KR102214257B1 - 항균성 칼슘계 물질 - Google Patents

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Abstract

적어도 뼈 임플란트로서 유용한 조제물을 제공하며, 이 조제물은 리튬 화합물 및 칼슘 화합물을 포함하는 고형 성분을 포함한다. 본 조제물은 칼슘 화합물을 포함하지만 리튬 화합물은 포함하지 않는 조제물과 비교해 항균 활성을 나타낸다.

Description

항균성 칼슘계 물질{ANTIBACTERIAL CALCIUM-BASED MATERIALS}
본 발명은 뼈 치료용 항균 조제물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 리튬-함유 칼슘계 물질인, 뼈 치료용 항균 조제물에 관한 것이다.
상당한 연구와 개발 노력에도 불구하고, 생체의료 기기 및 임플란트와 관련된 감염 문제는 계속해서 존재한다. 박테리아는 확실히, 카테터, 엉덩이 임플란트 및 무릎 임플란트, 치아 임플란트, 및 기타 많은 장치의 제작에 사용되는 것과 같은 합성 물질의 표면에서 콜로니를 쉽게 형성할 수 있다. 임플란트 장치와 관련된 감염은 심각한 병원 문제이며, 빈번하게는 임플란트 실패의 주원인이 되기도 한다 (Shi et al., Int J Artif Organs. 2008 Sep; 31(9):777-85; Zhao et al., J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2009 Oct; 91(1):470-80; Vasilev et al., Expert Rev Med Devices. 2009 Sep; 6(5):553-67). 생장중인 콜로니는 보호성 세포외 박테리아 다당류 층(protective exocellular bacterial polysaccharide layer)으로 자신을 캡슐화하기 때문에, 생물막은 순환중인 박테리아보다 대항하기가 훨씬 더 힘들어진다 (Vasilev et al., Expert Rev Med Devices. 2009 Sep; 6(5): 553-67). Ratner에 따르면 (UW Today 1999-12-14), 일단 박테리아가 장치에 존재하게 되면, 이들은 제거하기가 상당히 어려우며 치료에 매우 내성이어서, 부착된 상태의 박테리아를 죽이는 데 필요한 항생제의 농도는 유리(free) 상태의 박테리아를 죽이는 데 필요한 농도의 100배일 수 있다. 그 이유는, 박테리아가 구축된 후 이들이 생성하는 보호성 생물막때문일 수 있다. 이러한 일이 일어나면, 감염을 치료하는 유일한 방법은 환자로부터 장치를 제거하는 것이다. 그런 다음, 감염을 중단시키는 방법은, 박테리아가 부착되기 전에 장치 부근에 존재하는 박테리아를 죽이는 것이다.
Na, K 및 Cl 성분의 혼입 (Maria et al., 2012; Uwe et al., 2005), 산화질소의 혼입 (Nablo BJ et al., 2005), 겐타마이신, 세팔로틴(cephalothin), 카르베니실린(carbenicillin), 아목시실린(amoxicillin), 세파만돌(cefamandol), 토브라마이신(tobramycin) 및 반코마이신(vancomycin)과 같은 항생제의 혼입 (Stallmann HP et al., 2006; Stallmann HP et al., 2006; Bohner M et al., 2000; Zhao L et al., 2009; Zhao L et al., 2009; Akif et al., 2008; Helen et al., 2010; A.Dion et al., 2005), 은 및 키토산 나노입자의 혼입 (Huiliang et al., 2010; Volker et al., 2003; Ewald A et al., 2011; Shi Z et al., 2006), TiO2의 혼입 (Lingzhou et al., 2011; Bogdan et al., 2009), 이온 이식형 구리 및 은의 혼입 (N. Matsumoto et al., 2009; Jayesh et al., 2008) 등을 비롯하여, 박테리아의 접착 및 생장을 저해하기 위해 임플란트 또는 임플란트 표면을 변형하는 방법이 다수 개발되어 있으며, 수많은 리뷰 논문이 출판되어 있다 (Vasilev et al., Expert Rev Med Devices. 2009 Sep; 6(5): 553-67; Cao and Liu, Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol.2010 Nov-Dec; 2(6): 670-84; Chaloupka et al., Trends Biotechnol. 2010 Nov; 28(11):580-8. Epub 2010 Aug 18). 제안된 항균성 임플란트는 폴리머 시스템 (Alt et al, Biomaterials Volume 25, Issue 18, August 2004, Pages 4383-4391; Shi et al., Biomaterials Volume 27, Issue 11, April 2006, Pages 2440-2449; Marks et al., The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume 1976, 58(3): 358-64), 금속 시스템 (Visai et al., Int J Artif Organs. 2011 Sep; 34(9): 929-46; Heidenau et al., J Mater Sci Mater Med. 2005 Oct; 16(10): 883-8; Fiedler et al., Int J Artif Organs. 2011 Sep; 34(9): 882-8; Cao et al., Biomaterials. 2011 Jan;32(3):693-705), Kazemzadeh-Narbat M et al., 2010; Yoshinari M et al., 2001; Yoshinari M et al., 2010), 및 세라믹 시스템 (Gbureck et al., Biomaterials. 2005 Dec; 26(34):6880-6; Kim et al., 2007, Key Engineering Materials, 330-332, 791; Bohner et al., Journal of Pharmaceutical Sciences Volume 86, Issue 5, pages 565-572, May 1997)을 포함한다.
본 발명의 1차 목적은 뼈 치료용 항균 조제물을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명은 항균 조제물의 제조 방법, 및 뼈 치료에서 항균 조제물을 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라 제공되는 항균 조제물은 리튬 화합물 및 칼슘 화합물을 포함하는 고형 성분을 포함하며, 상기 항균 조제물은 칼슘 화합물을 포함하지만 리튬 화합물은 포함하지 않는 조제물과 비교해 향상된 항균 활성을 나타낸다.
10 cc/g의 용액 : 항균 조제물의 비로 침지된 항균 조제물을 포함하는 Hanks' 용액이 pH 10 이상의 pH 값을 나타낸다.
바람직하게는, 항균 조제물이 고형 성분의 중량을 기준으로 5 중량% 내지 80 중량%의 리튬 화합물을 포함하며, 더욱 바람직하게는, 항균 조제물이 고형 성분의 중량을 기준으로 10 중량% 내지 70 중량%의 리튬 화합물을 포함한다.
바람직하게는, 리튬 화합물이 리튬염, 리튬 옥사이드, 리튬 아미드 (LiNH2), 리튬 하이드록사이드 또는 리튬 할라이드이며; 더욱 바람직하게는, 리튬 화합물이 리튬 카르보네이트, 리튬 설페이트, 리튬 포스페이트, 리튬 옥사이드, 리튬 플루라이드, 리튬 아세테이트, 리튬 브로마이드, 리튬 하이드록사이드, 리튬 니트레이트, 리튬 니트라이트, 리튬 요오다이드, 리튬 몰리브데이트 (Li2MoO4), 리튬 테트라보레이트 (Li2B4O7), 리튬 시트레이트 테트라하이드레이트 (Li3C6H5O7·4H2O), 또는 리튬 스테아레이트 (LiC18H35O2)이며, 가장 바람직하게는, 리튬 화합물이 리튬 카르보네이트, 또는 리튬 포스페이트이다.
바람직하게는, 고형 성분이 리튬 화합물 및 칼슘 화합물을 포함하는 분말 성분이며, 칼슘 화합물이 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 옥사이드, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 하이드록사이드, 칼슘 마그네슘 포스페이트, 칼슘 니트레이트, 칼슘 시트레이트, 칼슘 클로라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 칼슘 화합물이 칼슘 설페이트, 칼슘 포스페이트 소스, 또는 이들의 혼합물이다. 바람직하게는, 칼슘 포스페이트가 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 다이칼슘 포스페이트, 트리칼슘 포스페이트, 모노칼슘 포스페이트 또는 혼합물이다. 바람직하게는, 칼슘 설페이트가 칼슘 설페이트 헤미하이드레이트(CSH), 칼슘 설페이트 데하이드레이트(CSD), 무수 칼슘 설페이트, 또는 이들의 혼합물이다.
바람직하게는, 고형 성분이 분말 성분일 때, 항균 조제물이 액체와 분말 비가 0.20 ml/g 내지 0.80 ml/g인 경화 액체 성분(setting liquid component)을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항균 조제물의 분말 성분 및 경화(setting) 액체 성분을 혼합함으로써 뼈 시멘트 페이스트(bone cement paste)를 제조하는 단계; 및 상기 뼈 시멘트 페이스트를 중공(hole) 또는 체강(cavity)에 충전시켜 치료가 필요한 중공 또는 체강에서 단단하게 경화시키는 단계를 포함하는, 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 고형 성분이 블록(block), 또는 상기 블록을 파쇄함으로써 수득되는 과립(granule) 또는 조각(piece)이다. 블록은 리튬 화합물 및 칼슘 화합물을 포함하며, 여기서, 칼슘 화합물이 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 옥사이드, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 하이드록사이드, 칼슘 마그네슘 포스페이트, 하이드록시아피타이트(hydroxyapitite), 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 칼슘 화합물이 테트라칼슘 포스페이트, 다이칼슘 포스페이트, 하이드록시아피타이트, 칼슘 설페이트 다이하이드레이트, 칼슘 설페이트 헤미하이드레이트, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한, 치료가 필요한 개체에서 본 발명의 항균 조제물의 상기 블록(block), 상기 과립(granule) 또는 상기 조각(piece)을 이식하는 단계를 포함하는, 개체의 치료 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 항균 조제물은 상기 항균 조제물로부터 방출되는 리튬 화합물의 속도를 서행시키는 리튬 지연제(retarding agent)를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 리튬 지연제는 폴리(아크릴산)이다. 바람직하게는 항균 조제물은 항균 조제물의 총 중량을 기준으로, -(CH2-C(COOH)H)n-의 반복 단위를 가지는 폴리(아크릴산) 0.01 중량% 내지 5 중량%를 포함하며, 상기 식에서, n은 50 내지 50000이며, 바람직하게는 n은 1000 내지 5000이며, 더욱 바람직하게는, n은 1500 내지 2500이다.
본 발명의 주요 이점은 하기의 (a) 내지 (d)이다:
(a) 본 발명의 항균제 (리튬 화합물)는 항생제가 아니므로, 항생제와 관련된 모든 종류의 부작용을 유발하지 않는다.
(b) 본 발명의 항균성 리튬 화합물은, 임플란트가 이식된 후 임플란트로부터 서서히 용해되어, 박테리아가 임플란트에 접근하지 못하게 할 수 있다. 더욱이, 항균성 리튬 화합물의 용해율은, 화합물의 농도가 주변 조직에 부정적인 반응을 유발할 정도로 너무 높지도 않으며 또는 불충분한 항균 효과를 유발할 정도로 너무 낮지 않도록 조정될 수 있다.
(c) 효과적인 항균 기간은 너무 길거나 또는 너무 짧지도 않게 조정될 수 있다. 금속성 항균제와 같은 영구 항균제를 혼입하는 임플란트 장치와는 달리, 본 발명의 항균 조제물의 기간은, 바람직한 항균 기간의 종료 시 (항균제 대부분이 방출되었을 때), 임플란트의 생체적합성이 정상적인 허용 가능한 수준으로 쉽게 증가하도록 설계될 수 있다.
(d) 본 발명의 항균성 리튬 화합물이 용해된 후, 설계된 크기의 기공은, 주변의 골 세포가 기공 쪽으로 성장하도록 함으로써 임플란트의 생체흡수율(bioresorption rate)을 증강시키도록 형성된다.
도 1은 본 발명에 따라 제조한 TTCP/DCPA/CSH/Li 샘플 및 TTCP/DCPA/CSH/알칼리 금속염 샘플의 항균 구역을 도시한 것이다.
도 2 내지 5는 본 발명에 따라 제조하고 각각 1일, 2일, 3일 및 5일 동안 Hanks' 용액에 침지한 TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 블록의 항균 구역을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조하였지만 침지하지 않은 CaCO3/Ca2P2O7/Li 블록의 항균 구역을 도시한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예는 하기의 항목을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다:
1. 칼슘 (Ca) 소스 및 리튬 (Li) 소스를 포함하는, 골 부위(bony site) 치료용 항균 제형.
2. 제1에 있어서, 칼슘 소스 및 리튬 소스의 중량을 기준으로, 약 5 중량% 내지 80 중량%, 보다 바람직하게는 약 10 중량% 내지 70 중량%의 리튬 소스를 포함하는, 항균 제형.
3. 제1에 있어서, 리튬 카르보네이트, 리튬 설페이트, 리튬 포스페이트, 리튬 옥사이드, 리튬 플루라이드, 리튬 아세테이트, 리튬 브로마이드, 리튬 하이드록사이드, 리튬 니트레이트, 리튬 니트라이트, 리튬 요오다이드, 리튬 몰리브데이트 (Li2MoO4), 리튬 아미드 (LiNH2), 리튬 테트라보레이트 (Li2B4O7), 리튬 시트레이트 테트라하이드레이트 (Li3C6H5O7·4H2O), 리튬 스테아레이트 (LiC18H35O2)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 리튬 소스.
4. 제2에 있어서, 리튬 카르보네이트 및/또는 리튬 포스페이트인, 리튬 소스.
5. 제1에 있어서, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 옥사이드, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 하이드록사이드, 칼슘 마그네슘 포스페이트, 칼슘 니트레이트, 칼슘 시트레이트, 칼슘 클로라이드, 또는 이들의 혼합물인, 칼슘 소스.
6. 제5에 있어서, 테트라칼슘 포스페이트 (TTCP), 다이칼슘 포스페이트, 트리칼슘 포스페이트 (TCP), 하이드록시아파타이트 (HA), 또는 이들의 혼합물인, 칼슘 포스페이트.
7. 제6에 있어서, 다이칼슘 포스페이트 무수물 (DCPA)인, 다이칼슘 포스페이트.
8. 제5에 있어서, 칼슘 설페이트 헤미하이드레이트 (CSH), 칼슘 설페이트 다이하이드레이트 (CSD), 무수 칼슘 설페이트, 또는 이들의 혼합물인, 칼슘 설페이트.
9. 제5에 있어서, 칼슘 포스페이트 및 칼슘 설페이트를 포함하는, 칼슘 소스.
10. 제9에 있어서, 테트라칼슘 포스페이트 (TTCP)를 포함하는, 칼슘 포스페이트.
11. 제10에 있어서, 다이칼슘 포스페이트를 추가로 포함하는, 칼슘 포스페이트.
12. 제11에 있어서, 다이칼슘 포스페이트 무수물 (DCPA)인, 다이칼슘 포스페이트.
13. 제9에 있어서, 칼슘 설페이트 헤미하이드레이트 (CSH)를 포함하는, 칼슘 설페이트.
14. 제1에 있어서, 상기 항균 제형으로부터의 리튬 방출을 서행시킬 수 있는 리튬 지연제(retarding agent)를 추가로 포함하는, 항균 제형.
15. 제14에 있어서, 폴리(아크릴산) (PAA)인, 리튬 지연제.
16. 제15에 있어서, 항균 조제물의 총 중량을 기준으로, -(CH2-C(COOH)H)n-의 반복 단위를 가지는 폴리(아크릴산) 0.01 중량% 내지 5 중량%를 포함하며, 여기서, n은 50 내지 50000, 바람직하게는 1000 내지 5000, 보다 바람직하게는 1500 내지 2500인, 항균 제형.
17. 제1에 있어서, 기공-형성제를 추가로 포함하여, 상기 기공-형성제의 용해 후 기공이 생체 내에서 형성되는, 항균 제형.
18. 제17에 있어서, LiCl, KCl, NaCl, MgCl2, CaCl2, NaIO3, KI, Na3PO4, K3PO4, Na2CO3, 아미노산-나트륨 염, 아미노산-칼륨 염, 포도당, 다당류, 지방산-나트륨 염, 지방산-칼륨 염, 포타슘 바이타르트레이트 (KHC4H4O6), 포타슘 카르보네이트, 포타슘 글루코네이트 (KC6H11O7), 포타슘-소듐 타르트레이트 (KNaC4H4O6·4H2O), 포타슘 설페이트 (K2SO4), 소듐 설페이트, 소듐 락테이트 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는, 기공-형성제.
19. 제18에 있어서, 칼슘 소스와 리튬 소스의 부피를 기준으로, 약 10 부피% 내지 80 부피%, 바람직하게는 약 20 부피% 내지 60 부피%인, 기공-형성제.
20. 제1에 있어서, 분말 형태, 시멘트 형태, 조밀한 블록(dense block)(성형전(pre-molded)) 형태, 조밀한(dense) 과립 형태, 다공성 블록 (성형전) 형태, 다공성 과립 형태, 또는 이들의 혼합물인, 항균 제형.
21. 제20에 있어서, 경화 액체 제제를 추가로 포함함으로써, 상기 칼슘 소스, 상기 리튬 소스, 및 상기 경화 액체 제제를 혼합하여, 시멘트 페이스트가 형성될 수 있는, 시멘트 형태의 항균 제형.
22. 제21에 있어서, 약 0.01 M 내지 약 2 M 농도의 암모늄 이온 (NH4 +)을 포함하는, 경화 액체 제제.
23. 제22에 있어서, NH4H2PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)3PO4·3H2O, (NH4)3PO4, 또는 이들의 혼합물의 용액인, 경화 액체 제제.
24. 제23에 있어서, (NH4)2HPO4의 용액인, 경화 액체 제제.
25. 제24에 있어서, 약 0.1 cc/g 내지 약 1.0 cc/g, 바람직하게는 약 0.2 cc/g 내지 약 0.8 cc/g인, 액체-대-분말의 비(ratio).
26. 제20에 있어서, 시멘트 분말과 제21의 경화 액체 제제를 혼합하여 시멘트 페이스트를 제조하는 단계; 페이스트를 몰드(mold)에서 성형하는 단계; 및 몰드를 제거하여 조밀한 블록을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 조밀한 블록 (성형전) 형태의 항균 제형.
27. 제26에 있어서, 상기 페이스트가 경화되기 전에 상기 몰드에서 상기 페이스트를 압축하여, 상기 페이스트로부터 액체 일부를 제거하여, 상기 페이스트의 액체-대-분말 비를 감소시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 몰드 내의 페이스트에 적용되는 압력은 약 1 MPa 내지 500 MPa, 바람직하게는 100 MPa 내지 500 MPa인, 방법.
28. 제26에 있어서, 조밀한 블록을 함침액(impregnating liquid)으로 소정 기간 동안 함침시켜, 함침액으로부터 제거한 생성되는 함침 블록의 압축 강도를 상기 함침 처리를 하지 않은 상기 블록의 압축 강도와 비교해 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
29. 제28에 있어서, 포스페이트 농도가 약 0.1 M 내지 약 3 M인 포스페이트-함유 용액인, 함침액.
30. 제20에 있어서, 시멘트 분말과 제21의 경화 액체 제제를 혼합하여 시멘트 페이스트를 제조하는 단계; 페이스트를 몰드에서 성형하는 단계; 몰드를 제거하여 조밀한 블록을 형성하는 단계; 및 상기 조밀한 블록을 조밀한 과립으로 파쇄하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 조밀한 과립 형태의 항균 제형.
31. 제30에 있어서, 상기 페이스트가 경화되기 전에 상기 몰드에서 상기 페이스트를 압축하여, 상기 페이스트로부터 액체 일부를 제거하여, 상기 페이스트의 액체-대-분말 비를 감소시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 몰드 내의 페이스트에 적용되는 압력은 약 1 MPa 내지 500 MPa, 바람직하게는 100 MPa 내지 500 MPa인, 방법.
32. 제30에 있어서, 조밀한 과립을 함침액으로 소정 기간 동안 함침시켜, 함침액으로부터 제거한 생성되는 함침된 조밀한 과립의 압축 강도를 상기 함침 처리를 하지 않은 상기 과립의 압축 강도와 비교해 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
33. 제32에 있어서, 포스페이트 농도가 약 0.1 M 내지 약 3 M인 포스페이트-함유 용액인, 함침액.
34. 제20에 있어서, 시멘트 분말과 제21의 경화 액체 제제를 혼합함으로써 시멘트 페이스트를 제조하되 기공-형성제를 시멘트에 첨가하는 단계; 페이스트를 몰드에서 성형하는 단계; 몰드를 제거하여 블록 물품(block article)을 형성하는 단계; 및 상기 블록 물품을 침지액(immersing liquid)에 침지시켜, 상기 기공-형성제 중 적어도 일부를 침지액에서 용해시켜 기공을 발생시킴으로써 다공성 블록을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며, 바람직하게는 다공성 블록은 50 부피% 내지 90 부피%의 다공성을 가지는, 다공성 블록 형태의 항균 제형.
35. 제34에 있어서, 상기 페이스트가 경화되기 전에 상기 몰드에서 상기 페이스트를 압축하여, 상기 페이스트로부터 액체 일부를 제거하여, 상기 페이스트의 액체-대-분말 비를 감소시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 몰드 내의 페이스트에 적용되는 압력은 약 1 MPa 내지 500 MPa, 바람직하게는 100 MPa 내지 500 MPa인, 방법.
36. 제34에 있어서, 다공성 블록을 함침액으로 소정 기간 동안 함침시켜, 함침액으로부터 제거한 생성되는 함침된 다공성 블록의 압축 강도를 상기 함침 처리를 하지 않은 상기 다공성 블록의 압축 강도와 비교해 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
37. 제36에 있어서, 포스페이트 농도가 약 0.1 M 내지 약 3 M인 포스페이트-함유 용액인, 함침액.
38. 제20에 있어서, 시멘트 분말과 제21의 경화 액체 제제를 혼합함으로써 시멘트 페이스트를 제조하되 기공-형성제를 시멘트에 첨가하는 단계; 페이스트를 몰드에서 성형하는 단계; 몰드를 제거하여 블록 물품을 형성하는 단계; 상기 블록 물품을 침지액에 침지시켜, 상기 기공-형성제 중 적어도 일부를 침지액에서 용해시켜 기공을 발생시킴으로써 다공성 블록을 형성하는데, 바람직하게는 다공성 블록은 50 부피% 내지 90 부피%의 다공성을 가지는 단계; 및 상기 다공성 블록을 다공성 과립으로 파쇄하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 다공성 과립 형태의 항균 제형.
39. 제20에 있어서, 시멘트 분말과 제21의 경화 액체 제제를 혼합함으로써 시멘트 페이스트를 제조하되 기공-형성제를 시멘트에 첨가하는 단계; 페이스트를 몰드에서 성형하는 단계; 몰드를 제거하여 조밀한 블록 물품을 형성하는 단계; 상기 조밀한 블록 물품을 조밀한 과립으로 파쇄하는 단계; 및 상기 조밀한 과립을 침지액에 침지시켜, 상기 기공-형성제 중 적어도 일부를 침지액에서 용해시켜 기공을 발생시킴으로써 다공성 과립을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며, 바람직하게는 다공성 과립은 50 부피% 내지 90 부피%의 다공성을 가지는, 다공성 과립 형태의 항균 제형.
40. 제38 또는 39에 있어서, 상기 페이스트가 경화되기 전에 상기 몰드에서 상기 페이스트를 압축하여, 상기 페이스트로부터 액체 일부를 제거하여, 상기 페이스트의 액체-대-분말 비를 감소시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 몰드 내의 페이스트에 적용되는 압력은 약 1 MPa 내지 500 MPa, 바람직하게는 100 MPa 내지 500 MPa인, 방법.
41. 제38 또는 39에 있어서, 다공성 블록을 함침액으로 소정 기간 동안 함침시켜, 함침액으로부터 제거한 생성되는 함침된 다공성 과립의 압축 강도를 상기 함침 처리를 하지 않은 상기 다공성 과립의 압축 강도와 비교해 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
42. 제41에 있어서, 포스페이트 농도가 약 0.1 M 내지 약 3 M인 포스페이트-함유 용액인, 함침액.
43. 제34 또는 38에 있어서, LiCl, KCl, NaCl, MgCl2, CaCl2, NaIO3, KI, Na3PO4, K3PO4, Na2CO3, 아미노산-나트륨 염, 아미노산-칼륨 염, 포도당, 다당류, 지방산-나트륨 염, 지방산-칼륨 염, 포타슘 바이타르트레이트 (KHC4H4O6), 포타슘 카르보네이트, 포타슘 글루코네이트 (KC6H11O7), 포타슘-소듐 타르트레이트 (KNaC4H4O6·4H2O), 포타슘 설페이트 (K2SO4), 소듐 설페이트, 소듐 락테이트 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는, 기공-형성제.
44. 제1에 있어서, 성장 인자, BMP, 살아 있는 세포, 또는 약물을 추가로 포함하는, 항균 제형.
45. 제1에 있어서, 정형외과적 부위(orthopedic site) 또는 치아 부위인, 골 부위(bony site).
46. 제45에 있어서, 골절 부위, 질환 부위, 또는 감염 부위인, 정형외과적 부위 또는 치아 부위.
47. 제46에 있어서, 잇몸-질환 부위인, 질환 부위.
48. 제1에 있어서, 상기 항균 제형 중 적어도 일부가 상기 부위에 용해되는 경우 pH 값이 적어도 10으로 증가되는, 골 부위.
실험 절차
약어
TTCP: 테트라칼슘 포스페이트
DCPA: 다이칼슘 포스페이트 무수물
CSH: 칼슘 설페이트 헤미하이드레이트
PAA: 폴리(아크릴산)
L/P 비: 액체/분말 비
표 1. 연구에 사용된 화학물질
화학물질 식 제조업체 위치
다이칼슘 파이로포스페이트 Ca2P2O7 Alfa 미국
테트라칼슘 포스페이트 (TTCP) Ca4(PO4)2O Fabricated in-house 타이완
다이칼슘 포스페이트 무수 (DCPA) CaHPO4 ACROS and
Innophos		 미국, 뉴저지
칼슘 설페이트 헤미하이드레이트 (CSH) CaSO4·1/2H2O Showa 일본 도쿄
다이암모늄 하이드로겐 포스페이트 (NH4)2HPO4 Showa 일본 도쿄
칼슘 카르보네이트 CaCO3 Katayama 일본
리튬 설페이트 Li2SO4 (99% 순도) Nihon Shiyaku Industries 일본 오사카
리튬 포스페이트 Li3PO4 (99% 순도) Nihon Shiyaku Industries 일본 오사카
리튬 카르보네이트 Li2CO3 (99% 순도) Nihon Shiyaku Industries 일본 오사카
리튬 카르보네이트 JT Baker
리튬 옥사이드 Li2O (99% 순도) Alfa 미국
리튬 플루라이드 LiF (98% 순도) Nihon Shiyaku Industries 일본 오사카
폴리(아크릴산) (PAA) -(CH2-C(COOH)H)n Showa 일본 도쿄
TTCP, TTCP/DCPA, TTCP/CSH 및 TTCP/DCPA/CSH 분말의 제조TTCP 분말은 Brown 및 Epstein에 의해 제시된 방법을 이용해 다이칼슘 파이로포스페이트 (Ca2P2O7) (미국 소재의 Alfa)와 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) (일본 도쿄 소재의 Katayama Chem. Co.)의 반응으로부터 자체 제조하였다 [Journal of Research of the National Bureau of Standards - A Physics and Chemistry 6 (1965) 69A 12].
TTCP 분말은 Ca2P2O7 분말을 CaCO3 분말과 12시간 동안 균일하게 혼합함으로써 제조하였다. Ca2P2O7 분말과 CaCO3 분말의 혼합비는 1:1.27 (중량비)이었으며, 분말 혼합물은 1400℃로 가열함으로써, 2가지 분말이 반응하여 TTCP를 형성하도록 하였다.
적절한 양의 TTCP 분말과 DCPA 분말을 볼 밀러(ball miller)에서 1:1의 몰 비로 균일하게 혼합하여, TTCP/DCPA 혼합형 분말을 수득하였다. 적절한 양의 TTCP 분말과 CSH 분말을 볼 밀러에서 균일하게 혼합하여, TTCP/CSH 혼합형 분말을 수득하였다. 적절한 양의 TTCP/DCPA 혼합형 분말 (1:1의 몰 비)과 CSH 분말을 볼 밀러에서 균일하게 혼합하여 TTCP/DCPA/CSH 혼합형 분말을 수득하였다.
TTCP/Li 화합물, TTCP/DCPA/Li 화합물, TTCP/CSH/Li 화합물 및 TTCP/DCPA/CSH/Li 화합물 혼합형 분말의 제조
적절한 양의 Li 화합물(들) (예를 들어, 리튬 카르보네이트, 리튬 포스페이트, 리튬 설페이트, 또는 리튬 옥사이드) 및 TTCP, TTCP/DCPA, TTCP/CSH 또는 TTCP/DCPA/CSH를 볼 밀러에서 균일하게 혼합하여, TTCP/Li 화합물, TTCP/DCPA/Li 화합물, TTCP/CSH/Li 화합물 또는 TTCP/DCPA/CSH/Li 화합물 혼합형 분말을 수득하였다.
PAA-함유 경화액의 제조
PAA를 첨가한 (NH4)2HPO4 용액 및 PAA를 첨가하지 않은 (NH4)2HPO4 용액을 둘 다 경화액으로서 사용하였으며, 이들이 다양한 Li-함유 샘플의 항균성 거동에 미치는 효과를 비교하였다. 본 연구에 사용되는 폴리(아크릴산) (PAA로 축약함)의 분자량은 150,000이며, 25 중량% 수용액 (일본 쇼와 소재의 reagent grade)으로서 수득하였다. 상이한 농도의 PAA-함유 (NH4)2HPO4 경화액은 상이한 부피%의 PAA 수용액을 (NH4)2HPO4 용액에 첨가함으로써 제조하였다.
PAA를 포함 및 불포함하는 TTCP/Li 화합물, TTCP/DCPA/Li 화합물, TTCP/CSH/Li 화합물 및 TTCP/DCPA/CSH/Li 화합물 시멘트 페이스트
PAA를 포함 및 불포함하는 일련의 TTCP/Li 화합물, TTCP/DCPA/Li 화합물, TTCP/CSH/Li 화합물 및 TTCP/DCPA/CSH/Li 화합물 시멘트 페이스트는, 적절한 양의 각각의 혼합형 분말을, PAA를 첨가 또는 무첨가하는 (NH4)2HPO4 경화액과 적절한 L/P 비로 혼합함으로써 각각 제조하였다.
시멘트 페이스트의 작동 시간/경화 시간 측정
시멘트 페이스트의 작동 시간은, 시멘트 페이스트가 더 이상 작동하지 않은 후의 시간으로 결정하였다. 시멘트 페이스트의 경화 시간은 치과용 아연 포스페이트 시멘트에 대해 ISO 1566에서 제시한 표준 방법에 따라 측정하였다. 시멘트는, 1 mm 직경의 팁(tip)을 가진 Vicat 니들(needle)에 하중된 400 gm의 중량이 시멘트의 표면 상에 인지 가능한 원형 함몰부(indentation)를 만드는 데 실패한 경우 설정되는 것으로 여겨진다.
PAA를 포함 및 불포함하는 TTCP/Li 화합물, TTCP/DCPA/Li 화합물, TTCP/CSH/Li 화합물 및 TTCP/DCPA/CSH/Li 화합물 블록 및 과립의 제조
적절한 양의 TTCP/Li 화합물, TTCP/DCPA/Li 화합물, TTCP/CSH/Li 화합물 또는 TTCP/DCPA/CSH/Li 화합물 혼합형 분말을, PAA를 포함 또는 불포함하는 (NH4)2HPO4 경화액과 바람직한 L/P 비로 혼합하여, 시멘트 페이스트를 제조하였다.
완전히 경화되기 전에, 페이스트를 바람직한 압력 (예를 들어, 450 Kgf 또는 156 MPa) 하에 몰드에 두어, 페이스트로부터 액체 일부를 짜내었다. 몰드로부터 제거한 후, 선택적으로 일부 블록 샘플을 바람직한 온도 (예를 들어, 0℃ 내지 50℃)에서 바람직한 기간 (예를 들어, 1일) 동안 함침액 (예를 들어, 1-3 M (NH4)2HPO4 또는 K2HPO4)에 추가로 함침시켜 강도를 높인 다음, 오븐에서 (예를 들어, 50℃에서 1일 동안) 건조하였다. 선택적으로, 블록을 바람직한 입자 크기 분포 범위를 가진 과립으로 파쇄하였다. 선택적으로, 몰드는 바람직한 모양 및 기하형태를 가진 블록을 생성하도록 맞춤 제작할 수 있다.
침지, pH 및 중량 손실 측정
다양한 Li-함유 샘플을 서로 다른 기간 (1d, 2d, 3d, 5d 및 7d) 동안 10 cc/g의 용액/샘플 비의 Hanks' 용액 (pH 7.4)에 침지시켰다. 이들의 침지에 의해 용액에서 유도되는 중량 손실 및 pH 변화를 측정하였다. Hanks' 용액은 침지 시험 동안 매일 다시 채워서, 용액의 일정한 이온 농도를 유지하는 데 일조하였다. 용액의 pH 값은 pH 미터 (타이완 타이페이 소재의 Suntex Instruments SP2300)를 사용해 측정하였다.
세포독성 시험
세포독성 시험은 ISO 10993-5에 따라 수행하였다. 추출 방법을 이용하였다. NIH/3T3 섬유모세포 (접종 밀도는 웰 당 5000개 세포)는 소 혈청 (10%) 및 PSF (1%)를 보충한 Dulbecco's modified essential 배지 (DMEM)에서 24시간 동안 예비-배양하였다. 추출물은, 경화된 시멘트 페이스트를 배양 배지에 0.1 (g/ml)의 비율로 37℃에서 24시간 동안 침지시킨 다음, 원심분리에 의해 액체를 수집함으로써 제조하였다. 추출물을 96웰 마이크로플레이트에 (웰 당 100 ㎕) 첨가하고, 37℃, 5% CO2 습도 분위기에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 추출물을 흡출(suck out)한 다음, 배양 배지 (100 ㎕)와 WST-1 (10 ㎕)의 혼합물을 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포의 생존율을 WST-1 분석법으로 측정하였다. 이는, 450 nm에서의 흡광도가 세포 내 탈수소효소의 활성 양과 비례하는, 미토콘드리아 탈수소효소의 활성에 대한 비색 분석법(colorimetric assay)이다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 배지와 WST-1의 혼합물을 96웰 마이크로플레이트에 옮기고, 450 nm에서의 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하였다. Al2O3 분말 또한 대조군으로서 분석하였다. 4개의 막대를 각각의 샘플에 대해 시험하였다 (n=4).
표 2. 세포독성 시험에 사용되는 세포주
세포명 NIH/3T3
세포수 BCRC 60008
유형 마우스 NIH/Swiss 배아
생장 특성 흡착성, 5% CO2, 37℃
형태학 섬유모세포
세포 배양 배지 90% Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM) +10% 소 혈청
동결 배지 93% 배양 배지 + 7% DMSO
항균성 시험트립틱 소이 배지 (Tryptic Soy Broth; TSB) 배지의 제조
TSB 배지를 제조하기 위해, 6 g 트립톤(Tryptone) (미국 소재의 Neogen), 2 g 소이톤(Soytone) (미국 소재의 Soytone BD) 및 2 g NaCl (미국 소재의 J.T. Baker)을 이중 증류수 400 ml을 채운 비커에 넣고 교반 막대기(stir bar)를 사용해 혼합하였다. 전체적으로 용해된 후, 용액의 pH를 pH 7.3으로 조정하고, 용액을 30분 동안 오토클레이브 (121℃, 1.2 kg/cm2)하였다.
트립틱 소이 한천 (Tryptic Soy Agar; TSA) 배지의 제조
TSA 배지를 제조하기 위해, 6 g 트립톤 (미국 소재의 Neogen), 2 g 소이톤 (미국 소재의 Soytone BD), 2 g NaCl (미국 소재의 J.T. Baker) 및 6 g Agar (미국 소재의 Neogen)을 이중 증류수 400 ml을 채운 비커에 넣고 교반 막대기를 사용해 혼합하였다. 전체적으로 용해된 후, 용액의 pH를 pH 7.3으로 조정하고, 용액을 30분 동안 오토클레이브 (121℃, 1.2 kg/cm2)하였다. 멸균한 후, TSA 배지를 페트리 접시에 붓고, 경화되게 방치하였다. 그런 다음, TSA 배지를 30℃ 인큐베이터에 두었다.
디스크 확산 분석법(Disk diffusion assay)
TSB 배지를 포함하는 1 ml 스타필로코커스 아우레우스 (staphylococcus aureus; SA)를 15 ml 원심분리 튜브에 옮기고, 10 ml 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 첨가한 후 부드럽게 혼합하였다. 혼합물을 3000 rpm에서 10분간 원심분리하였다 (일본 소재의 KUBOTA 5922). 상층액을 제거하고 SA 펠렛을 남겨 두었다. 그런 다음, 1 ml PBS를 첨가하여, 펠렛을 현탁하였다. SA 현탁액 20 ㎕와 PBS 180 ㎕ PBS를 96웰 플레이트의 각 웰에 옮겼다. 600 nm에서 ELISA 판독기 (스위스 소재의 Sunrise, Tecan)를 사용해 흡광도를 분석하여, 박테리아 농도 (cfu/ml)를 측정하였다 (PBS 200 ㎕를 음성 대조군으로 사용하였음). 일단 측정하고 나면, SA 함유 배지 중 적절한 부피를 1 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고, TBS를 첨가하여, 박테리아 농도를 3.5 X 106 (cfu/ml)로 조정하였다. 튜브를 15초간 진탕하여, 완전히 혼합되게 하였다. SA 함유 배지 100 ㎕를 거둬내어 한천 플레이트 상에 고르게 떨어뜨렸다. 일단 브로쓰(broth)가 한천 플레이트 상에 고르게 분포되어 거의 마르고 나면, 시험할 샘플을 한천의 상부에 두고 페트리 접시를 파라필름(parafilm)으로 덮었다. 접시를 37℃ 인큐베이터 (LM-570R, Yih Der, 타이완)에 24시간 두었다. 그런 다음, 박테리아 콜로니의 형성을 관찰하고 콜로니 직경을 측정하였다.
Hanks' 용액에 담그기
로딩한 후, 샘플을 테이블 위에 1시간 동안 두어 건조시켰다. 그런 다음, 4가지 샘플을 20 ml 유리 바이얼에 넣고, 8 ml Hanks' 용액을 0.1 g/ml의 고체/액체 비율로 첨가하였다. 유리 바이얼을 37℃ 수조에 1일, 2일, 3일, 5일 및 7일 동안 두었다. Hanks' 용액은 매일 변하였다. 일단 바람직한 기간 동안 담근 다음, 샘플을 50℃ 오븐에 24시간 동안 두고, 그런 다음 지퍼백(zip lock bag)에 보관하였다.
실시예 1. 공업용의 순수한 리튬염에서의 항균성 시험
항균성 시험은, Li2SO4, Li3PO4, Li2CO3, Li2O, 및 LiF를 포함하는, 일련의 공업용의 순수한 리튬 화합물에서 수행하였다.
샘플은, 경화액과 혼합하지 않은 채 높이 3 mm, 직경 6 mm의 실린더에 넣어 450 kgf의 압력 조건 하에 건식-성형하거나, 또는 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.2 내지 0.6 (Li2SO4의 경우 0.20, Li3PO4의 경우 0.25, Li2CO3의 경우 0.60)의 L/P 비로 혼합한 채 높이 3 mm, 직경 6 mm의 실린더에 넣어 1.4 MPa의 압력 조건 하에 습식-성형하였다.
결과:
(1) 시험된 모든 리튬 화합물 (Li2SO4, Li3PO4, Li2CO3, Li2O 및 LiF)은 높은 항균성 거동을 나타낸다.
(2) Li2CO3를 제외하고, 건식-성형된 모든 (경화액과 혼합되지 않은) 리튬 화합물은 TSB 한천 플레이트에서 다소 분해/용해된다.
(3) 모든 습식-성형된 (0.6 M (NH4)2HPO4와 0.2-0.6 cc/g의 L/P 비로 혼합된) Li 화합물은 TSB 한천 플레이트에서 분해되지 않는다.
(4) 습식-성형된 Li2SO4 및 Li2CO3 샘플은 2가지의 가장 큰 항균 구역 (각각 (22 mm 및 18 mm)을 나타낸다.
실시예 2. TTCP/Li 염 및 TTCP/Li 염/PAA 샘플에 대한 항균성 거동 시험 및 기타 시험
침지, pH 측정, 중량 손실, 세포독성 및 항균성 시험을 TTCP/Li 및 TTCP/Li/PAA 블록 샘플에서 수행하였다.
TTCP/Li/PAA 블록은, 적절한 양의 TTCP 분말과 Li2CO3 분말 (TTCP : Li2CO3 = 1 : 1 (중량에 의해))을 혼합하여 TTCP/Li2CO3 혼합형 분말을 수득함으로써 제조하였다. TTCP/Li2CO3 분말은 3 부피%, 5 부피%, 또는 10 부피% PAA 용액을 포함하는 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.45 cc/g의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/Li/PAA 시멘트 페이스트를 수득하였다. TTCP/Li/PAA 블록 샘플은 TTCP/Li/PAA 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
표 3. Hanks' 용액에 상이한 기간 (days) 동안 침지시킨 TTCP/Li/PAA 블록의 항균 구역의 평균 직경 (mm).
1d 2d 3d 5d 7d
3% PAA 11.4 10.3 8.5 6 6
5% PAA 11.5 11.4 11.3 6 6
10% PAA 12.6 12.5 11.7 6.7 6
(주의: 측정되는 항균 구역은 6 mm 직경의 샘플을 포함함).
결과:(1) PAA의 첨가는 TTCP/Li 제형의 항균 효과를 연장시킨다.
(2) 3 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 11.4 mm; 2일 동안 침지한 후 10.3 mm; 및 3일 동안 침지한 후 8.5 mm의 항균 구역을 보여준다.
(3) 5 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 11.5 mm; 2일 동안 침지한 후 11.4 mm; 및 3일 동안 침지한 후 11.2 mm의 항균 구역을 보여준다.
(4) 10 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 12.6 mm; 2일 동안 침지한 후 12.5 mm; 3일 동안 침지한 후 11.7 mm; 및 5일 동안 침지한 후 6.7 mm의 항균 구역을 보여준다.
표 4. TTCP/Li/PAA 블록을 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 Hanks' 용액의 평균 pH 값.
1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d
3% PAA 11.4 12.2 12.0 11.6 11.2 10.7 10.6 10.5 10.4 10.3
5% PAA 10.7 11.9 12.1 11.8 11.4 11.1 10.7 10.6 10.4 10.3
10% PAA 10.5 11.0 11.5 11.9 11.5 11.1 10.7 10.6 10.4 10.3
결과:(1) Hanks' 용액의 평균 pH 값은 모두 10 초과이며, 일부 경우에는 심지어 12 초과이다.
표 5. Hanks' 용액에 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 TTCP/Li/PAA 블록의 평균 중량 손실 백분율 (%).
1d 2d 3d 5d 7d 10d
3% PAA 11.4 14.9 17 23.8 24.4 27.4
5% PAA 12.4 20.9 24.9 28.5 30.1 37.9
10% PAA 15.3 22.5 28.9 38.6 39.6 42.8
결과:(1) Hanks' 용액에 침지한 모든 샘플의 평균 중량 손실은 침지 기간에 따라 증가한다.
(2) 중량 손실은 PAA 함량에 따라 증가하였다.
(3) 10일 후, 3% PAA 샘플의 경우 중량의 27.4%가 손실되며; 5% PAA 샘플의 경우 중량의 37.9%가 손실되며; 및 10% PAA 샘플의 경우 중량의 42.8%가 손실된다. 이러한 결과는, Li 화합물이 보다 신속하게 용해된 후, 매우 다공성인 구조가 임플란트의 생체흡수율을 증가시킬 수 있는 임플란트 물질에서 발달되기 때문에 바람직하다.
표 6. Hanks' 용액에 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 TTCP/Li/PAA 블록의 평균 세포 생존율 (샘플/DMEM 배지 비율 = 0.1 g/ml, NIH-3T3).
1d 2d 3d 5d 7d 10d
3% PAA 39.8 41.2 42.0 43.2 43.4 50.0
5% PAA 38.2 40.9 42.7 44.6 48.6 51.8
10% PAA 40.8 42.9 45.1 44.8 57.4 75.0
결과:(1) Hanks' 용액에 침지한 모든 샘플의 평균 세포 생존율은 침지 시간에 따라 증가하며, 이는 생체적합성 수준이 Li 화합물의 점차적인 소비로 인해 계속 증가함을 의미한다. 이러한 결과는, 최상의 결과가, 고 항균 효과 단계 후 임플란트 물질이 생체적합성 수준을 점차 회복하는 것이기 때문에 바람직하다.
(2) 7일 후, 10% PAA 샘플의 세포 생존율 값은 3% PAA 샘플 및 5% PAA 샘플보다 상당히 더 높다.
실시예 3. TTCP/DCPA/Li 염 및 TTCP/DCPA/Li 염/PAA 샘플에 대한 항균성 거동 시험 및 기타 시험
침지, pH 측정, 중량 손실, 세포독성 및 항균성 시험을 TTCP/DCPA/Li 샘플 및 TTCP/DCPA/Li/PAA 블록 샘플에서 수행하였다.
TTCP/DCPA/Li 블록은, 적절한 양의 TTCP/DCPA 분말 (1:1의 몰 비) 및 Li 화합물 (Li2CO3 또는 Li2O) 분말 (Li2CO3 또는 Li2O= 모든 분말 성분의 10 중량% 또는 30 중량%)을 혼합하여 TTCP/DCPA/Li 화합물 혼합형 분말을 수득함으로써 제조하였다. TTCP/DCPA/Li 화합물 분말은 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 cc/g의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/DCPA/Li 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 1.4 MPa의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
표 7. 37℃ PBS에서 24시간 동안 침지한 TTCP/DCPA/Li 샘플의 PBS 추출물의 pH 값
샘플 : PBS
(중량비)		 TTCP/DCPA : Li2CO3
= 90:10 (중량에 의해)		 TTCP/DCPA : Li2CO3
= 70:30 (중량에 의해)		 TTCP/DCPA : Li2O
= 90:10 (중량에 의해)
1:5 10.5 10.4 12.6
1:10 10.6 10.5 12.7
결과: (1) 90 중량% TTCP/DCPA 및 10 중량% Li2O를 포함하는 샘플은 22 mm의 항균 구역을 보여준다.
(2) 70 중량% TTCP/DCPA 및 30 중량% Li2CO3를 포함하는 샘플은 24 mm의 항균 구역을 보여준다.
(3) 추출물의 pH 값은 모두 10 초과이며, 심지어 Li2O 샘플의 경우에는 12 초과이다.
TTCP/DCPA/Li/PAA 블록은, 적절한 양의 TTCP/DCPA 분말 (1:1의 몰 비) 및 Li2CO3 분말 (TTCP/DCPA : Li2CO3 = 1 : 1 (중량에 의해))을 혼합하여 TTCP/DCPA/Li 혼합형 분말을 수득하고, 그런 다음 3 부피%, 5 부피%, 또는 10 부피% PAA 용액을 포함하는 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 cc/g의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/DCPA/Li/PAA 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
표 8. Hanks' 용액에 상이한 기간 (days) 동안 침지시킨 TTCP/DCPA/Li/PAA 블록의 항균 구역의 평균 직경 (mm).
1d 2d 3d 5d 7d
3% PAA 12.5 9.9 9.8 6 6
5% PAA 12.7 10.6 10.9 7.3 6
10% PAA 11.9 11.5 10.6 8.8 6.9
(주의: 측정되는 항균 구역은 6 mm 직경의 샘플을 포함함)
결과:(1) PAA의 첨가는 TTCP/DCPA/Li 제형의 항균 효과를 연장시킨다.
(2) 3 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 12.5 mm; 2일 동안 침지한 후 9.9 mm; 및 3일 동안 침지한 후 9.8 mm의 항균 구역을 보여준다.
(3) 5 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 12.7 mm; 2일 동안 침지한 후 10.6 mm; 3일 동안 침지한 후 10.9 mm; 및 5일 동안 침지한 후 7.3 mm의 항균 구역을 보여준다.
(4) 10 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 11.9 mm; 2일 동안 침지한 후 11.5 mm; 3일 동안 침지한 후 10.6 mm; 5일 동안 침지한 후 8.8 mm; 및 7일 동안 침지한 후 6.9 mm의 항균 구역을 보여준다.
표 9. TTCP/DCPA/Li/PAA 블록을 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 Hanks' 용액의 평균 pH 값.
1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d
3% PAA 10.5 10.5 10.8 10.8 10.6 10.5 10.4 - - -
5% PAA 10.5 10.7 10.7 10.7 10.8 10.6 10.4 - - -
10% PAA 10.5 10.8 10.8 10.8 10.7 10.7 10.7 - - -
결과:(1) Hanks' 용액의 평균 pH 값은 모두 10 초과이다.
표 10. Hanks' 용액에 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 TTCP/DCPA/Li/PAAA 블록의 평균 중량 손실 백분율 (%).
1d 2d 3d 5d 7d 10d
3% PAA 7.6 14 25.1 27.2 27.4 -
5% PAA 8.5 14.3 26.1 32.1 33.9 -
10% PAA 8.6 20.9 26.6 32.3 41.0 -
결과:(1) Hanks' 용액에 침지한 모든 샘플의 평균 중량 손실은 침지 기간에 따라 증가한다.
(2) 중량 손실은 PAA 함량에 따라, 특히 7일 후에 증가한다. 이러한 결과는, Li 화합물이 보다 신속하게 용해된 후, 매우 다공성인 구조가 임플란트의 생체흡수율을 증가시킬 수 있는 임플란트 물질에서 발달되기 때문에 바람직하다.
표 11. Hanks' 용액에 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 TTCP/DCPA/Li/PAA 블록의 평균 세포 생존율 (샘플/DMEM 배지 비율 = 0.1 g/ml, NIH-3T3).
1d 2d 3d 5d 7d 10d
3% PAA 26.0 43.1 42.9 - - 48.1
5% PAA 25.7 44.0 43.9 - - 70.6
10% PAA 27.3 44.9 51.2 - - 80.3
결과:(1) Hanks' 용액에 침지한 모든 샘플의 평균 세포 생존율은 침지 시간에 따라 증가하며, 이는 생체적합성 수준이 Li 화합물의 점차적인 소비로 인해 계속 증가함을 의미한다. 이러한 결과는, 최상의 결과가, 고 항균 효과 단계 후 임플란트 물질이 생체적합성 수준을 점차 회복하는 것이기 때문에 바람직하다.
(2) 3일 후, 10% PAA 샘플의 세포 생존율 값은 3% PAA 샘플 및 5% PAA 샘플보다 상당히 더 높다. 10일 후, 10% PAA 샘플의 세포 생존율 값은 80.3에 달한다.
실시예 4. TTCP/DCPA/Li 염/KCl 샘플의 항균성 거동
항균성 시험은 TTCP/DCPA/Li/KCl 블록 샘플에서 수행하였다. TTCP/DCPA/Li/KCl 블록은, 적절한 양의 TTCP/DCPA 분말 (1:1의 몰 비) 및 Li2O 분말 (Li2O= 모든 분말 성분의 10 중량%)과 추가로 100-200 ㎛ KCl 분말 (TTCP/DCPA/Li 분말 : KCL 분말 = 60 : 40 (중량에 의해))과 혼합하여 TTCP/DCPA/Li/KCl 혼합형 분말을 수득함으로써 제조하였다. 혼합형 분말을 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.50 cc/g의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/DCPA/Li/KCl 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
결과:
(1) 상기 TTCP/DCPA/Li 샘플은 21 mm의 평균 항균 구역을 보여준다.
(2) 상기 TTCP/DCPA/Li/KCl 샘플은 22 mm의 평균 항균 구역을 보여준다.
실시예 5. TTCP/CSH/Li 염 및 TTCP/CSH/Li 염/PAA 샘플에 대한 항균성 거동 시험 및 기타 시험
침지, pH 측정, 중량 손실, 세포독성 및 항균성 시험을 TTCP/CSH/Li 및 TTCP/CSH/Li/PAA 블록 샘플에서 수행하였다.
TTCP/CSH/Li/PAA 블록은, 적절한 양의 TTCP/CSH 분말 (65 : 35 (중량에 의해)) 및 Li2CO3 분말 (TTCP/CSH : Li2CO3 = 1 : 1 (중량에 의해))을 혼합하여 TTCP/CSH/Li 혼합형 분말을 수득함으로써 제조하였다. TTCP/CSH/Li 분말은 3 부피%, 5 부피%, 또는 10 부피% PAA 용액을 포함하는 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 cc/g의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/CSH/Li/PAA 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
표 12. Hanks' 용액에 상이한 기간 (days) 동안 침지시킨 TTCP/CSH/Li/PAA 블록의 항균 구역의 평균 직경 (mm).
1d 2d 3d 5d 7d
3% PAA 11.7 8.0 6 6 6
5% PAA 12.7 8.0 6 6 6
10% PAA 13.0 10.0 11.0 6 6
(주의: 측정되는 항균 구역은 6 mm 직경의 샘플을 포함함)
결과:(1) PAA의 첨가는 TTCP/CSH/Li 제형의 항균 효과를 연장시킨다.
(2) 3 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 11.7 mm; 및 2일 동안 침지한 후 8.0 mm의 항균 구역을 보여준다.
(3) 5 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 12.7 mm; 및 2일 동안 침지한 후 8.0 mm의 항균 구역을 보여준다.
(4) 10 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 13.0 mm; 2일 동안 침지한 후 10.0 mm; 및 3일 동안 침지한 후 11.0 mm의 항균 구역을 보여준다.
표 13. TTCP/CSH/Li/PAA 블록을 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 Hanks' 용액의 평균 pH 값.
1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d
3% PAA 11.9 12.1 11.5 11.0 10.8 10.5 10.5 - - -
5% PAA 10.9 12.2 11.8 11.1 10.9 10.6 10.5 - - -
10% PAA 10.2 11.5 12.1 11.6 11.1 10.7 10.6 - - -
결과:(1) Hanks' 용액의 평균 pH 값은 모두 10 초과이며, 일부 경우에는 심지어 12 초과이다.
표 14. Hanks' 용액에 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 TTCP/CSH/Li/PAA 블록의 평균 중량 손실 백분율 (%).
1d 2d 3d 5d 7d 10d
3% PAA 20.7 24.6 25.0 31.8 33.8
5% PAA 18.6 25.9 30.2 33.3 37.4
10% PAA 19.1 27.4 32.4 33.3 40.0
결과:(1) Hanks' 용액에 침지한 모든 샘플의 평균 중량 손실은 침지 기간에 따라 증가한다.
(2) 중량 손실은 PAA 함량에 따라, 특히 7일 후에 증가한다. 이러한 결과는, Li 화합물이 보다 신속하게 용해된 후, 매우 다공성인 구조가 임플란트의 생체흡수율을 증가시킬 수 있는 임플란트 물질에서 발달되기 때문에 바람직하다.
표 15. Hanks' 용액에 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 TTCP/CSH/Li/PAA 블록의 평균 세포 생존율 (샘플/DMEM 배지 비율 = 0.1 g/ml, NIH-3T3).
1d 2d 3d 5d 7d 10d
3% PAA 38.1 39.7 40.2 40.7 50.8 51.9
5% PAA 38.5 40.0 42.2 42.9 54.7 60.9
10% PAA 42.2 42.6 43.1 43.7 55.1 76.7
결과:(1) Hanks' 용액에 침지한 모든 샘플의 평균 세포 생존율은 침지 시간에 따라 증가하며, 이는 생체적합성 수준이 Li 화합물의 점차적인 소비로 인해 계속 증가함을 의미한다. 이러한 결과는, 최상의 결과가, 고 항균 효과 단계 후 임플란트 물질이 생체적합성 수준을 점차 회복하는 것이기 때문에 바람직하다.
(2) 10일 후, 10% PAA 샘플의 세포 생존율 값은 76.7에 달하며, 3% PAA 샘플 및 5% PAA 샘플보다 상당히 더 높다.
실시예 6. TTCP/DCPA/CSH/Li 염 샘플의 항균성 거동
항균성 시험은 다양한 TTCP/DCPA/CSH/Li 블록 샘플에서 수행하였다. TTCP/DCPA/CSH/Li 블록은, 적절한 양의 TTCP/DCPA/CSH 분말 및 Li2CO3 분말 (TTCP/DCPA/CSH : Li2CO3 = 1 : 1 (중량에 의해))을 혼합하여 TTCP/DCPA/CSH/Li 혼합형 분말을 수득함으로써 제조하였으며, 여기서, TTCP : DCPA = 1 : 1 (몰수(mole)에 의해) 및 TTCP/DCPA : CSH 중량비를 표 16에 열거한다. 예를 들어, 65 중량% TTCP/DCPA 분말 및 35 중량% CSH 분말을 포함하는 혼합형 분말을 "TTCP/DCPA/CSH 샘플 65/35" 또는 단순히 "65/35"로 지칭하며; 45 중량% TTCP/DCPA 분말 및 55 중량% CSH 분말을 포함하는 혼합형 분말은 "TTCP/DCPA/CSH 샘플 45/55" 또는 단순히 "45/55"로 지칭하는 등이다.
표 16. TTCP/DCPA/CSH 샘플 명칭
TTCP/DCPA/CSH 샘플 명칭 TTCP/DCPA:CSH
(중량에 의해)		 TTCP:DCPA:CSH
(중량에 의해)
"90/10" 90:10 2.69:1:0.41
"85/15" 85:15 2.69:1:0.65
"80/20" 80:20 2.69:1:0.92
"75/25" 75:25 2.69:1:1.23
"65/35" 65:35 2.69:1:1.99
"55/45" 55:45 2.69:1:3.02
"45/55" 45:55 2.69:1:4.51
"35/65" 35:65 2.69:1:6.85
"25/75" 25:75 2.69:1:11.07
"10/90" 10:90 2.69:1:33.21
TTCP/DCPA/CSH/알칼리 금속염 샘플의 항균성 거동항균성 시험은 일련의 알칼리 금속염 (Li2CO3, KCl 또는 NaCl 분말)과 혼합된 "65/35"에서 수행하였으며, 여기서, "65/35" : 알칼리 금속염 = 1:1 (중량에 의해)이다. "65/35" 알칼리 금속염 혼합형 분말을 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 g/cc의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/DCPA/CSH/알칼리 금속염 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
도 1은 TTCP/DCPA/CSH/Li 샘플 및 TTCP/DCPA/CSH/알칼리 금속염 샘플에 대한 항균성 시험의 결과를 도시한 것이다.
도 1의 결과:
(1) 시험된 3종의 알칼리 금속 (Li, Na 및 K) 염 중에서, 오로지 Li계 알칼리 금속염 (Li2CO3)만 항균 구역이 13 mm로 강한 항균 효과를 나타내었다 (Nihon Shiyaku 및 JT Baker 제품 모두에 대해);
(2) Na 염 또는 K 염으로 제조한 샘플에서는 항균 구역이 관찰되지 않았다.
TTCP/DCPA/CSH/Li 샘플의 항균성 거동
항균성 시험은 일련의 여러 가지 Li 화합물 (Li2SO4, Li3PO4, Li2CO3, Li2O)과 혼합된 "65/35"에서 수행하였으며, 여기서, "65/35" : Li 화합물 = 1:1 (중량에 의해)이다. "65/35" Li 화합물 혼합형 분말을 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.3-0.5 g/cc (Li2SO4의 경우 0.3; Li3PO4의 경우 0.35 및 Li2CO3; Li2O의 경우 0.5)의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/DCPA/CSH/Li 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
결과:
(1) Li2O를 포함하는 샘플은 TSB 한천 플레이트에서 분해되긴 하였지만 가장 강한 항균 효과를 보여준다.
(2) Li2O 및 Li2CO3를 포함하는 샘플은 Li2SO4 또는 Li3PO4를 포함하는 샘플보다 강한 항균 효과를 보여준다.
TTCP/DCPA/CSH/Li 염 샘플의 항균성 거동
항균성 시험은 Li2CO3 분말과 혼합된 "55/45"에서 수행하였으며, 여기서, "55/45" : Li2CO3 = 1:1 또는 7:3 (중량에 의해)이다. "55/45"/Li2CO3 분말을 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 g/cc의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/DCPA/CSH/Li 염 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 1.4 MPa의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
결과:
(1) 70 중량% "55/45" 및 30 중량% Li2CO3를 포함하는 샘플은 13 mm의 항균 구역을 보여주며;
(2) 50 중량% "55/45" 및 50 중량% Li2CO3를 포함하는 샘플은 17 mm의 항균 구역을 보여준다.
TTCP/DCPA/CSH/Li 염 샘플의 항균성 거동
항균성 시험은 Li2CO3 분말과 혼합된 "65/35"에서 수행하였으며, 여기서, "65/35" : Li2CO3 = 7:3 (중량에 의해)이다. "65/35"/Li2CO3 분말을 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 g/cc의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/DCPA/CSH/Li 염 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다. 이어서, TTCP/DCPA/CSH/Li 염 블록 샘플을 400℃로 1시간 또는 2시간 동안 가열하였다.
결과:
(1) 400℃로 1시간 동안 가열한 TTCP/DCPA/CSH/Li 염 블록 샘플은 15 mm의 항균 구역을 보여주며;
(2) 400℃로 2시간 동안 가열한 TTCP/DCPA/CSH/Li 염 블록 샘플은 16 mm의 항균 구역을 보여준다.
실시예 7. TTCP/DCPA/CSH/Li 염 /PAA 샘플에 대한 항균성 거동 시험 및 기타 시험
침지, pH 측정, 중량 손실, 세포독성 및 항균성 시험을 다양한 TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 블록 샘플에서 수행하였다. TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 블록은, 적절한 양의 TTCP/DCPA/CSH 분말 및 Li2CO3 분말을 바람직한 TTCP/DCPA/CSH : Li2CO3 중량비 (예를 들어 1:1 (중량에 의해))로 혼합하여 TTCP/DCPA/CSH/Li 혼합형 분말을 수득함으로써 제조하였으며, 여기서, TTCP : DCPA = 1 : 1 (몰수에 의해) 및 TTCP/DCPA : CSH 중량비는 표 16에 열거되어 있다. 예를 들어, 65 중량% TTCP/DCPA 분말 및 35 중량% CSH 분말을 포함하는 혼합형 분말을 "TTCP/DCPA/CSH 샘플 65/35" 또는 단순히 "65/35"로 지칭하며; 45 중량% TTCP/DCPA 분말 및 55 중량% CSH 분말을 포함하는 혼합형 분말은 "TTCP/DCPA/CSH 샘플 45/55" 또는 단순히 "45/55"로 지칭하는 등이다.
TTCP/DCPA/CSH/Li 염 /PAA 샘플의 항균성 시험
"65/35 분말 (TTCP/DCPA:CSH = 65:35 (중량에 의해))을 Li2CO3 분말 ("65/35" : Li2CO3= 70 : 30 (중량에 의해))과 혼합하여, TTCP/DCPA/CSH/Li 혼합형 분말을 수득한다. 생성되는 TTCP/DCPA/CSH/Li 분말을 3 부피% PAA 용액을 포함하는 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 cc/g의 L/P 비로 혼합하여 TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
결과:
(1) 3% PAA 샘플은 15 mm의 항균 구역을 보여준다.
TTCP/DCPA/CSH/Li 염 /PAA 샘플에 대한 항균성 시험 및 기타 시험
TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 블록은, 적절한 양의 "65/35" 분말 및 Li2CO3 분말 ("65/35" : Li2CO3 = 1 : 1 (중량에 의해))을 혼합하여 TTCP/DCPA/CSH/Li 혼합형 분말을 수득함으로써 제조하였으며, 여기서, TTCP:DCPA = 1:1 (몰수에 의해) 및 TTCP/DCPA : CSH = 65:35 (중량에 의해)였다. 생성되는 TTCP/DCPA/CSH/Li 분말은 3 부피%, 5 부피%, 또는 10 부피% PAA 용액을 포함하는 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 cc/g의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다.
도 2 내지 5는 각각 1일, 2일, 3일 및 5일 동안 Hanks' 용액에 침지시켜 상기와 같이 제조한 TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 블록을 도시한 것이다.
표 17. Hanks' 용액에 상이한 기간 (days) 동안 침지시킨 TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 블록의 항균 구역의 평균 직경 (mm).
1d 2d 3d 5d 7d
3% PAA 11.0 8.0 6.3 6 6
5% PAA 10.7 10.0 6.7 6 6
10% PAA 11.0 10.0 10.0 9.0 7.5
(주의: 측정되는 항균 구역은 6 mm 직경의 샘플을 포함함)
결과:(1) PAA의 첨가는 TTCP/DCPA/CSH/Li 제형의 항균 효과를 연장시킨다.
(2) 3 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 11.0 mm; 2일 동안 침지한 후 8.0 mm; 및 3일 동안 침지한 후 6.3 mm의 항균 구역을 보여준다.
(3) 5 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 10.7 mm; 2일 동안 침지한 후 10.0 mm; 및 3일 동안 침지한 후 6.7 mm의 항균 구역을 보여준다.
(4) 10 부피% PAA를 포함하는 경화액으로 처리한 샘플은 Hanks' 용액에 1일 동안 침지한 후 11.0 mm; 2일 동안 침지한 후 10.0 mm; 3일 동안 침지한 후 10.0 mm; 5일 동안 침지한 후 9.0 mm; 및 7일 동안 침지한 후 7.5 mm의 항균 구역을 보여준다.
표 18. TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 블록을 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 Hanks' 용액의 평균 pH 값.
1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d
3% PAA 10.1 11.1 11.0 10.8 10.6 10.5 10.4 10.3 10.2 10.1
5% PAA 10.1 11.1 11.2 10.8 10.7 10.5 10.5 10.3 10.2 10.1
10% PAA 10.2 10.7 10.6 10.7 10.9 10.7 10.7 10.6 10.3 10.2
결과:(1) Hanks' 용액의 평균 pH 값은 모두 10 초과이며, 일부 경우에는 심지어 11 초과이다.
표 19. Hanks' 용액에 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 블록의 평균 중량 손실 백분율 (%).
1d 2d 3d 5d 7d 10d
3% PAA 19.5 25.8 29.5 35.3 41.2 43.2
5% PAA 17.3 22.8 28.3 31.7 42.9 45.6
10% PAA 15.2 23.3 28.7 40.2 48.3 49.5
결과:(1) Hanks' 용액에 침지한 모든 샘플의 평균 중량 손실은 침지 기간에 따라 증가한다. 7일 후, 중량의 40% 초과가 손실된다.
(2) 중량 손실은 PAA 함량에 따라, 특히 5일 후에 증가한다. 이러한 결과는, Li 화합물이 보다 신속하게 용해된 후, 매우 다공성인 구조가 임플란트의 생체흡수율을 증가시킬 수 있는 임플란트 물질에서 발달되기 때문에 바람직하다.
표 20. Hanks' 용액에 상이한 기간 (일(days)) 동안 침지한 TTCP/DCPA/CSH/Li/PAA 블록의 평균 세포 생존율 (샘플/DMEM 배지 비율 = 0.1 g/ml, NIH-3T3).
1d 2d 3d 5d 7d 10d
3% PAA 49.9 50.2 50.5 51.0 54.2 54.2
5% PAA 55.6 55.5 55.6 58.6 59.3 60.3
10% PAA 64.6 65.9 64.4 65.1 68.3 86.1
결과:(1) Hanks' 용액에 침지한 모든 샘플의 평균 세포 생존율은 침지 시간에 따라 증가하며, 이는 생체적합성 수준이 Li 화합물의 점차적인 소비로 인해 계속 증가함을 의미한다. 이러한 결과는, 최상의 결과가, 고 항균 효과 단계 후 임플란트 물질이 생체적합성 수준을 점차 회복하는 것이기 때문에 바람직하다.
(2) 10% PAA 샘플의 평균 세포 생존율 값은 3% PAA 샘플 및 5% PAA 샘플보다 상당히 더 높았다. 10일 후, 10% PAA 샘플의 세포 생존율 값은 86.1에 달하였다.
TTCP/DCPA/CSH/Li 염 /PAA 시멘트 페이스트의 주입성 시험
주입성 시험은 TTCP/DCPA/CSH/Li 염/PAA 시멘트 페이스트에서 수행하였다. TTCP/DCPA/CSH/Li 염/PAA 시멘트 페이스트는, 적절한 양의 "65/35" 분말 및 Li2CO3 분말 ("65/35" : Li2CO3 = 1 : 1 (중량에 의해))을 혼합하여 TTCP/DCPA/CSH/Li 염 혼합형 분말을 수득함으로써 제조하였으며, 여기서, TTCP : DCPA = 1 : 1 (몰수에 의해) 및 TTCP/DCPA : CSH = 65:35 (중량에 의해)이다. 생성되는 TTCP/DCPA/CSH/Li 염 분말을 10 부피% PAA 용액을 포함하는 0.6 M, 1 M, 2 M 또는 3 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 g/cc 내지 0.7 g/cc의 L/P 비로 혼합하여, TTCP/DCPA/CSH/Li 염 /PAA 시멘트 페이스트를 수득하였다. 생성되는 페이스트를 외과용 니들(surgical needle)을 부착한 5 cc 주사기 또는 니들을 부착하지 않은 5 cc 주사기를 사용해 37℃ 물에 주입하여, 시멘트 페이스트의 주입성을 시험하였다. 잔여 시멘트 (정상적으로 손으로 주입한 후 주사기에 남은 시멘트)의 양을 측정하고, 시멘트의 주입성 지수(index of injectability)로서 간주하였다 (잔여 시멘트의 양이 많다는 것은 주입성이 더 낮음을 의미함).
표 21. 니들이 부착되지 않은 5 cc 주사기를 통해 TTCP/DCPA/CSH/Li 염/PAA 시멘트 페이스트를 손으로 주입한 후, 주사기에 남은 잔여 시멘트 (중량%).
(NH4)2HPO4 농도 L/P = 0.35 cc/g L/P = 0.40 cc/g L/P = 0.45 cc/g
0.6 M 78.6 10.3 0
1 M 100 22.8 0
2 M 100 0 0
3 M 100 0 0
표 22. 길이 11 cm, 내경 0.6 mm의 "18G" 스테인레스 스틸 니들이 부착된 5 cc 주사기를 통해 TTCP/DCPA/CSH/Li 염 /PAA 시멘트 페이스트를 손으로 주입한 후, 주사기에 남은 잔여 시멘트 (중량%).
(NH4)2HPO4 농도 L/P=
0.40		 L/P=
0.45		 L/P=
0.50		 L/P=
0.55		 L/P=
0.60		 L/P=
0.65		 L/P=
0.70
1 M 100 90.1 70.8 20.2 0 0 0
2 M 100 95.2 88.1 80.8 60.2 34.2 0
결과: (1) 주사기에 남은 잔여 시멘트의 양은 L/P 비가 증가함에 따라 감소한다.
(2) 주사기에 남은 잔여 시멘트의 양은 경화액 농도가 증가함에 따라 증가한다.
실시예 8. CaCO 3 /Ca 2 P 2 O 7 /Li 염 샘플의 항균성 거동
항균성 시험을 CaCO3/Ca2P2O7/Li 염 샘플에서 수행하였다. CaCO3/ Ca2P2O7/Li 염 샘플은, 적절한 양의 CaCO3 분말 및 Ca2P2O7 분말 (CaCO3 : Ca2P2O7 = 1 : 1.27 (중량에 의해))을 Li2CO3 분말과 혼합하여 CaCO3/Ca2P2O7/Li 염 혼합형 분말을 수득함으로써 제조하였으며, 여기서, CaCO3/Ca2P2O7 : Li2CO3 = 1 : 1 또는 7 : 3 (중량에 의해)이다. CaCO3/Ca2P2O7/Li 염 혼합형 분말을 0.6 M (NH4)2HPO4 경화액과 0.35 g/cc의 L/P 비로 혼합하여 CaCO3/Ca2P2O7/Li 염 시멘트 페이스트를 수득하였다. 높이 3 mm 직경 6 mm의 블록 샘플은 시멘트 페이스트를 450 kgf의 압력 하에 압축-성형함으로써 제조하였다. 블록 샘플을 600℃로 1시간 또는 3시간 동안 가열하였다.
도 6은 침지시키지 않고 본 발명에 따라 제조한 CaCO3/Ca2P2O7/Li 블록의 항균 구역을 도시한 것이다.
결과:
(1) 70 중량% CaCO3/Ca2P2O7 및 30 중량% Li2CO3를 포함하며 600℃로 1시간 동안 가열한 샘플은 12 mm의 항균 구역을 보여준다.
(2) 70 중량% CaCO3/Ca2P2O7 및 30 중량% Li2CO3를 포함하며 600℃로 3시간 동안 가열한 샘플은 18 mm의 항균 구역을 보여준다.
(3) 50 중량% CaCO3/Ca2P2O7 및 50 중량% Li2CO3를 포함하며 600℃로 1시간 동안 가열한 샘플은 19.5 mm의 항균 구역을 보여준다.
(4) 50 중량% CaCO3/Ca2P2O7 및 50 중량% Li2CO3를 포함하며 600℃로 3시간 동안 가열한 샘플은 22.8 mm의 항균 구역을 보여준다.
실시예 9: 항미생물 활성 측정
시험되는 적절한 양의 UV-멸균된 샘플 (과립 또는 시멘트)을 12-웰 플레이트에 넣었으며, 여기에 1 ml 트립톤 소야 브로쓰(Tryptone Soya Broth; TSB)를 106개의 살아 있는 S. 아우레우스 박테리아와 함께 각 웰에 첨가하였다 (농도: ml 당 106 콜로니-형성 단위(CFU)). S. 아우레우스 박테리아를 샘플과 함께 37℃에서 혐기성 조건 하에 배양하였다. 샘플을 포함하지 않고 배양한 1가지는 각 연구 군에서 양성 대조군으로 간주하였다. 상이한 샘플과 함께 인큐베이션한 박테리아 현탁액의 생존율은 트립톤 소야 한천(Tryptone Soya Agar; TSA) 고형 한천 플레이트를 사용해 평가하였다. 24시간 동안 배양한 후, 각 웰의 브로쓰를 단계적으로 희석하고 평판배양하였다. 박테리아의 생장은 37℃에서 24시간 동안 한천 플레이트 상에서 배양한 후 평가하였다. 그런 다음, 콜로니-형성 단위(CFU)를 계수하여, 방정식을 이용해 농도를 계산하고,
Figure 112020054494125-pat00001
항미생물 활성을 하기의 방정식으로 수득한다:
항미생물 활성 = {[(대조군 농도) - (실험군 농도)] / (대조군 농도)} x 100%
적절한 양의 UV-멸균된 Li3PO4 염 또는 Li2CO3 염을 각각 1 ml TSB와 혼합하고, 이들의 항미생물 활성 값을 상기 방법을 이용해 시험하였다. 그 결과를 표 23에 나타낸다.
Li 염 Li 염의 양/TSB (g/ml) 항미생물 활성 (24시간)(%)
Li3PO4 0.06 98.9
Li3PO4 0.08 98.9
Li3PO4 0.10 97.4
Li3PO4 0.12 98.8
Li3PO4 0.14 99.8
Li2CO3 0.06 100
Li2CO3 0.08 100
Li2CO3 0.10 100
Li2CO3 0.12 100
Li2CO3 0.14 100
결과:(1) 1 ml TSB에 0.06-0.12 g Li3PO4 염을 포함하는 Li3PO4 염 샘플의 24h 항미생물 활성 값은 약 97.4% 내지 98.9%이다. 1 ml TSB에 0.14 g Li3PO4 염을 포함하는 샘플의 24h 항미생물 활성은 99.8%에 달한다.
(2) 모든 Li2CO3 염 샘플은 100%의 24h 항미생물 활성 값을 보여준다.
적절한 양의 "65/35" 분말을 적절한 양의 Li3PO4 염 또는 Li2CO3 염과 혼합하여 Li 염 비율이 상이한 TTCP/DCPA/CSH/Li 염 혼합형 분말을 형성하였다. 혼합형 분말을 0.6 M (NH4)2HPO4 용액과 혼합하여 시멘트 페이스트를 형성하였다. 완전히 경화되기 전, 페이스트를 450 Kgf의 압력 하에 스테인레스 스틸 몰드에 넣어 페이스트로부터 액체 일부를 짜내었다. 경화되고 몰드로부터 제거된 후, 경화된 블록을 파쇄하고 약 0.4 mm 내지 1.2 mm 입자 크기의 과립으로 체질(sieve)하였다. 0.2 g UV-멸균되어 수득된 과립형 샘플을 1 ml TSB와 혼합하고 상기 방법을 이용해 이의 항미생물 활성을 시험하였다. 그 결과를 표 24에 나타낸다.
샘플 항미생물 활성 (24시간) (%)
Li3PO4 : 65/35 = 25 : 75 (중량) 81
Li3PO4 : 65/35 = 50 : 50 (중량) 100
Li2CO3 : 65/35 = 25 : 75 (중량) 100
Li2CO3 : 65/35 = 50 : 50 (중량) 100
결과:(1) Li3PO4-함유 과립형 샘플의 경우, 24h 항미생물 활성 값은 Li3PO4 염 함량이 증가함에 따라 증가한다. 50 중량% Li3PO4를 포함하는 샘플의 24h 항미생물 활성 값은 100%에 달한다.
(2) Li2CO3-함유 샘플 둘 다의 24h 항미생물 활성 값은 100%에 달한다.
상기 상세한 설명에서, 당해 기술분야의 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 쉽게 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 여러 용도 및 상황에 맞게 조정할 수 있다. 따라서, 다른 구현예들 또한 청구항에 포함된다.

Claims (9)

  1. 리튬 화합물 및 칼슘 화합물을 포함하는 고형 성분을 포함하며, 상기 고형 성분이 50 부피% 내지 90 부피%의 다공성을 가지는 다공성 블록, 또는 상기 다공성 블록을 파쇄함으로써 수득되는 다공성 과립(granule) 또는 다공성 조각(piece)이며, 상기 칼슘 화합물이 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 옥사이드, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 하이드록사이드, 칼슘 마그네슘 포스페이트, 하이드록시아피타이트(hydroxyapitite) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는
    항균 조제물.
  2. 제1항에 있어서, 칼슘 화합물을 포함하지만 리튬 화합물은 포함하지 않는 조제물과 비교해 항균 활성이 향상된, 조제물.
  3. 제1항에 있어서, 10 cc/g의 용액 : 항균 조제물의 비로 침지된 항균 조제물을 포함하는 Hanks' 용액이 pH 10 이상의 pH 값을 나타내는, 조제물.
  4. 제1항에 있어서, 항균 조제물이 고형 성분의 중량을 기준으로 5 중량% 내지 80 중량%의 리튬 화합물을 포함하는, 조제물.
  5. 제1항에 있어서, 리튬 화합물이 리튬염, 리튬 옥사이드, 리튬 아미드 (LiNH2), 리튬 하이드록사이드 또는 리튬 할라이드인, 조제물.
  6. 제1항에 있어서, 리튬 화합물이 리튬 카르보네이트, 리튬 설페이트, 리튬 포스페이트, 리튬 옥사이드, 리튬 플루라이드, 리튬 아세테이트, 리튬 브로마이드, 리튬 하이드록사이드, 리튬 니트레이트, 리튬 니트라이트, 리튬 요오다이드, 리튬 몰리브데이트 (Li2MoO4), 리튬 테트라보레이트 (Li2B4O7), 리튬 시트레이트 테트라하이드레이트 (Li3C6H5O7·4H2O), 또는 리튬 스테아레이트 (LiC18H35O2)인, 조제물.
  7. 제1항에 있어서, 리튬 화합물이 리튬 카르보네이트 또는 리튬 포스페이트인, 조제물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 칼슘 화합물이 테트라칼슘 포스페이트, 다이칼슘 포스페이트, 하이드록시아피타이트, 칼슘 설페이트 다이하이드레이트, 칼슘 설페이트 헤미하이드레이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조제물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항균 조제물로부터 방출되는 리튬 화합물의 속도를 서행시키는 리튬 지연제(retarding agent)를 추가로 포함하며, 상기 리튬 지연제는 -(CH2-C(COOH)H)n-의 반복 단위를 가지는 폴리(아크릴산)이고, 상기 n은 50 내지 5000이며, 상기 항균 조제물은 상기 항균 조제물의 총 중량을 기준으로, 상기 폴리(아크릴산)의 0.01 중량 % 내지 5 중량 %를 포함하는, 조제물.
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