KR20240004307A - 면역리간드-페이로드 접합체의 생성을 위한 생체촉매 조성물 및 용도 - Google Patents

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마농 브리앙
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이브스 두달
울프 그러운더
레미 제블로
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이노페아 아게
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Abstract

본 발명은 고체 담체;　포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커; 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 및 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

면역리간드-페이로드 접합체의 생성을 위한 생체촉매 조성물 및 용도
본 발명은 고체 담체(solid carrier);　포획 모이어티(capture moiety); 기능성 단백질(functional protein); 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커(first linker); 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커(second linker);　고체 담체를 완전히 매립(embedding)하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 제1 보호 층(first protective layer); 및 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층(second protective layer)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 제조하는 방법 및 상기 조성물을 사용하여 면역리간드/페이로드 접합체(immune ligand/payload conjugate)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
　
산업적 적용에서 효소와 같은 단백질을 사용하는 공정은 사용된 효소가 전단력, 발포 및/또는 바람직하지 않은 pH 조건을 포함한 가혹한 조건에 노출될 수 있고/있거나 기능성 단백질 또는 효소가, 배치 제조 공정에 첨가되면, 제조에 재이용하기 위해 공정으로부터 회수될 수 없다는 과제에 직면한다.　 이러한 과제는 발효 공정, 폐기물-관리 공정, 식품 제조 공정을 포함하지만 이에 제한되지 않는 산업적 적용에서, 그리고 또한 치료용 분자의 제조에서 효소의 광범위한 용도에 적용된다. 이러한 과제를 극복하기 위한 한 가지 해결책은 종래 기술 분야, 예를 들어, WO2015/014888에 개시된 바와 같이, 기능성 단백질 또는 바람직하게는 효소를 고체 담체에 고정시키고, 다양한 유형의 응력에 대한 보호를 제공하는 보호 분자 층에 의해 기능성 단백질 또는 효소를 차폐시키는 것이다(효소/단백질을 "차폐시킨다"). 이러한 고정된 및 보호된("차폐된") 효소의 추가 이점은 담체 상의 고정된 효소가 원심분리, 여과, 한외 여과, 제조 공정의 가용성 성분으로부터 담체의 막 분리를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 분리 기술에 의해 효소 공정으로부터 분리될 수 있다는 것이다. WO2015/014888은 고체 담체, 효소와 같은 기능성 단백질, 및 효소 또는 기능성 단백질을 적어도 부분적으로 매립하여 효소 또는 기능성 단백질을 보호하는 보호 층을 포함하는 생체촉매 조성물 및 이러한 생체촉매 조성물을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 이러한 방법이, 예를 들어, 항체로 제한되지 않는 큰 단백질 또는 분자로의 형광 염료의 효소적 접합을 촉매(catalyzing)할 수 있는 효소를 고정시키기 위해 이용될 수 있음이 종래 기술에서 추가로 제시되었다[참조: Briand et al. (2020) Chem Commun. 56: 5170-5173].
그러나, WO2015/014888에 기재되어 있고 문헌(Briand et al.)에 의해 이용된 공정 및 조성물은 동일한 반응에 이용된 가용성 효소와 비교하여 촉매 활성을 감소시킨다는 결점을 갖는다[참조: Briand et al. (2020) Chem Commun. 56: 5170-5173]. 이는, 예를 들어, 거대 단백질과 소분자의 면역리간드-페이로드 접합체의 예로서 항체-염료 접합체의 효소적 제조로 제한되지 않는 다양한 도전적인 효소 반응에서 관찰되었다. 이러한 과제는 일반적으로 단백질 글리코실화, 단백질 소화 및 기타 생체분자 변형에 적용될 수 있다. 최적의 효소 활성은 항체 약물 접합체(ADC)의 제조를 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료용 면역리간드-페이로드 접합체의 효소적 제조에 특히 관심이 있는데, 이는 면역리간드-페이로드 접합체를 환자의 치료에 임상적으로 사용하는 경우, 현행 우수 제조 기준(cGMP)하에 제조해야 하는 이러한 면역리간드-페이로드 접합체, 그들의 제조 중간체 및 촉매 효소의 높은 상품 제조 비용 때문이다. 이러한 이유로, 최적 기능 또는 효소 활성을 갖는 고정되고 "차폐된" 기능성 단백질 또는 효소를 제공해야 할 필요성이 있다. 추가로, 최적의 효소 활성을 보존하는 고체 담체 상에 고정된 효소는, 접합 공정 중 또는 접합 공정이 완료된 후에 고정된 효소가 목적하는 생성물로부터 분리될 수 있기 때문에, 반복된 면역리간드-페이로드 및 ADC 제조 공정에 재사용하여 상품 제조 비용을 개선시킬 수 있다.
본 발명은 고체 담체;　포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커;　고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 및 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 제1 링커에 의해 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 단계;
(b) 고체 담체의 표면에 제1 보호 층을 형성하여 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 단계;
(c) 제2 링커에 의해 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 단계;
(d) 제1 보호 층의 표면에 제2 보호 층을 형성하여 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 단계.
추가로, 본 발명은 면역리간드/페이로드 접합체를 제조하는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 조성물에 의해 페이로드를 면역 리간드에 접합시키는 단계를 포함한다.
항체와 소분자량 염료를 융합하는 생체접합에서, 효소의 2층 고정화를 수반하는 본 발명의 조성물의 효소 활성은 한 층을 갖는 통상적인 고정화 효소와 비교하여 놀랍도록 우수한 생체접합을 나타냈고, 가용성 효소의 활성과 본질적으로 동일했다. 이는 새로운 2층 고정화 공정이 상응하는 가용성 기능성 단백질 또는 효소와 본질적으로 동일한 활성을 갖는 기능성 또는 효소 조성물을 유도하는 방향적으로 고정된 단백질 또는 효소를 초래한다는 것을 입증한다.
도 1은 기능성 단백질의 부위-특이적 고정화의 개략도를 나타낸다.
도 2는 상이한 조성으로 층을 성장시킨 후에 입자 표면에 소르타제(sortase)의 비특이적 흡착을 나타낸다. 층은 3-아미노프로필-트리에톡시실란(A), 오르토실리케이트(T), 및 하이드록시메틸트리-에톡시실란(H)("ATH"로 지정된 층); 3-아미노프로필-트리에톡시실란(A) 및 오르토실리케이트(T)("AT"로 지정된 층); 및 3-아미노프로필-트리에톡시실란(A), 오르토실리케이트(T) 및 프로필트리에톡시실란(P)("ATP"로 지정된 층)으로 각각 제조된다.　ATH로 제조된 층은 소르타제 비특이적 흡착의 최저치를 나타낸다.
도 3a는 실리카 입자에 공유 고정되고 유기실리카 층(AT)으로 부분적으로 차폐된 소르타제 A 및 실리카 입자에 고정되고 상이한 조성을 갖는 이중 층(AT-AT 및 ATH-AT)으로 차폐된 소르타제 A의 SDS-PAGE 겔의 형광 스캔을 나타낸다.
도 3b는 소르타제 입자에 의해 촉매된 형광 프로브에 대한 항체의 생체접합을 나타낸다. 소르타제 A는 실리카 입자에 공유 고정되고 유기실리카 층(AT)으로 부분적으로 차폐된다. 소르타제 A는 실리카 입자에 고정되고 상이한 조성을 갖는 이중 층(AT-AT 및 ATH-AT)으로 차폐된다.
도 4는 자외선 조사에 의해 시각화된 바와 같이 항체 중쇄 및 경쇄에 대한 FITC 염료의 접합 동역학을 나타낸다. 도시된 것은 SDS-PAGE 겔의 상부에 지시된 시점 후에 항체의 약 50kD 중쇄 및 약 30kD 경쇄에서 소르타제-효소 매개된 접합이고, 여기서 항체 중쇄 및 경쇄에 대한 접합은 부착된 FITC 염료의 녹색 형광을 유도하는 자외선 조사에 의해 시각화된다(여기서는 흑색 밴드로 표시됨). 패널 A는 고정된 및 차폐된 소르타제 A 효소와의 접합 동역학을 나타낸다. 패널 B는 동등한 양의 가용성 효소와 접합 동역학을 나타낸다.　
도 5a는 소르타제 입자 또는 가용성 소르타제에 의해 촉매된 독성 페이로드에 대한 항체의 생체접합에서 ADC 생산 수율을 나타낸다. 소르타제 A는 실리카 입자에 공유 고정되고, 이중 층(ATH-AT)으로 차폐된다.　
도 5b는 소르타제 입자 또는 가용성 소르타제에 의해 촉매된 독성 페이로드에 대한 항체의 생체접합에서 약물 항체 비율(DAR)을 나타낸다. 소르타제 A는 실리카 입자에 공유 고정되고, 이중 층(ATH-AT)으로 차폐된다.　
도 6a는 소르타제 입자로 촉매된 독성 페이로드에 대한 항체의 생체접합에서 ADC 생산 수율을 나타낸다. 소르타제 A는 실리카 입자에 공유 고정되고, 이중 층(ATH-AT)으로 차폐된다. 소르타제 A는 글루타르알데히드 가교결합을 통해 실리카 입자에 공유 고정되고, 유기실리카 단일 층(AT)으로 차폐된다.　
도 6b는 소르타제 입자에 의해 촉매된 독성 페이로드에 대한 항체의 생체접합에서 약물 항체 비율(DAR)을 나타낸다. 소르타제 A는 실리카 입자에 공유 고정되고 이중 층(ATH-AT)으로 차폐된다. 소르타제 A는 글루타르알데히드 가교결합을 통해 실리카 입자에 공유 고정되고, 유기실리카 단일 층(AT)으로 차폐된다.　
본 발명은 고체 담체;　포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커;　고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 및 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 명세서를 해석할 목적으로, 하기 정의가 적용되며, 적절한 경우, 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함하며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본원에 사용된 용어는 특정 구현예만을 기재하기 위한 목적이며, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
본원에 사용된 용어 "고체 담체"는 일반적으로 입자를 지칭한다. 바람직하게는, 고체 담체는 단분산 입자 또는 다분산 입자이며, 더욱 바람직하게는 단분산 입자이다. 고체 담체는 일반적으로 유기 입자, 무기 입자, 유기-무기 입자, 자기-조립 유기 입자, 실리카 입자, 금 입자, 티타늄 입자를 포함하며, 바람직하게는 실리카 입자이고, 더욱 바람직하게는 실리카 나노입자(SNP)이다. 고체 담체의 입자 크기는 일반적으로 1nm 내지 1000㎛, 바람직하게는 10nm 내지 100㎛, 특히 50nm 내지 50㎛, 더욱 특히 100nm 내지 1㎛이다.　　
본원에 사용된 용어 "기능성 단백질"은 고체 담체에 첨가된 후에 이의 특징적인 기능적 특성을 유지하는 단백질을 지칭한다. 본 발명의 의미에서 기능성 단백질은, 예를 들어, 효소, 항체 또는 촉매 활성을 갖는 RNA일 수 있다. 따라서, "기능성 단백질"이 바람직한 기능성 단백질인 효소인 경우, 효소를 포함하는 담체는 효소적으로 활성이다. 기능성 단백질은 일반적으로 고체 담체에 고정되어 있고, 예를 들어, 기능성 단백질은 일반적으로 고체 담체에 공유 및/또는 비공유 결합되어 있다. 본원에 사용된 용어 "기능성 단백질"은 기능성 단백질의 단편도 포함하고, 예를 들어, 기능성 단백질은 효소 또는 이의 단편일 수 있다.　 본원에 정의된 기능성 단백질의 단편은 일반적으로 그것이 유래되는 기능성 단백질과 동일한 기능적 특성을 갖는다. 단편과 관련하여 "그것이 유래되는 기능성 단백질"이라는 용어는 단편이 유래되는 전장 기능성 단백질을 지칭한다. "그것이 유래되는 기능성 단백질과 동일한 기능적 특성"이라는 용어는 단편이 유래되는 전장 단백질의 분자 기능(또는 분자 기능 중 하나)을 지칭하며, 이는, 예를 들어, 효소 활성일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 제1 링커의 경우, 링커의 한쪽 말단이 담체 물질의 표면에 결합하고 다른 쪽 말단이 포획 모이어티에 결합하며, 제2 링커의 경우, 링커의 한쪽 말단이 포획 모이어티에 결합하고 다른 쪽 말단이 기능성 단백질에 결합하거나 융합될 수 있도록 특정 작용기(예: 1급 아민, 설프하이드릴 등)에 결합할 수 있는 그룹을 함유하는 임의의 연결 시약을 지칭한다. 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커, 펩티드 링커, 폴리에테르 링커 및 태그로서 당업계에 공지되어 있는 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 유형의 링커가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 제1 링커는 고체 담체 상, 예를 들어, 담체 물질로서 실리카 표면 상에 고정될 수 있고, 이어서 포획 모이어티는 링커의 비점유 결합 부위에 결합될 수 있다. 대안적으로, 제1 링커는 먼저 포획 모이어티에 결합하고, 이어서 포획 모이어티에 결합된 링커는 이의 비점유 결합-부위와 함께 고체 담체, 예를 들어, 담체 물질로서 실리카 표면에 결합할 수 있다. 제2 링커는 포획 모이어티에 결합될 수 있고, 이어서 기능성 단백질은 링커의 비점유 결합 부위에 결합될 수 있다. 대안적으로, 제2 링커는 먼저 기능성 단백질에 결합할 수 있거나 융합될 수 있고, 이어서 기능성 단백질에 결합되거나 융합된 링커는 이의 비점유 결합 부위와 함께 포획 모이어티에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 제2 링커가 태그인 경우, 태그는 바람직하게는 기능성 단백질, 바람직하게는 기능성 단백질의 C-말단에 융합된다.　기능성 단백질에 융합된 태그는 일반적으로 기능성 단백질이 방향적 방식으로 고정되도록 포획 모이어티의 태그 결합 부위에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "태그"는 친화성 태그(affinity tag), 가용화 태그, 크로마토그래피 태그 및 에피토프 태그를 포함할 수 있다. 친화성 태그(정제 태그로서도 사용됨)는 친화성 정제 기술을 사용하여 그들의 조 생물학적 공급원으로부터 태깅된 분자의 정제를 허용하도록 단백질에 부착/융합된다. 이들은 키틴-결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 비오틴(biotin) 및 변형된 비오틴을 포함한다. 폴리(His) 태그, 바람직하게는 6xHis 태그는 광범위하게 사용된 태그이고; 그것은 금속-함유 매트릭스에 결합한다. 가용화 태그는, 특히 이. 콜라이(E. coli)와 같은 샤페론-결손 종에서 발현되는 재조합 단백질에 사용되어 단백질의 적절한 폴딩을 지원하고 그들이 침전되지 않도록 한다. 이들은 티오레독신(TRX) 및 폴리(NANP)를 포함한다. 일부 친화성 태그는 MBP 및 GST와 같은 가용화제로서 이중 역할을 갖는다.
바람직하게는, 링커, 즉 제1 및/또는 제2 링커, 특히 제1 및 제2 링커는 태그, 바람직하게는 단백질 정제 태그(protein purification tag) 및 친화성 태그로 이루어진 그룹으로부터 선택된 태그이다. 단백질 정제 태그 및 친화성 태그는 일반적으로 단백질 A, LacZ, His-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 말토스-결합 단백질, 칼모둘린-결합 펩티드, 인테인-키틴 결합 도메인(domain), His-패치 티오퓨전, 에피토프 태그, 및 스트렙타비딘- 및 비오틴-기반 태그, 예를 들어, Strep-태그, Twin-Strep tag®, 비오틴 및 변형된 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다(단백질 정제 태그 및 친화성 태그에 대한 검토는 문헌[참조: Kimple et al, Current Protocols in Protein Science 9.9.1-9.9.23 August 2013, DOI:10.1002/0471140864.ps0909s73] 참조). 보다 바람직하게는, 링커, 즉 제1 및/또는 제2 링커, 특히 제1 및 제2 링커는 Strep-태그, Twin-Strep tag®, 비오틴 및 변형된 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.　 용어 "Strep-태그"는 적어도 8개의 아미노산(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)으로 이루어진 합성 펩티드를 지칭한다. 이 펩티드 서열은, 예를 들어, Strep-Tactin®과 같은 가공된(engineered) 스트렙타비딘에 대해 고유한 친화성을 나타낸다. 용어 "Twin-Strep 태그®"는 적어도 8개의 아미노산(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)으로 2회 이루어진 합성 펩티드를 지칭한다. Strep-태그로서, 이 펩티드 서열은, 예를 들어, Strep-Tactin®과 같은 가공된 스트렙타비딘에 대해 고유한 친화성을 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "변형된 비오틴"은 비오틴의 가공된 변이체, 즉 스트렙타비딘에 결합하는 변형된 구조를 갖는 기능적 변이체 또는 설포-NHS-비오틴과 같은 가공된 스트렙타비딘을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "포획 모이어티"는 관심 있는 고체 담체에 결합하거나 결합될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 포획 모이어티는 일반적으로 제1 링커를 통해 고체 담체에 결합, 바람직하게는 비공유 결합된다. 본 발명의 적합한 포획 모이어티는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드; 폴리펩티드; 항체 또는 이의 기능적 단편; 아비딘; 가공된 아비딘; 스트렙타비딘; 가공된 스트렙타비딘; 압타머, SpegelmerTM(L-RNA 압타머); 글루타티온; 또는 S-펩티드이다. 본원에 사용된 용어 "가공된 아비딘" 및 "가공된 스트렙타비딘"은 각각 아비딘 및 스트렙타비딘의 가공된 변이체, 즉 비오틴에 결합하는 변형된 구조를 갖는 기능적 변이체를 지칭한다.　바람직한 가공된 스트렙타비딘은 Strep-Tactin®이다. Strep-Tactin®은 비오틴에 결합하는 스트렙타비딘에 필적하는 방식으로 펩티드 Strep-태그 및 비오틴에 각각 강력하게 결합한다.
본원에 사용된 용어 "보호 층"은 기능성 단백질 또는 효소의 기능적 특성을 보호하기 위한 층을 지칭한다. 제1 보호 층은 고체 담체의 표면에서 기능성 단백질의 비특이적 흡착을 회피하기 위해 고체 담체를 완전히 커버한다. 제2 보호 층은 기능성 단백질의 정확한 배향을 지원하기 위해 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 커버한다.　층, 즉 본 발명의 제1 및/또는 제2 보호 층은 일반적으로 적어도 일부가 일반적으로 공유 결합에 의해 서로 및 일반적으로 비공유 결합에 의해 고정된 기능성 단백질과 상호작용할 수 있는 단량체인 구성 요소로 구축된다. 제1 보호 층과 제2 보호 층은 동일하거나 상이한 물질, 예를 들어, 동일하거나 상이한 구성 요소로 이루어질 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 제1 보호 층과 제2 보호 층은 동일한 물질, 예를 들어, 동일한 구성 요소로 이루어진다. 바람직하게는, 제1 보호 층과 제2 보호 층은 상이한 물질, 예를 들어, 상이한 구성 요소로 이루어진다. 보호 층은 일반적으로 보호 층에 매립된 기능성 단백질 또는 바람직하게는 효소의 특성을 보존하는 균질한 층이다. 보호 층은 일반적으로 보호 층에 매립된 기능성 단백질 또는 바람직하게는 효소의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%가 동일한 방향으로 배향되어 있는(즉, 방향성 방식으로 고정되어 있는) 균질한 층이다.
모두 본원에서 동의어로 사용된 용어 "고체 담체를 완전히 매립하는 제1 보호 층" 또는 "고체 담체를 완전히 매립하는"은 고체 담체가 제1 보호 층에 의해 완전히 커버된다는 것을 의미한다.
모두 본원에서 동의어로 사용된 용어 "제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제1 보호 층" 또는 "제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하는"은 제1 링커가 제1 보호 층에 의해 부분적으로 또는 완전히 커버되고, 따라서 제1 링커가 제1 보호 층에 부분적으로 또는 완전히 매립된다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 제1 링커는 제1 보호 층에 완전히 매립된다.
본원에 사용된 용어 "포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 제1 보호 층"은 포획 모이어티가 제1 보호 층에 의해 전혀 커버되지 않거나 완전히 커버되지 않고, 따라서 포획 모이어티가 제1 보호 층에 매립되지 않거나 완전히 매립되지 않음을 의미한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 포획 모이어티의 적어도 10%가 제1 보호 층에 의해 커버되지만, 전형적으로 적어도 50%가 커버된다. 바람직한 구현예에서, 포획 모이어티의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 특히 적어도 60%가 제1 보호 층에 의해 커버된다. 특히 바람직한 구현예에서, 포획 모이어티의 약 30%, 바람직하게는 약 40%, 더욱 바람직하게는 약 50%, 특히 약 60%가 제1 보호 층에 의해 커버된다.
본원에 사용된 용어 "포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층"은 포획 모이어티가 제2 보호 층에 의해 완전히 또는 부분적으로 커버되고, 따라서 포획 모이어티가 보호 층에 완전히 또는 부분적으로 매립된다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 제2 보호 층은 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고 있다. 제2 보호 층에 의한 포획 모이어티의 커버 범위는 제1 보호 층에 의한 포획 모이어티의 커버 범위에 따라 달라지고, 예를 들어, 포획 모이어티의 10%가 제1 보호 층에 의해 커버되는 경우 포획 모이어티의 90%는 제2 보호 층에 의해 커버되거나, 포획 모이어티의 50%가 제1 보호 층에 의해 커버되는 경우 포획 모이어티의 50%는 제2 보호 층에 의해 커버된다. 일반적으로, 포획 모이어티의 약 90%는 제1 보호 층에 의해 커버되고 포획 모이어티의 약 10%는 제2 보호 층에 의해 커버되며, 포획 모이어티의 약 80%는 제1 보호 층에 의해 커버되고 포획 모이어티의 약 20%는 제2 보호 층에 의해 커버되며, 포획 모이어티의 약 70%는 제1 보호 층에 의해 커버되고 포획 모이어티의 약 30%는 제2 보호 층에 의해 커버되며, 포획 모이어티의 약 60%는 제1 보호 층에 의해 커버되고 포획 모이어티의 약 40%는 제2 보호 층에 의해 커버되며, 포획 모이어티의 약 50%는 제1 보호 층에 의해 커버되고 포획 모이어티의 약 50%는 제2 보호 층에 의해 커버되며, 포획 모이어티의 약 40%는 제1 보호 층에 의해 커버되고 포획 모이어티의 약 60%는 제2 보호 층에 의해 커버되며, 포획 모이어티의 약 30%는 제1 보호 층에 의해 커버되고 포획 모이어티의 약 70%는 제2 보호 층에 의해 커버되며, 포획 모이어티의 약 20%는 제1 보호 층에 의해 커버되고 포획 모이어티의 약 80%는 제2 보호 층에 의해 커버되며, 포획 모이어티의 약 10%는 제1 보호 층에 의해 커버되고 포획 모이어티의 약 90%는 제2 보호 층에 의해 커버된다. 특정 구현예에서, 포획 모이어티의 약 50%는 제1 보호 층에 의해 커버되고, 포획 모이어티의 약 50%는 제2 보호 층에 의해 커버된다.
모두 본원에서 동의어로 사용되는 용어 "제2 링커를 완전히 매립하는 제2 보호 층" 또는 "제2 링커를 완전히 매립하는"은 제2 링커가 제2 보호 층에 의해 완전히 커버된다는 것을 의미한다.
모두 본원에서 동의어로 사용되는 용어 "기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층" 또는 "기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는"은 기능성 단백질이 제2 보호 층에 의해 부분적으로 또는 완전히 커버되고, 따라서 기능성 단백질이 제2 보호 층에 부분적으로 또는 완전히 매립된다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 기능성 단백질은 부분적으로 매립된다.
본원에 사용된 용어 "부분적으로 매립된 기능성 단백질"은 기능성 단백질이 제2 보호 층에 의해 완전히 커버되지 않고, 따라서 기능성 단백질이 보호 층에 완전히 매립되지 않는다는 것을 의미한다. 하나의 구현예에서, 관심 있는 기능성 단백질의 50% 미만이 보호 층에 의해 커버되지만, 전형적으로 적어도 70% 이상이 커버되어 기능성 단백질의 보호를 개선시킨다. 바람직한 구현예에서, 관심 있는 기능성 단백질의 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%가 보호 층에 의해 커버된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 관심 있는 기능성 단백질의 약 70% 내지 약 95%, 더욱 바람직하게는 약 80% 내지 약 95%, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 내지 약 95%, 가장 바람직하게는 약 90% 내지 약 95, 96, 97, 98 또는 99%가 보호 층에 의해 커버된다. 특히 바람직한 구현예에서, 관심 있는 기능성 단백질의 약 70%, 특히 약 80%, 더욱 특히 약 90%, 가장 특히 약 95%가 보호 층에 의해 커버된다. 보다 특히 바람직한 구현예에서, 관심 있는 기능성 단백질의 약 70%, 특히 약 80%, 보다 특히 약 90%, 가장 특히 약 95%가 보호 층에 의해 커버되고, 여기서 활성 부위는 커버되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "완전히 매립된 기능성 단백질"은 본 발명에 따른 관심 있는 기능성 단백질이 제2 보호 층에 의해 완전히, 즉 100% 커버된다, 즉 활성 부위도 커버된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "면역리간드"는 소정의 표적, 예를 들어, 수용체, 세포 표면 단백질, 사이토카인 등에 대해 친화성을 갖는 실체, 제제 또는 분자를 정의하는 것을 의미한다. 이러한 면역리간드는 임의로 작용제-매개 반응을 차단 또는 약화시키거나, 수용체-작용제 상호작용을 억제할 수 있다. 그러나, 가장 중요하게는, 면역리간드는 상기 면역리간드에 의해 인식된 표적에 의해 정의되는 특정 부위로 페이로드를 전달하는 셔틀로서 기능할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 수용체를 표적으로 하지만 이에 제한되지 않는 면역리간드는 상기 수용체의 풍부함을 특징으로 하는 부위로 그의 페이로드를 전달한다. 면역리간드는 항체, 항체 단편, 항체-기반 결합 단백질, 항체 모방체(mimetic), 수용체, 가용성 미끼 수용체, 소정 표적에 대한 친화성을 갖는 스캐폴드 단백질 및 수용체의 리간드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
동의어로 "면역글로불린"(Ig)이라고도 불리는 "항체"는 일반적으로 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하며, 따라서 다량체 단백질 또는 이의 동등한 Ig 동족체(예: 중쇄만을 포함하는 카멜리드 나노바디, 중쇄 또는 경쇄로부터 유래될 수 있는 단일 도메인 항체(dAb))이고; 전장 기능적 돌연변이체, 변이체 또는 이의 유도체(Ig 분자의 본질적인 에피토프 결합 특징을 유지하는 뮤린, 키메라, 인간화 및 완전 인간 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이중 특이적, 이중특이적, 다중특이적 및 이중 가변 도메인 면역글로불린을 포함)를 포함하고; 면역글로불린 분자는 임의의 부류(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY) 또는 하위부류(예: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 및 알로타입일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 약물 접합체"(ADC)는 독소(예를 들어, 튜불린 억제제, 액틴 결합제, RNA 폴리머라제 억제제, DNA-삽입 및 변형/손상 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않음), 키나제 억제제, 또는 세포의 생존에 필수적이거나 특정 생리학적 세포 경로에 필수적인 특정 세포 경로를 간섭하는 임의의 API를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 소분자량 활성 약제학적 성분(API)에 결합된 항체, 항체 단편 또는 항체-기반 결합 단백질에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 유도체 또는 단편"은 (i) 가변 경쇄(VL), 가변 중쇄(VH), 불변 경쇄(CL) 및 불변 중쇄 1(CH1) 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab(Fa) 단편의 중쇄 부분; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 가변 단편(Fv) 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 도메인 항체(dAb) 단편; (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); (vii) 단일 쇄 Fv 단편(scFv); (viii) VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현되지만 너무 짧아서 동일한 쇄에서 2개 도메인 사이의 쌍화를 허용할 수 없는 링커를 사용하여 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개 항원 결합 부위를 생성하도록 강제하는 2가, 이중특이적 항체인 디아바디; 및 (ix) 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fv 세그먼트(VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 선형 항체; 및 (x) 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 기타 비전장 부분 또는 이의 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 단독 또는 임의의 조합으로 포함하지만 이에 제한되지 않는, 전장이 아닌 항체로부터 유래된 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 분자에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "변형된 항체 포맷(modified antibody format)"은 항체-약물 접합체, 폴리알킬렌 옥사이드-변형된 scFv, 모노바디, 디아바디, 카멜리드 항체, 도메인 항체, 이중 또는 삼중특이적 항체, IgA, 또는 J 쇄 및 분비 성분에 의해 연결된 2개의 IgG 구조, 샤크 항체, 신세계 영장류 프레임워크 + 비신세계 영장류 CDR, 힌지 영역이 제거된 IgG4 항체, CH3 도메인에 가공된 2개의 추가 결합 부위를 갖는 IgG, Fc 감마 수용체에 대한 친화성을 증강시키기 위해 Fc 영역이 변경된 항체, CH3+VL+VH를 포함하는 이량체화 작제물 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체 모방체"는 면역글로불린 계열에 속하지 않는 단백질, 및 심지어 압타머 또는 합성 중합체와 같은 비단백질을 지칭한다. 일부 유형은 항체-유사한 베타-시트 구조를 갖는다. 항체에 대한 "항체 모방체" 또는 "대안적인 스캐폴드"의 잠재적 이점은 더 양호한 용해도, 더 높은 조직 침투, 열 및 효소에 대한 더 높은 안정성 및 비교적 낮은 생산 비용이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "접합"은 공유 결합의 형성에 의해 분자와 또 다른 분자의 공유 결합에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "페이로드"는 화학적으로 합성될 수 있는 소분자량 분자 또는 화학적 실체, 및 숙주 세포의 발효에 의해 생성될 필요가 있고 표적 또는 항원에 대한 결합에 특이적인 면역리간드에 새로운 기능성을 부여하는 더 큰 분자 또는 생물학적 실체를 포함하는 임의의 천연 또는 합성적으로 생성된 분자를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "독소"는 포유류 세포에 대해 세포독성인 분자량 2,500 달톤을 초과하지 않는 소분자량의 세포독성 화합물을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "서열 특이적 트랜스펩티다제"는 상기 기질 펩티드 또는 단백질을 또 다른 펩티드 또는 단백질에 연결하기 위해 소정의 펩티드 서열을 인식 서열(N-말단 및/또는 C-말단)로서 갖는 적어도 하나의 기질 펩티드 또는 단백질을 필요로 하는 트랜스펩티다제, 또는 펩티드 또는 단백질 성분을 함유하는 소분자량 화합물을 정의하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "부위-특이적 트랜스펩티다제"는 또 다른 펩티드 또는 단백질에 접합하기 위해 사용하는 적어도 하나의 기질 펩티드 또는 단백질에서 특이적 부위를 갖는 트랜스펩티다제, 또는 펩티드 또는 단백질 성분을 함유하는 소분자량 화합물을 정의하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "방사성제"는 불안정한 핵을 갖는 적어도 하나의 원자를 갖고 따라서 방사성 붕괴를 겪기 쉽고, 그 결과 세포 사멸 효과를 갖는 감마선 및/또는 알파 또는 베타 입자와 같은 아원자 입자의 방출을 초래하는 실체에 관한 것이다. 본 맥락에서, 방사성제는 암 세포와 같은 병원성 실체를 손상시키거나 심지어 사멸시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "마커(marker)"("검출 태그"로 지칭되기도 함)는 화학적, 물리적 또는 효소 반응에서 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 화합물 또는 신호를 생성하는 하나 이상의 적절한 화학 물질 또는 효소를 포함하는 임의의 분자 또는 모이어티를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항염증 약물"은 염증을 감소시키는 화합물에 관한 것이다. 이는, 예를 들어, 글루코코르티코이드 수용체에 결합함으로써 염증 또는 부기를 감소시키는 특정 글루코코르티코이드(종종 코르티코스테로이드로 지칭됨)와 같은 스테로이드일 수 있다. 상기 용어는 사이클로옥시게나제(COX) 효소에 대항하는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)을 추가로 포함한다. 그 자체로, COX 효소는 프로스타글란딘을 합성하여 염증을 생성한다. 전체적으로, NSAID는 프로스타글란딘이 합성되어 통증을 감소 또는 제거하는 것을 방지한다. 상기 용어는 염증 반응의 증폭을 담당하는 면역 세포인 염증 세포의 활성화 및 이동을 변경하는 펩티드의 부류인 면역 선택적 항염증 유도체(ImSAID)를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 용어 "독소"는 살아있는 세포 또는 생물에 독성이 있는 분자에 관한 것이다. 독소는 병원성 실체, 예를 들어, 암 세포를 손상시키거나 심지어 사멸시키는 것을 의미하는 펩티드, 또는 단백질 또는 바람직하게는 소분자량 화합물일 수 있다. 본원에서 의미하는 바와 같이, 독소는 특히 세포 독소를 포함한다. 바람직하게는, 상기 독소는 소분자 독소, 즉 분자량이 2500Da 미만이다.
본원에 사용된 용어 "사이토카인"은 다수의 세포에 의해 분비되고 세포간 통신에서 광범위하게 사용되는 신호전달 분자의 범주인 작은 세포-신호전달 단백질 분자를 지칭한다. 사이토카인은 단백질, 펩티드 또는 당단백질로 분류될 수 있으며; 용어 "사이토카인"은 다양한 배아 기원의 세포에 의해 신체 전체에 걸쳐 생성되는 크고 다양한 조절인자 계열을 포함한다. 본 맥락에서, 사이토카인은, 예를 들어, 병원성 실체, 예를 들어, 암 세포를 손상시키거나 심지어 사멸시키는 것을 의미한다.　
본원에 사용된 용어 "화학요법제"는 신생물, 특히 악성(암성) 병변, 예를 들어, 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 림프종(lymphoma) 또는 백혈병(leukemia)의 발생 또는 진행을 억제하는 기능적 특성을 갖는 분자에 관한 것이다. 전이 또는 혈관신생의 억제는 종종 항암제 또는 화학요법제의 특성이다. 화학요법제는 세포독성제 또는 화학요법제일 수 있다. 바람직하게는, 상기 화학요법제는 암 세포의 성장 및/또는 증식을 억제 또는 억압하는 소분자량 세포증식 억제제이다.
제1 양태에서, 본 발명은　
고체 담체;　
포획 모이어티;
기능성 단백질;
포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커;
기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커;　
고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 및
포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함하는 조성물을 제공한다.
고체 담체 및 포획 모이어티는 비공유 결합 또는 공유 결합에 의해 제1 링커에 의해 연결될 수 있다.　포획 모이어티 및 기능성 단백질은 비공유 결합 또는 공유 결합에 의해 제2 링커에 의해 연결될 수 있다.　비공유 결합은 p-p(방향족) 상호작용, 반 데르 발스 상호작용(van der Waals interaction), H-결합 상호작용 및 이온 상호작용을 포함한다. 바람직하게는, 고체 담체 및 포획 모이어티는 비공유 결합에 의해 제1 링커에 의해 연결되고/되거나 기능성 단백질은 비공유 결합에 의해 제2 링커에 의해 포획 모이어티에 연결된다. 더욱 바람직하게는, 고체 담체 및 포획 모이어티는 비공유 결합에 의해 제1 링커에 의해 연결되고/되거나, 기능성 단백질은 비공유 결합에 의해 제2 링커에 의해 포획 모이어티에 연결되며, 여기서 제2 링커는 기능성 단백질에 융합되고 포획 모이어티에 비공유 결합한다.
하나의 구현예에서, 고체 담체는 유기 입자, 무기 입자, 유기-무기 입자, 자가-조립 유기 입자, 실리카 입자, 금 입자, 티타늄 입자의 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 실리카 입자, 더욱 바람직하게는 실리카 나노입자(SNP)이다. 입자 크기는 일반적으로 입자의 직경을 측정함으로써 측정된다. 고체 담체가 단분산 입자인 경우, 크기는 일반적으로 1nm 내지 1000μm, 바람직하게는 10nm 내지 100μm, 특히 50nm 내지 50μm, 더욱 특히 100nm 내지 1μm이다. 고체 담체가 다분산 입자인 경우, 크기는 일반적으로 1nm 내지 1000μm, 바람직하게는 10nm 내지 100μm, 특히 50nm 내지 50μm이다.
일반적으로, 단분산 입자 또는 다분산 입자, 바람직하게는 단분산 입자가 본 발명에서 고체 담체로서 사용된다.　바람직한 구현예에서, 단분산 입자는 구형 단분산 입자이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 다분산 입자는 비구형 다분산 입자이다.
고체 담체는 일반적으로 현탁액으로 제공된다. 고체 담체의 현탁액은, 예를 들어, 물 또는 완충액, 바람직하게는 완충액에 존재할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 완충액은 인산염, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산), 2-하이드록시-3-모르폴리노프로판설폰산, N.,N-비스[2-하이드록시에틸]-2- 아미노에탄설폰산), (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), 2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄설폰산, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신, 디글리신, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설폰산, N-(1,1-디메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산이다. 바람직하게는, 인산염 완충액이 사용된다.
하나의 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 고체 담체의 표면은 분자 또는 기능성 화학 그룹을 고정 점, 즉 제1 링커의 고정 점으로서 도입하도록 변형된다.　바람직하게는, 상기 고정 점은 아민 기능성 화학 그룹 또는 모이어티이다. 비제한적인 예로서, 고체 담체의 아미노-변형된 표면, 예를 들어, 아미노-변형된 실리카 표면이 변형된 고체 담체로서 사용될 수 있다. 이러한 고체 담체의 아미노 변형된 표면은 실리카 표면을 갖는 고체 담체를 아미노 실란, 예를 들어, APTES와 반응시킴으로써 수득할 수 있다. 바람직하게는, 고체 담체의 표면은 단지 부분적으로 아미노 변형된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 고체 담체는 아미노 변형된 표면과 함께 실리카 표면을 갖는 고체 담체, 더욱 바람직하게는 실리카 표면을 갖는 고체 담체를 아미노 실란, 예를 들어, APTES와 반응시킴으로써 수득된 고체 담체, 더욱 바람직하게는 실리카 표면을 갖는 고체 담체를 부분적으로 아미노 실란, 예를 들어, APTES와 반응시킴으로써 수득된 고체 담체이다. 이러한 변형된 담체는 담체 물질의 표면에서 제1 링커(예: 설포-NHS-비오틴)와 아민 그룹 사이에 아미드 결합을 형성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 고정 점으로서 도입된 분자 또는 기능성 화학 그룹은 고체 담체의 표면에 균일하게 분포된다.　
하나의 구현예에서, 고체 담체 대 기능성 단백질의 크기 비율은 입자당 10 내지 200개, 바람직하게는 50 내지 250개, 더욱 바람직하게는 20 내지 150개 단백질 분자의 결합을 허용하는 정도이다.
하나의 구현예에서, 제1 보호 층의 두께는 1 내지 100nm, 1nm 내지 50nm, 1nm 내지 30nm, 1nm 내지 25nm, 1nm 내지 20nm 또는 1nm 내지 15nm이다.　
하나의 구현예에서, 제2 보호 층의 두께는 1 내지 100nm, 1nm 내지 50nm, 1nm 내지 30nm, 1nm 내지 25nm, 1nm 내지 20nm 또는 1nm 내지 15nm이다.
일부 구현예에서, 제1 보호 층 및 제2 보호 층은 함께 약 1 내지 약 200nm, 일반적으로 약 1 내지 약 100nm, 바람직하게는 약 1 내지 약 50mm, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 25nm, 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 약 20nm, 특히 약 1 내지 약 15nm의 정의된 두께를 갖는다. 가장 바람직한 정의된 두께는 약 1 내지 약 15nm이다. 일부 구현예에서, 제1 보호 층 및 제2 보호 층은 함께 약 5 내지 약 100nm, 바람직하게는 약 5 내지 약 50nm, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 25nm, 더욱 더 바람직하게는 약 5 내지 약 20nm, 특히 약 5 내지 약 15nm의 정의된 두께를 갖는다. 가장 바람직한 정의된 두께는 약 5 내지 약 15nm이다.
하나의 구현예에서, 제1 보호 층과 제2 보호 층은 동일한 물질로 이루어진다.　 바람직한 구현예에서, 제1 보호 층 및 제2 보호 층은 상이한 물질로 이루어진다.　 제1 보호 층 및/또는 제2 보호 층은 일반적으로 다공성이며, 기공 크기는 1 내지 100nm, 바람직하게는 1 내지 20nm이다.
보호 층 두께는 현미경, 예를 들어, 주사 전자 현미경(SEM), 투과 전자 현미경(TEM), 주사 프로브 현미경(SPM), 광 산란 방법을 사용하거나 타원 측정법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 반응기와 같은 반응 용기 내에서 제조된다. 제1 및/또는 제2 보호 층의 형성은 일반적으로 구성 요소에 의해 각각의 보호 층을 형성함으로써 수행되며, 여기서 구성 요소는 중축합 반응으로 보호 층을 구축한다. 중축합은 다양한 용매에서, 바람직하게는 수용액에서 수행될 수 있다. 중축합은 적절한 경우 용이하게 제어 및 중지되어 정의된 두께의 보호 층의 달성을 허용할 수 있다. 제2 보호 층을 구축하는 데 사용될 수 있는 구성 요소의 선택은 최적의 및/또는 목적하는 파라미터에 따라 제2 보호 층의 친화성을 조정하기 위해 기능성 단백질의 공지된 구조에 따라 달라질 수 있다. 제1 및/또는 제2 보호 층의 구성 요소로서, 일반적으로 구조적 구성 요소 및 보호 구성 요소가 보호 층을 구축하는 데 사용된다. 사용될 수 있는 구조적 구성 요소는, 예를 들어, 테트라에틸오르토실리케이트(본원에서 "TEOS" 또는 "T"로 지정됨)이다. 사용될 수 있는 보호 구성 요소는, 예를 들어, 3-아미노프로필트리에톡시실란(본원에서 "APTES" 또는 "A"로 지정됨), 프로필트리에톡시실란(본원에서 "PTES" 또는 "P"로 지정됨), 이소부틸트리에톡시실란("IBTES"로 지정됨), 하이드록시메틸트리에톡시실란(본원에서 "HTMEOS" 또는 H로 지정됨), 벤질트리에톡시실란(본원에서 "BTES"로 지정됨), 우레이도프로필트리에톡시실란("UPTES"로 지정됨) 또는 카복시에틸트리에톡시실란(본원에서 "CETES"로 지정됨)이다.　 구조적 구성 요소는 일반적으로 형성된 층에 4개의 공유 결합을 형성할 수 있는 무기 실리카의 전구체이다.　 보호 구성 요소는 일반적으로 기능성 단백질(예: 효소)과 상호작용하는 능력이 부여된 유기 모이어티를 보유하는 오가노실란이다. 바람직한 구조적 구성 요소는 4가 실란, 특히 테트라-알콕시-실란이다. 바람직한 보호 구성 요소는 3가 실란, 특히 트리-알콕시-실란이다. 보다 바람직한 구조적 구성 요소는 4가 실란과 3가 실란의 혼합물, 특히 테트라-알콕시-실란과 트리-알콕시-실란의 혼합물이다. 더욱 더 바람직한 구조적 구성 요소는 테트라에틸오르토실리케이트, 테트라-(2-하이드록시에틸)실란 및 테트라메틸오르토실리케이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더욱 더 바람직한 보호 구성 요소는 카복시에틸실란트리올, 벤질실란, 프로필실란, 이소부틸실란, n-옥틸실란, 하이드록시실란, 비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노프로필실란, 아미노프로필실란, 우레이도프로필실란, (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필실란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,　특히 벤질트리에톡시실란, 프로필트리에톡시실란, 이소부틸트리에톡시실란, n-옥틸트리에톡시실란, 하이드록시메틸트리에톡시실란, 비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, 우레이도프로필트리에톡시실란, (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리에톡시실란으로부터 선택되거나, 또는 벤질트리메톡시실란, 프로필트리메톡시실란, 이소부틸메톡시실란, n-옥틸트리메톡시실란, 하이드록시메틸트리메톡시실란, 비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, 아미노프로필트리메톡시실란, 우레이도프로필트리메톡시실란 (N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리메톡시실란으로부터 선택되거나, 또는 벤질트리하이드록시에톡시실란, 프로필트리하이드록시에톡시실란, 이소부틸트리하이드록시에톡시실란, n-옥틸트리하이드록시에톡시실란, 하이드록시메틸트리하이드록시에톡시실란, 비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노프로필트리하이드록시에톡시실란, 아미노프로필트리하이드록시에톡시실란, 우레이도프로필트리하이드록시에톡시실란(N-아세틸글리실)-3-아미노프로필트리하이드록시메톡시실란으로부터 선택된다.
특히 바람직한 구성 요소는 구조적 구성 요소로서의 TEOS 및 보호 구성 요소로서의 APTES, PTES 및/또는 HTMEOS, 바람직하게는 APTES 및 HTMEOS이다. 특히 구조적 구성 요소로서의 TEOS 및 보호 구성 요소로서의 APTES 및 HTMEOS는 제1 보호 층을 구축하는 데 사용되며, 구조적 구성 요소로서의 TEOS 및 보호 구성 요소로서의 APTES는 제2 보호 층을 구축하는 데 사용된다.
제1 보호 층을 형성하기 위해 제1 링커를 통해 포획 모이어티에 연결된 고체 담체와 구성 요소의 반응 시간은 제1 링커의 길이 및 포획 모이어티의 크기에 따라 달라진다. 일반적으로, 반응 시간은 제2 링커와 결합하는 포획 모이어티의 일부가 제1 보호 층에 의해 커버되지 않도록 선택된다. 반응은 일반적으로 0.5 내지 10시간, 바람직하게는 1 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 4시간, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 4시간의 기간 동안, 바람직하게는 수용액에서, 바람직하게는 약 5 내지 약 15℃의 실온 또는 약 10℃에서 수행된다. 제2 보호 층을 형성하기 위해 구성 요소와 기능성 단백질을 포함하는 조성물의 반응 시간은 제2 링커의 길이 및 기능성 단백질의 크기에 따라 달라진다. 일반적으로, 반응 시간은 기능성 단백질의 일부가 제2 보호 층에 의해 커버되지 않도록 선택된다.
대안적으로, 반응 시간은 기능성 단백질이 제2 보호 층에 의해 완전히 커버되도록 선택된다. 반응은 일반적으로 0.5 내지 10시간, 바람직하게는 1 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 4시간, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 2시간의 기간 동안, 바람직하게는 수용액에서, 바람직하게는 약 5 내지 약 15℃의 실온 또는 약 10℃에서 수행된다. 보호 층의 형성은, 예를 들어, 세척 단계에 의해, 예를 들어, 미반응 구성 요소를 제거함으로써 중축합 반응을 능동적으로 정지시키거나 제한된 양의 구성 요소에 의해 유발되는 중축합 반응의 자체 정지에 의해 정지될 수 있다.
하나의 구현예에서, 제1 링커는 태그, 바람직하게는 단백질 정제 태그 및 친화성 태그로 이루어진 그룹으로부터 선택된 태그, 더욱 바람직하게는 Strep 태그, Twin-Strep tag®, 비오틴 및 변형된 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 태그, 더욱 더 바람직하게는 변형된 비오틴, 특히 설포-NHS-비오틴이다.
하나의 구현예에서, 포획 모이어티는 올리고뉴클레오티드; 폴리펩티드; 항체 또는 이의 기능적 단편; 아비딘; 가공된 아비딘; 스트렙타비딘; 가공된 스트렙타비딘, 압타머; SpiegelmerTM(L-RNA 압타머); 글루타티온; 또는 S-펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 포획 모이어티는 폴리펩티드, 항체 또는 이의 기능적 단편, 아비딘, 가공된 아비딘, 스트렙타비딘 및 가공된 스트렙타비딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 포획 모이어티는 항-비오틴 항체, 스트렙타비딘 및 가공된 스트렙타비딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 가공된 스트렙타비딘, 특히 Strep-Tactin®이다.
하나의 구현예에서, 제2 링커는 태그, 바람직하게는 단백질 정제 태그 및 친화성 태그로 이루어진 그룹으로부터 선택된 태그, 더욱 바람직하게는 Strep 태그, Twin-Strep tag®, 비오틴 및 변형된 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 태그, 더욱 더 바람직하게는 Strep 태그, Twin-Strep tag®로 이루어진 그룹으로부터 선택된 태그이다. 가장 바람직하게는, 제2 링커는 Twin-Strep tag®이고, 특히 제2 링커는 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 기능성 단백질은 촉매 활성 효소 또는 이들의 혼합물을 갖는 효소, 항체 또는 RNA이며, 더욱 바람직하게는 효소 또는 이의 단편, 더욱 더 바람직하게는 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 리아제, 아이소머라제, 트랜스 펩티다제 또는 리가제 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소 또는 이의 단편이다. 특히 바람직한 것은 하이드롤라제 또는 이의 단편, 더욱 특히 트랜스펩티다제 또는 이의 단편 또는 서열-특이적 트랜스펩티다제 또는 이의 단편, 더욱 더 특히 소르타제 또는 이의 단편 또는 서열-특이적 소르타제 또는 이의 단편이다. 바람직한 소르타제는 소르타제 A3 또는 이의 단편, 특히 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 소르타제 A 또는 이의 임의의 기능적 단편 또는 돌연변이체, 바람직하게는 스타필로콕쿠스 아우레우스(균주 NCTC 8325)의 유니프로트 번호 KB-Q2FV99(SRTA_STAA8)를 갖는 소르타제 A 변이체이다.
하나의 구현예에서, 제2 링커는 기능성 단백질에 결합되고, 바람직하게는 공유 결합되고, 더욱 바람직하게는 기능성 단백질의 활성 부위의 대향 측면에서 기능성 단백질에 융합된다.　 바람직하게는, 제2 링커는 기능성 단백질, 기능성 단백질의 C 말단에 결합되고, 바람직하게는 공유 결합되고, 더욱 바람직하게는 융합된다.
하나의 구현예에서, 포획 모이어티는 스트렙타비딘 및 가공된 스트렙타비딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 포획 모이어티는 Strep-Tactin®이다.
하나의 구현예에서, 포획 모이어티는 서로 대향하는 제1 및 제2 링커에 대한 결합 부위를 함유한다.
하나의 구현예에서, 제1 보호 층은 고체 담체 및 제1 링커를 완전히 매립하고, 포획 모이어티를 부분적으로 매립한다.　
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 고체 담체; 포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커; 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 매립하고, 포획 모이어티를 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함한다.　
보다 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 고체 담체; 포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커; 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 매립하고, 포획 모이어티를 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 고체 담체; 포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 방향성 방식으로 연결하는 제2 링커; 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 매립하고, 포획 모이어티를 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함한다.　
보다 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 고체 담체; 포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 방향성 방식으로 연결하는 제2 링커; 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 매립하고, 포획 모이어티를 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함한다.
하나의 구현예에서, 포획 모이어티는 제1 보호 층 및 제2 보호 층에 의해 완전히 매립된다.
하나의 구현예에서, 포획 모이어티는 제1 보호 층 및 제2 보호 층에 의해 완전히 매립되어 제1 보호 층이 포획 모이어티의 일부를 매립하고, 제2 보호 층이 포획 모이어티의 나머지 부분을 매립하도록 한다.
따라서, 더욱 더 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 고체 담체; 포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커; 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 매립하고, 포획 모이어티를 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로, 바람직하게는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함하고, 여기서 포획 모이어티는 제1 보호 층 및 제2 보호 층에 의해 완전히 매립되어 제1 보호 층이 포획 모이어티의 일부를 매립하고 제2 보호 층이 포획 모이어티의 나머지 부분을 매립하도록 한다.
더욱 더 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 고체 담체; 포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 방향성 방식으로 연결하는 제2 링커; 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 매립하고, 포획 모이어티를 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로, 바람직하게는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함하고, 여기서 포획 모이어티는 제1 및 제2 보호 층에 의해 완전히 매립되어 제1 보호 층이 포획 모이어티의 일부를 매립하고 제2 보호 층이 포획 모이어티의 나머지 부분을 매립하도록 한다.
하나의 구현예에서, 제1 보호 층은 포획 모이어티의 20% 내지 90%, 바람직하게는 50% 내지 90%, 더욱 바람직하게는 60% 내지 95%를 매립하며, 여기서 제2 링커가 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 포획 모이어티의 섹션은 제1 보호 층에 의해 매립되지 않는다.
바람직하게는, 제1 보호 층은 고체 담체 및 제1 링커를 완전히 매립하고, 포획 모이어티의 20% 내지 90%, 바람직하게는 50% 내지 90%, 더욱 바람직하게는 60% 내지 95%를 매립하며, 여기서 제2 링커가 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 포획 모이어티의 섹션은 제1 보호 층에 의해 매립되지 않는다.
하나의 구현예에서, 제1 보호 층은 포획 모이어티의 20% 내지 90%를 매립하며, 여기서 제2 링커가 포획 모이어티에 결합하여 포획 모이어티와 기능성 단백질에 연결하는 포획 모이어티의 섹션은 매립되지 않는다.
하나의 구현예에서, 제2 보호 층은 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고 제2 링커를 완전히 매립하며 기능성 단백질의 50% 내지 150%를 매립하고, 일반적으로 10% 내지 150%, 바람직하게는 20%와 95% 내지 99% 사이, 더욱 바람직하게는 30%와 90% 내지 95% 사이, 더욱 더 바람직하게는 60%와 90 내지 99% 사이의 기능성 단백질을 매립한다.
추가 구현예에서, 제2 보호 층은 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하며, 기능성 단백질의 20%와 95% 내지 99% 사이, 더욱 바람직하게는 30%와 90% 내지 95% 사이, 더욱 더 바람직하게는 60%와 90 내지 99% 사이를 매립하고, 여기서 기능성 단백질의 활성 부위는 매립되지 않는다.
하나의 구현예에서, 제2 보호 층은 제1 보호 층을 완전히 매립하고, 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 적어도 부분적으로 매립한다.
제1 보호 층이 형성된 후, 제1 링커와 포획 모이어티 및 제1 보호 층을 포함하는 고체 담체가 저장될 수 있다. 저장은, 예를 들어, 형성된 조성물을, 예를 들어, 완충액으로 세척하고 이를 목적하는 기간 동안 완충액에 현탁 또는 용해시켜 저장함으로써 일반적으로 달성된다. 바람직한 구현예에서, 제1 링커, 포획 모이어티 및 제1 보호 층을 포함하는 고체 담체는 2 내지 25℃ 사이의 일정한 온도에서 저장된다. 추가로 바람직한 구현예에서, 제1 링커, 포획 모이어티 및 제1 보호 층을 포함하는 고체 담체는 5 내지 48시간, 바람직하게는 10 내지 30시간 동안 저장된다. 더욱 바람직하게는, 제1 링커, 포획 모이어티 및 제1 보호 층을 포함하는 고체 담체는 2 내지 25℃ 사이의 일정한 온도에서, 바람직하게는 10 내지 30시간 동안 실온에서 저장된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 조성물, 예를 들어, 고체 담체; 포획 모이어티; 기능성 단백질; 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커; 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커; 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하며, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 제1 보호 층; 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하며, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공하고; 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 제1 링커에 의해 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 단계;
(b) 고체 담체의 표면에 제1 보호 층을 형성하여, 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 단계;
(c) 제2 링커에 의해 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 단계;
(d) 제1 보호 층의 표면에 제2 보호 층을 형성하여, 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 단계.
단계 (a)는 일반적으로 물 또는 완충액에서 현탁액 중 고체 담체에 제1 링커를 첨가함으로써 수행된다. 현탁액은, 예를 들어, 400rpm, 20℃에서 30분 동안 교반할 수 있다. 임의의 세척 단계 및 입자의 재현탁 후, 포획 모이어티를 첨가하고, 생성되는 혼합물은 일반적으로, 예를 들어, 20℃, 400rpm에서 1시간 동안 교반한다.
단계 (b)에 따라 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 고체 담체의 표면에 제1 보호 층의 형성은 일반적으로 구성 요소, 예를 들어, TEOS와 같은 4가 실란을 단계 (a)에 의해 수득된 혼합물에 첨가함으로써 수행되고, 예를 들어, 10℃, 400rpm에서, 예를 들어, 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 추가의 구성 요소, 예를 들어, APTES와 같은 3가 실란 또는 2개의 3가 실란, 예를 들어, APTES 및 하이드록시메틸트리에톡시실란을 이전 혼합물에 첨가하고, 예를 들어, 4시간 동안 반응시킨다. 제1 보호 층에 의해 커버된 조성물의 샘플을 반응 중에 다양한 시간에서 채취하여 두께가 상이한 제1 보호 층을 갖는 조성물을 수득할 수 있다.　 샘플은 경화를 위해, 예를 들어, 24시간 동안 실온에서 저장할 수 있다.
단계 (c)에 따른 포획 모이어티에 대한 기능성 단백질의 결합은 일반적으로 단계 (b) 후에 수득된 샘플에 기능성 단백질, 예를 들어, 효소를 첨가함으로써 수행된다. 이어서, 수득된 현탁액을 일반적으로, 예를 들어, 20℃, 400rpm에서 1시간 동안 교반한다. 후속적으로 및 중간 세척의 존재 또는 부재하에, 구성 요소, 예를 들어, TEOS와 같은 4가 실란을 입자에 첨가하고, 예를 들어, 10℃, 400rpm에서 1시간 동안 반응시킨다. 이어서, 추가의 구성 요소, 예를 들어, APTES와 같은 3가 실란을 혼합물에 첨가한다. 제2 보호 층에 의해 커버된 조성물의 샘플을 반응 중에 다양한 시간에 채취하여 두께가 상이한 제2 보호 층을 갖는 조성물을 수득할 수 있다.　 샘플은 경화를 위해, 예를 들어, 24시간 동안 실온에서 저장할 수 있다.
하나의 구현예에서, 단계 (b) 후에 수득된 조성물은 단계 (c)에서 기능성 단백질을 포획 모이어티에 결합시키기 전에 저장된다. 추가의 구현예에서, 조성물은 단계 (d) 후에 저장된다. 바람직한 구현예에서, 저장은 2 내지 25℃ 사이의 일정한 온도에서 일어난다. 추가의 바람직한 구현예에서, 저장은 5 내지 48시간, 바람직하게는 10 내지 25시간 동안 일어난다.
하나의 구현예에서, 제2 보호 층은 제1 보호 층을 완전히 매립한다.
하나의 구현예에서, 제1 및 제2 보호 층은 동일한 물질 또는 상이한 물질로 이루어지며, 바람직하게는 상이한 물질로 이루어진다.　
추가의 양태에서, 본 발명은 면역리간드/페이로드 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 기재된 조성물에 의해 페이로드를 면역리간드에 접합시키는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 조성물의 기능성 단백질은 트랜스펩티다제 또는 이의 단편, 바람직하게는 서열-특이적 트랜스펩티다제 또는 이의 단편이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물의 트랜스펩티다제 또는 이의 단편은 접합 반응을 촉매한다.　
추가의 구현예에서, 트랜스펩티다제 또는 이의 단편을 포함하는 조성물은 면역리간드 및 페이로드와 함께 배양(incubating)된다.　
추가의 구현예에서, 트랜스펩티다제 또는 이의 단편을 포함하는 조성물은 　
i) 용액으로 제공되고;
ii) 조성물을 포함하는 용액이 면역리간드 및 페이로드와 함께 배양되고;
ii) 접합 반응이 일어난 후, 용액이 원심분리되고, 면역리간드/페이로드 접합체를 함유하는 상청액(supernatant)이 제거된다.
하나의 구현예에서, 페이로드 및/또는 면역리간드는
a) 전적으로 단백질 또는 펩티드로 이루어지거나, 또는
b) 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드 도메인을 포함하거나, 또는
c) 면역리간드로서 적어도 하나의 단백질과 페이로드로서 소분자량 분자를 포함하거나, 또는
d) 면역리간드로서 적어도 하나의 단백질과 페이로드로서 소분자량 독소를 포함하거나, 또는
e) 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드 쇄를 포함하며, 여기서 추가로, 단백질 또는 펩티드 쇄는 트랜스펩티다제 또는 이의 단편에 의해 검출될 수 있는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 면역리간드/페이로드 접합체에 포함된 면역리간드는 항체, 변형된 항체 포맷, 항체 유도체 또는 단편, 및/또는 항체 모방체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 면역리간드/페이로드 접합체에 포함된 페이로드는 마커, 태그 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 소분자량 약물 또는 소분자량 독소이다.
하나의 구현예에서, 면역리간드/페이로드 접합체에 포함된 페이로드는 마커, 태그 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서 마커는 방사성 표지, 바람직하게는 방사성 표지된 펩티드 또는 단백질, 형광 표지, 바람직하게는 형광 펩티드 또는 단백질, 및 효소 표지, 바람직하게는 퍼옥시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 면역리간드/페이로드 접합체에 포함된 페이로드는 방사성 표지, 바람직하게는 방사성 표지된 펩티드 또는 단백질, 형광 표지, 바람직하게는 형광 펩티드 또는 단백질, 및 효소 표지, 바람직하게는 퍼옥시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마커이다.
하나의 구현예에서, 면역리간드/페이로드 접합체에 포함된 페이로드는 마커, 태그 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서 약물은 사이토카인, 방사성제, 항염증제, 독소 및 화학요법제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 면역리간드/페이로드 접합체에 포함된 페이로드는 사이토카인, 방사성제, 항염증제, 독소 및 화학요법제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 약물이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 수득된 면역리간드/페이로드 접합체를 제공한다.
실시예
물질: 테트라에틸 오르토실리케이트(T, ≥99%), (3-아미노프로필)트리에톡시실란(A, ≥98%), N-하이드록시설포석신이미드 나트륨 염(설포-NHS), 수산화암모늄(NH4OH, ACS 등급, 28-30%), 에탄올(EtOH, ACS 등급, 무수), 글루타르알데히드(등급 I, 물 중 25%), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC, 99%), Trizma® 염기(≥99.9%), CH3CN 및 글리세롤은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, Switzerland)에서 구입했다. n-프로필트리에톡시실란(P, 97%) 및 헥사하이드로-2-옥소-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-펜탄산(비오틴, 97%)은 ABCR(Germany)에서 구입했다. 하이드록시메틸트리에톡시실란(H, 에탄올 중 50%)은 겔레스트(Gelest, USA)에서 구입했다. 프리캐스트 단백질 겔(4-20% Mini-PROTEAN® TGXTM 프리캐스트 단백질 겔, 15-웰, 15μl) 및 래더(Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Prestained Proteins Standards)는 바이오-라드(Bio-Rad)에서 구입했다. 인산칼륨 염 및 TFA는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific, Switzerland)에서 구입했다. 인산나트륨 염, HEPES 염, NaCl, CaCl2, 글리신 및 DTT는 칼 로쓰(Carl Roth, Germany)에서 구입했다. Gly5-변형된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)는 바켐(Bachem, Switzerland)에서 구입했다. 소르타제 A(SrtA)는 AGC 바이올로직스(Biologics)에서 구입했다. 동결건조된 Strep-Tactin은 IBA 라이프사이언스(Lifesciences, Germany)에서 구입했다. 에어로펄(Aeroperl) 300 입자는 에보닉(Evonik)에서 구입했다. LPQTG-태깅 모노클로날 항체는 에비트리아(Evitria)/우시 바이올로직스(WuXi Biologics)에서 구입했다. Gly2-변형된 독소는 레베나 바이오파마(Levana Biopharma)에서 구입했다. PBS는 바이오컨셉트(BioConcept)에서 구입했다.　
실시예 1: 입자 상의 소르타제 A 효소의 비특이적 결합의 최적화
SNP는 다음과 같이 문헌[참조: Imhof et al.(J. Phys. Chem . B 1999, 103, 1408)]의 보고에서 채택된 종래의 스토버(Stober) 방법을 사용하여 생산되었다. 에탄올(345.4ml), 암모니아 25%(39.3ml) 및 TEOS(테트라에틸오르토실리케이트, 15.3ml)를 환저 플라스크에서 혼합하고, 이 혼합물을 20℃의 일정한 온도에서 20시간 동안 600rpm으로 교반했다. 이어서, 생성되는 침전물을 에탄올로 2회 및 물로 2회 세척하고, 동결-건조하여 주사 전자 현미경(Zeiss, SUPRA 40 VP)을 사용하여 특성화된 베어 SNP를 수득했다. 획득된 현미경 사진은 analysis®(Olympus) 소프트웨어 패키지(100회 측정에 대해 수행된 통계 분석)를 사용하여 입자 크기 측정에 사용되었다.　
기능성 단백질 또는 이 경우 소르타제 A 효소의 고정화를 허용하는 SNP 표면에 아민 기능성 화학 그룹을 도입하기 위해, SNP를 아미노-실란과 반응시켰다. 이 변형은 보호 층의 추가 부착을 위해 실란올 그룹을 유리시키기 위해 부분적이어야만 한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 이를 위해, 20℃에서 90분 동안 수중 현탁액 중의 SNP(20mL, 10mg/ml)를 APTES(3-아미노프로필트리에톡시실란, 33mg)와 함께 배양했다. 물로 2회 세척 단계 후, 생성되는 아미노-변형된 SNP(SNPs-NH2)가 수득되었다.　
아미노-변형된 나노입자(SNPs-NH2)의 비오틴-변형은 수용성 비오틴화 시약인 설포-NHS-비오틴을 사용하여 수행했다. 전형적인 절차에서, 설포-NHS-비오틴을 pH 8.0의 인산염 완충액 중의 아미노 변형된 실리카 입자(SNPs-NH2)에 첨가했다. 현탁액을 400rpm, 20℃에서 30분 동안 교반했다. 인산염 완충액 pH 8.0에서 비오티닐화 입자(SNPs-bio)(3.2mg/mL, 15mL)의 세척 및 재현탁 후, Strep-Tactin(500μg/mL)을 첨가하고, 생성되는 혼합물(SNPs-bio-ST)을 20℃, 400rpm에서 1시간 동안 교반했다. 후속적으로, 그리고 중간 세척 부재하에, 43.3μL의 테트라에틸 오르토실리케이트(T)를 입자(3.2mg/mL, 14.5mL)에 첨가하고, 10℃, 400rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 입자를, 3-아미노프로필-트리에톡시실란(A), 하이드록시메틸트리-에톡시실란(H) 및 프로필트리에톡시실란(P)을 함유하는 3개의 상이한 오가노실란 혼합물과 함께 배양했다. 결과적으로, 3개의 상이한 층(ATH, AT 및 ATP)이 생성되어 비교되었다. 상세하게는, ATH로 이루어진 층의 합성을 위해, 입자의 현탁액에 16.5μL의 A와 27.1μL의 H를 첨가했고; AT 층의 합성을 위해, 28.2μL의 T와 6.7μL의 A를 첨가했으며; ATP 층을 위해, 17.5μL의 T, 6.7μL의 A 및 11.3μL의 P를 첨가하고, 4시간 동안 매시간 샘플을 수집했다. SNPs-bio-ST-AT 또는 SNPs-bio-ST-ATH 또는 SNPs-bio-ST-ATP의 상이한 샘플을 실온에서 24시간 동안 저장했다. 3개의 상이한 조성물 모두에 대해 약 1.4nm의 층이 수득되었다. 약 50%의 Strep-Tactin(포획 모이어티)이 이 층에 의해 커버되었다. 이어서, 비오틴-Strep-Tactin을 수반하는 3개의 입자 샘플에 C-말단에서 Twin-Strep 태그(서열번호 1)에 융합된 스타필로콕쿠스 아우레우스(균주 NCTC 8325)의 유니프로트 번호 KB-Q2FV99(SRTA_STAA8)를 갖는 소르타제 A(130μg/mL)를 첨가하고, 현탁액을 20℃, 400rpm에서 1시간 동안 교반했다. ATH, AT 및 ATP로 이루어진 층은 소르타제 A의 비특이적 흡착을 각각 최대 69%, 51% 및 32%까지 감소시킬 수 있었다(도 2). 비특이적 흡착은 담체와 소르타제 A의 이용 가능한 표면 사이의 분자간 힘(이온 상호작용 및 반 데르 발스 힘을 포함)으로부터 발생한다. 사용된 오가노실란(A, H, 및 P)의 화학적 기능성은 입자 표면에서의 화학적 전하를 변형시켜 소르타제 A의 비특이적 흡착을 감소시킨다. 비특이적 흡착은 담체의 표면에서 소르타제 A의 제어되지 않은 결합을 유발하고, 결과적으로 생체접합의 감소를 유발한다.
실시예 2: 소르타제 A의 방향성 고정화 및 차폐
실시예 1에서 수득된 결과에 기초하여, 조성 ATH를 갖는 층은 소르타제 A의 최저 비특이적 흡착을 나타냈다. 결과적으로, ATH로 이루어진 층으로 차폐된 Strep-Tactin을 수반하는 입자(3.2mg/mL, 2.5mL)를 포함하는 시스템은 방향성 방식으로 소르타제 A의 고정화를 위한 담체로서 선택되었다. C-말단에서 Twin-Strep 태그(서열번호 1)에 융합된 스타필로콕쿠스 아우레우스(균주 NCTC 8325)의 유니프로트 번호 KB-Q2FV99(SRTA_STAA8)를 갖는 소르타제 A(130μg/mL)를 첨가하고, 현탁액을 20℃, 400rpm에서 1시간 동안 교반하고, 후속적으로 그리고 중간 세척 없이, 12μL의 테트라에틸 오르토실리케이트(T)를 입자에 첨가하고(3.2mg/mL, 2.5mL), 10℃, 400rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 3-아미노프로필-트리에톡시실란(A)(2.83μL)을 이전 혼합물에 첨가했다. 4시간 동안 매시간 625μL를 수집했다. 특히, A 및 T와의 3시간 배양 후, 층은 9.8nm였고, 4시간 후 층은 11.2nm였다.
실시예 3: 생체접합 반응　
소르타제-SNP 또는 가용성 소르타제 효소에 의해 촉매된 생체접합 반응은 항체 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 존재하는 소르타제 인식 모티프를 갖는 재조합 항체의 펜타-글리신-변형된 플루오레세인 이소티오시아네이트(Gly5-FITC)에의 접합으로 측정하였고, 이들 둘 다는 따라서 소르타제 A 매개된 트랜스펩티드화 반응을 위한 기질이다. C-말단에서 Twin-Strep 태그(서열번호 1)에 융합된 스타필로콕쿠스 아우레우스(균주 NCTC 8325)로부터 유니프로트 번호 KB-Q2FV99(SRTA_STAA8)를 갖는 소르타제 A를 실리카 입자 표면에 존재하는 Strep-Tactin 포획 모이어티를 통해 방향성 방식으로 고정시키고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라 2개의 상이한 층(AT-AT 및 ATH-AT) 또는 보호 단일 층(AT)으로 차폐했다. C-말단에서 Twin-Strep 태그(서열번호 1)에 융합된 스타필로콕쿠스 아우레우스(균주 NCTC 8325)로부터 소르타제 A(유니프로트 번호 KB-Q2FV99(SRTA_STAA8))가 실리카 입자의 표면에 방향성 방식으로 고정되고 2개의 상이한 층(AT-AT 및 ATH-AT)으로 차폐된 시스템을 사용하는 생체접합의 동역학은 소르타제 A가 SNP에 직접 결합되고 단일 보호 단일 층(AT)으로 차폐된 시스템과 비교하여 예상외로 더 높았다. 전형적인 생체접합 실험에서, 실리카 입자에 고정되고 차폐된 소르타제의 용액을 트리스-완충액 pH 7.5, 25℃, 800rpm에서 4시간 동안 암실에서 항체(mAb)(10μM) 및 Gly5-FITC(200μM)와 함께 배양했다. 접합 반응 후, 샘플을 원심분리하고, 상청액을 빈 바이알에 옮겼다. 각 샘플의 상청액을 나트륨-도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석하고(도 3a), 각 시스템의 생체접합 효율성을 결정했다(도 3b).
글루타르알데히드를 가교결합제로 사용하여 소르타제 A를 아미노-변형된 실리카 입자 표면에 공유 고정시키고 부분적으로 2nm의 층으로 차폐시킨 경우, 프로브에 대한 항체의 생체접합이 최저였다: AT(2.5h); AT(3h); AT(3.5h); AT(4h); AT(4.5h). 소르타제 A가 이미 포획 모이어티를 수반하고 이중 층(AT/AT 또는 AT/ATH)을 수반하는 SNP에 방향성 방식으로 실리카 입자에 고정되는 경우, 항체 생체접합의 더 높은 값이 수득된다. 최적 값은 AT(1h)/ATH(4h)로 제조된 이중 층에서 수득된다.
실시예 4: 가용성 소르타제 A와 방향성 고정된 및 차폐된 소르타제 A에 의해 촉매된 생체접합 반응의 비교
가용성 소르타제 A와 방향성 고정된 및 차폐된 소르타제 A(실시예 2에 제시된 바와 같이 합성됨)에 의해 촉매된 생체접합 반응은 다음과 같이 수행되었다: 실시예 3에 사용된 10μM의 재조합 항체 및 200μM의 Gly5-FITC를 트리스 완충액(50mM, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.5) 중의 고정된 및 차폐된 소르타제 A(3μM)의 현탁액에 첨가하고, 25℃, 800rpm에서 7시간 동안 암실에서 열 혼합기로 진탕시켰다. 분액은 매시간 수집했다. 생체접합 반응을 중지하기 위해, 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 유사하게, 3μM의 가용성 소르타제 A를 10μM의 항체 및 200μM의 Gly5-FITC와 함께 배양했다. 형광 스캔은 차폐된 소르타제의 접합 활성이 가용성 효소와 동일했음을 나타냈다.
실시예 5: 에어로펄(Aeroperl) 300 입자 및 차폐에 대한 소르타제 A의 부위-특이적 고정화
시판되는 다공성 실리카 입자(직경 20 내지 60μm)를 변형하여 소르타제 A를 고정시켰다. 보다 상세하게는, 물 중의 현탁액 중 에어로펄 입자(20mL; 10mg/ml)를 20℃에서 90분 동안 APTES(3-아미노프로필트리에톡시실란, 33mg)와 함께 배양했다. 물로 2회 세척 단계 후, 생성되는 아미노-변형된 에어로펄(Aer-NH2)을 수득했다. 아미노-변형된 입자(Aer-NH2)의 비오틴-변형은 수용성 비오티닐화 시약인 설포-NHS-비오틴을 사용하여 수행되었다.　
전형적인 절차에서, 설포-NHS-비오틴을 인산염 완충액 pH 8의 아미노 변형된 실리카 입자(Aer-NH2)에 첨가했다. 현탁액을 1000rpm, 20℃에서 30분 동안 혼합했다. 인산염 완충액 pH 8에서 비오티닐화 입자(Aer-bio)(1.6mg/mL, 25mL)의 세척 및 재현탁 후, Strep-Tactin(500μg/mL)을 첨가하고, 생성되는 혼합물(Aer-bio-ST)을 20℃, 1000rpm에서 1시간 동안 혼합했다. 후속적으로 그리고 중간 세척 없이, 37μL의 테트라에틸 오르토실리케이트(T)를 입자(1.6mg/mL, 23.9mL)에 첨가하고, 1시간 동안 1000rpm으로 혼합하면서 10℃에서 반응시켰다. 이어서, 입자를 3-아미노프로필-트리에톡시실란(A) 및 하이드록시메틸-트리에톡시실란(H)을 함유하는 오가노실란 혼합물과 함께 배양했다. 보다 상세하게는, ATH로 이루어진 층의 합성을 위해, 입자의 현탁액에 14.1μL의 A 및 23.1μL의 H를 첨가하고, 혼합물을 1000rpm으로 혼합하면서 10℃에서 1시간 동안 반응시켰다.　 약 50%의 Strep-Tactin(포획 모이어티)이 층에 의해 커버되었다. Aer-bio-ST-ATH의 샘플은 경화를 위해 실온에서 24시간 동안 저장했다. 이어서, C-말단에서 Twin-Strep 태그(서열번호 1)에 융합된 스타필로콕쿠스 아우레우스(균주 NCTC 8325)로부터 유니프로트 번호 KB-Q2FV99(SRTA_STAA8)를 갖는 소르타제 A(130μg/mL)를 비오틴-Strep-Tactin을 수반하는 샘플에 첨가하고, 현탁액을 1시간 동안 1000rpm으로 혼합하면서 20℃에서 혼합했다. 후속적으로 그리고 중간 세척 없이, 57.4μL의 테트라에틸 오르토실리케이트(T)를 입자(1.6mg/mL, 23.9mL)에 첨가하고, 1시간 동안 1000rpm으로 혼합하면서 20℃에서 반응시켰다. 이어서, 3-아미노프로필-트리에톡시실란(A)(13.5μL)을 이전 혼합물에 첨가하고, 4시간 동안 1000rpm으로 혼합하면서 20℃에서 반응시켰다.
생체접합: 고정된 소르타제-매개 항체 접합
페이로드는 3μM 고정된 소르타제 A의 존재하에 LPQTG-태깅 모노클로날 항체(10μM)를 Gly2-변형 독소(400μM)와 함께 50mM HEPES, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 10% 글리세롤에서 pH 7.5에서 16 내지 20시간 동안 25℃에서 배양함으로써 mAb에 접합시켰다. 고정된 소르타제 A 접합 샘플을 200rcf에서 5분 동안 원심분리했다. ISMAC의 상청액을 별도의 튜브에 수집했다. 나머지 소르타제 비드를 50mM NaH2PO4, 100mM NaCl, pH 8로 3회 세척하고, ISMAC 상청액으로 풀링했다. ISMAC를 25mM HEPES, 150mM NaCl, 10% 글리세롤(v/v), pH 7.5의 24 컬럼 용적(CV)으로 평형화된 중력 유동 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, #28-9852-54)을 통해 통과시켜 정제했다. 이어서, 컬럼을 동일한 완충액의 24 CV로 세척했다. 결합된 접합체를, 1:25 1M HEPES, pH 8.0을 함유하는 튜브에 수집된 분획으로서 용출 완충액(100mM 글리신, 50mM NaCl, 10% 글리세롤(v/v), pH 2.7)으로 용출시켜 용액을 중화시켰다. 단백질 함유 분획을 풀링하고, 제조업체의 지침에 따라 탈염/제형 컬럼(Zeba Spin 컬럼, ThermoFisher, #89892, 5mL 수지)을 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)에서 제형화했다. 제형화된 ADC는 0.22μm PES 주사기 필터 장치 및 상응하는 일회용 주사기로 여과했다.
ADC 분석
약물 로딩은 0.1% TFA/3.0% CH3CN/96.9% H2O 및 0.1% TFA/99.9% CH3CN 사이에서 9분 선형 구배로 60℃에서 0.7mL/분으로 실행되는 PLRP-S 1000Å, 2.1 × 50mm, 3μm 컬럼(Agilent, #PL1912-3301) 상의 역상 크로마토그래피(RP-LC)에 의해 평가했다. 샘플을 먼저 37℃에서 15분 동안 DTT와 함께 배양하여 환원시키고, 14000rcf에서 5분 동안 원심분리했다.
소르타제 A가 이중 층(ATH/AT)을 수반하는 에어로펄 입자에 고정된 경우, 수득된 ADC 생산 수율 및 DAR 값은 가용성 소르타제 A로 수득된 것에 필적한다. 보다 상세하게는, 에어로펄 ATH/AT는 78%의 ADC 생산 수율을 나타냈고, 가용성 효소는 81%의 ADC 생산 수율을 나타냈다(도 5a). 추가로, 에어로펄 ATH/AT는 1.86의 DAR을 나타냈고, 가용성 효소는 2.00의 DAR 값을 나타냈다(도 5b).
실시예 6: 에어로펄 300 입자 상의 소르타제 A의 비 부위-특이적 고정화 및 차폐(비교 실험)
시판되는 다공성 실리카 입자(직경 20 내지 60μm)를 변형하여 WO2015/014888에 기재된 바와 같이 소르타제를 고정시켰다. 보다 상세하게는, 물 중의 현탁액 중의 에어로펄 입자(20mL; 10mg/ml)를 20℃에서 90분 동안 APTES(3-아미노프로필트리에톡시실란, 33mg)와 함께 배양했다. 물로 2회 세척 단계 후, 생성되는 아미노-변형된 에어로펄(Aer-NH2)을 수득했다.　
아미노-변형된 입자(Aer-NH2)의 글루타르알데히드-변형은 글루타르알데히드(H2O 중 25%)를 사용하여 수행되었다. 전형적인 절차에서, 글루타르알데히드를 물 중의 아미노 변형된 실리카 입자(Aer-NH2)에 첨가했다. 현탁액을 1000rpm, 20℃에서 30분 동안 혼합했다. 인산염 완충액 pH 8 중의 글루타르알데히드 입자(Aer-glut)(3.2mg/mL, 15mL)의 세척 및 재현탁 후, 소르타제 A(45μg/mL)를 첨가하고, 생성되는 혼합물(Aer-glut-소르타제 A)을 20℃, 1000rpm에서 1시간 동안 혼합했다. 후속적으로 그리고 중간 세척 없이, 36μL의 테트라에틸 오르토실리케이트(T)를 입자(3.2mg/mL, 7.5mL)에 첨가하고, 1시간 동안 1000rpm으로 혼합하면서 10℃에서 반응시켰다. 이어서, 입자를 3-아미노프로필-트리에톡시실란(A)과 함께 배양했다. 보다 상세하게는, AT로 이루어진 층의 합성을 위해, 입자의 현탁액에 8.48μL의 A를 첨가하고, 혼합물을 1000rpm으로 혼합하면서 10℃에서 3시간 동안 반응시켰다. Aer-bio-ST-ATH의 샘플을 경화를 위해 실온에서 24시간 동안 저장했다.　
고정된-소르타제-매개 항체 접합 및 ADC 분석은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행되었다. 소르타제 A가 글루타르알데히드를 사용하여 에어로펄 입자에 고정되고 WO2015/014888에 기재된 바와 같이 층(AT)으로 차폐된 경우, ADC 생산 수율 및 DAR 값은 실시예 5에 기재된 바와 같이 부위 특이적 고정된 소르타제 A로 수득된 것보다 낮다. 보다 상세하게는, 글루타르알데히드를 통해 고정되고 차폐된 것(에어로펄_글루타르알데히드_AT)은 53%의 ADC 생산 수율을 나타냈고, 부위-배향 고정된 소르타제 A는 78%의 ADC 생산 수율을 나타냈다(도 6a). 추가로, 에어로펄_글루타르알데히드_AT는 1.44의 DAR을 나타냈고, 부위-배향 고정된 소르타제 A는 1.86의 DAR 값을 나타냈다(도 6b).
SEQUENCE LISTING <110> Inofea AG NBE-Therapeutics AG <120> Biocatalytical composition and use for generation of immunoligand-payload conjugates <130> P5664PC00 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second linker <400> 1 Lys Ile Phe Val Ala Thr Glu Val Lys Leu Glu Trp Ser His Pro Gln 1 5 10 15 Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp 20 25 30 Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ser His His His His His His 35 40 45

Claims (18)

  1. 고체 담체(solid carrier);　
    포획 모이어티(capture moiety);
    기능성 단백질(functional protein);
    포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 제1 링커(first linker);
    기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 제2 링커(second linker);　
    고체 담체를 완전히 매립(embedding)하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 제1 보호 층(first protective layer); 및
    포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 제2 보호 층(second protective layer)을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기능성 단백질이 효소 또는 이의 단편인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기능성 단백질이 트랜스펩티다제 또는 이의 단편인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 기능성 단백질이 소르타제(sortase) 또는 이의 단편인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 제2 링커가 단백질 정제 태그(protein purification tag) 및 친화성 태그(affinity tag)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 태그인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커가 Strep-Tag, Twin-Strep tag®, 비오틴(biotin) 및 변형된 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 링커가 Strep-Tag, Twin-Strep tag®, 비오틴 및 변형된 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 모이어티가 스트렙타비딘 및 가공된(engineered) 스트렙타비딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 보호 층이 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 매립하고, 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고; 상기 제2 보호 층이 포획 모이어티를 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 제1 링커에 의해 포획 모이어티를 고체 담체에 연결하는 단계;
    (b) 고체 담체의 표면에 제1 보호 층을 형성하여 고체 담체를 완전히 매립하고, 제1 링커를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 포획 모이어티를 매립하지 않거나 부분적으로 매립하는 단계;
    (c) 제2 링커에 의해 기능성 단백질을 포획 모이어티에 연결하는 단계;
    (d) 제1 보호 층의 표면에 제2 보호 층을 형성하여 포획 모이어티를 완전히 또는 부분적으로 매립하고, 제2 링커를 완전히 매립하고, 기능성 단백질을 완전히 또는 부분적으로 매립하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 면역 리간드/페이로드 접합체(immune ligand/payload conjugate)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물에 의해 페이로드를 면역리간드에 접합시키는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 트랜스펩티다제 또는 이의 단편이 접합 반응을 촉매(catalyzing)하는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물이 면역리간드 및 페이로드와 함께 배양(incubating)되는, 방법.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물이
    i) 용액으로 제공되고;
    ii) 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 용액이 면역리간드 및 페이로드와 함께 배양되고;
    ii) 접합 반응이 일어난 후, 용액이 원심분리되고, 면역리간드/페이로드 접합체를 함유하는 상청액(supernatant)이 제거되는, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드 및/또는 면역리간드가
    a) 전적으로 단백질 또는 펩티드로 이루어지거나, 또는
    b) 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드 도메인(domain)을 포함하거나, 또는
    c) 면역리간드로서 적어도 하나의 단백질과 페이로드로서 소분자량 분자를 포함하거나, 또는
    d) 면역리간드로서 적어도 하나의 단백질과 페이로드로서 소분자량 독소를 포함하거나, 또는
    e) 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드 쇄를 포함하고, 여기서 추가로, 단백질 또는 펩티드 쇄가 트랜스펩티다제 또는 이의 단편에 의해 검출될 수 있는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역리간드/페이로드 접합체에 포함된 면역리간드가 항체, 변형된 항체 포맷(modified antibody format), 항체 유도체 또는 단편 및/또는 항체 모방체(mimetic)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역리간드/페이로드 접합체에 포함된 페이로드가 마커(marker), 처리 태그(processing tag) 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 면역리간드/페이로드 접합체.
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