백질-유형 화합물, 구체적으로 상기 효소 또는 효소-유형 화합물은 고체 운반체의 표면에 공유적으로 결합된다.

따라서, 본 발명에 따른, 그리고 본 명세서에서 공개된 방법은 운반체 물질의 표면에 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 결합되기 전, 운반체 물질의 표면을 활성화시키는 추가 단계를 더 포함할 수 있고, 그리고 특이적 측면에서 이는 운반체 물질의 표면 상에 연계 수단을 균질하게 분포시킴으로써 달성될 수 있다.

이 점에 있어서, 연계 수단의 균질한 분포는 이들 사이에 대등한 또는 최소한 필적가능한 공간에 의해 운반체 물질의 표면에 결합된 연계 수단과 관련된다. 운반체 표면 상에 고정된 기능성 성분들이 방해되지 않거나 또는 그렇지 않으면 서로 간섭되지 않을 때 달성되며; 바람직하게는, 운반체 표면에 단량체들의 결합에 적합한 공간은 또한 남아있다. 연계 수단에 의해 제공되는 결합 부위의 균질성은 운반체 물질의 표면의 균질성에 의존할 것이다.

바람직하게는, 연계 수단은 운반체 물질의 패턴화된(patterned) 표면의 제공으로 인하여, 운반체 물질의 표면 상에 균질하게 분포된다.

패턴화된 표면은 다양한 방식, 예를 들면 입자들, 이를 테면, 나노입자들로 구성된 표면을 준비함으로써 획득될 수 있으며, 여기에서 각 입자는 사전정의된 직경을 가진다. 더욱이, 패턴화된 표면은 상기 표면을 운반체 물질의 표면 상에 균질하게 유인물질과 비-유인물질 영역이 분포되도록 조직화함으로써 획득될 수 있다. 예를 들면, 상기 유인물질 영역은 연계 수단에 대한 친화력을 가진다. 대조적으로, 상기 비-유인물질 영역은 연계수단에 대해 감소된 친화력 또는 친화력이 없으며, 따라서 상기 연계 수단은 운반체 물질의 표면에 결합할 수 없다. 이렇게 구조된 표면은 잘 공지된 기술, 이를 테면, 사진석판술 방법 또는 미세접촉-인쇄(microcontact-printing)에 의해 획득될 수 있다.

따라서, 표면 영역의 단지 일부만 변형시켜 기능성 성분의 고정이 개선되도록 하기 위하여 표면 영역의 단지 일부만 변형시키고, 한편 나머지 부분들은 변형안된 상태로 남아있도록 하는 것이 가능하며, 그리고 이러한 경우, 단량체들은 운반체의 표면의 변형안된 부분들과 상호작용 결합을 (또한) 바람직하게 할 수 있다. 이러한 방식에서, 상기 보호 층은 기능성 성분과 운반체 표면 모두에 결합하기 때문에 특히 단단할 것이다. 따라서, 특히 안정적인 조성물이 획득될 수 있다.

이점에 있어서, 운반체에 적용되는 화학 종류, 예를 들면 아미노 변형, 그리고 좀더 정확하게는 아미노 기들의 변형은 고정 단계에서 단백질 안정성과 활성에 영향을 줄 수 있다는 것은 당업자에 의해 또한 인지될 것이다. 고정에 이용되는 가교 링커 (이를 테면, 글루타알데히드)는 일반적으로 지지대 물질, 고 밀도의 표면 아미노 기들에 공유적으로 단백질을 결합시키고, 따라서 고밀도의 고정점은 상기 효소를 고정시키고, 늘이며, 편평하게 하고, 그리고 최종적으로 풀림이(unfold) 있게 되며, 따라서 필시 단백질 구조에 영향을 주며, 이로써 기능을 상실하게 될 것이다. 이 점에 있어서, 일반적으로 가교-링커의 이용은 먼저 입자들이 가교-링커에 의해 변형되고, 그 다음 단백질이 추가되어 단백질 구조에 영향을 주지 못할 것이며, 또는 상이한 방법보다 단백질 구조에 최소한의 영향을 주며, 여기에서 다른 방법은 우선 입자들 상에 단백질 흡착이 영향을 받게 되며, 그 다음 가교 링커가 추가되고, 이는 단백질 구조의 변형을 더 초래할 수 있는데, 그 이유는 과량의 가교 링커가 상기 단백질을 "고정(fix)"시키거나 또는 "펼쳐지게(stretch)" 할 수 있기 때문이다.

이런 이유로, 안정적인 고정을 이루기 위하여 적절한 밀도의 고정 아미노 기들은 입자들 표면에 도달되어야만 한다. 고정 아미노 기들이 너무 적으면 약하게 결합된 단백질들이 누출되는 결과를 초래할 것이다. 대조적으로, 고정 아미노 기 밀도가 너무 높으면 고정된 단백질의 풀림이 초래될 수 있다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "연계 수단(linking means)"은 이를 테면, 특이적 작용기들(이를 테면, 1차 아민, 술퍼히드릴, 등등)에 결합할 수 있는 반응성 말단이 함유된 가교 반응물질 또는 가교-링커와 관계하며, 이때 가교 반응 물질 또는 가교-링커의 한 단부는 운반체 물질의 표면에 결합되며, 다른 단부는 단백질 또는 단백질-유형 화합물에 결합된다. 가교-링커들은 핵산, 단백질들, 폴리머 및 고체 표면 또는 고체 주형을 변형시키는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 가교-링커는 운반체 물질로써 규소 표면 상에 고정될 수 있고, 그 다음 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 가교-링커의 점유되지 않은(unoccupied) 결합-부위에 결합될 수 있다. 대안으로, 상기 가교-링커는 우선 단백질 또는 단백질-유형 화합물에 결합되고, 그 다음 단백질 또는 단백질-유형 화합물에 결합된 가교-링커는 규소 표면의 점유되지 않는 결합-부위를 통하여 규소 표면에 결합될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 이용된 가교-링커는 이용되는 운반체 물질의 유형, 예를 들면, 무기 산화물, 예를 들면 실리콘 산화물 또는 티타늄 산화물, 유기, 무기, 폴리머의 또는 무기-유기 복합물 및 자가-어셈블링된 유기 물질에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 상기 가교-링커는 절단가능한 가교-링커, 이를 테면, 가교-링커는 외부 자극 예를 들면 온도, pH, 전도성, 빛이 있을 때 절단되는 링키지를 보유할 수 있다. 특히 가교-링커는 예를 들면, DTT (디티오트레톨)을 환원제로 이용함으로써, 절단될 수 있는, 예를 들면 DTSSP (3,3'-디티오비스[술포숙시니미딜프로피오네이트])가 이용될 수 있다.

비-제한적 예로써, 아미노-변형된 규소 표면은 운반체 물질의 표면에서 아민기와 함께 Schiff 염기를 형성하는 동종(homo)-이중기능성 가교-링커 (이를 테면, 글루타알데히드)로 변형된 운반체 물질로 이용될 수 있다. 그 다음 나머지 유리 알데히드 기는 단백질 또는 단백질-유형 화합물과 함께 또다른 Schiff 염기를 형성할 수 있고, 따라서 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 운반체 물질의 표면에 연계될 수 있다. 산성 조건들에서 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 방출될 수 있기 때문에, 주의를 해야 한다.

금 또는 티탄 표면이 운반체 물질로 이용되는 경우, 주형을 해당 표면에 연계시키는데 적합한 가교-링커는 해당 표면과 더나아가 절단가능한 분자내 이황화물 결합에 결합될 수 있는 티올 단부 기를 보유할 수 있다.

기능성 성분, 즉 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 공유적 결합에 의해 운반체 물질의 표면에 결합되는 것이 바람직하다. 공유적 결합을 할 수 있다는 의미이기 때문에, 단량체들은 이러한 결합을 통하여 변형된 표면과 상호작용할 수 있도록 개조될 수 있다. 일반적으로, 단량체들이 이 표면에 직접 결합되는 것이 선호되며, 그리고 고정화를 개선시키기 위하여 표면을 준비하는 것이 가능하다.

이런 이유로, 상기 조성물은 단백질과 단백질-유형 화합물로부터 선택된 최소한 한 가지 기능성 성분에 결합하고, 그리고 고체 운반체의 표면에 결합하는 이-작용기성 가교 링커, 특히 아민을 술프히드릴 (티올) 기능에 가교-연계시키는 가교-링커 및/또는 술프히드릴을 술프히드릴 (티올) 기능에 가교-연계시키는 가교-링커 및/또는 글루타알데히드, 디숙시니미딜 타르트레이트, 비스[술포숙시니미딜] 수베레이트, 에틸렌 글리콜비스(술포숙시니미딜숙시네이트), 디메틸 아디피미데이트, 디메틸 피멜이미데이트, 술포숙시니미딜 (4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠, 활성화된 술프히드릴, 술프히드릴-반응성 2-피리딜디티오), BSOCOES (비스[2-(숙시이미도옥시카르보닐옥시)에틸]술폰 DSP (디티오비스[숙시니미딜 프로피오네이트]), DTSSP (3,3'-디티오비스[술포숙시니미딜프로피오네이트 DTBP (디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트ㆍ2 HCl DST (디숙시니미딜 타르타레이트), 술포-LC-SMPT (4-술포숙시니미딜-6-메틸-a-(2- 피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트)), SPDP (N -숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트), LC-SPDP (숙시니미딜 6-(3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트), SMPT (4-숙시니미딜옥시카르보닐-메틸-a-[2-피리딜디티오]톨루엔), DPDPB (1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오)-프로피온아미도]부탄), DTME (디티오-비스말레이미도에탄), BMDB (1,4 비스말레이미딜-2,3-디히드록시부탄)에서 선택된 이-작용기성 가교-링커를 최소한 한가지 더 포함할 수 있다.

기능성 성분이 운반체 표면상에서 특정 방향으로 고정되어 있을 필요는 없다. 오히려, 운반체 표면 상에 고정된 기능성 성분 분자들의 방향이 무작위인 경우, 본 발명에 따라 양호한 보호 효과를 더 얻을 수 있다. 이것은 대부분의 기능성 성분들의 경우 단량체들과 상호작용하는 다수의 부위들이 모든 방향으로 존재하기 때문에, 주어진 분자의 특이적 방향과 독립적으로, 보호층의 단단한 결합이 초래될 것이다.

또한, 기질이 보호 층을 침투할 수 있는 한, 그리고/및 상기 효소 또는 다른 기능성 성분의 활성 부위에 도달될 수 있는 한, 운반체의 표면 상에 고정된 효소의 방향은 중요한 것으로 간주되지 않는다. 현재, 보호 층은 오히려 얇게 설계될 수 있고, 따라서 고정된 그리고 보호된 기능성 성분과 상호작용하도록 표적 분자가 용이하게 침투될 수 있도록 설계될 수 있기 때문에, 보호 층은 상기 효소 기능성 성분 방향과 무관하게 활성에 불리하게 영향을 줄 경우는 거의 없을 것이다. 그럼에도 불구하고, 대부분 경우에 보호 층은 기능성 성분을 잠금 방식 형태로 유지하는데 충분한 두께가 될 것이며, 따라서 기능성 성분 분자들의 최소한 일부분 위에 단량체들로부터 구축된 중합화된 이를 테면, 고분자축합된 물질을 제공하며, 따라서 방출이 손상되거나 또는 저지된다. 단면(sections)을 가로지르는 원형(circular) 분자를 가지는 기능성 성분으로, 보호층은 횡단면(cross section) 직경의 50% 이상보다 더 두꺼워야 한다. 잠김 형태가 발생되는 이러한 경우, 상기 분자들은 빌딩 블록들과의 약한 상호작용에 의해 유지되며, 뿐만 아니라 기능성 성분 분자들 위의 빌딩 블록들이 폴리머를 형성하는 다른 빌딩 블록들과 교차-연계될 수 있고, 따라서 기능성 성분 분자들을 제거하려면 이러한 가교-연계 힘보다 강한 힘을 요구하기 때문에, 또한 유지될 수 있다. 이것은 바이러스 각인 기술에서 이를 테면, 바이러스 입자들의 방출을 위하여 형성된 인지층과 극명히 대조된다. 보호 층 안에 포어의 제공은 이러한 층들을 통하여 기능성 성분과 상호작용하는 표적 물질 분자들의 확산이 느리거나 또는 불가능하더라도, 층들이 기능성 성분의 관련 횡단면에 100% 도달하거나 또는 이를 초과하는 것이 허용되도록 하는데 특히 효과적이라는 것을 당업자는 인지할 수 있을 것이다. 이런 이유로, 포어의 제공은 기능성 성분들을 더 잘 유지하는데 도움이 된다. 이런 이유로, 다공성, 기능성 성분 유지 층은 특히 보호층으로 선호된다.

따라서, 기능성 성분의 분자들이 특정 방향으로 반드시 고정시켜야 할 필요는 없기 때문에, 본 발명에 따른 방법을 더 용이하게 실행할 수 있다.

그러나, 방향이 바람직한 경우라면, 이러한 방향은 효소-특이적 용액을 적용시켜 획득될 수 있는데, 예를 들면 특이적 기질 존재 하에서 또는 용매 존재 하에서 상기 효소를 고정시키거나, 또는 당분야에서 그 자체로 공지된 특이적 고정 전략에 의해 획득될 수 있다.

또한, 오직 기능성 성분들을 조성물에 추가할 필요는 없다. 대신, 상기 조성물은 어뎁터(adaptor) 분자들, 고정 분자들, 스캐폴드(scaffold) 분자들 및/또는 수용체 분자들 군에서 선택된 기능성 (보조) 분자중 최소한 한 가지 종류를 더 포함하는 것도 가능하다. 본 발명은 따라서 특정 구체예에서 본 명세서에서 설명될 것과 같이, 본 발명의 조성물에 관계하며, 여기에서 전술한 조성물은 임의선택적으로 어뎁터 분자들, 고정 분자들, 스캐폴드 분자들 및/또는 수용체 분자들로 구성된 군에서 선택된 최소한 한 가지 분자를 더 포함한다. 임의의 이들 분자들을 이용하여 기질 (표적) 분자에 결합하고, 안정화시키고, 붙들고(capture), 옭아매고(trap) 또는 잡을 수 있다. 이는 기질 또는 상호작용 짝(partner)을 기능성 성분, 즉, 단백질 또는 단백질-유형 화합물, 구체적으로 상기 효소 또는 효소-유형 화합물에 더 근접하게 가져올 수 있도록 하며, 그리고 단백질 또는 단백질-유형 화합물과 이의 기질 또는 상호작용 짝의 상호작용을 용이하게 할 수 있도록 한다.

따라서, 이러한 기능성 (보조) 분자들의 이용은 기능성 성분을 고정시키는데 및/또는 일단 고정된 또는 보호 층의 구축전에 기능성 성분을 안정화시키는데 도움이 될 수 있다. 이러한 기능성 (보조) 분자들이 이용되는 경우, 단량체 빌딩 블록들은 예를 들면 어뎁터 분자들, 고정 분자들, 스캐폴드 분자들 및/또는 수용체 분자들로 구성된 집단에서 선택된 최소한 한 가지 종류의 기능성 분자들과 상호작용할 수 있는 것이 선택되는 경우, 기능성 성분을 보호하기 위한 보호층이 최소한 한 가지 종류의 기능성 분자들을 또한 매립하여 유익할 것이다.

특히 선호되는 구체예에서, 본 발명에 따라 구축된 보호 층은 다공성 층일 것이다.

이 점에 있어서, 기능성 성분을 이용하기 위하여, 이의 특이적 영역은 본 발명의 조성물로 함께 이용되는 특이적 분자들 또는 분자들의 기에 접촉되어야 한다는 사실은 당업자들에게 자명할 것이다. 지금, 이러한 "표적" 분자들은 기능성 성분이 오직 부분적으로 매립된 경우 그리고 해당 특이적 영역이 덮혀있지 않는 경우, 기능성 성분의 특이적 부위에 직접적인 접촉을 보유하거나, 또는 그렇지 않으면 보호 층을 통한 접촉이 이루어져야 한다. 이러한 경우, "표적" 분자들이 고정된 그리고 보호된 기능성 성분의 특이적 부위에 접촉되도록, 포어가 제공되어야 할 필요가 있다.

상기로부터, 본 발명은 이러한 경우와 특정 비-제한적 구체예의 경우로 표현되는 경우, 다음의 단계를 포함하는 조성물을 생산하는 방법에 관련되는데, 이 방법은 고체 운반체를 획득하는 단계; 그리고 관심 대상의 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물을 고정시키는 단계, 구체적으로 운반체의 표면에 최소한 한 가지 효소 또는 효소-유형 화합물, (그리고 본 명세서로부터 자명하게 되는) 임의선택적으로, 최소한 한 가지 선택적 분자를 고정시키는 단계; 그리고 그 다음 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물 그리고, 가능하다면, 자가-어셈블리되는 빌딩 블록을 가진 고체 운반체의 표면에 결합된 선택적 분자를 항온처리하여 고체 운반체의 자유로운 표면과 최소한 한 가지 단백질 및 또는 단백질-유형 화합물과 고체 운반체에 결합된 선택적 분자 주변 다공성 나노-환경을 만드는 단계를 포함한다.

상기에서 언급한 바와 같이, 보호 층의 구축은 정확하게 제어될 수 있고, 특이적 성질을 가진 층이 용이하게 획득된다. 특히, 층의 두께는 정확하게 제어될 수 있을 것으로 상기에서 언급되고 있다.

대부분의 경우 불리한 영향으로부터 충분한 보호를 보증하도록 충분한 두께가 있는 경우 보호는 더 잘 되며, 한편 층이 너무 두꺼운 경우 활성이 손상될 수 있다는 것이 예측된다. 너무 두꺼운 층에 불충분한 포어가 제공되고, 표적 분자들이 고정된 그리고 보호된 기능성 성분에 접근이 차단되기 때문에 이러한 손상이 야기될 것이며, 한편 구체적으로 큰 및/또는 다수의 포어가 제공되는 경우, 층들이 기능성 성분을 충분히 포집하지 못하기 때문에 보호가 손상될 것이다. 따라서, 보호 층을 위한 최적의 두께가 존재할 것으로 예상될 수 있다.

보호 층의 두께는 최소한 한 가지 기능성 성분의 종축 길이의 최소한 5%, 바람직하게는 최소한 한 가지 기능성 성분의 종축 길이의 50% 내지 150% 사이에 있는 것이 유익하다. 전형적인 경우에서 보호층의 두께는 1 내지 100 nm, 더욱 전형적으로 1 nm 내지 50 nm, 더욱 전형적으로 1 nm 내지 30 nm, 더욱 전형적으로 1 nm 내지 25 nm, 더욱 전형적으로 1 nm 내지 20 nm, 더욱 전형적으로 1 nm 내지 15 nm, 바람직하게는 5 nm 내지 15 nm의 범위 내에 있다. 상기 층의 최적 두께는 고려되는 특이적 기능성 성분, 조성물과 함께 이용될 특이적 표적 분자 및 공정 매개변수에 의해 변화될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이러한 최적 두께는 동일한 조건하에 상이한 두께의 보호층에 의해 획득되는 활성과 비교하여 단순한 일련의 측정에 의해 결정될 수 있을 것으로 또한 이애될 것이다. 이런 이유로, 특이적 공정 조건에 대한 개조가 가능하다. 다시, 선호되는 값의 두께는 실험적으로 결정될 수 있다는 것도 주지될 수 있다. 이런 이유로, 특정 경우에 있어서 본 발명의 조성물에 의해 제공되며, 본 명세서에서 공개된 바와 같이, 보호 물질은 특정 필요에 따라 개작될 수 있고, 2 nm 내지 50 nm, 구체적으로 5 nm 내지 40 nm, 구체적으로 5 nm 내지 25 nm, 구체적으로 10 nm 내지 25 nm, 구체적으로 5 nm 내지 20 nm, 구체적으로 10 nm 내지 20 nm, 구체적으로 15 nm 내지 25 nm, 구체적으로 15 nm 내지 20 nm, 구체적으로 20 nm 내지 25 nm 또는 25 nm 이상의 두께를 보유할 수 있다.

보호 층 두께와 특이적 포어 크기 모두 결정되어야 할 필요가 있는 경우, 첫째 일련의 실험에서 표적 분자의 크기에 최소한 상응하는 포어 크기를 가진 최적의 층 두께를 먼저 측정하고, 그 다음 이미 밝혀진 층 두께를 가진 최적 활성을 위하여 포어 크기를 재조정하고, 필요하다면, 개선된 포어 크기를 가진 최적 활성을 위한 층 두께를 조절함으로써 반복적으로 실행될 수 있다는 것 또한 주지되어야 한다. 적은 수의 반복 단계로 양호한 활성이 획득될 수 있다는 것을 알 것이다.

상기와 같이, 보호 층이 기능성 성분 분자의 종축 길이의 최소한 50%인 경우 보호층 내 포어는 특히 유익할 것이 명백할 것이다. 이 점에 있어서, 기능성 성분의 고정은 무작위 방향에서 영향받는다는 것이 추정될 수 있다. 기능성 성분 분자들이 지향된 방식으로 고정된다면, 이를 테면, 더 긴 축은 일반적으로 운반체 표면에 평행하고, 그리고 기능성 성분 분자들의 장축과 단축의 형상비가 높다면, 설사 두께가 종축의 30% 미만이더라도 포어들이 유익할 수 있을 것이다. 기능성 성분 분자는 큰 사이드 암스(side arms) 및 이와 유사한 것을 가지는 것을 유지한다. 또한, 박층 포어들의 경우에도 표적 분자들은 오히려 크거나 또는 벌키(bulky)하고, 기능성 성분들에게 표적 분자들의 접근이 손상되는 경우도 유익할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물에 의해 제공되고, 본 명세서에서 공개된 바와 같이, 보호 물질의 크기는 특별 필요에 따라 개작되며, 기능성 성분, 즉, 고정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물, 구체적으로 고정된 효소 또는 효소-유형 화합물의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 100%가 보호 물질에 의해 덮히도록 형상화될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 기능성 성분 분자의 더 긴 축과 층 두께의 비율에 의해 측정되었을 때, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 100%의 층 두께의 경우 포어를 제공하는 것이 유익할 것임을 이해할 것이다. 일반적으로, 층이 더 두꺼울 경우, 포어는 더더욱 유익하게 된다.

포어가 제공되는 경우, 포어 크기가 1 nm 내지 10 nm, 구체적으로 2 nm 내지 9 nm, 구체적으로 3 nm 내지 8 nm, 구체적으로 4 nm 내지 7 nm, 구체적으로 4 nm 내지 6 nm, 구체적으로 4 nm 내지 5 nm 사이에 있을 때 유익하다. 상기로부터, 실질적인 포어 크기는 기능성 성분에 도달되는 특이적 표적 분자(들)에 따라 달라질 것임이 자명해질 것이다. 포어가 조성물의 사용 동안 이와 상호작용하는 기능성 성분들의 분자 확산을 허용하도록 크기를 갖추면 유익하다. 이런 이유로, 상기 포어는 표적 분자의 크기에 최소한 상응하는 크기를 가질 것이다. 선호되는 것으로 나타낸 상이한 포어 크기는 상이한 특이적 표적 분자들 및/또는 상이한 두께의 층들과 관련되며; 더 두꺼운 층들의 경우, 더 큰 크기의 포어는 표적 분자들이 기능성 성분의 기능성 부위(들)로 더 용이하게 그리고/또는 더 큰 수준으로 삼투를 허용한다는 유익할 것이라고 당업자는 인지할 것이다.

이점에 있어서 포어 크기가 영향을 받고, 조정될 수 있다는 것을 주지해야만 한다. 따라서, 본 발명의 조성물에 의해 제공되고, 본 명세서에서 공개된 바와 같이 보호 물질 안에 존재하는 포어 크기는 특정 필요에 따라 조정될 수 있고, 여기에서 전술한 기능성 성분을 형성하는 단백질 또는 단백질-유형 화합물들과 상호작용하는 분자들의 확산이 허용되도록 포어 크기가 선택된다. 상기 포어 크기는 바람직한 작용기들을 보유하는 특정 빌딩 블록들의 선택에 의해 조정될 수 있다. 일반적으로, 더 큰 작용기들의 사용은 더 작은 작용기들의 사용과 비교하였을 때 다공성 증가를 초래한다. 예를 들면, 보호 층을 위한 빌딩 블록들로써 단량체가 이용될 수 있는데, 이의 최소 일부는 공유적 결합들을 형성하는 3개의 화학적 기와 비-공유 방식으로 기능성 성분과 사용하는 네번째 기들을 보유한다. 또한, 보호 층 형성하는 동안 임계 미셀(critical micelle) 농도에서 계면활성제가 도입될 수 있다 그 다음, 크고 벌키한 기들을 운반하는 단량체들이 추가될 수 있다. 예로써, 옥타데실실란 및 트리페닐일실란 이를 테면, 옥타데실트리메톡시실란 및 트리페닐-트리에톡시실란은 유기 실란이 빌딩 블록 단량체들인 경우에 이용될 수 있다.

보호 층의 표면으로부터 운반체 표면 까지 포어 크기를 변화시키는 것이 가능하다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 보호 층의 빌트-업(built-up)은 빌트-업 공정 동안 공정 조건을 변화시키는데 충분히 느리고, 그래서 상이한 포어 크기는 이를 테면, 단지 나중 단계에서 특정 성분들을 첨가함으로써 획득되기 때문에, 이러한 변이가 실현가능한다.

특별히 선호되는 구체예에서, 보호 층의 표면에서 그라디언트를 만들기 위하여 상기 보호 물질은 추가 기능들을 도입시키기 위하여, 구체적으로 단백질 또는 단백질-유형 화합물들, 예를 들면, 효소의 기질과 상호작용하는 분자들을 위하여 생성된 보호층의 친화력을 개선시킴으로써, 외측 표면에서 추가적으로 화학적으로 변화될 수 있다.

서로 그리고 고정된 기능성 성분과 상호작용할 수 있는 단량체들이 수성 용액으로 제공된다면 유익하다. 수성 용액의 단량체들을 이용하면 기능성 성분의 입체형태로 인한 손상을 방지하는데 도움이 되며, 따라서 이의 활성이 유지된다.

빌딩 블록들이 자가-어셈블리 반응에서 보호 층을 구축한다면 유익하다. 본 발명의 목적을 위하여 중합화는 이를 테면, 표면 결합된 또는 가용성 개시자, 수용성 불포화된 단량체들 또는 수용성 가교-링커를 이용하는 라디칼 중화화일 수 있고, 중합화 반응은 흔히 수성 조건하에 규소 전구물질들, 예를 들면 트리-알콕시-실란과 테트라-알콕시-실란의 폴리-축합이다. 따라서, 폴리축합을 이용한 반응은 선호되는 자가-어셈블링 반응이다.

대부분 경우에서, 중합화에 이용되는 특정 화학물질, 예를 들면 아직-보호안된 단백질들 또는 단백질-유형 화합물들의 활성을 손상시킬 수 있는 출발물질 및 이와 유사한 것들을 추가하지 않는 것이 바람직할 것이다. 폴리축합은 수성 용액에서 영향을 받을 수 있는데, 그 이유는 생물-친화적인 반응 환경을 일반적으로 보장하고, 이와 같은 방식에서 기능성 성분의 입체형태가 보존되거나 또는 단지 작은 규모로 최소한 불리하게 영향을 주고, 따라서 만약 활성 손상이 있다면 활성은 작은 수준으로만 손상되기 때문에, 이렇게 하는 것이 특히 바람직하다는 것이다. 또한, 폴리축합은 용이하게 조절될 수 있는데, 보호 층의 두께는 효소 보호와 기질 확산과 필적되도록 획득되어 (예를 들면, 효소 기능성 성분이 효소, 또는 50% 이상인 경우 더 긴 축), 활성 보호된 효소가 초래되는 것을 허용한다. 이 내용에서 유기 실란 단량체들은 유익하게 이용될 수 있다.

기존 청구항중 하나에 따른 조성물을 생산하는 방법은 원하는 두께를 가진 선호되는 보호 층을 획득하기 위하여, 보호 물질의 보호 층 구축 및/또는 자가-어셈블리 반응을 중단시키는 단계를 더 포함하는 것이 유리하다. 운반체 물질의 표면 상에(및/또는 보호 매립 층 상에, 이러한 층들이 이미 구축된 경우) 보호 물질의 중합화 중단은 중합화 반응을 적극적으로 중단시키거나 또는 중합화 반응이 자가-중단됨으로써 실행될 수 있다.

보호층용 단량체 빌딩 블록들과 고정된 기능성 성분의 상호작용은 기능성 성분의 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 아미노산 측쇄들 사이에서 영향을 받는 경우, 구체적으로 약한 힘 상호작용에 근거하는 경우 유익하다.

이러한 아미노산 측쇄들은 본 발명에 따라 매립된 기능성 성분들의 분자 표면에 제시될 것이다. 상이한 산 측쇄들은 상이한 약한 힘 상호작용을 통하여 상호작용할 것이기 때문에, 다수의 상이한 빌딩 블록들이 제공되어, 상기 상이한 빌딩 블록들이 상이한 기능성 부분들 및/또는 상이한 아미노산 측쇄들과 상호작용하는 것 또한 유익하다. 이 점에 있어서, 약한 힘 상호작용은 비-공유 결합 및/또는 p-p (방향족) 상호작용, van der Waals 상호작용, H-결합 상호작용, 이온 상호작용과 관련된다. 단량체들이 서로 간 상호작용은 바람직하게는 중합화 반응일 수 있고, 반면 단량체들과 기능성 성분과의 상호작용은 바람직하게는 약한 상호작용이라는 사실로부터, 단량체-단량체-상호작용은 단량체들과 기능성 성분과의 상호작용과 반드시 동일할 필요가 없다는 것을 추론할 수 있다. 대신, 전형적으로 상호작용은 상이한 것일 것이다. 더욱이, 단량체들이 고체 운반체 표면에 결합 상호작용은 공유적 결합에 의한 것일 수 있다.

고정된 기능성 성분과 상호작용하기 위하여 최소한 한 가지 기능성기를 보유한 단량체들이 이용된다면, 이들은 알코올, 아민, 카르복실레이트, 방향족 작용기, 티올, 티오에테르, 구아니디늄, 이미다졸, 지방족 쇄, 아미드 및/또는 페놀에서 선택되는 경우, 작용기는 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 표면에 있는 아미노산의 하나 또는 그 이상의 아미노산 측쇄들과 약한 힘 상호작용에 의해 상호작용할 수 있어서 바람직할 것이다.

이러한 기능성기들을 보유한 다수의 상이한 단량체들이 이용가능하며, 유기실란의 이용은 통상 특별히 선호된다는 점이다.

특이적 구체예에서, 따라서 본 발명은 본 명세서에서 공개된 바와 같은 조성물에 관계하며, 여기에서 상기 보호 물질은 유기 규소다.

이런 이유로, 특별히 선호되는 구체예에서, 유기 실란 단량체들은 기능성 성분을 최소한 부분적으로 매립시키는 보호 층을 구축하기 위한 빌딩 블록으로 이용된다. 이 경우, 알코올, 아민, 카르복실레이트, 방향족 작용기, 티올, 티오에테르, 구아니디늄, 이미다졸, 지방족 쇄, 아미드 및/또는 페놀에서 선택된 고정된 기능성 성분과 상호작용하는 최소한 한 가지 작용기, 특히 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 표면에 있는 아미노산들의 하나 또는 그 이상의 아미노산 측쇄들과 약한 힘 상호작용에 의해 상호작용하는 기능성기를 보유하는 유기 실란 단량체들이 이용되면 유익하다. 이 점에 있어서, 약한 힘 상호작용은 비-공유 결합 및/또는 p-p (방향족) 상호작용, van der Waals 상호작용, H-결합 상호작용, 이온 (정전기적) 상호작용과 관련된다.

상기 유기 실란 단량체들은 테트라오르토규산염, 카르복시에틸실란트리올 및/또는 벤질실란, 프로필실란, 이소부틸실란, n-옥틸실란, 히드록시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필실란, 아미노프로필실란, 우레이도프로필실란 (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필실란로 구성된 집단에서 선택되는 것이 바람직하며, 특히 벤질트리에톡시실란, 프로필트리에톡시실란, 이소부틸트리에톡시실란, n-옥틸트리에톡시실란, 히드록시메틸트리에톡시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, 아미노프로필트리에톡시실란, 우레이도프로필트리에톡시실란 (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리에톡시실란으로 구성된 집단 및/또는 벤질트리메톡시실란, 프로필트리메톡시실란, 이소부틸트리메톡시실란, n-옥틸트리메톡시실란, 히드록시메틸트리메톡시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란 아미노프로필트리메톡시실란, 우레이도프로필트리메톡시실란 (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리메톡시실란으로 구성된 집단 및/또는벤질트리히드록시에톡시실란, 프로필트리히드록시에톡시실란, 이소부틸트리히드록시에톡시실란, n-옥틸트리히드록시에톡시실란, 히드록시메틸트리히드록시에톡시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리히드록시에톡시실란, 아미노프로필트리히드록시에톡시실란, 우레이도프로필트리히드록시에톡시실란 (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리히드록시메톡시실란으로 구성된 집단으로부터 선택되는 것이 바람직할 것이다. 이들 실란은 상업적으로 이용가능하기 때문에 바람직하다. 본 명세서로부터 현재 또는 미래에 이용가능한 다른 유기 실란 이용가능한 또한 미용될 수 있으며, 선호되는 단량체들이 명시되지만, 상기 목록에는 본 명세서의 다른 단량체들이 배제되지 않는다는 것은 당업자들에게 자명할 것이다.

상이한 표면 아미노 측쇄들은 일반적으로 기능성 성분의 표면에 존재하기 때문에, 구체적으로 선호되는 구체예에서 단일 단량체를 대신하여 상이한 유기 실란 단량체들이 이용된다. 평균적 지식을 가진 당업자는 상이한 표면 아미노산들은 상이한 상호작용 (결합) 기전을 통하여 상호작용할 것임을 인지할 것이다. 이는 또한 상이한 작용기들을 가진 단량체들에게도 마찬가지며, 상이한 표면 아미노산들의 양에 있어서 최적화된 단량체들의 혼합물을 이용하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 따라서, 본 발명에 따른 방법은 빌딩 블록들을 제공하기에 앞서, 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 표면 구조를 분석 또는 결정하는 단계, 그리고 표면 구조에 상응하는 빌딩 블록들을 선택하는 단계를 포함한다. 이 단계는 특히, 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 상기에서 언급된 바와 같이 공지의 구조를 가지는 경우, 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 보호 물질에 특이적 결합되도록 하는데 유용하다.

상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 공지의 구조의 구조를 가진다면, 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 표면 상에 있는 화학적 기능들은 식별될 수 있다. 따라서, 보호 물질을 준비하기 위하여 이용되는 빌딩 블록의 선택은 보호 물질의 친화력을 맞추기 위하여 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 공지 구조에 의존적이 될 것이다. 보호 물질을 준비하는데 이용될 수 있는 빌딩 블록들의 선택은 보호 물질의 친화력을 이의 요구에 맞도록 하기 위하여 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 공지 구조에 의존적이 될 것이다. 보호 물질의 조성물은 반응 혼합물안에 존재하는 화합물들, 예를 들면 구조적 빌딩 블록들 (이를 테면, 테트라에틸오르토규산염 (TEOS)) 및/또는 보호 빌딩 블록들 (이를 테면, 테트라에틸오르토규산염 (TEOS), 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTES), n-프로필트리에티옥시실란 (PTES), 이소부틸트리에톡시실란 (IBTES), 히드록시메틸트리에톡시실란 (HTMEOS), Benzyl트리에톡시실란 (BTES), 우레이도프로필트리에톡시실란 (UPTES), Carb옥시에틸트리에톡시실란 (CETES)) 그리고 약한 힘 상호작용 예를 들면 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용 또는 van-der-Waals 상호작용, π - π 스태킹 [(pi-pi) 스태킹]을 통하여 단백질 또는 단백질-유형 화합물 주변에 이들 빌딩 블록들의 자가 사전-조직화에 따라 달라진다.

따라서, 최소한 한 가지 기능성 성분의 경우, Phe, Tyr, Trp, Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Ser, Thr, Asp, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His로 구성된 군에서 선택되는 표면 아미노산들중 최소 몇 가지의 각 양이 결정되고, 이러한 결정에 따라 상이한 단량체들이 이용된다면 유익할 것이다.

따라서, 최소한 한 가지 기능성 성분의 표면 아미노산으로써, Phe, Tyr, Trp의 최소한 한 가지가 결정되면 유익하다. 이러한 결정은 전술한 표면 아미노산들중 오직 하나의 양 또는 전술한 표면 아미노산들 몇 가지의 양, 바람직하게는 이들 모두의 합에 관련될 수 있다. 그 다음 p-p (방향족) 상호작용을 통하여, 기능성 성분의 표면 아미노산들 Phe, Tyr, Trp과 상호작용하는 작용기를 보유한 단량체(들)의 양은 이러한 결정에 따라, 특히 벤질실란, 구체적으로 하나 또는 그 이상의 벤질트리에톡시실란, 벤질트리메톡시실란 또는 벤질트리히드록시에톡시실란의 양에 따라 선택된다. 상기 결정은 전술한 표면 아미노산들중 오직 하나의 양 또는 전술한 표면 아미노산들 몇 가지의 양, 바람직하게는 이들 모두(의 합)에 관련될 수 있다. 그 다음, 기능성 성분의 언급된 표면 아미노산들과 상호작용하는 작용기를 보유한 단량체(들)의 양이 이러한 결정에 따라 설정될 때, 각 상호작용을 가진 하나 또는 그 이상의 단량체들은 보호 층 구축을 위하여 선택될 수 있다.

추가적으로 및/또는 대안으로 최소한 한 가지 기능성 성분의 표면 아미노산들로써 최소한 한 가지 Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Pro의 양이 결정되면, van der Waals 상호작용을 통하여 기능성 성분의 표면 아미노산들 Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Pro와 상호작용하는 작용기를 보유하는 단량체의 양은 이러한 결정에 따라 선택되는데, 특히 프로필실란, 이소부틸실란, n-옥틸실란중 최소한 한 가지의 양, 구체적으로 프로필트리메톡시실란, 이소부틸트리에톡시실란, 또는 n-옥틸트리에톡시실란중 하나의 양 및/또는 프로필트리에톡시실란, 이소부틸트리에톡시실란, n-옥틸트리에톡시실란, 및/또는 프로필트리히드록시에톡시실란, 이소부틸트리히드록시에톡시실란, n-옥틸트리히드록시에톡시실란중 하나의 양에 따라 선택된다. 다시, 상기 결정은 전술한 표면 아미노산들중 오직 하나의 양 또는 전술한 표면 아미노산들 몇 가지의 양, 바람직하게는 이들 모두의 합에 관련될 수 있다. 그 다음, 기능성 성분의 언급된 표면 아미노산들과 상호작용하는 작용기를 보유한 단량체(들)의 양이 이러한 결정에 따라 설정될 때, 각 상호작용을 가진 하나 또는 그 이상의 단량체들은 보호 층 구축을 위하여 선택될 수 있다.

추가적으로 및/또는 대안으로, 최소한 한 가지 기능성 성분의 표면 아미노산들로써 Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Tyr중 최소 한 가지의 양이 결정되고, H-결합 상호작용을 통하여 기능성 성분의 표면 아미노산들 Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Tyr와 상호작용하는 기능성기를 가진 단량체의 양은 이러한 결정에 따라 선택되는데, 구체적으로 히드록시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필실란중 최소한 하나의 양, 구체적으로 히드록시메틸트리에톡시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란중 하나, 및/또는 히드록시메틸트리메톡시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란중 하나 및/또는 히드록시메틸트리히드록시에톡시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리히드록시에톡시실란중 하나의 양에 따라 선택된다. 다시, 기능성 성분의 언급된 표면 아미노산들과 상호작용하는 작용기를 보유한 단량체(들)의 양이 이러한 결정에 따라 설정될 때, 각 상호작용을 가진 하나 또는 그 이상의 단량체들은 보호 층 구축을 위하여 선택될 수 있다.

추가적으로 및/또는 대안으로, 최소한 한 가지 기능성 성분의 표면 아미노산들로써 Asp, Glu중 최소 한 가지의 양이 결정되고, 이온 상호작용을 통하여 기능성 성분의 표면 아미노산들 Asp, Glu과 상호작용하는 기능성기를 가진 단량체의 양은 이러한 결정에 따라 선택되는데, 구체적으로 아미노프로필실란의 양, 구체적으로 아미노프로필트리메톡시실란, 아미노프로필트리히드록시에톡시실란 아미노프로필트리에톡시실란중 최소한 하나의 양에 따라 선택된다. 다시, 기능성 성분의 언급된 표면 아미노산들과 상호작용하는 작용기를 보유한 단량체(들)의 양이 이러한 결정에 따라 설정될 때, 각 상호작용을 가진 하나 또는 그 이상의 단량체들은 보호 층 구축을 위하여 선택될 수 있다.

일부 표면 아미노산 측쇄들은 상이한 기전을 통하여 상호작용할 수 있다. 단량체 혼합물이 특이적 표면 아미노산 측쇄들의 양에 따라 개작될 때, 이점이 고려될 수 있다.

상기 내용으로부터 이를 테면, 표적 효소의 아미노산 표면 분석에 근거할 때, 상기 효소 표면에 존재하는 기능성 성분을 한정하는 아미노산의 대부분은 음전하를 띄고, 빌딩 블록들 혼합물에는 양전하를 띈 작용기들을 보유하는 더 많은 유기 실란이 추가되어야 한다. 이와 같은 방식에서, 상기 혼합물의 유기실란은 사용을 위하여 매립에 의해 보호된 효소와 더 잘 상호작용(비-공유적 방식에서)할 것이다.

운반체가 임의의 고체 운반체, 이를 테면, 칩 또는 이와 유사한 것일 수 있고, 대부분의 적용에서 고체 운반체가 미립자 운반체, 구체적으로 20 내지 1000 nm 범위의 입자크기, 구체적으로 200 내지 500 nm, 구체적으로 300 내지 400 nm 범위의 입자 크기의 미립자가 유익하다.

이 점에 있어서, 단백질들 또는 단백질-유형 화합물 분자들의 수, 즉, 주어진 입자에 결합할 수 있는 또는 하게 되는 개별 기능성 성분 분자들의 수는 전술한 단백질 또는 단백질-유형 화합물 분자의 크기에 대한 운반체 입자 크기 비율에 의존적일 것이라는 점이다. 더 큰 입자들의 경우, 전술한 수의 통계학적 변수가 명백히 있을 수 있다. 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 나노입자와 유사한 크기를 보유하며, 입자 당 한개의 단백질 또는 단백질-유형 화합물 분자가 결합될 수 있다. 이 경우에서 유사한 크기는 0,5% 내지 10% 사이 범위에 크기 차이를 말한다.

한 구체예에서, 단백질 또는 단백질-유형 화합물에 대한 입자 크기 비율은 나노입자 당 10 내지 200개, 구체적으로 50-250개, 구체적으로 20-150개의 단백질들 또는 단백질-유형 화합물들의 결합을 허용한다. 특이적 구체예에서, 상기 나노입자는 나노입자 당 200개의 단백질들 또는 단백질-유형 화합물들의 결합을 허용하는 크기를 갖는다. 이러한 비율은 이러한 비율에 의해 소량의 조성물을 공정 용기, 유기체 또는 이와 유사한 것에 추가하는 것이 다소 많은 양의 활성 기능성 성분들의 추가와 대등할 것이기 때문에 선호된다.

그러나, 다소 많은 미립자 운반체의 이용으로 사용 후 여과에 의해 유체로부터 조성물의 분리가 허용된다는 것을 주지해야 한다. 일부 경우에서 이를 테면, 살아있는 유기체 안에 조성물의 운송을 허용하기 위하여 작은 입자의 이용이 더 선호될 수 있으며, 본 발명의 범위 안에는 더 큰 크기의 입자들이 이용될 것인데, 구체적으로 최소한 1000 nm 내지 최대 100 μm 크기의 입자들이 이용되는 경우 또한 있을 수 있다.

그런 이유로 상기 운반체는 나노입자, 구체적으로 유기 나노입자, 무기 나노입자, 유기-무기 복합 나노입자, 자가-어셈블링 유기 나노입자, 다공성물질 규소 나노입자 (SNP), 금 나노입자, 티타늄 나노입자의 집단에서 선택된 나노입자일 수 있다.

운반체의 크기와 무관하게, 상기 운반체 물질은 산화규소 표면을 보유할 수 있는데, 유기 실란이 단량체들로 이용되는 경우 특히 선호된다.

전술한 기능성 성분은 단백질과 단백질-유형 화합물로부터 선택된 전술한 기능성 성분이 효소 또는 효소-유형 화합물인 경우, 구체적으로 산화환원효소, 전달효소, 가수분해효소, 리아제, 이소메라제 및/또는 리가제로 구성된 집단에서 선택된 효소 또는 효소-유형 화합물인 것이 가능하며, 그리고 유익하다.

보호에는 고체 운반체, 단백질과 단백질-유형 화합물에서 선택되고, 고체 운반체의 표면에 고정된 최소한 한 가지 기능성 성분, 이 기능성 성분을 최소한 부분적으로 매립시킴으로써 기능성 성분을 보호하는 보호층을 추구하며, 여기에서 기능성 성분을 보호하는 보호층은 서로 그리고 고정된 기능성 성분과 상호작용할 수 있는 빌딩 블록 단량체로 구축된 층이다.

다시, 매립은 기능성 성분(최소한 대부분 또는 많은 분획)이 사용될 때까지, 바람직하게는 사용이 종료될 때까지 남아있도록 할 것이며, 그리고 기능성 성분이 씻겨나가도록 의도되거나 또는 의도된 사용 동안 씻겨나가는 것이 일어나지 않을 것이다.

평균적 지식을 가진 자는 단백질들은 매우 이형적인 부류의 생물학적 거대분자들을 포함한다는 것을 인지한다. 많은 것들이 고유 환경에 있지 않을 때 불안정적이다. 특정 완충 조건이 유지되지 않는 경우, 추출된 단백질들이 적절하게 기능을 하지 않을 수 있거나 또는 가용성 상태로 유지되지 않을 수 있다. 단백질들은 부적당한(suboptimal) 온도, 단백질분해, 응집 및 부적당한 완충 조건의 결과로써 구조적 완전성(integrity) 및 활성을 상실할 수 있다.

본 발명에 따라서, 본 명세서에서 공개된 조성물의 보호 물질은 고유한 상태로부터 벗어난 환경적인 상태에 대하여 단백질 또는 단백질-유형 화합물, 구체적으로 상기 효소 또는 효소-유형 화합물의 보호를 제공한다.

특히, 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물, 구체적으로 상기 효소 또는 효소-유형 화합물은

a) 부적당한 pH; 및/또는

b) 화학적 스트레스들; 및/또는

c) 생물학적 스트레스들; 및/또는

d) 용매들; 및/또는

e) 물리적인 스트레스에 대항하여 보호된다.

"부적당한 pH"는 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물에 대하여 이를 테면, +/- 5, +/- 4; +/- 3, +/- 2, +/- 1, +/- 0.5 pH 단위의 값으로 최적 pH와 상이한 pH를 지칭하며; 본 발명의 조성물이 더 극적인 조건에 직면하게 될 경우, 상기 보호 층은 이러한 조건에 적응될 수 있다는 것을 평균적 지식을 가진 자는 인지할 것이다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "화학적 스트레스"는 용매에 희석, 원치않는 반응물질, 이를 테면, 농약, 살충제, 오염된 공기 및/또는 물, 중금속, 예를 들면 수은 또는 납, 석면 또는 방사능활성 폐기물, 화학요법, 또는 독소에 이용된 화합물들로 인한 오염에 의해 야기되는 상태를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 특히 효소들은 이들의 최적 완충 시스템과 상이한 용매에서 불안정적이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 스트레스"는 단백질분해효소 활성, 산화 스트레스, 카스파제 활성, 천연 효소 저해제, 낮은 기질 농도, 밝은 빛 노출, UV 빛 노출, 낮은 ATP 수준, 원치않는 단백질들에 의한 오염, 포스파타제 활성 및 약물 대사에 의해 야기된 상태를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "물리적인 스트레스"는 전단력, 건조, 압력 및 진공 유도된 스트레스를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

한 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에서 공개된 조성물에 관계하며, 여기에서 보호 물질은 보호안된 단백질의 비활성화 및/또는 변성으로 이어질 수 있는 부적당한 온도에 대항하여 단백질 또는 단백질-유형 화합물에 대한 보호를 제공한다.

상기 단백질이 효소인 경우, 본 명세서에서 공개된 고정된 그리고 보호된 효소는 최적 반응 온도보다 더 높고, 관심 효소가 감소된 활성을 가지게 되는, 부적당한 온도 하에서 이의 활성 및 구조적 완전성을 유지할 수 있다. 특히, 본 발명은 본 명세서에서 공개된 조성물을 제공하는데, 여기에서 상기 보호 물질은 보호안된 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 최적 온도를 60℃, 구체적으로 50℃, 구체적으로 40℃ 더 높은, 구체적으로 30℃, 구체적으로 20℃, 구체적으로 10℃, 구체적으로 5℃ 초과하는 상승된 온도에 대항하여 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 호보를 제공한다. 특이적 구체예에서, 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 효소 또는 효소-유형 화합물이다. 따라서, 본 발명에 따라 획득된 단단한 포획으로 매우 불리한 조건하에서도 상기 기능성 성분을 보호한다.

따라서, 조성물이 촉매 및/또는 다른 산업 공정들에서 이용되는 경우; 상기 조성물은 다양한 촉매 공정들에서 이용되는 것 또한 가능하고, 그리고 유익하다.

특히, 촉매 공정에 본 발명의 조성물을 사용하는 것이 가능한데, 여기에서 상기 공정 동안 상기 조성물을 기능성 성분의 최적 pH와 상이한 pH, 특히 기능성 성분의 최적 pH로부터 최소한 +/- 0.5 pH 단위 및/또는 최대 +/- 5 pH 단위가 상이한 pH 값, 및/또는 화학적 스트레스들; 및/또는 생물학적 스트레스들; 및/또는 용매들; 및/또는 물리적인 스트레스; 및/또는 기능성 성분의 최적 온도를 최소한 5℃; 및/또는 최대 60℃, 구체적으로 50℃, 구체적으로 40℃ 이상, 구체적으로 30℃, 구체적으로 20℃, 구체적으로 10℃ 초과한 상승된 온도; 및/또는 기능성 성분의 최적 온도로부터 최소한 5℃; 및/또는 최대 60℃ 벗어난 감소된 온도중 최소한 하나에 직면하게 된다.

한 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에서 공개된 조성물에 관계하며, 여기에서 보호 물질은 보호안된 단백질의 비활성화 및/또는 변성으로 이어질 수 있는 최적 온도보다 더 낮은 감소된 온도에 대항하여 단백질 또는 단백질-유형 화합물에 대한 보호를 제공한다.

상기 단백질이 효소인 경우, 본 명세서에서 공개된 고정된 그리고 보호된 효소는 최적 반응 온도보다 더 낮고, 관심 효소가 감소된 활성을 가지게 되는, 부적당한 온도 하에서 이의 활성 및 구조적 완전성을 유지할 수 있다. 특히, 본 발명은 본 명세서에서 공개된 조성물을 제공하는데, 여기에서 상기 보호 물질은 보호안된 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 최적 온도를 60℃, 구체적으로 50℃, 구체적으로 40℃, 구체적으로 30℃, 구체적으로 20℃, 구체적으로 10℃, 구체적으로 5℃ 벗어난 감소된 온도에 대항하여 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 보호를 제공한다. 특이적 구체예에서, 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 효소 또는 효소-유형 화합물이다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 본 명세서에서 공개된 조성물은 생물촉매 시스템이다. 특히, 상기 관심 대상의 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 효소 또는 효소-유형 화합물이다.

특히, 상기 효소 또는 효소-유형 화합물은 산화환원효소, 전달효소, 가수분해효소, 리아제, 이소메라제 및/또는 리가제 이를 테면, 예를 들면, 락카제, 과산화효소, 포스파타제, 산화추가효소, 환원효소, 단백질분해효소, 아밀라제 및/또는 에스테라제의 군으로부터 선택된다.

이런 이유로, 특히, 본 발명에 따른, 그리고 본 명세서에서 공개된 바와 같은 조성물은 식품 가공 및 양조에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른, 그리고 본 명세서에서 공개된 바와 같은 조성물은 식품 공정, 구체적으로 낙농산물의 공정, 양조, 과일 쥬스 공정, 구체적으로 과일 쥬스 제거, 설탕 생산, 부드러운 고기 생산, 와인 생산 등에 이용될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른, 그리고 본 명세서에서 공개된 바와 같은 조성물은 오염제거 공정들, 해독 공정들, 전분 산업, 종이 산업, 생물연료 산업, 고무 산업, 사진 산업 또는 세제 생산에 이용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 공개된 조성물은 추가 반응주기에 재사용을 위하여 재순환될 수 있다. 따라서, 촉매 공정들을 위하여 본 발명 따른 상기 조성물의 이용은 매우 유익하다.

더욱이, 본 발명의 조성물은 오염제거 공정들, 구체적으로 효소-의존적 오염제거 공정들에 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 원치않는 화학적 화합물들, 예를 들면 탄화수소, 방향성 탄화수소, 농약, 독소, 용매들, 농업용 화학물질 및/또는 중금속을 제거 또는 분해하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 오염된 토양 또는 물을 정화하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 따라서, 본 발명에 따른 상기 조성물은 오염물질을 제거 또는 분해시킴으로써 폐기물을 정제하는데 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 여과 공정을 통하여 물을 처리하기 위하여 충전층(packed-bed) 반응기 시스템 준비를 위하여 직접 이용될 수 있다. 추가 가능한 기술은 유출액을 처리하기 위하여 여과 막에서 단백질들 또는 단백질-유형 화합물들의 조정/매립이다. 본 출원은 개발 도상국과 관련될 수 있지만, 가정용수를 위하여 여과 형태에서 볼 수 있을 것이다.

원칙적으로, 본 발명에 따른 조성물은 임의의 촉매 공정, 즉, 최소한 한 가지 특정 단백질, 구체적으로 효소의 이용을 바탕으로 하는 임의의 공정에서 이용될 수 있다.

고유의 단백질 또는 효소 대신 본 발명에 따른 조성물의 사용은 상기 단백질 또는 효소가 재사용될 수 있고, 따라서 또다른 반응 주기에 다시 이용될 수 있는 장점을 가진다. 이것은 관심대상의 단백질, 구체적으로, 상기 괌심 효소를 생산 또는 분리에 비용 및 노력을 줄여준다. 상기 조성물이 관심대상의 보호안된 단백질 대신 이용되는 경우, 관심 대상의 총 요구되는 양은 단일 생물촉매성 반응이 획득될 때 보다 더 적다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 대규모로 생산될 수 있고, 기질의 고처리율(high through-put)이 대개 요구되는 산업 제조 공정들의 이용에 특히 적합하다. 단리된 또는 재조합 단백질들, 특히 효소들은 광범위한 다양한 산업 부분내 몇 가지 용도를 가지고 있다. 효소들은 예를 들면, 식품 산업, 화학적 산업 및 단백질 공학에 이용된다. 특히, 이들은 거울상체적으로 순수한 아미노산들, 희귀 당, 예를 들면 푸락토즈, 페니실린 및 이의 유도체들, 세척 물질, 뿐만 아니라 다른 화학적 화합물들의 생산에 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 고정된 그리고 보호된 효소는 이의 생물촉매성 활성을 증가시키기 위하여 유전공학적으로 또한 최적화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 기능성 성분의 특별히 양호한 보호를 제공하여, 상당히 불리한 조건하에 조성물의 이용을 허용한다. 이것은 전적으로 새로운 용도 또는 활성의 신속한 감소로 인하여 사용하기에 너무 고가이며, 따라서, (보호안된) 기능성 성분들의 양을 증가시킬 필요성을 초래하게 되는 물질의 사용에 대한 길을 흔히 열어주기 때문에 유익하다.

본 발명은 본 명세서에서 공개된 조성물에 더 관계하는데, 여기에서 상기 조성물은 비-독성이다. 더욱이, 본 발명에 따른 조성물은 대규모 생산에 잘 처리될 수 있다.

따라서, 상기 조성물은 인간 또는 동물의 요법, 구체적으로 포유류 요법에 이용되는 것이 가능하고, 그리고 유익하다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 인간 또는 동물 요법에 이용될 수 있도록 약학 조성물로써 제형화될 수 있다.

특히, 상기 조성물은 스핑고미엘린분해효소 결핍 (ASMD) 증후군, Niemann-Pick 질환 (NPD), 리소좀 저장 질환, Gaucher 질환, Fabry 질환, MPS I, MPS II, MPS VI 글리코겐 저장 질환 유형 II, 암, 알레르기 질환, 대사 질환, 심혈관 질환, 자가면역 질환, 신경 시스템 질환, 림프 질환 및 바이러스 질환 중 하나의 요법에 이용될 수 있다.

본 발명에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 특정 효소의 결핍 또는 부재에 의해 유도된, 질환을 앓고 있는 환자에서 효소 대체 요법(ERT)에 이용될 수 있다. 본 발명의 고정된 그리고 보호된 포멧에서 결핍 또는 손실 효소를 포함하는 조성물은 단독으로 투여되거나, 또는 동물, 구체적으로 포유류, 더 구체적으로 인간에서 전술한 질환의 요법에 사용되는 다른 약물과 복합되어 투여될 수 있다.

특히, 암 요법에서 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 보호 층에 의해 보호된 효소를 제공하고, 이의 촉매 활성은 하나 또는 그 이상의 대사물질의 결핍으로 이어지는데, 이는 생존을 위하여 암 세포에 의해 요구된다.

예를 들면, 특정 암들에서 암 세포들은 효소, 이를 테면, 아르기노숙시네이트 합성효소가 부족하여, 아르기닌에 대하여 세포는 영양요구성(auxotrophic)이 된다. 아르기닌 분해 효소 이를 테면, 예를 들면, 보호 층에 의해 보호된 아르기나제를 포함하는 본 발명에 따른 그리고 본 명세서에서 설명된 조성물을 제공함으로써 아르기닌 수준의 감소는 암 세포에는 치명적일 수 있고, 정상 세포는 영향을 받지 않거나 또는 최소한으로 치명적으로 영향을 받지 않는다.

또다른 측면에서, 본 발명에 따른, 그리고 본 명세서에서 공개된 바와 같은 조성물은 질환, 장애 또는 전술한 질환의 상태 또는 징후를 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에 이용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 본 발명의 조성물과, 본 명세서에서 설명된 바와 같이 약학적으로 수용가능한 운반체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 치료요법적으로 및/또는 예방학적으로 효과적인 양으로 제공될 수 있다.

예를 들면, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 크림, 테블릿, 알약, 생체흡착성 패취, 스폰지, 필름, 로젠지(lozenge), 하드 캔디(hard candy), 웨어퍼(wafer), 구(sphere), 롤리팝(lollipop), 판-모양(disc-shaped)의 구조, 또는 스프레이(spray) 형태로 제형화될 수 있다.

상기 조성물은 전신, 비강내, 볼, 구강, 경점막, 기관내(intratracheal), 정맥내, 피하내, 요도관, 질내, 설하, 기관지내, 폐내, 경피 또는 근육내 투여에 의해 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 신체 안으로 투여된 후, 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 분해, 구체적으로 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 프로테아좀(proteasomal) 분해를 막는데 더 이용될 수 있다. 단백질들은 프로테아좀 분해를 위하여 작은 단백질, 소위 유비퀴틴(ubiquitin)으로 테그된다. 본 발명에 따른 조성물의 사용으로 관심대상의 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 유비퀴틴-테그를 방지할 수 있고, 따라서 프로테아좀에 의한 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 분해를 또한 막는다. 따라서, 투여된 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 수준은 환자의 혈액 및 조직 안에서 더 오랜 기간 동안 안정적으로 유지될 수 있다.

상기로부터, 본 발명의 일부는 운반체, 구체적으로 고체 운반체의 표면에서 고정된 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것으로 간주될 수 있으며, 여기에서 전술한 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 자가-어셈블링 빌딩 블록들로 구성된 보호 물질 안에 완전하게 또는 부분적으로 매립된 것으로 이해될 수 있다. 보호 물질의 이들 빌딩 블록은 고정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 주변에 다공성 나노-환경을 확립하기 위하여, 운반체 표면과 운반체 표면 상에 고정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물 주변에서 자가-어셈블리를 할 수 있다. 전술한 다공성 나노-환경의 확립은 보호 물질에 의해 제공되는 선택된 작용기들에 의해 확립될 수 있는데, 이들 기능 기는 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 화학 기들과 상호작용하며, 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 고유한 입체형태는 안정화되며, 이의 기능은 보존된다.

좀더 상세한 그리고 특이적 구체예에 따르면, 본 발명은 운반체, 구체적으로 고체 운반체의 표면에 고정된 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 전술한 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 자가-어셈블링 빌딩 블록들로 구성된 보호 물질 안에 완전히 또는 부분적으로 매립된다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 보호 물질은 중합화 반응할 수 있는 물질과 관련된 것으로 이해되며, 이 물질은 운반체 물질의 표면으로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 상기 보호 물질은 단량체적 물질이거나 또는 이러한 단량체적 물질이 큰 분획으로 포함되며, 액체 상태로 제공된다. 중합화 동안, 상기 보호 물질은 운반체 표면 상에 그리고 고체 운반체 표면에 고정된 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물 주변에 자가-어셈블리할 수 있다. 이러한 방식에서 상기 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 운반체 물질의 표면으로부터 상기 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 방향으로 자라난 보호층, 또는 상기 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물로부터 운반체 물질의 표면 방향으로 자라난, 또는 이 둘 모두의 경우 보호 층에 매립되게 된다. 중합화된 후, 상기 보호 물질은 보통 고체 상태다.

본 발명에 따른 선호되는 방법을 적용하여, 중합화된 보호 물질은 단백질 또는 단백질-유형 화합물 주변에 다공성 나노-환경을 제공하며, 그 다음 완전하게 또는 부분적으로 보호 물질에 의해 매립된다. 선호되는 구체예에서 상기 보호 물질은 유기실란 단량체(들)일 것이다.

선호되는 구체예에서, 상기 조성물은 규소 상에서 효소 고정에 의해 획득되며, 규소의 APTES 변형과 글루타알데히드 가교 화학에 의해 영향을 받고, 그 다음 주형으로써 상기 효소 주변 유기실한 단량체들의 자가-어셈블리가 영향을 받으며, 물 안에서 폴리축합 반응 동안 첨가제의 사용의 필요와 함께 영향받는다.

본 명세서에서 "완전하게 매립된 단백질 또는 단백질-유형 화합물"이란 표현이 이용될 때, 이는 본 발명에 따른 관심 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 본 발명의 다양한 구체예들에서 정의된 바와 같이, 자가-어셈블링된 보호 물질에 의해 100% 덮힌다는 것을 의미하는 것이다.

본 명세서에서 이용된 "부분적으로 매립된 단백질 또는 단백질-유형 화합물"이란 표현 및 이와 유사한 표현은 본 발명에 따른 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 본 발명의 다양한 구체예들에서 정의된 바와 같이 자가-어셈블링된 보호 물질들에 의해 완전하게 덮히지 않고, 따라서 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 보호 물질 안에 완전하게 매립되지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 다양한 구체예들에서, 관심 대상의 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 적어도 5%는 보호 물질에 의해 덮히지만, 일반적으로 최소한 10% 이상이 덮히게 될 것이며, 따라서 기능성 성분의 보호는 개선된다. 이러한 최소한의 매립이 때로 충분할 수 있지만, 일반적으로 더 나은 보호 및 기능성 성분의 유지를 위하여 더 높은 수준의 매립이 더 선호되며, 따라서 전형적으로 구체적으로 최소한 50% 매립이 제공될 것이다. 특별히 선호되는 구체예에서, 상기 매립은 관심 대상의 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 최소한 80%, 구체적으로 최소한 90%, 구체적으로 99%는 자가-어셈블링된 보호 물질에 의해 덮힐 것이다. 이런 이유로, 기능성 성분이 전반적으로 씻겨나가지 않도록 매립 수준이 선택되는 것이 매우 바람직하다는 것은 자명하다. 기능성 성분의 분자들의 원형 또는 실린더형 모양으로 추정하면, 최소한 50%의 매립이 이용되지만, 단순히 기하학적 고려로부터 전형적으로 최소한 70% 매립이 바람직하고, 그러나, 측쇄 및 이와 유사한 것들의 존재에 따라 씻겨나감을 방지하는데 있어서 더 낮은 수준 이를 테면, 30%도 충분할 수 있다는 것이 자명할 것이다. 다시, 씻겨나감의 측정은 용이하게 결정되며, 따라서 보호 층의 충분한 두께 또는 매립 수준이 결정될 수 있음이 주지되어야 한다.

다른 한편, 기능성 성분 유지 보호 층의 두께가 보호를 개선시키기 위하여 지나칠 필요는 없다. 상기 기능성 성분 분자들이 거의 또는 완전하게(즉, 100%) 덮혀 있는 경우, 보호층 두께의 추가 증가 필요 없이, 기능성 성분 분자들과 높은 수준으로 알맞게 중첩되는 가교-연계된 물질 형태에 의한 기능성 분자들의 보유와 화학물에 의한 공격으로부터 보호는 모두 충분할 것이다. 화학적 공격에 대항한 일부 추가 보호는 확산이 더 두터운 층에 의해 감소될 때 획득될 수 있지만, 약 200% 이상 더 두터운 층을 가질 필요는 거의 없다. 일반적으로 상기 층은 기능성 성분의 더 긴 축 길이의 150% 보다는 더 작을 것이며, 가장 흔하게는 상기 층은 약 120% 보다는 더 작을 것이며, 선호되는 경우는 110%는 초과하지 않을 것이다. 작은 기능성 성분 분자들의 경우 조차, 상기 층 위에 가교-연계된 물질로부터 유지력은 대부분 경우 충분할 것이며, 심지어 마찰 상태 및 이와 유사한 것에서도 대부분의 공정들에서 이러한 층의 내구성은 충분할 것이다.

본 발명의 특이적 구체예에서, 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 공유적 결합에 의해 운반체 물질의 표면에 결합된다. 공유적으로 결합된 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 단백질 또는 단백질-유형 화합물을 보유하는 운반체 물질의 안정적 표면의 원인이 되며, 이는 보호물질의 중합화를 위한 안정적인 조건을 제공할 수 있다.

특이적 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 제공되며, 본 명세서에서 공개된 바의 보호 물질은 단량체 빌딩 블록들로 구성될 수 있으며, 운반체의 유리(free) 표면 및 운반체의 표면에 고정된 고정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물 주변에서 자가-어셈블리되는 것으로 평균적 지식을 가진 자는 또한 이해할 것이다. 그 다음 보호 물질의 단량체 빌딩 블록은 운반체의 유리 표면 상에 자가-어셈블리되고, 운반체 표면 상에 제공된 반응성 기들과 결합, 구체적으로 공유 결합을 형성하고, 그리고 자가-어셈블링 빌딩 블록들에 의해, 보호 층이 생성되며, 이 층은 운반체 표면에 (다소 강한 결합력에 의해) 고정되고, 그리고 고정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물 주변에 다공성 나노-환경을 제공한다. 상기 다공성 나노-환경은 본 명세서에서 정의된 바의 환경적 스트레스, pH 스트레스, 생물학적 스트레스, 기계적인 스트레스 및/또는 물리적인 스트레스가 포함된 다양한 스트레스들에 대항하여 고체 운반체의 표면에 고정된 상기 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물를 보호한다. 상기 다공성 나노-환경은 포어를 통하여 작은 분자들의 이동 및 관심 대상의 고정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물과 상호작용을 더 허용한다. 보호 층에 포허의 제공은 가교-연계된 물질에 의해 제공되는 유지력을 감소시킬 수 있지만, 이러한 힘은 여전히 적정 이상일 것이라는 것을 평균적 지식을 가진 자는 이해할 것이다.

특별히 선호되는 구체예에서, 보호 층의 표면에서 그라디언트를 만들어내기 위하여 상기 보호 물질은 추가 기능들을 도입시키기 위하여, 구체적으로 단백질 또는 단백질-유형 화합물들, 예를 들면, 효소의 기질과 상호작용하는 분자들을 위하여 생성된 보호층의 친화력을 개선시킴으로써, 외측 표면에서 추가적으로 화학적으로 변화될 수 있다.

본 명세서에서 공개된 바와 같이 본 발명에 따르면, 기능성 성분으로 이용된 매립 유지된 효소 또는 효소-유형 화합물의 촉매 부위를 보호하고, 이의 기능을 보호 및 보존하는 것이 가능하다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물에서 제공되고, 본 명세서에서 공개된 바와 같이, 전술한 고정된 그리고 보호된 효소 또는 효소-유형 화합물은 예를 들면:

a) 유리-보호안된 효소와 비교하였을 때 스트레스 조건하에 활성이 증가되며; 및/또는

b) 유리-보호안된 효소와 비교하였을 때 연속 작동에 이용하기 위한 증가된 회수가능성을 보유한다 .

본 명세서에서 이용된 바와 같이, "증가된 활성"이란 동일한 테스트 시스템에서 그리고 동일한 조건 하에서 테스트될 경우, 결합안된 그리고 비-보호된 포멧에서 제공되는 동일한 효소 또는 효소-유형 화합물의 활성보다 높은 고정된 그리고 보호된 효소 또는 효소-유형 화합물의 활성을 지칭하는 것으로 이해된다. 특히, 전술한 증가는 약 5%, 구체적으로 약 10%, 구체적으로 약 15%, 구체적으로 약 20%, 구체적으로 약 25%; 구체적으로 약 30%, 구체적으로 약 35%, 구체적으로 약 40%, 구체적으로 약 45%, 구체적으로 약 50%, 구체적으로 약 55%, 약 60%, 구체적으로 약 70%, 구체적으로 약 80%, 구체적으로 약 90%, 구체적으로 약 100%, 구체적으로 약 110%, 구체적으로 약 120%, 구체적으로 약 130%, 구체적으로 약 140%, 구체적으로 약 150%, 구체적으로 약 160%, 구체적으로 약 165%이다. 활성 증가의 정확한 양은 기능성 성분, 매개변수, 예를 들면 필요한 포어 크기, 층 두께 및 공정 매개변수에 따라 변화될 것이지만, 일반적으로 최소한 10%의 증가가 기대된다는 것을 인지할 것이다.

그 다음, "증가된 회수 가능성(recoverability)"이란 본 발명의 목적을 위하여 상기 조성물이 치료 목적으로 투여되지 않는, 즉, 산업 또는 실험실 사용에서 몇 번 재사용되는 본 발명에 따른 조성물의 능력을 지칭한다. 특히, 본 명세서에서 설명된 그리고 본 발명의 조성물은 2 내지 30 회, 구체적으로 5 내지 30 회, 구체적으로 10 내지 30 회, 구체적으로 15 내지 30 회, 구체적으로 20 내지 30 회, 구체적으로 25 내지 30 회, 구체적으로 최소한 30 회 재사용될 수 있다. 여기에서, "증가된 회수 가능성"은 상기 조성물의 기계적 회수와 실제 공정 후 상기 조성물에 손상 방지에 따라 달라지지만, 그러나, 일반적으로 산업 공정에 대한 적절한 개조가 관찰된다면, 손상한 손상없이 최소한 2회가 될 것으로 예상된다.

본 발명은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 특정 구체예에서 본 발명의 조성물에 관련되는데, 여기에서 전술한 조성물은 임의선택적으로 어뎁터 분자들, 고정 분자들, 스캐폴드 분자들 및/또는 수용체 분자들의 군에서 선택된 최소한 한 가지 분자를 더 포함한다. 임의의 이들 분자들을 이용하여 기질 (표적) 분자에 결합하고, 안정화시키고, 붙들고(capture), 옭아매고(trap) 또는 잡을 수 있다. 이는 기질 또는 상호작용 짝(partner)을 기능성 성분, 즉, 단백질 또는 단백질-유형 화합물, 구체적으로 상기 효소 또는 효소-유형 화합물에 더 근접하게 가져올 수 있도록 하며, 그리고 단백질 또는 단백질-유형 화합물과 이의 기질 또는 상호작용 짝의 상호작용을 용이하게 할 수 있도록 한다.

한 구체예에서 본 발명은 본 명세서에서 공개된 조성물에 관계되는데, 여기에서 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물 및/또는 최소한 한 가지의 선택적 분자들은 고체 운반체의 표면에서 공유적으로 결합된다. 상기 단백질 또는 단백질-유형 화합물 및/또는 최소한 한 가지의 선택적 분자들은 운반체의 표면에서 제공되는 반응성 기, 이를 테면, 예를 들면, 이-작용기성 가교-링커, 구체적으로 글루타알데히드에 의해 고체 운반체의 표면에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 테스트될 대상의 시료에서 질환 또는 장애의 질환에 이용될 수 있는데, 여기에서 상기 운반체의 표면에 고정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 포획(capturing) 분자이며, 이것은 특이적 상호작용 짝에 결합하며, 여기에서 전술한 특이적 상호작용 짝의 존재 또는 부재는 전술한 대상이 상기 질환을 앓고 있는지를 나타낸다. 적합한 포획 분자의 예는 특이적 항체 또는 기능적으로 등가 부분이다.

더욱이, 본 발명에 따른 조성물은 테스트될 대상의 시료 안에 질환 또는 장애의 진단을 위하여 이용될 수 있는데, 여기에서 운반체의 표면에 공정된 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 효소이며, 여기에서 상기 효소는 반응을 촉매하며, 전술한 시료 안에 특정 분자가 존재한다면, 구체적으로 상기 효소는 최소한 2개 분자 사이에 반응을 촉매하며, 여기에서 최소한 한 가지 분자는 전술한 시료로부터 유도된다. 예를 들면, 양성 반응은 용액의 색깔 변화 또는 분자의 침전, 그로 인하여 용액 안에서 고체의 형성일 수 있다.

테스트될 대상에서 질환 또는 장애 또는 특정 의학적 상태의 진단을 위한 방법은 다음 단계들을 포함할 수 있다:

a) 전술한 대상으로부터 시료를 획득하는 단계;

b) 음성 대조군 기준으로써 건강한 대상으로부터 시료를 획득하는 단계;

c) 양성 대조군 기준으로써 이 질환을 앓는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계;

d) a) 내지 c) 단계에서 획득된 각 시료 안에 존재하는 특정 분자의 양을 측정하는 단계;

e) 단계 d)에서 획득된 각 시료 안에 존재하는 전술한 분자의 양을 비교하는 단계;

도 1a) 고체 운반체 물질 상에 보호된 효소 생산을 위한 공정의 개요;
a) 상기 효소는 고체 운반체 물질 상에 결합되어 있고;
b) 고정된 촉매 주변으로 성장되는 보호층;
c) 시간이 경과함에 따라 보호 층은 완벽하게 상기 효소를 에워쌀 수 있다.
도 1b) 상기 효소 보호 전략의 도식적인 묘사;
a: 고형 지지대 (검정) 상에 효소 (원형 모양) 고정;
b: 상기 효소 주변의 보호 층 빌딩 블록들의 자가-어셈블리,
c&d: 보호 층 성장 (회색).
도 2a) 운반체 물질로 이용된 규소 나노입자들 (SNPs)의 SEM 현미경사진.
도 2b) 상기 효소-고정된 SNPs의 SEM 현미경사진.
보호 층 성장 4시간 후 (좌측),
6 시간 후 (중간)
그리고 20 시간 후
도 3: 반응 4, 6 및 20시간 후 측정된 보호층 층 두께
도 4: 증가된 시간 동안 42℃에서 열-가해진(stressed) 유리 효소 (검정 사각형) 및 보호된 (흰색 사각형) 효소들의 상대적 활성; (활성 값은 열 스트레스 없이 측정된 초기 활성 값으로 정상화되었다.)
도 5: 증가된 반응 온도에서 측정된 유리 효소 (검정 사각형) 및 보호된 (흰색 사각형) 효소들의 상대적 활성.
도 6: 상이한 pH 값에서 항온처리되고, pH 6.5에서 측정된 유리 효소 (흰색 막대) 및 보호된 (검정 막대) 효소들의 상대적 활성 ; (활성 값은 초기 활성 값으로 정상화 되었다.)
도 7: 상이한 pH 값에서 측정된 유리 효소 (빈 사각형) 및 보호된 (채워진 사각형) 효소들의 상대적 활성; (활성 값은 pH 6.5에서 관찰된 최대 활성으로 정상화되었다)
도 8: 실란 층 성장 동안 상대적인 효소 활성; (활성 값은 보호 층 없이 고정된 촉매의 활성으로 정상화되었다).
도 9: 증가된 열(65℃) 스트레스 기간에서 보호된 효소 (검정 사각) 및 기준 유리 효소 (빈 사각)의 상대적 활성; (활성 값은 온도 스트레스에 앞서 고정된 촉매의 활성으로 정상화되었다)
도 10: 본 발명에 따른 또다른 실시예의 증가된 반응 횟수에서 측정된 보호층 층 두께
도 11: 한 시간 동안 50℃에서 열 스트레스 받은 유리 락타제 및 APTES-TEOS 혼합물 또는 실혼 혼합물로 만들어진 층에 의해 락타제 의 상대적 활성
고체 운반체 물질 상에 보호된 호소의 생산을 위한 공정의 도식적 관점을 보여주는 도 1a)에 따르면; 상기 효소는 먼저 고체 운반체 물질에 결합된다. 비교 a). 그 다음, 고정된 촉매 주변으로 보호 층이 성장된다. 비교 b). 그 다음, 시간이 경과 함에 따라, 상기 보호 층은 상기 효소를 완벽하게 에워쌀 수 있다. 비교 c.
그 다음, 도 1 b)는 상기 효소 보호 전략의 도식적인 그림을 나타낸다; 우선, 상기 고체 규소 지지대 (검정) 상에 효소 (원형 모양) 고정; cmp. a).
그 다음 상기 효소 주변에 보호 층 빌딩 블록들의 자가 어셈블리가 일어난다. 그 다음, cmp. c&d, 상기 보호 층(회색)이 성장한다. 상기 효소 주변의 환경 (이를 테면, 표면 외측의 효소와 유기규소 층에 형성된 동공 사이에 상호작용)은 상당한 형태학적 안정 효과를 제공한다. 이 실시예에서, 상기 운반체 물질은 규소 (나노입자)이며, 그리고 보호 층은 규소 전구물질들 (테트라오르토규산염 & 유기-실란)의 폴리축합 반응에 의해 생성된 유기규소(폴리실세스퀴옥산(polysilsesquioxane)이다.
적절하게 폴딩된 효소만 활성이 있기 때문에, 스트레스에 대항하여 획득된 3차 단백질 구조의 안정성 증가는 활성 측정으로 판단된다.
도 2 a)에서 운반체 물질로 이용된 규소 나노입자들 (SNPs)의 SEM 현미경사진을 나타내고, 그리고 보호 층 성장 4시간(좌측), 6시간(중간) 그리고 20시간 후 효소 고정된 SNPs의 SEM 현미경 사진을 도 2a에 나타낸다.

실시예들

실시예 1: 고체 운반체 물질 상에 락타제 고정 및 유기-규소 ( 이를 테면 , 실세스퀴옥산 ) 층에 의한 보호

고체 운반체 물질 예를 들면 규소 나노입자들 (SNPs) 상에 락타제/β-갈락토시다제 (EC 3.2.1.23) 고정 및 보호는 다음과 같은 4가지 주요 단계를 포함한다:

i. 상기 효소와 추가적인 화학적 결합을 위하여 고정 점들(이를 테면, 아민)을 도입시키기 위하여 SNPs의 표면 변형

ii. 도입된 아민 모이어티와 이-작용기성 가교-링커 (이를 테면, 글루타알데히드)의 화학적 반응

iii. 이-작용기성 가교-링커의 유리 활성 기능을 통하여 SNPs의 표면에서 효소 결합

iv. 보호 층을 얻기 위하여 고정된 효소들과 SNPs의 유리 표면 주변으로 실란 빌딩 블록의 폴리축합반응.

이러한 합성 과정으로 SNPs의 표면에서 상기 효소를 에워싸는 보호층이 형성되고, 따라서 상기 효소가 보호된다. 생성된 보호 층의 두께는 목표로 하는 용도에 따른 디자인에 따라 조정될 수 있다.

i) SNPs는 다음과 같이, Imhof et al. (J. Phys. Chem . B 1999, 103, 1408)의 보고서로부터 각색된 고전적인

방법을 이용하여 만들어졌다. 에탄올 (345.4 ml), 암모니아 25% (39.3 ml) 및 TEOS (테트라에틸오르토규산염, 15.3 ml)는 밑 둥근 플라스크 안에서 혼합되었고, 이 혼합물은 20℃의 항온에서 20시간 동안 600rpm에서 교반되었다. 생성된 침전물은 결과적으로 에탄올로 2회, 그리고 물로 2회 세척되었고, 동결-건조되어 주사 전자 현미경 (Zeiss, SUPRA 40 VP)을 이용하여 특징화되는 아무것도 걸치지 않은(bare) SNPs를 얻었다. 획득된 현미경사진은 분석® (Olympus) 소프트웨어 패키지 (100회 측정에서 실행된 통계학적 분석)를 이용하여 입자 크기 측정에 이용되었다. 도 2a는 생성된 SNPs의 대표적인 현미경사진을 제공한다.

ii) SNPs의 표면에 보호된 효소의 추가 고정을 허용하는 아민 기능을 도입시키기 위하여, 이들은 아미노-실란과 반응되었다. 보호 층의 추가 부착을 위하여 실라놀기를 남겨두기 위하여 이러한 변형은 오직 부분적이어야 한다는 점이 중요하다.

더욱 상세하게, 물에서 SNPs 현탁액 (18 mL; 3.2 mg/ml)은 20℃에서 90분 동안 APTES (3-아미노프로필트리에톡시실란, 11 mg)와 항온처리되었다. 물에서 2회 세척 단계 후, 30분 동안 생성된 아미노-변형된 SNPs는 1 g/L의 최종 농도로 이-작용기성 가교-링커 (상기 효소의 추가 고정이 허용되도록).

iii) 물에서 2회 세척 단계 후, 생성된 SNPs는 MES (2-(N-몰포리노) 에탄술폰산) 완충 (pH 6.2, 1 mM, 5 mM MgCl₂)에서 재-현탁되었고, 20℃에서 1 시간 동안 400rpm에서 자석 교반하에 상기 효소, 락타제와 함께 항온처리되었다.

iv) 생산된 효소-고정된 SNPs를 상기 효소 주변에서 자가-어셈블리되어 폴리축합 반응함으로써 효소 주변에 보호 층을 만드는 실란 빌딩 븍록 혼합물과 항온처리됨으로써, SNPs 상에 고정된 효소의 보호가 실행되었다. 표면에 있는 관심 대상의 단백질 또는 단백질-유형 화합물과 이의 아미노산 잔기에 따라 적합한 빌딩 블록들이 선택되어야 한다. 자가-어셈블링 빌딩 블록들의 바람직한 선택을 위한 예들이 표 1에 제시되는데, 이 표는 추정 보호 층 빌딩 블록들의 목록과 보호된 단백질의 단백질 표면의 아미노산 잔기들과 자가-어셈블링된 빌딩 블록 사이에 상호작용하는 주요 힘이 제시된다. 상기 폴리축합 반응은 SNPs의 표면에서 이 층의 부착이 허용되도록 SNPs의 노출 표면(bare surface)에서 또한 일어난다. 이를 위하여, 효소-고정된 SNPs (18 mL; 3.2 mg/ml)들은 우선 20℃, 400 rpm의 교반 하에서 36 μl의 TEOS와 반응되었다. 반응 2 시간 후, 18 μl의 APTES가 추가되었고, 4℃에서 시간 경과에 따라 보호층의 성장이 허용되었다. SNPs의 시료들은 매 2시간마다 수거되었고, MES 완충액에서 2회 세척 단계에 의해 20시간 후 반응이 종료되었다. 상기에서 설명된 바와 같이, 상이한 시점에서 실란 보호층 두께가 측정되었고, 도 2b와 3에 나타낸다. 이들 결과로부터, 반응 4시간, 6시간 및 20시간 후 각각 유기실란 층의 두께는 2, 10 및 25 nm이다. 이들 결과는 효소-고정된 SNPs의 표면에서 유기규소 층 성장의 성장 조절 가능성을 확인시켰다.

이렇게-생산된 입자들의 효소 활성은 인위적인 기질로써 오르토-니트로페닐-β-갈락토시드 (ONPG)를 이용하여 분석되었고, 이어서 알카리 조건에서 420 nm에서 분광학적으로 생성물 오르토-니트로페놀 (ONP)의 외양이 드러났다. 더욱 상세하게, SNPs는 증가된 실란 폴리축합 기간에서 수집되었고, MES 완충액에서 2회 세척되었다. 락타제 활성을 측정하기 위하여, SNPs는 40℃, pH 6.5에서 ONPG (40 mM)와 5분 간 항온처리되었고, 동일한 용적의 Na₂CO₃ (1 M)을 추가하여 이 반응을 중단시켰다. 상기 결과는 25 nm의 보호층을 보유한 입자들은 최초 효소 활성의 45%을 가지며, 이는 상기 효소가 유기규소 보호 층에 매립되어 있을 때에도, 부분적으로 이의 활성이 유지된다는 것을 보여주었다.

도 3에 있어서, 시간의 경과에 따라 획득된 층 두께는 폴리축합 반응 역학에 의존적이며, 따라서 (i) 시간, (ii) 온도 및 (iii) 이용된 유기실란 혼합물에 의존적이다. (i)의 경우 반응을 더 오래유지할수록 보호 층의 두께는 두터워질 것임이 자명하다. 온도의 경우, 온도가 더 높을 수록 운동학이 빨라지며, 따라서 보호 층은 더 두터워질 것임을 인지할 것이다(역도 성립). 단량체들의 혼합물에 있어서, 기본적 특징을 갖는 유기실란 (APTES 또는 UPTES)은 보호 층 성장을 부추긴다.

도 3에서, 초기 사전-가수분해 및 더 많은 소수성 단량체들의 가용화의 원인이 되는 초기 지연이 관찰될 수 있다. 이러한 초기 반응이 실시된 후, 보호 층의 두께는 측정가능하다(이를 테면, 주사 전자 현미경과 소프트웨어를 이용한 입자들 크기의 통계학적 분석). 보호 층이 필요한 두께에 도달되면, 반응 및 따라서 보호층이 더 두터워지는 것이 중단될 것이며, 보호 층 구축 폴리축합 반응의 경우, 입자들의 세척 및 반응안된 단량체들의 제거에 의해 실행될 수 있다.

표 1에 있어서, 다음이 주지된다: 우선, 표 1은 특이적 기능성 성분의 매립과 관련되어 제공되며, 표 1에서 공개된 정보와 이와 관련하여 다른 기능성 성분들 또한 관련될 것임을 이해할 것이다. 그 다음, 표 1의 목록들이 완벽한 것은 아니며, 본 발명에 따른 방법에 이용될 수 있는 다른 유기실란 단량체들이 있음을 평균적 지식을 가진 자가 인지할 것이다.

이 점에 있어서, 완벽한 목록을 확립하는 것이 어렵기 때문에, 이를 테면, 비-상업적인 실란 또한 생산될 수 있고, 이용될 수 있어서, 상기 목록은 하나도 빠지지 않는 목록이 아님을 더 주지시킨다. 더욱이, 특정 경우들에 있어서, 충분히 큰 포어를 획득하기 위하여, 유기실란 운반 거대기 및 벌키 군들, 이를 테면, 옥타데실트리메톡시실란 및 트리페닐-트리에톡시실란을 이용하는 것이 유익할 수 있다.

추가적으로, 표에 있는 실란 뿐만 아니라 명세서의 다른 부분들을 통하여 빈번하게 나타나는 것들은 트리에톡시 유도체로 제공되며; 여전히, 모든 가능한 유도체들보다는 단일 유도체, 예를 들면 이를 테면, 트리-메톡시 또는 트리-히드록시에톡시 유도체들은 명세서 범위를 제한하기 위함이 아니라, 판독을 단순화시키고, 동시에 판독자가 유기 실란을 이용가능하도록 하기 위하여 실행되었다는 것도 주지할 것이다. 평균적 지식을 가진 자는 참조가 일반적으로 "실란"이 될 수 있다 (이를 테면, 표에서 아미노프로필트리에톡시 실란으로 지칭되는 대신 아미노프로필 실란)는 점을 인지할 것이다. 더욱이, 목록은 특정 주요 상호작용에 구체적으로 관련된 실란에 있어서 조차도 완벽하지 않다. 예로써, 우레이도프로필트리에톡시실란 및 (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리메톡시실란은 더 강력한 H-결합 제공자 수용자 단량체들로 포함될 수 있다.

그 다음, CYS와 MET는 표 1에 포함되지 않는다. 그러나, 이들은 기능성 성분의 표면에 존재한다면, 이들 아미노산들과 상호작용하는 적합한 유기실란을 선택하는 것이 가능하다. 예를 들면, 이들 아미노산들은 -SH 기를 보유한 적합한 유기실란, 예를 들면 (3-멀캅토프로필)트리메톡시실란 또는, 더 일반적인 방식에서 (3-멀캅토프로필) 실란에 공유적 이황화물 다리 (-S-S-)를 형성할 수 있다는 사실을 이용할 수 있다. 이런 이유로, 이를 테면, 기능성 -SH 기를 보유하는 유기 실란이 목록에 또한 추가될 수 있다.

최종적으로, 표 1은 락타제 고정의 포획화에 있어서 뿐만 아니라 다른 기능성 성분들을 매립시키려는 의도를 가진 평균적 지식을 가진 자에게도 마찬가지로 유익할 것임이 자명할 것이다.

실시예 2: 열적 스트레스에 대항하는 보호

본 명세서에서 설명된 방법으로 보호된 효소들의 열 저항은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 생산된 20nm의 보호 층을 가진 락타제-변형된 입자들을 이용하여 테스트되었다. 촉매 활성은 실시예 1에서 또한 설명된 ONPG 비색적(colorimetric) 방법을 이용하여 측정되었다.

우선, 보호된 효소 및 유리 효소들은 증가된 시간 동안 42℃에서 열적으로 스트레스를 받았고, 활성이 측정되었다; cf. 도 4.

유리 효소들의 활성은 5분 후 70%, 30분 후 45% 그리고 60분 후 8%로 떨어지며; 테스트된 모든 조건 동안 보호된 효소는 90%보다 더 높은 활성 값을 유지하였다는 것을 볼 수 있다. 흥미로운 것은, 상기 활성은 20 분과 30 분의 열 스트레스 동안 심지어 112%로 증가되었다. 이 결과는 여기에서 설명된 상기 효소 보호 전략의 장점을 분명하게 설명하였다.

또한, 상기 효소 활성은 증가된 온도 값에서 측정되었고; 그 결과는 도 5에 보고된다.

도 5에서 보고된 결과로부터, 유리 효소의 활성은 50℃에서 52% 값으로 떨어질 수 있고, 50, 55 및 60℃에서는 활성이 측정될 수 없다. 보호된 효소의 경우, 흥미롭게도, 상기 활성은 45℃, 50℃ 및 55℃의 반응 온도의 경우 106%, 113% 및 111%로 증가되었다. 60℃에서 측정된 반응의 경우 11%의 약간의 감소가 관찰되었다.

실시예 3: 보호된 락타제들의 pH 저항 및 pH 범위

본 명세서에서 설명된 방법으로 보호된 효소들의 열 저항과 이들의 pH 활성 범위 확장은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 생산된 20nm의 보호 층을 가진 락타제-변형된 입자들을 이용하여 테스트되었다. 촉매 활성은 실시예 1에서 또한 설명된 ONPG 비색적(colorimetric) 방법을 이용하여 측정되었다.

우선, 유리 효소들과 고정된 효소들은 상이한 pH 값 (4.8, 6.5, 7.6, 8.8)에서 15분 동안 항온처리되었고; 그 다음 pH 값은 최적 촉매 pH (6.5)로 조정되었고, 상이한 시스템들의 활성이 측정되었고; 결과는 도 6에 보고된다. pH 6.5에서 처리는 고정된 효소 또는 유리 효소에 영향을 주지않았고, pH 4.8에서 처리는 유리 효소의 활성을 25%로 급격히 감소시키는 원인이었으며, 보호된 효소는 영향을 받지 않고 유지되었다는 것을 볼 수 있다. pH 7.6 및 8.8 값에서 유리 효소는 활성의 15% 와 28%를 각각 상실하였으며, 보호된 효소는 pH 7.6에서 영향을 받지 않았으며, pH 8.8에서는 단지 활성의 10%만 상실되었다.

추가적으로, 유리 락타제와 고정된 락타제의 촉매 활성은 상이한 pH 값 (5.5, 6.0, 6.5, 7.5 및 8.0)에서 실시예 1에서 또한 설명된 ONPG 비색적(colorimetric) 방법을 이용하여 측정되었다. 측정된 상대적 활성 값은 도 7에서 보고된다.

이들 두 가지 효소 시스템은 최적 pH 값 6.5를 가지고 있었다. pH를 7.5와 8.0으로 증가시키면, 유리 효소는 각각 20% 및 40%의 활성이 감퇴함을 보여주었고, 한편 보호된 효소는 동일한 조건에서 단지 5% 및 18%의 활성만 잃었다. 산성 pH 값의 경우, 유리 효소는 각각 pH 6.0 및 5.5에서 활성의 40%와 80%를 상실하였지만, 보호된 효소는 단지 2%와 15%의 활성만 잃었다. 이들 결과는 효소의 보호는 이의 활성 범위 확장을 결과하였다는 것을 확인시켰다.

실시예 4: 단백질분해효소 공격에 대항한 보호

본 명세서에서 설명된 방법으로 보호된 효소들의 프로테아제에 대한 저항은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 생산된 20nm의 보호 층을 가진 락타제-변형된 입자들을 이용하여 테스트되었다. 유리 효소들과 보호된 효소들은 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4)내에서 프로테아제 K와 트립신 (1 mg/mL)과 함께 37 ℃에서 60분 동안 항온처리되었다. 유리 효소의 활성은 0으로 떨어진 반면, 보호된 효소의 활성은 변화없었다.

실시예 5: SNPs 상에서 산 포스파타제 고정 및 유기-규소 ( 이를 테면 , 실세스퀴옥산 ) 층에 의해 보호, 그리고 온도 스트레스 테스트.

SNPs 상에 산 포스파타제 (EC 3.1.3.2) 고정 및 유기실한 층의 성장에 의한 보호는 실시예 1에서 설명된 것과 같이 실행되었다. 보호 층 두께를 증가시키면서, 보호된 촉매들이 생성되었고, 인위적인 기질로써 파라-니트로페닐포스페이트(pNPP)를 이용하여 분석되었다. 분광학적으로 405 nm에서 생성물 p-니트로페놀 (pNP)의 출현이 있었고, 알칼리 조건에서 드러났다.

간략하게 설명하자면, 산 포스파타제 활성을 측정하기 위하여, 보호된 생물촉매들은 pNPP (15 mM) pH 4.8과 37℃에서 5분 동안 항온처리되었고, 동량의 NaOH (100 mM) 수성 용액을 첨가함으로써 이 반응은 중단되었다; 결과는 도 8에 제시된다. 효소 활성은 보호층의 존재로 증가된다는 것을 볼 수 있다.

온도에 대한 저항은 65℃에서 증가된 기간 동안 생산된 입자들 (및 가용성 기준 효소)을 항온처리함으로써 분석되었다. 활성 결과는 도 9에서 보고된다. 유리 참조 효소는 10분 후 90% 이상의 활성 그리고 30분 후 95% 이상의 활성을 상실하지만, 보호된 효소는 처리 10분 후 80% 그리고 60분 후 75% 이상을 유지한다는 것이 설명된다.

실시예 6: SNPs 상에 락타제 고정 및 실란 혼합물로 만든 층에 의한 보호

SNPs에 락타제/β-갈락토시다제 (EC 3.2.1.23) 고정은 실시예 1에서 설명된 것과 같이 실행되었다. 생산된 효소-고정된 SNPs를 상기 효소 주변에서 자가-어셈블리되어 폴리축합 반응함으로써 효소 주변에 보호 층을 만드는 실란 빌딩 븍록 혼합물과 항온처리됨으로써, SNPs 상에 고정된 효소의 보호가 실행되었다. 이용된 실란들은 다음과 같다: APTES, TEOS, 벤질트리에톡시실란 (BTES), 프로필트리메톡시실란 (PTES), 및 히드록시메틸트리에톡시실란 (HMTES). 더욱 상세하게, 효소-고정된 SNPs (18 mL; 3.2 mg/ml)는 20℃에서 400rpm에서 교반 하에 우선 36 μl의 TEOS와 반응되었다. 반응 1 시간 후, 18 μl APTES, 18 μl BTES, 18 μl PTES 및 36 μl HMTES가 추가되었고, 보호 층은 20℃에서 성장되었다. 반응 횟수를 증가시키면서 SNPs 시료들이 수집되었고, 20 시간 후 MES 완충액에서 2단계 세척에 의해 이 반응은 중단되었다. 상이한 시점들에서 보호 실란 층 두께는 이미 설명된 것과 같이 측정되었다. 도 10에서 볼 수 있는 것과 같이, 반응 4, 6, 10, 17 및 20 시간 후, 유기실란 층의 두께는 차례로 2, 8, 12 및 16 nm이었다.

이렇게-생산된 보호된 락타제의 열 저항은 50℃에서 60 분간 항온처리에 의해 테스트되었고, APTES-TEOS 혼합물을 이용하여 보호된 촉매와 비교되었으며, 도 5에서 나타낸다. 상기 결과는 유리 락타제의 활성이 50℃에서 1 시간 처리 후 5%보다 낮아졌지만, APTES-TEOS 또는 실란 혼합물로 만들어진 층으로 보호된 락타제 활성은 차례로 110 % 및 150 %로 더 높다는 것을 보여주었다 (도 11).

본 발명은 EP 13 17 850.4의 우선권을 주장한다. 공개 목적으로 본 명세서에는 우선권을 제공하는 서류가 온전히 동봉된다.

따라서, 상기에서 설명된 것들은 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물을 포함하고, 임의선택적으로 고체 운반체의 표면에서 고정된 어뎁터 분자들, 고정 분자들, 스캐폴드 분자들 및/또는 수용체 분자들로부터 선택된 최소한 한 가지 분자를 더 포함하는 조성물이며, 여기에서 전술한 단백질 또는 단백질-유형 화합물과 상기 최소한 한 가지 선택적 분자는 자가-어셈블링 빌딩 블록들로 구성된 보호 물질안에 완전히 또는 부분적으로 매립되며, 이들 빌딩 블록들은 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 화학적 기들과 상기 최소한 한 가지 선택적 분자와 상호작용하여, 운반체 표면 상에 그리고 상기 최소한 한 가지 선택적 분자 주변에 다공성 나노-환경을 만들는 작용기들을 포함하며, 이 나노환경은 단백질 또는 단백질-유형 화합물과 상기 최소한 한 가지 선택적 분자의 고유한 형태를 안정화시키고, 이의 기능을 보존한다.

더욱이, 이러한 조성물에서 고체 운반체는 나노입자, 구체적으로 규소 나노입자 (SNP), 구체적으로 금 나노입자, 구체적으로 티타늄 나노입자라고 제안되었다.

더욱이 이러한 조성물에서 단백질 또는 단백질-유형 화합물이 고체 운반체에 결합은 유적 결합임이 제안되었다.

더욱이, 이러한 조성물에서 나노입자 크기 범위는 20 내지 1000 nm, 구체적으로 200 내지 500 nm, 구체적으로 300 내지 400 nm 범위로 제안되었다.

더욱이, 이러한 조성물에서, 보호 물질의 두께는 1 내지 100 nm, 1 nm 내지 50 nm, 1 nm 내지 30 nm, 1 nm 내지 25 nm, 1 nm 내지 20 nm, 1 nm 내지 15 nm, 바람직하게는 5 nm 내지 15 nm로 제안되었다.

더욱이, 이러한 조성물에서, 자가-어셈블링된 보호 물질은 기질의 확산을 허용하는 포어 크기, 구체적으로 1 nm 내지 10 nm, 구체적으로 2 nm 내지 9 nm, 구체적으로 3 nm 내지 8 nm, 구체적으로 4 nm 내지 7 nm, 구체적으로 4 nm 내지 6 nm, 구체적으로 4 nm 내지 5 nm의 포어 크기를 보유한다.

더욱이, 이러한 조성물에서 자가-어셈블링 보호 물질의 작용기들은 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 아미노산 측쇄들과 상호작용하는, 구체적으로 약한 힘 상호작용에 기반을 둔 기들임이 제안되었다.

더욱이, 이러한 경우 전술한 보호 물질은 유기규소라는 것이 제안되었다.

더욱이, 전술한 단백질 또는 단백질-유형 화합물은 효소 또는 효소-유형 화합물, 구체적으로 산화환원효소, 전달효소, 가수분해효소, 리아제, 이소메라제 및/또는 리가제로 구성된 집단에서 선택된, 효소 또는 효소-유형 화합물이다.

더욱이, 이러한 조성물에서 전술한 단백질 또는 단백질-유형 화합물 및/또는 최소한 한 가지 선택적 분자들은 이-작용기성 가교-링커, 구체적으로 글루타알데히드, 디숙시니미딜 타르트레이트, 비스[술포숙시니미딜] 수베레이트, 에틸렌 글리콜비스(술포숙시니미딜숙시네이트), 디메틸 아디피미데이트, 디메틸 피멜이미데이트, 술포숙시니미딜 (4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠, 활성화된 술프히드릴 (이를 테면, 술프히드릴-반응성 2-피리딜디티오)의 집단에서 선택된 이-작용기성 가교-링커에 의해 고체 운반체의 표면에 결합되는 것으로 제안되었다.

더욱이, 이러한 조성물에서, 보호 물질은 다음에 대항하여 보호를 제공한다:

a) 상기 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 최적 pH와 상이한 pH, 여기에서 이 pH 값은 최적 pH 값과 +/- 5, +/- 4; +/- 3, +/- 2, +/- 1, +/- 0.5 pH 단위가 상이하며; 및/또는

b) 화학적 스트레스들; 및/또는

c) 생물학적 스트레스들; 및/또는

d) 용매들; 및/또는

e) 물리적인 스트레스; 및/또는

f) 상승된 온도, 보호안된 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 최적 온도를 60℃, 구체적으로 50℃, 구체적으로 40℃ 더 높은, 구체적으로 30℃, 구체적으로 20℃, 구체적으로 10℃, 구체적으로 5℃를 초과한 상승된 온도이며; 및/또는

g) 감소된 온도, 보호안된 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 최적 온도를 60℃, 구체적으로 50℃, 구체적으로 40℃ 더 높은, 구체적으로 30℃, 구체적으로 20℃, 구체적으로 10℃, 구체적으로 5℃를 벗어난 온도이다.

더욱이, 이러한 조성물에서 전술한 고정된 그리고 보호된 효소는 다음을 갖는다:

a) 유리-보호안된 효소와 비교하였을 때 스트레스 조건하에 활성이 증가되며; 및/또는

b) 유리-보호안된 효소와 비교하였을 때, 연속적인 작동에 이용하기 위한 증가된 회수 가능성.

그 다음, 이러한 조성물을 생산하는 방법은 다음의 단계들을 포함하는 것으로 제안된다:

a) 고체 운반체를 획득하는 단계; 그리고

b) 관심대상의 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물, 구체적으로 최소한 한 가지 효소 또는 효소-유형 화합물, 그리고 임의선택적으로, 최소한 한 가지 선택적 분자를 운반체의 표면에 고정시키는 단계; 그리고

c) 고체 운반체의 표면에 결합된 상기 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물과, 선택적 분자는 자가-어셈블링 빌딩-블록과 항온처리되어, 고체 운반체의 유리 표면과 고체 운반체의 표면에 결합된 상기 최소한 한 가지 단백질 및 또는 단백질-유형 화합물과 선택적 분자의 주변에 다공성 나노-환경을 얻는 단계, 그리고

d) 바람직한 두계를 가진 선호되는 보호 층을 수득하기 위하여 특정 시점에 보호 물질의 자가-어셈블리 반응을 중단시키는 단계.

더욱이, 이러한 조성물은 촉매 공정에 이용된다고 제안되었다.

더욱이, 이러한 조성물은 요법 이를 테면, 예를 들면, 스핑코밀레나제 결핍 (ASMD) 증후군, Niemann-Pick 질환 (NPD), 리소좀 저장 질환, Gaucher 질환, Fabry 질환, MPS I, MPS II, MPS VI and 글리코겐 저장 질환 유형 II, 암, 알레르기 질환, 대사 질환, 심혈관 질환, 자가면역 질환, 신경 시스템 질환, 림프 질환 및 바이러스 질환의 치료법에 이용된다고 제안되었다.

참고자료

1. C. Mateo et al., Enzyme Microb. Technol, 2007, 40, 1451

2. D. Brady and J. Jordaan, Biotechnol Lett, 2009, 31, 1639

3. R.C. Rodrigues et al., Chem Soc Rev, 2013 [Epub ahead of print]

4. H. R. Luckarift et al., Nat Biotechnol, 2004, 22, 211

5. U. Hanefeld et al., Chem Soc Rev, 2009, 38, 453

6. M. Hartmann and D. Jung, J Mater Chem, 2010, 20, 844

7. L. Hilterhaus et al., Bioproc Biosyst Eng, 2008, 31, 163

8. R. R. Naik et al., US2005095690; 2005

9. S.A. Werchant, WO2010039384; 2010

10. W. R. K. Schoevaart, US 20120149082A1; 2012

11. Ostaszewski et al., US 2010/0240116 A1; 2010

12. R. Bond et al., US 7642077B2, 2010

13. R. Bond et al., WO2005056808, 2006

14. S. J. Chung et al., US 2010/0196937A1, 2010

15. J.H. Chang et al., US 2012/0264188A1, 2012

A. Auger et al., WO2011/058046A1, 2011

A. Auger et al., US 2012/0283379A1, 2012

16. A Leech et al., WO 2011/060129 A1, 2011

17. N. J. Lant et al., WO 2013/003025, 2013

18. L.S. Wong et al., Chem Rev, 2009, 109, 4025

19. S. C. Esener et al., WO2012142625 A2, 2012

20. Q. Husain, Crit Rev Biotechnol, 2010, 30, 41

21. H. Hirohara et al., EP0026672A2, 1981

B. Giacomini et al., J Mol Catal B- Enzym, 1998, 4, 313

A. Tanriseven and S. Dogan, Process Biochem, 2002, 38, 27

22. E.J. Mammarella and A.C. Rubiolo, J Mol Catal B Enzym. 2005, 34, 7

23. S. Rejikumar and S. Devi, Int J Food Sci Technol, 2001, 36, 91

I. Roy and M. N. Gupta, Process Biochem, 2003, 39, 325

24. N. Albayrak and S.T. Yang, Enz . Microb Technol, 2002, 31, 371

25. N. Albayrak and S. T. Yang, Biotechnol Prog , 2002, 18, 240

C. Mateo et al., Biotechnol Prog , 2004, 20, 1259

26. M. Ladero et al., Enzyme Microb Tech, 2000, 27, 583

27. L. Betancor et al., Biotechnol Bioeng, 2008, 99, 261

28. Y. Kuwahara et al., Chem Commun, 2012, 48, 2882

29. Z. Grosova et al, Biotechnol Lett. 2008, 30, 763

30. D.F.M. Neri et al., Catal Commun, 2008, 9, 2334

31. J. Hotchkiss and J. N. Talbert, US 2010196985A1, 2010

32. WO 93/07263 A2 (GENENCOR INT [US]) 15 April 1993 (1993-04-15)

33. US 6 268 329 B1 (MARKUSSEN ERIK KJ AELIG R [DK]) 31 July 2001 (2001 -07-31)

34. YONG-GINO XIA ET AL: "Protein recognition onto silica particles using chitosan as intermedium substrate", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALSRESEARCH PART A, vol: 90A, no. 2, 1 August 2009 (2009-08-01), pages 326-332, XP055099686, ISSN: 1549-3296, DOI: 10.1002/jbm.a.32084

35. MATEO ET AL: "Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques" ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, STONEHAM, MA, US, vol. 40, no. 6, 29 March 2007. (2007-03-29), pages 1451-1463, XP022003968, ISSN: 0141 -0229, DOI: 10.1oie/J.ENZMICTEC.2007.01.018

36. ULF HANEFELD ET AL: "Understanding enzyme immobilization", CHEMICAL SOCIETY REVIEWS, vol. 38, no. 2, 1 January 2009 (2009-01-01), page 453, XP055099160, ISSN: 0306-0012, DOI: 10.1039/b711564b

37. DEAN BRADY ET AL: "Advances in enzyme immobilisation", BIOTECHNOLOGY LETTERS, SPRINGER NETHERLANDS, DORDRECHT, vol. 31, no. 11, 10 July 2009 (2009-07-10), pages 1639-1650, XPO19746235, ISSN: 1573-6776, DOI: 10.1007/S10529-009-0076-4

38. GALLIKER P ET AL: "Laccase-modified silica nanoparticles efficiently catalyze the transformation of phenolic Compounds", JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE, ACADEMIC PRESS, NEW YORK, NY, US, vol. 349, no. 1, 1 September 2010 (2010-09-01), pages 98-105, XP027113832, ISSN: 0021-9797 [retrieved on 2010-05-16]

39. CHIORCEA-PAQUIM A M ET AL: "AFM nanometer surface morphological study of in situ electropolymerized neutral red redox mediator oxysilane sol-gel encapsulated glucose oxidase electrochemical biosensors", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, ELSEVIER BV, NL, vol. 24, no. 2, 15 October 2008 (2008-10-15), pages 297-305, XP023439562, ISSN: 0956-5663, DOI: 10.1016/J.BIOS.2008.04.001 [retrieved on 2008-04-1 1]

40. WO 2005/056808 A2 (GENENCOR INT [US]; DOW CORNINGI [US]; BOND RISHA [US]; JEWETT MICHAEL C) 23 June 2005 (2005-06-23)

41. SANJIB BHATTACHARYYA ET AL: "Polymer-coated mesoporous silica nanoparticles for the controlled release of macromolecules", ACTA BIOMATERIALIA, vol. 8, no. 9, 1 September 2012 (2012-09-01), pages 3429-3435, XP055099688, ISSN: 1742-7061, DOI: 10.1016/j.actbio. 2012.06.003

Claims (35)

1. 조성물을 생산하는 방법에 있어서,
   상기 조성물은 최소한
   고체 운반체,
   단백질 및 단백질-유형 화합물에서 선택되는 기능성 성분, 이때 단백질 및 단백질-유형 화합물에서 선택되는 상기 기능성 성분은 효소 또는 효소-유형 화합물이며, 그리고
   기능성 성분을 최소한 부분적으로 매립시킴으로써, 상기 기능성 성분을 보호하기 위한 보호층, 그리고
   효소 또는 효소-유형 화합물을 고체 운반체의 표면에 결합시키는, 최소한 한 가지 이-작용기성 가교-링커를 포함하며,
   여기에서 상기 방법은 먼저, 최소한 한 가지 기능성 성분을 고체 운반체의 표면에 고정시키는 단계, 그리고 그 다음, 기능성 성분을 최소한 부분적으로 매립시킴으로써, 상기 기능성 성분을 보호하기 위한 보호층을 빌딩 블록으로 구축하는 단계를 포함하며, 이때 상기 빌딩 블록의 최소한 일부는 서로 그리고 고정된 기능성 성분과 상호작용할 수 있는 단량체이고, 상기 빌딩 블록은 수성 조건하에 규소 전구물질의 폴리축합에 의해 보호층을 구축하고, 상기 규소 전구물질은 트리-알콕시-실란 및 테트라-알콕시-실란이고,
   상기 방법은 바람직한 두께를 가진 선호되는 보호층을 수득하기 위하여 특정 반응 시간 간격 후, 빌딩 블록으로 보호층을 구축하기 위한 보호 물질의 자가-어셈블리 반응을 중단시키는 추가 단계를 포함하고, 이때 상기 보호층의 두께는 1 내지 25 nm 범위가 되고, 그리고 상기 최소한 한 가지 기능성 성분의 더 긴축 길이의 50% 내지 150%인, 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 이용된 단량체는 고체 운반체의 표면과도 추가로 상호작용을 할 수 있는, 방법.
3. 청구항 1 또는 2에서, 고체 운반체의 표면에 기능성 성분을 고정시키기에 앞서, 표면 상에서 기능성 성분의 고정이 개선되도록 고체 운반체가 변형되는, 방법.
4. 청구항 3에 있어서, 기능성 성분의 고정이 개선되도록 표면 영역의 오직 일부만 변형되고, 다른 부분들은 변형되지 않은 상태로 남아있으며, 이때 단량체는 운반체 표면의 변형안된 부분과 결합 상호작용할 수 있는, 방법.
5. 청구항 1에서, 기능성 성분은 무작위 방향으로 운반체 표면에 고정되는, 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 조성물은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 최소한 한 가지 종류의 기능성 분자를 더 포함하는, 방법:
   어뎁터 분자, 고정 분자, 스캐폴드 분자 및 수용체 분자.
7. 청구항 1에 있어서, 단량체 빌딩 블록은 어뎁터 분자, 고정 분자, 스캐폴드 분자 및 수용체 분자로 구성된 군에서 선택되는 최소한 한 가지 종류의 기능성 분자와 더 상호작용할 수 있는 것으로 선택되어, 기능성 성분을 보호하기 위한 보호층 또한 상기 최소한 한 가지 종류의 기능성 분자를 매립하는, 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 층은 다공성 층으로서 구축되는, 방법.
9. 청구항 1에 있어서, 유기 실란 단량체는 기능성 성분을 최소한 부분적으로 매립시키는 보호층을 구축하기 위한 빌딩 블록으로서 이용되는, 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 유기 실란 단량체는 알코올, 아민, 카르복실레이트, 방향족 작용기, 티올, 티오에테르, 구아니디늄, 이미다졸, 지방족 쇄, 아미드 및 페놀에서 선택되는 고정된 기능성 성분과 상호작용하는 최소한 하나의 기능성기를 가진 것들이 이용되는, 방법.
11. 청구항 9에 있어서, 유기 실란 단량체는 테트라오르토규산염, 벤질트리에톡시실란, 프로필트리에톡시실란, 이소부틸트리에톡시실란, n-옥틸트리에톡시실란, 히드록시메틸트리에톡시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, 아미노프로필트리에톡시실란, 우레이도프로필트리에톡시실란, (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리에톡시실란, 벤질트리메톡시실란, 프로필트리메톡시실란, 이소부틸트리메톡시실란, n-옥틸트리메톡시실란, 히드록시메틸트리메톡시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, 아미노프로필트리메톡시실란, 우레이도프로필트리메톡시실란, (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리메톡시실란, 벤질트리히드록시에톡시실란, 프로필트리히드록시에톡시실란, 이소부틸트리히드록시에톡시실란, n-옥틸트리히드록시에톡시실란, 히드록시메틸트리히드록시에톡시실란, 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리히드록시에톡시실란, 아미노프로필트리히드록시에톡시실란, 우레이도프로필트리히드록시에톡시실란, (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리히드록시메톡시실란으로 구성된 군에서 선택되는 고정된 기능성 성분과 상호작용하는 최소한 하나의 기능성기를 가진 것들이 이용되는, 방법.
12. 청구항 9에 있어서, 상이한 유기 실란 단량체가 이용되는, 방법.
13. 청구항 12에 있어서, 최소한 한 가지 기능성 성분에 대하여, Phe, Tyr, Trp, Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Ser, Thr, Asp, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His로 구성된 군에서 선택되는 최소한 몇 가지 표면 아미노산의 각 양이 측정되며, 그리고 이러한 측정에 따라 상이한 유기 실란 단량체가 이용되는, 방법.
14. 하기를 포함하는 조성물로서:
    고체 운반체,
    단백질 및 단백질-유형 화합물에서 선택되는 최소한 한 가지 기능성 성분, 이때 단백질 및 단백질-유형 화합물에서 선택되는 상기 기능성 성분은 효소 또는 효소-유형 화합물이며,
    효소 또는 효소-유형 화합물을 고체 운반체 표면에 결합시키는 최소한 한 가지 이-작용기성 가교-링커, 이때 상기 효소 또는 효소-유형 화합물은 고체 운반체 표면에 고정되고, 그리고
    기능성 성분을 최소한 부분적으로 매립시킴으로써, 상기 기능성 성분을 보호하기 위한 보호층,
    여기서 기능성 성분을 보호하기 위한 상기 보호층은 빌딩 블록으로 구축된 층이며, 이들 빌딩 블록의 단량체는 서로 그리고 고정된 기능성 성분과 상호작용할 수 있고, 상기 빌딩 블록은 수성 조건하에 규소 전구물질의 폴리축합에 의해 보호층을 구축하고, 상기 규소 전구물질은 트리-알콕시-실란 및 테트라-알콕시-실란이고, 상기 보호층의 두께는 1 내지 25 nm 범위가 되고, 그리고 상기 최소한 한 가지 기능성 성분의 더 긴축 길이의 50% 내지 150%인, 조성물.
15. 청구항 14에 있어서, 고체 운반체는 유기 나노입자, 무기 나노입자, 유기-무기 복합 나노입자, 자가-어셈블링 유기 나노입자, 다공성물질 규소 나노입자 (SNP), 금 나노입자 및 티타늄 나노입자로 구성된 군에서 선택되는 나노입자인, 조성물.
16. 청구항 14에 있어서, 상기 운반체는 최대 100 μm의 입자 크기를 가진 미립자 운반체인, 조성물.
17. 청구항 14에 있어서, 보호층의 두께는 5 nm 내지 15 nm 범위가 되는, 조성물.
18. 청구항 14에 있어서, 보호층의 두께는 더 긴 축 길이의 최소한 30%이며, 상기 층은 다공성인, 조성물.
19. 청구항 14에 있어서, 포어 크기는 1 nm 내지 10 nm인, 조성물.
20. 청구항 18에 있어서, 포어 크기는 조성물을 사용하는 동안 기능성 성분과의 상호작용을 위해 기능성 성분으로의 분자 확산을 가능하게 하는 크기로 결정되는, 조성물.
21. 청구항 14에 있어서, 고체 운반체 표면에 상기 최소한 한 가지 기능성 성분의 고정화 결합은 공유 결합인, 조성물.
22. 청구항 14에 있어서, 최소한 한 가지 기능성 성분을 결합시키는 최소한 한 가지 이-작용기성 가교-링커는 아민을 술프히드릴 (티올) 작용기에 가교시키는 가교-링커, 술프히드릴을 술프히드릴 (티올) 작용기에 가교시키는 가교-링커, 그리고 글루타알데히드, 디숙시니미딜 타르트레이트, 비스[술포숙시니미딜] 수베레이트, 에틸렌 글리콜비스(술포숙시니미딜숙시네이트), 디메틸 아디피미데이트, 디메틸 피멜이미데이트, 술포숙시니미딜 (4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠, 활성화된 술프히드릴, 술프히드릴-반응성 2-피리딜디티오, BSOCOES (비스[2-(숙시이미도옥시카르보닐옥시)에틸]술폰, DSP (디티오비스[숙시니미딜 프로피오네이트]), DTSSP (3,3'-디티오비스[술포숙시니미딜프로피오네이트), DTBP (디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트ㆍ2 HCl, DST (디숙시니미딜 타르타레이트), 술포-LC-SMPT (4-술포숙시니미딜-6-메틸-a-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트)), SPDP (N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트), LC-SPDP (숙시니미딜 6-(3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트), SMPT (4-숙시니미딜옥시카르보닐-메틸-a-[2-피리딜디티오]톨루엔), DPDPB (1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오)-프로피온아미도]부탄), DTME (디티오-비스말레이미도에탄), BMDB (1,4 비스말레이미딜-2,3-디히드록시부탄)로 구성된 군에서 선택되는 이-작용기성 가교-링커에서 선택되는 가교-링커인, 조성물.
23. 청구항 14에 있어서, 보호층의 단량체 빌딩 블록 및 고정된 기능성 성분 사이의 상호작용은 단백질 또는 단백질-유형 화합물의 아미노산 측쇄 사이에서 약한 힘 상호작용에 의해 생성되는, 조성물.
24. 청구항 14에 있어서, 다수의 상이한 빌딩 블록은 상이한 기능성 부분 또는 상이한 아미노산 측쇄와 상호작용하도록 제공되는, 조성물.
25. 청구항 14에 있어서, 고정된 최소한 한 가지 단백질 또는 단백질-유형 화합물과 상호작용하는 보호 물질의 작용기는 알코올, 아민, 카르복실레이트, 방향족 작용기, 티올, 티오에테르, 구아니디늄, 이미다졸, 지방족 쇄, 아미드 또는 페놀 중 하나인, 조성물.
26. 청구항 14에 있어서, 유기 실란 단량체는 기능성 성분을 최소한 부분적으로 매립시키는 보호층을 구축하기 위한 빌딩 블록으로서 이용되는, 조성물.
27. 청구항 14에 있어서, 단백질 및 단백질-유형 화합물에서 선택되는 상기 기능성 성분은 효소 또는 효소-유형 화합물이며, 상기 효소 또는 효소-유형 화합물은 산화환원효소, 전달효소, 가수분해효소, 리아제, 이소메라제 및 리가제로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
28. 청구항 14에 있어서, 촉매 공정에 이용하기 위한, 조성물.
29. 청구항 14에 있어서, 치료요법에 이용하기 위한, 조성물.
30. 청구항 14에 있어서, 스핑고미엘린분해효소 결핍 (ASMD) 증후군, Niemann-Pick 질환 (NPD), 리소좀 저장 질환, Gaucher 질환, Fabry 질환, MPS I, MPS II, MPS VI, 글리코겐 저장 질환 유형 II, 암, 알레르기 질환, 대사 질환, 심혈관 질환, 자가면역 질환, 신경 시스템 질환, 림프 질환 및 바이러스 질환 중 하나의 치료요법에 이용하기 위한, 조성물.
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