KR102196631B1

KR102196631B1 - 모발 침투성이 증가된 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체를 유효성분으로 함유하는 염모제용 조성물

Info

Publication number: KR102196631B1
Application number: KR1020190009415A
Authority: KR
Inventors: 임정대; 이한나; 장창희; 고은지; 류병렬
Original assignee: 강원대학교산학협력단; (주)선율
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2020-12-30
Also published as: KR20200092188A

Abstract

본 발명은 모발 침투성이 증가된 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체를 유효성분으로 함유하는 염모제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체는 천연색소를 이용한 인체에 부작용이 없는 염모제로서 개발이 가능하며, 모발의 염색성 및 염색 지속성이 우수하고 모발의 손상을 완화해주므로, 염모 관련 산업에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

모발 침투성이 증가된 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체를 유효성분으로 함유하는 염모제용 조성물{Composition for hair dye comprising polymer of cationic polymer and gardenia yellow pigment with increased hair permeability as effective component}

본 발명은 모발 침투성이 증가된 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체를 유효성분으로 함유하는 염모제용 조성물에 관한 것이다.

인체의 모발은 인종에 따라 색상 및 형태 등이 다르고 미용의 목적으로 다양한 색상으로 염색하는 것이 일반적이다. 모발 염색은 개성을 중요시하는 시대의 흐름에 따라 흑색-갈색 일변도에서 다양한 컬러를 추구하는 방향으로 나아가고 있다.

종래의 모발 염색의 경우, 타르색소를 주성분으로 하는 일시적 염색과 산화염료를 주성분으로 하는 반영구적 염색방법이 이용되며 두 가지 방법 모두 화학적 합성 염모제를 주성분으로 사용한다. 이러한 합성 염모제는 모발 손상, 발진 및 접촉성 피부 반응, 시력 장애와 함께 자주 사용할 경우 백혈병, 방광암, 자궁암과 유방암 등 암 발생을 일으키는 잠재적 유해요인을 내포하고 있다. 따라서 인체에 무해하며 친환경적인 천연 염모제의 개발이 요구되며 현재 천연 염모제로는 헤나가 대표적인 물질이다. 그 밖에 먹물, 월넛(walnut), 인디고(indigo), 카모마일(camomile) 등이 사용되고 있으며 그 색상으로서 헤나는 적색 계열, 월넛은 갈색 계열, 먹물은 흑색 계열, 인디고는 남색 계열, 카모마일은 황색 계열을 나타낸다. 식물성 천연염료들은 모발에 흡착하기 풍부한 친수성기와 소수성기를 포함하고 있어 염모제로서의 적용가능성이 매우 크다.

모발 염색에 있어 천연색소 사용의 한계점으로 합성색소에 비해 유기용매에 대한 용해도가 낮고 재현성, 표준화의 문제점, 원료공급의 불안정성, 고가의 원료비 등이 대두되어 천연색소를 활용한 모발 염색 제재에 대한 연구가 활발하게 이루어지지 않았다. 본 발명에서는 원료비가 저렴하고 원료 공급이 용이한 식물자원의 부산물을 활용하여 발색력이 우수한 천연색소를 확인하고 이를 양이온성 고분자와 결합시켜 구조적 안정성을 확보하고, 음이온을 띄는 손상된 모발에 흡착효과를 증가시켜 모발 염색에 적용하고자 한다.

치자(Gardenia jasminoides)는 꼭두서니과(Rubiaceae)의 상록 활엽 관목으로 9~11월에 타원형의 과실이 성숙하여 홍황색을 띄면 이를 채취하여 건조시켜 약용 및 염료용으로 사용하고 있다. 특히 한방에서는 이뇨제, 해열제, 진정제 및 눈병, 황달 등에 치료에 사용되고, 지혈제로 중요하게 사용된다.

한편, 한국공개특허 제2013-0143296호에는 '치자황색소와 구주소나무잎 오일을 함유한 염모제 조성물'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1652731호에는 '아실화된 천연염료의 제조방법, 이에 의해 제조된 아실화된 천연염료 및 이를 포함하는 모발 염색제'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '모발 침투성이 증가된 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체를 유효성분으로 함유하는 염모제용 조성물'에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 수용액 100 부피부에 대하여 30~35 중량부의 치자황색소를 혼합한 후, 이의 혼합물에 물을 첨가하여 55~65℃에서 5~10시간 동안 반응시켜 합성한 중합체를 모발에 처리하였을 때, 색도가 높고 세정 견뢰도가 우수하며, 모발의 손상을 완화해주고 모발 침투성이 현저히 증가되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체를 유효성분으로 함유하는 염모제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체는 천연색소를 이용한 인체에 부작용이 없는 염모제로서 개발이 가능하며, 모발의 염색성 및 염색 지속성이 우수하고 모발의 손상을 완화해주므로, 염모 관련 산업에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 크로신(A) 및 크로세틴(B) 표준물질과 치자황색소(C)에 대한 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 합성 시간에 따른 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)의 합성량을 비교하기 위해, 합성 시간별로 제조한 중합체의 중합 여부를 TLC로 확인한 결과이다. GY는 치자황색소 원색소를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)의 세포독성을 확인한 결과이다. GY는 치자황색소 원색소를 나타내고, PEI는 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)와 치자황색소 원색소(GY)를 각각 상온에서 40분 동안 모발에 염색한 후, 색차계를 사용하여 색상수(color index)를 측정한 결과이다. GY는 치자황색소 원색소를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)와 치자황색소 원색소(GY)를 각각 40℃에서 40분 동안 모발에 염색한 후, 색차계를 사용하여 색상수(color index)를 측정한 결과이다. GY는 치자황색소 원색소를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)와 치자황색소 원색소(GY)를 각각 상온에서 40분 동안 모발에 염색한 후, 염색한 모발을 중성샴푸를 이용하여 10회까지 세정한 후, 색상수(color index)를 측정한 결과이다. GY는 치자황색소 원색소를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)와 치자황색소 원색소(GY)를 각각 40℃에서 40분 동안 모발에 염색한 후, 염색한 모발을 중성샴푸를 이용하여 10회까지 세정한 후, 색상수(color index)를 측정한 결과이다. GY는 치자황색소 원색소를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)와 치자황색소 원색소(GY)로 각각 염색된 모발의 외관 특성을 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)을 통해 확인한 결과이다. A는 원모발(virgin hair)이며; B는 탈색모(bleaching hair)이며; C는 치자황색소 원색소(GY)를 처리한 모발이며; D는 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)를 처리한 모발을 나타낸다.
도 9는 FITC(Fluorescein isothiocyanate)로 표지된 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)와 치자황색소 원색소(GY)로 모발을 각각 염색한 후, FITC 형광 발현을 통해 PGYP 및 GY의 모발 침투성을 확인한 결과이다. A는 GY로 모발을 염색하는 경우에 모표피(cuticle)에서 형광 발현이 확인되는 것을 나타내며, B는 PGYP로 모발을 염색하는 경우에 모표피 뿐만 아니라, 모피질(cortex)까지도 형광 발현이 확인된다는 것을 나타내며, C 및 D는 각각 PGYP 및 GY로 염색된 모발 단면의 FITC 형광 발현을 확인한 것으로 GY(C)보다 PGYP(D)로 염색하였을 경우에 모발 침투성이 더 우수하다는 것을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체를 유효성분으로 함유하는 염모제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 염모제용 조성물에서, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)일 수 있으며, 바람직하게는 선형 폴리에틸렌이민(linear polyethyleneimine) 또는 분지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 염모제용 조성물에서, 상기 치자황색소는 크로신(crocin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 치자황색소는

1) 치자열매로부터 황색소 수용액을 수득하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)에서 수득한 황색소 수용액에 에탄올을 첨가하여 석출물을 제거하고, 에탄올 및 에틸 에테르를 첨가한 후, 3~5℃에서 방치하여 치자황색소를 수득하는 단계;를 포함하여 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체는

1) 양이온성 고분자 수용액 100 부피부에 대하여 30~35 중량부의 치자황색소를 첨가하여 혼합하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 혼합물에 물을 첨가하여 55~65℃에서 5~10시간 동안 반응시키는 단계;를 포함하여 제조되는 것일 수 있으며, 바람직하게는, 1) 양이온성 고분자 수용액 100 부피부에 대하여 35 중량부의 치자황색소를 첨가하여 혼합하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 혼합물에 물을 첨가하여 60℃에서 5시간 동안 반응시키는 단계;를 포함하여 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 단계 1)에서 양이온성 고분자 수용액은 물 100 부피부에 대하여 20~40 중량부의 양이온성 고분자를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 30 중량부의 양이온성 고분자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체는 염모제 조성물 100 중량부에 대하여 0.0001~20 중량부 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체가 염모제 조성물 100 중량부에 대하여 0.0001 중량부 미만이면 색소생성이 미약하여 모발의 착색효과가 거의 없고, 20 중량부를 초과하면 색소생성이 과다하게 되어 제형 전체의 색상이 너무 밝게되어 바람직하지 않다.

본 발명의 염모제 조성물에서 염색성을 향상시키기 위하여 pH조절제가 사용되며, 그 예로는 L-아르기닌, 모노에탄올아민(monoethanolamine), 디에탄올아민(diethanolamine), 트리에탄올아민(triethanolamine), 이소프로판올아민, 수산화칼륨(potassium hydroxide), 수산화나트륨(sodium hydroxide), 탄산나트륨(sodium carbonate), 아미노메틸프로판올(aminomethyl propanol), 암모니아수 등의 알칼리제와, 인산, 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycolic acid), 구연산(citric acid), 아세트산, 염산 및 황산 등의 유기산 또는 무기산 및 그들의 염 등을 들 수 있는데, 그 종류에 있어서 특별히 한정되지 않고 통상적으로 염모제에 사용되는 pH조절제를 사용할 수 있다.

본 발명의 염모제 조성물에서 모발 염색성 향상 및 철염의 안정화를 위하여 환원제가 사용되며, 그 예로는 피로아황산나트륨, 아황산나트륨 등의 설파이트류 및 그 염, 디소듐 파이로포스페이트(disodium pyrophosphate), 트리소듐 파이로포스페이트(trisodium pyrophosphate), 테트라소듐 파이로포스페이트(tetrasodium pyrophosphate) 등과 같은 파이로포스페이트 또는 포스페이트류, 프로필갈레이트, 아스코르빈산(ascorbic acid), 에리소르빈산(erythorbic acid)와 같은 비타민 유도체, 시스테인하이드로클로라이드 등의 시스테인(cystein) 유도체, 소듐 티오설페이트, 소듐 헥사하이드록소스타네이트(sodium hexahydroxostannate), 티오글리콜산 및 티오젖산 등을 들 수 있는데, 그 종류에 있어서 특별히 한정되지 않고 통상적으로 염모제에 사용되는 환원제를 사용할 수 있다.

본 발명의 염모제 조성물을 모발에 도포시 흘러내림 등의 문제를 방지하면서 사용편의성을 향상시키는 역할을 하는 점증제는 전분, 수용성 폴리머인 하이드록시에틸셀룰로스(Hydroxyethylcellulose), 폴리쿼터늄(Polyquaternium) 및 셀룰로오스 검(Cellulose gum) 등이 있다.

또한, 상기 염모제용 조성물은 헤어틴트, 아이브로우, 타투용 제형, 헤어 영양로션, 헤어트리트먼트, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어비누, 모발 염색제, 모발용 웨이브제, 헤어에센스 및 헤어컨디셔너로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 제형으로 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 치자황색소의 유효성분 함량 분석

본 발명에 사용된 치자황색소(gardenia yellow, GY)는 치자열매로부터 얻은 황색소 수용액에 에탄올을 첨가하여 석출물을 제거하고, 에탄올 및 에틸 에테르를 첨가하여 4℃에서 방치하여 얻었다. 치자 열매로부터 황색소를 추출할 때, 크로세틴(crocetin)이 포함되는 경우가 있는데 크로세틴이 존재하는 경우 색소의 질이 떨어진다. 따라서 추출한 치자황색소(이하 '시료'라 칭함)에 함유된 크로신 함량과 크로세틴의 존재 여부를 확인하기 위해 HPLC(high-performance liquid chromatography)를 이용하여 분석을 진행하였다(표 1). 치자황색소를 1㎎/㎖로 제조한 후 10배 희석하여 시린지 필터(0.45㎛, syinge-driven filter unit, ADVENTEC, Ehime, Japan)로 여과시키고 HPLC 분석에 사용하였으며, 크로신 및 크로세틴 표준물질(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하여 1㎎/㎖로 제조한 후 크로신은 1, 2, 4, 6, 8 및 10㎍/㎖ 농도로 희석하여 사용하였고, 크로세틴은 1, 10, 20, 30, 40 및 50㎍/㎖의 농도로 희석하여 사용하였다.

그 결과, 크로신 표준물질은 RT(retention time) 9.769에서 피크(R²=0.9965945)를 확인할 수 있었으며, 크로세틴 표준물질의 경우, RT 27.332에서 피크(R²=0.9998863)를 확인할 수 있었다(도 1A 및 1B). 추출한 치자황색소 0.1㎎/㎖의 시료를 3회 반복 분석하여 검량곡선에 대입한 결과, 크로신의 함량은 각각 2.7123㎍/㎖, 2.3452㎍/㎖ 및 2.2034㎍/㎖으로 측정되어 평균 2.4203 ± 0.2144㎍/㎖인 것을 확인하였고(표 2), 이를 시료 g당 함량으로 계산하였을 때, 상기 추출한 치자황색소에 24.203㎎/g의 크로신이 함유되어 있음을 확인하였다. 크로세틴의 경우에는 동일한 RT를 가지는 피크를 검출할 수 없었으며(도 1C), 이를 통해 치자황색소에 크로세틴이 존재하지 않음을 확인하였다(표 2). 따라서 이후 분석에서 치자황색소의 지표성분은 크로신으로 지정하여 하기 실시예를 진행하였다.

HPLC 분석 조건

장비	Shimadzu LC-20A
칼럼	YMC Pack ODS-AM
오븐 온도	30℃
검출기	UV-VIS 검출기
파장	443㎚
용매 A	물
용매 B	아세토니트릴
유량	1㎖/min
주입량	20㎕
이동상	구배
용출시간 (min)	용매 A (%)	용매 B (%)
0	80	20
0 - 20	20	80
20 - 25	20	80
25 - 35	80	20
35 45	80	20

크로신 및 크로세틴 함량 측정 결과

화합물		치자황색소(㎍/㎖)
화합물		크로신	크로세틴
시료 번호	1	2.7123	-
	2	2.3452	-
	3	2.2034	-
	평균	2.4203 ± 0.2144	-

-; 미검출

실시예 2. 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체( PGYP ) 합성 조건 확립

1) 온도에 따른 치자황색소의 안정성 평가

양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP) 합성 시, 합성온도 확립을 위해, 온도에 따른 치자황색소의 안정성 평가를 진행하였다. 1㎎/㎖의 치자황색소 원색소(GY)를 제조하여 상온, 45℃, 60℃, 75℃ 및 90℃에서 각각 5시간 동안 중탕한 후 분석하였다. 그 결과, 크로신의 함량은 상온에서 37.78275㎍/㎖, 45℃에서 30.03999㎍/㎖, 60℃에서 18.37164㎍/㎖, 75℃에서 10.37444㎍/㎖, 90℃에서 3.32795㎍/㎖였으며, g당 함량으로 계산한 결과, 각각 37.78275㎎/g, 30.03999㎎/g, 18.37164㎎/g, 10.37444㎎/g 및 3.32795㎎/g으로, 상온에서의 함량을 100%로 하였을 때 45℃에서 79.51%, 60℃에서 48.62%, 75℃에서 27.46% 및 90℃에서 8.81%로, 온도가 증가함에 따라 크로신의 함량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(표 3).

치자황색소에서 온도 처리에 따른 크로신의 함량 측정

온도	크로신(㎍/㎖)	%(상온 대비)
상온	37.78275	100.00
45℃	30.03999	79.51
60℃	18.37164	48.62
75℃	10.37444	27.46
90℃	3.32795	8.81

2) 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합 여부 확인

중합형 천연색소 합성을 위해 0.102g의 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, Mn=7,000, branched, PDI=1.2, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 0.2g의 치자황색소 원색소(GY)를 첨가한 후, 이를 증류수 2㎖에 용해시켜 90℃에서 환류 냉각기를 연결하여 시간별(1, 3, 5, 10 및 15시간)로 반응시켜 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)를 제조하였다. 반응 후 100㎖의 증류수로 희석하여 디클로로메탄(dichloromethane, DCM)으로 3회 분획하여 세척하였으며 이후 농축하여 시료를 제조하였다. 시간별로 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)를 제조하고, 이를 TLC로 확인한 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 크로신 표준물질에서 R_f값 0.63 정도에서 암갈색 형광 spot을 관찰할 수 있었으며 육안으로도 노란색 색소를 확인할 수 있었다. 또한, 치자황색소 원색소(GY)에서도 동일한 위치에 spot을 확인할 수 있었으며, PGYP에서도 1시간부터 3시간까지는 동일한 위치에서 spot을 확인할 수 있었으나, 5시간부터는 관찰되지 않았다. 따라서 반응을 위한 최적의 시간은 90℃에서 반응하는 경우 5시간 이상의 반응에서 폴리에틸렌이민(PEI)과 치자황색소가 완전히 중합반응이 이루어짐을 확인할 수 있었다. 또한, 356㎚의 UV 조명하에서 기존에 존재하지 않고 분리되지 않는 새로운 spot이 형성됨을 확인하였다(도 2). 이 spot은 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)로 높은 분자량에 의해 TLC로 분리되지 못한 것으로 판단된다.

3) 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체의 합성 시간 확립

상기 동일한 방법으로 시간별로 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)를 제조하고 각 시간별 시료를 HPLC를 이용하여 크로신에 대해 분석한 결과, 시간별로 반응시켜 제조한 PGYP 시료에서는 크로신(RT 값=9.54min)이 관찰되지 않았으며, 시간이 경과함에 따라 RT 값이 19분대와 22분대를 가지는 새로운 피크가 유도되었다. 반응시간이 경과함에 따라 함량이 증가하여 10시간에서 최대의 함량을 나타내었고 이후에는 큰 함량변화를 나타내지 않았다(표 4). 이는 크로신과 폴리에틸렌이민의 서로 중합하여 새로운 화합물을 형성하고 있다는 것을 의미하며 최적의 반응시간은 10시간 이하임을 뜻한다고 할 수 있다.

중합체의 합성 시간에 따른 RT(Retention time) 및 Area

합성 시간(hour)	RT	Area
1	18.956	35230.0
1	22.056	2951.3
3	18.697	50396.2
3	21.930	3016.0
5	19.417	541896.9
5	22.203	62770.2
10	19.206	818978.1
10	22.065	67876.5
15	20.183	33270.8
	20.250	231465.0
	21.925	77506.6

4) 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체의 합성 온도 확립

온도에 따른 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)의 합성량 비교를 위해, 0.102g의 폴리에틸렌이민(PEI, Mn=7,000, PDI=1.2, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 0.2g의 치자황색소(GY)를 첨가한 후, 이를 2㎖의 증류수에 용해시켜 온도별(45℃, 60℃, 75℃ 및 90℃)로 가열된 환류 냉각기를 연결하여 5시간 동안 반응을 시켜 PGYP를 제조하였다. 반응 후 100㎖의 증류수로 희석하여 디클로로메탄(DCM)으로 3회 분획하여 세척하였으며 이후 농축하여 HPLC 분석 시료로 사용하였다. 그 결과, 45℃에서는 어떠한 피크도 발견되지 않았고, 60℃, 75℃ 및 90℃에서 반응시켜 제조한 시료(PGYP)에서 RT 값이 21분대와 23분대에 피크가 확인된 것으로 보아 해당 피크가 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)인 것으로 판단된다. 또한, 60℃부터 합성이 시작되어 온도가 증가할수록 중합체 합성량이 많아지는 것으로 확인되었으며, 상기 합성 온도에 따른 치자황색소의 안정성 평가 결과와 종합하였을 때 합성이 시작되고 색소량이 약 50%(상온 대비) 남아있는 60℃를 최적 조건으로 확립하여 하기 실시예를 실시하였다.

중합체의 합성 온도에 따른 RT(Retention time) 및 Area

합성 온도(℃)	RT	Area
45	-	-
60	21.102	384266.4
60	23.577	105632.3
75	21.071	359208.4
	23.369	213529.0
	26.531	147378.8
90	21.000	388144.8
90	23.236	109375.7

-; 미검출

5) 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체의 적정 치자황색소량 확립

양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)의 합성이 완결되는 여부를 직접적으로 확인할 수 없기 때문에 합성되지 못하고 남은 치자황색소를 분석하여 적정 색소량을 확립하고자 한다. 따라서 PGYP의 합성을 위해, 물 100 중량부에 대하여 30 중량부의 폴리에틸렌이민(PEI, Mn=7,000)을 포함하는 폴리에틸레이민 수용액 100㎖에 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 및 55g의 치자황색소(GY)를 각각 첨가하여 용해시켜 60℃로 가열된 환류 냉각기를 연결하여 5시간 동안 반응시켜 HPLC 분석 시료로 사용하였다.

그 결과, 하기 표 6에 개시한 바와 같이 20g/100㎖, 25g/100㎖ 및 30g/100㎖의 PGYP에서는 크로신의 피크를 확인할 수 없었으나, 35g/100㎖의 PGYP에서 2.70689㎍/㎖의 크로신을 확인하였다. 이후 40g/100㎖를 시작으로 점점 높은 크로신 함량을 나타내었고, 이러한 결과를 통해, 100㎖의 폴리에틸렌이민에 31~35g의 치자황색소를 첨가하여 반응시킬 때 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(PEI)과 치자황색소(GY)의 합성비율이 적합하다고 판단된다.

치자황색소 첨가량에 따른 중합체의 크로신 함량

색소 함량(g/㎖)	크로신(㎍/㎖)
색소 함량(g/㎖)	GY	PGYP
20	115.4474	-
25	154.8337	-
30	209.9894	-
35	393.5756	2.70689
40	452.2102	20.92404
45	469.7420	21.84520
50	570.5491	103.53300
55	663.5618	104.84870

-; 미검출

실시예 3. 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체의 항산화 효능 검정

양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)의 항산화 효능 검정은 ABTS 라디칼 소거능 검정을 통해 확인하였다. 구체적으로, ABTS[2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)-diammonium salt] 시약은 7.4mM ABTS에 2.4mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 넣고 25℃의 암실에서 12시간 동안 반응시킨 후 사용하였으며, 치자황색소 원색소(GY), 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP), 폴리에틸렌이민(PEI)을 각각 17.5, 35, 46.7, 70, 140 및 350㎍/㎖의 농도가 되도록 제조한 후 400㎕에 ABTS 시약 800㎕를 가하여 암실에서 10분간 반응시킨 후 734nm에서 UV-1650PC UV/VIS 분광광도계(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 L(+)-아스코르브산(Junsei Chemical Co., Ltd, Tokyo, Japan)을 2, 4, 6, 8 및 10㎍/㎖로 제조하여 사용하였고 라디칼을 50% 저해시키는 농도인 RC₅₀값으로 나타내어 비교하였다. 그 결과, 하기 표 7에 개시한 바와 같이 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(PEI)의 경우에 라디칼을 50% 저해시키는 농도가 187.089㎍/㎖이며, 치자황색소 원색소(GY)의 경우에 310.984㎍/㎖인 반면, 본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)는 93.313㎍/㎖으로, 폴리에틸렌이민(PEI) 및 치자황색소 원색소(GY) 단독 처리보다 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체의 항산화 활성

시료	RC₅₀ (㎍/㎖)
L(+)-아스코르브산	8.261
PEI	187.089
GY	310.984
PGYP	93.313

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실시예 4. 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체의 세포독성 평가

세포는 인간 유래 각질세포인 HaCaT 세포를 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, 2~3일 간격으로 HaCaT 세포가 70~80% 밀집(confluence)하게 되면 1:3으로 계대하여 실험에 사용하였다. 시약은 DMEM(Dulbecco’s modified Eagels’s medium)과 FBS(fetal bovine serum), 0.25mM 트립신-EDTA 및 페니실린/스트렙토마이신(P/S)는 Gibco 사(NY, USA) 제품을 사용하였으며, PBS(pH7.4)는 AMRESCO 사(Solon, OH, USA)의 제품을 사용하였다. DMSO(dimethyl sulfoxide)는 Mylan N. V. 사(canonsburg, PA, USA)의 Cyroserv 제품을 사용하였고, MTT[3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]는 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. HaCaT 세포의 배양은 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다.

HaCaT 세포의 독성평가는 MTT 분석을 통해 확인하였다. 96-웰 세포 플레이트에 세포를 웰당 1×10⁵세포로 접종하고 37℃ 및 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양한 후, PBS를 이용하여 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP), 치자황색소 원색소(GY) 및 양이온성 고분자(PEI)를 17.5, 35, 46.7, 70, 140 및 350㎍/㎖의 농도로 희석하여 각각 처리하였다. 시료처리 24시간 이후에 MTT 용액(5㎎/㎖ in PBS)을 100㎕당 10㎕가 되도록 처리하고, 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 배지를 제거하여 200㎕의 DMSO로 포르마잔(formazan) 결정을 녹였다. ELISA 리더(VITOR X 2030 multilabel reader, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용해 540㎚의 파장에서 흡광도를 측정하고 측정된 흡광도는 대조군(control) 값에 대한 백분율(%)로 표현하였다.

그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(PEI)의 경우에 가장 높은 농도인 350㎍/㎖ 처리농도에서 56.06%의 세포 생존율을 보여 세포 독성이 있는 것을 확인한 반면, 치자황색소 원색소(GY) 및 양이온 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)는 모든 처리농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 나타내었다.

실시예 5. 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체의 모발염색 및 세정 견뢰도 확인

모발 시료는 염색, 탈색 등의 화학처리를 하지 않은 20대 아시아 여성의 모발을 수집하여 약 10㎝ 기장으로 잘라 모아 상단부를 실리콘으로 처리하여 사용하였으며, 탈색약은 1제인 블리치 분말(bleach powder)과 2제인 6% 과산화물(peroxide)로 구성된 '웰라 블론더' 제품을 사용하였다. 탈색은 약 20g의 모발에 블리치 분말 50g과 6%의 과산화물 100g을 1:2(w/w)의 중량 비율로 혼합한 후, 염색 브러시를 사용해 모발에 도포하여 55℃에서 20분간 방치 후, 미온수로 깨끗이 세척하여 건조시켰으며, 탈색은 총 2회 진행하였다. 모발 염색은 10×10㎝로 자른 모발에 35g/100㎖로 제조한 치자황색소 원색소(GY)와 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)를 각각 10㎖ 처리하여 상온 및 40℃에서 각각 40분간 방치한 후 흐르는 미온수로 깨끗이 세척하여 색차 분석을 진행하였다.

또한, 모발의 세정 견뢰도 평가를 위해, GY 및 PGYP를 상온과 40℃에서 각각 염색하였고, 색차계(X-rite vs450, X-Rite Inc., Grand Rapids, MI, USA)를 사용하여 D65-10 광원에서 측정하였으며, CIELCh 색 공간에 나타내어 L*(명도), a*(적색 및 녹색), b*(황색 및 청색) 값을 비교 분석하였다. 각 모발시료를 중성샴푸를 이용하여 미온수로 깨끗이 세척한 후 건조하여 염색 직후 측정한 값을 기준으로 색차를 측정하였다. 최대 10회 진행하였으며 색차측정 시 높이에 따른 색차이를 제외하기 위해 모발 양끝을 고정하여 같은 높이에서 측정하였다.

그 결과, 상온에서 40분 동안 염색한 모발의 색차를 분석하였을 때, 치자황색소 원색소(GY)보다 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)를 처리한 모발의 명도 값이 전체적으로 낮았으며, 적색도(a*) 및 황색도(b*) 값은 PGYP가 GY에 비해 높은 적색과 황색을 나타냄을 확인하였다(도 4). 또한, 40℃에서 40분 동안 염색한 모발의 색차 분석 결과, 상기 상온 결과와 마찬가지로 GY 보다 PGYP 명도 값이 낮게 나왔으며, 적색도는 PGYP, 황색도는 GY가 높게 나왔다(도 5).

모발의 세정 견뢰도 분석 결과, 색차 렌더링(rendering)을 통해 GY 보다 PGYP가 염색성이 높다는 것을 확인할 수 있으며(도 6 및 도 7), 이러한 결과는 본 발명의 PGYP가 황색도 및 적색도 모두 높게 발색되는 비가열 염색제로 사용되어야 함을 의미한다.

실시예 6. 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체의 외관특성 및 모발 침투성 확인

1) 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체로 염색된 모발의 외관특성

양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)로 염색된 모발의 외관특성을 확인하기 위해, 원모발(virgin hair), 탈색모(bleaching hair)와 치자황색소 원색소(GY), 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)로 염색된 모발을 대상으로 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 모발시료의 표면을 촬영하였다. 염색 모발의 중간부를 채취한 후, 각각 모발 시료길이를 4㎜로 자른 다음 처리된 지지대(aluminium stub) 위에 카본 테이프로 부착시켜 나열하였다. 그리고 이온 코팅기(PT plasma coater)를 사용하여 240초 동안 백금 도금(platinum cating)한 후 FE-SEM(주사전자현미경, JSM-6701F, JEOL, Japan)으로 15kV에서 관찰하였다.

각 모발을 통해 얻어진 SEM 이미지를 비교한 결과, 도 8에 개시한 바와 같이 모표피(cuticle) 층의 손상 정도, 형태 변화 및 모발 표면에서 큰 차이를 나타내었는데, 탈색모(bleaching hair)의 경우, 모피질 보호에 필요한 정상적인 모표피 층을 관찰하기 어려웠으며, 모표피 층 손상에 따라 나무껍질과 같은 모피질 내의 섬유조직이 모두 드러났으며 모발 섬유 표면의 일부가 섬유에서 분리되어 들떠 있어 탈색에 의해 모표피의 분리·소실 및 비늘(scale)의 이동 및 박리현상이 일어남을 확인할 수 있었다(도 8B). 반면에, 치자황색소 원색소(GY) 및 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)로 염색된 모발의 경우, 탈색에 의해 드러난 제거된 모표피 층 대신 색소 성분이 모피질에 흡착되어 모피질의 노출을 방지하는 형태를 보였으나, 치자황색소 원색소(GY)의 경우에 노출되거나 박리된 모피질을 완전히 덮지 못하고 일부가 노출되거나 들떠있을 뿐 아니라 분리된 큐티층의 이동 및 박리현상이 여전히 관찰되었다(도 8C). 그에 비해, 본 발명의 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)로 염색된 모발의 경우 중합체가 모피질에 균일하게 흡착되어, 들떠있거나 분리된 모피질 섬유를 확인할 수 없었으며, 탈락된 큐티층 조직도 관찰되지 않았고 원모발(도 8A)과 유사하게 전체적으로 모표피 층이 선명하고 건강한 모발의 형태임을 알 수 있었다(도 8D).

2) FITC ( Fluorescein isothiocyanate )로 표지된 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체의 모발 침투성

FITC(fluorescein isothiocyanate)를 표지한 치자황색소 원색소(GY)와 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)를 모발에 각각 염색한 후, FITC 형광 발현을 통해 폴리에틸렌이민(PEI) 중합에 의한 색소의 모발 침투성 증가 여부를 확인하였다. 구체적으로, PGYP를 대상으로 형광염색제인 FITC(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 표지하였다. GY 및 PGYP 각각 1㎖를 사용하였으며, PGYP의 경우에 FITC와의 가교결합을 위하여 0.01%의 PEI(25kDa, branched, Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI, USA)를 추가적으로 첨가하였다. 각 시료를 10㎎/㎖의 FITC가 포함된 카보네이트 버퍼(0.5M, pH 9.0)에 혼합하고 실온에서 2시간 동안 반응하여 표지하였으며, 결합되지 않은 FITC는 Sephadex G25 칼럼(Pharmacia, Uppsala, Sweden)을 이용하여 제거하였다. FITC로 표지된 GY 및 PGYP를 모발 염색 전까지 4℃에서 보관하였다.

GY 및 PGYP를 이용한 모발염색에 있어 염색제의 투과 효율을 가시적으로 확인하기 위해, 형광 이미지 복원 현미경(fluorescence image restoration microscopy)을 이용하였으며, 염색된 각 시료를 cryo mold에서 OCT embedding matrix(Cell Path Ltd., UK)를 처리하여 조직을 70℃에서 동결하였다. 염색 모발 조직에 대한 형광 시약의 피부 투과 정도를 확인하기 위해, 모발 조직을 Olympus IX70 Inverted Microscope로 관찰하였으며, FITC에 대한 여기 파장은 430/10㎚였으며, 방출 파장은 470/30㎚로 조정하였다. 또한, 염색된 모발조직의 종단면을 관찰하기 위해, 동결된 염색 모발 조직은 cryotome(HM505E, Germany)을 이용하여 20℃에서 10㎛의 두께로 크로스 섹션하여 절편 슬라이드를 제작하였다. 광퇴색(Photobleaching) 현상을 감소시키고 모발 조직과 커버 글래스와의 부착성을 높이기 위해 polyvinyl alchol mounting medium with DABCO(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 처리하였고 Olympus IX70 도립현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 9에 개시한 바와 같이 FITC를 표지한 치자황색소 원색소(GY)를 모발에 염색한 경우에 FITC 형광 발현이 케라틴층이 약 10~15층으로 이루어진 모표피(cuticle)까지 투과되어 염색되었으며, 특히 양이온성 고분자 및 치자황색소의 중합체(PGYP)로 모발을 염색하는 경우에는 FITC 형광 발현이 모표피뿐만 아니라 섬유세포로 이루어진 모피질(cortex)까지 발현됨을 확인할 수 있었다(도 9A 및 9B).

또한, GY와 PGYP로 염색된 모발을 크로스 섹션하고 절단된 단면의 FITC의 형광 발현을 확인하였을 경우에도, PGYP로 염색된 모발의 단면 전체에서 GY 보다 모발 침투성이 더 우수한 것을 확인하였다(도 9C 및 도 9D).

Claims

폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 및 크로신(crocin)의 중합체를 유효성분으로 함유하는 염모제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민은 선형 폴리에틸렌이민(linear polyethyleneimine) 또는 분지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine)인 것을 특징으로 하는 염모제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민 및 크로신의 중합체는
1) 폴리에틸렌이민 수용액 100 부피부에 대하여 30~35 중량부의 크로신을 첨가하여 혼합하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 폴리에틸렌이민 및 크로신의 혼합물에 물을 첨가하여 55~65℃에서 5~10시간 동안 반응시키는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 염모제용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 단계 1)에서 폴리에틸렌이민 수용액은 물 100 부피부에 대하여 20~40 중량부의 폴리에틸렌이민을 포함하는 것을 특징으로 하는 염모제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민 및 크로신의 중합체는 조성물 100 중량부에 대하여 0.0001~20 중량부 포함되는 것을 특징으로 하는 염모제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 염모제용 조성물은 헤어틴트, 아이브로우, 타투용 제형, 헤어 영양로션, 헤어트리트먼트, 헤어 샴푸, 헤어린스, 헤어크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어비누, 모발 염색제, 모발용 웨이브제, 헤어에센스 및 헤어컨디셔너로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 염모제용 조성물.