KR102192908B1

KR102192908B1 - 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법

Info

Publication number: KR102192908B1
Application number: KR1020180160367A
Authority: KR
Inventors: 권순익
Original assignee: 주식회사 리엔젠
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2018-12-12
Publication date: 2020-12-18
Also published as: KR20200072322A

Abstract

본 발명은 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법에 관한 것으로, 특히 온도감응성 고분자(thermosensitive polymer) 복합체를 이용하여 동결건조(lyophilization)된 형태를 갖도록 하여 환자에게 적용하기 전 필요한 약물과 혼합하면 저점도의 고분자 수용액 상태로서 약물 투여 전에는 액체의 형태를 띠고 있다가 필요 약물을 혼합한 후 인체의 사용 부위에 적용시 생체온도에서 가역적 저온임계용액온도(lower critical solution temperature, LCST)를 형성하여 하이드로겔(hydrogel)의 형태로 변하여 1~3일 동안 약물을 서서히 방출하할 수 있도록 한 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법에 관한 것이다.

Description

온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법{Method for manufacturing controlled releasable DDS device using thermosensitive hydrogel}

본 발명은 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법에 관한 것으로, 특히 온도감응성 고분자(thermosensitive polymer) 복합체를 이용하여 동결건조(lyophilization)된 형태를 갖도록 하여 환자에게 적용하기 전 필요한 약물과 혼합하면 저점도의 고분자 수용액 상태로서 약물 투여 전에는 액체의 형태를 띠고 있다가 필요 약물을 혼합한 후 인체의 사용 부위에 적용시 생체온도에서 가역적 저온임계용액온도(lower critical solution temperature, LCST)를 형성하여 하이드로겔(hydrogel)의 형태로 변하여 1~3일 동안 약물을 서서히 방출할 수 있도록 한 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법에 관한 것이다.

하이드로겔은 고분자의 온도감응성은 그대로 유지하면서 세포 부착성이 우수하고 생체 내에서 일정 기간 후에 생분해 될 수 있으며, 이에 조직공학 지지체 및 약물전달시스템 등에서 다양한 응용이 이루어지고 있다.

특히, 현재의 의료기술로는 심각한 장기 손상시 약물 요법만으로 치료가 불가능하며, 이식만이 유일한 치료법인 경우가 증가하고 있다.

이에 따라, 이식을 필요로 하는 환자수 증가 대비 인공조직 및 장기 공급도 진행되고 있으며, 경우에 따라서는 외과적 수술 없이 주입형 하이드로겔을 이용하여 약물 치료 혹은 조직공학적 재생을 진행하기도 한다.

그런데, 기존 하이드로겔은 세포 친화력이 떨어지고, 약물 전달용으로 사용시 생체 온도에 따른 반응성이 약해 이에 대한 보완이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1780391호(2017년09월14일), '피부온도 감응형 순수하이드로겔을 지지하는 지지체를 포함하여 밀착력을 향상시킨 하이드로겔의 제조방법' 대한민국 등록특허 제10-1424172호(2014년07월22일), '전기장 감응성 하이드로겔, 그를 이용한 약물전달체 및 그의 제조방법' 대한민국 등록특허 제10-1570300호(2015년11월12일), '핵산 물질 및 약물의 다중 전달을 위한 온도 감응형 마이셀을 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법'

본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술상의 제반 문제점들을 감안하여 이를 해결하고자 창출된 것으로, 온도감응성 고분자(thermosensitive polymer) 복합체를 이용하여 동결건조(lyophilization)된 형태를 갖도록 하여 환자에게 적용하기 전 필요한 약물과 혼합하면 저점도의 고분자 수용액 상태로서 약물 투여 전에는 액체의 형태를 띠고 있다가 필요 약물을 혼합한 후 인체의 사용 부위에 적용시 생체온도에서 가역적 저온임계용액온도(lower critical solution temperature, LCST)를 형성하여 하이드로겔(hydrogel)의 형태로 변하여 1~3일 동안 약물을 서서히 방출하할 수 있도록 한 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법을 제공함에 그 주된 목적이 있다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위한 수단으로, 겔 형성용 중합체 배합단계와; 배합물에 약물전달물질을 첨가하는 혼합단계와; 혼합물을 여과한 후 바이알(Vial)에 충전하는 단계와; 충전된 바이알을 동결건조하는 단계;를 포함하는 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법에 있어서;
상기 겔 형성용 중합체 배합단계는 배합탱크에 플록사머 407(Poloxamer 407) 3200g과 주사용수 12L를 투입한 후 교반하면서 배합하는 단계로서, 배합조건은 칠링온도(Chilling Temp):2℃, 교반속도:80-250rpm, 교반시간:60-140분이고;
상기 배합물에 약물전달물질을 첨가하는 혼합단계는 소듐히알루로네이트(Sodium hyaluronate) 84.8g을 첨가한 후 주사용수를 첨가하여 배합탱크내 용량표시인 16L 표시선에 레벨을 맞춘 다음 혼합 교반하는 단계로서, 교반조건은 교반속도:150-250rpm, 교반시간:120-600분이며;
상기 바이알 충전단계는 필터 크기(Filter size) 10.0um, 여과시간 300분 동안 여과시킨 후 10g/총1368 vial의 바이알당 충전량으로 충전하는 단계이고;
상기 동결 건조조건은 -15 ~ -50℃에 이르는 냉동의 경우 60~120분에 걸쳐 이루어지도록 하고, -45 ~ 30℃까지의 건조는 -45℃에서 1분, -30℃에서 180-240분, -20℃에서 840분, 0℃에서 600분, 30℃에서 10분간 건조하도록 구성된 것을 특징으로 하는 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법을 제공한다.

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본 발명에 따르면, 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.

첫째, 온도감응성 고분자(thermosensitive polymer) 복합체를 이용하여 동결건조(lyophilization)된 형태로 제조하므로 관리, 사용이 편리하다.

둘째, 환자에게 적용하기 전에 필요한 약물과 혼합하면 저점도의 고분자 수용액 상태를 유지할 수 있어 정확한 투약이 가능하다.

세째, 약물 투여 전에는 액체의 형태를 띠고 있다가 필요 약물을 혼합한 후 인체의 사용 부위에 적용시 생체온도에서 가역적 저온임계용액온도(lower critical solution temperature, LCST)를 형성하여 하이드로겔(hydrogel)의 형태로 변하여 1~3일 동안 약물을 서서히 방출할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체의 개념을 보인 예시도이다.
도 2는 본 발명에 따른 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체의 약물 전달예를 보인 예시도이다.
도 3은 본 발명에 따른 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체의 용해 및 체내 용출예를 보인 예시적인 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체의 예시적인 시료 샘플 사진이다.

이하에서는, 첨부도면을 참고하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명 설명에 앞서, 이하의 특정한 구조 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

또한, 본 발명의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로, 특정 실시예들은 도면에 예시하고 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경물, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명과 관련하여 대부분의 고분자들은 온도가 증가함에 따라 용해도가 증가하지만 저임계 용액온도(lower critical solution temperature;LCST)를 보이는 온도 감응성 고분자들은 온도가 증가함에 따라 용해도가 낮아진다는 특성을 갖는다.

온도 감응성 고분자로 형성된 하이드로젤은 LCST 보다 높은 온도에서 수축한다.

온도 감응성 고분자들은 공통적으로 소수성기를 갖고 있는데 온도 변화에 반응하여 이 소수성기에 결합되어 있는 물 분자가 방출되면서 상 분리 현상이 일어나게 되며 이로 인해 수축하게 된다.

따라서, 체온과 유사한 온도에서 약물방출 거동을 조절할 수 있기 때문에 온도 감응성 약물 전달 시스템에서 유용하게 응용 될 수 있다.

본 발명에 따른 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법은 도 1의 예시와 같이, 온도감응성 고분자(thermosensitive polymer)에 겔 형성 보조제를 결합하여 서방형 약물전달체인 복합체를 만들어 사용한다.

이때, 복합체는 동결건조(lyophilization)된 형태를 지니고 있으며, 환자에게 적용하기 전에 필요한 약물과 혼합하면 저점도의 고분자 수용액 상태로 바뀌게 된다.

이와 같이, 약물 투여 전에는 액체의 형태를 띠고 있다가 필요 약물을 혼합한 후 도 2의 예시와 같이, 인체의 사용 부위에 적용시 생체온도에서 가역적 저온임계용액온도(lower critical solution temperature, LCST)를 형성하여 하이드로겔(hydrogel)의 형태로 변하여 1~3일 동안 약물을 서서히 방출하는 온도감응성 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체를 제조할 수 있게 된다.

특히, 대량생산이 가능하도록 하면서 35-50℃에서 온도감응성 생분해 하이드로겔이 졸-겔 변화가 가능하도록 조성물의 성분함량을 조절하는 것이 매우 중요하다.

이것은 생체온도에서 가역적 저온임계용액온도(lower critical solution temperature, LCST)를 확립하기 위해 매우 중요한 인자로서 약물전달체는 상온에서의 점도가 낮아(예를 들어, 섭씨 20도에서 점도 10 Pas), 주사기를 이용하여 약물 주입을 용이하게 할 수 있으며, 체내에서의 점도는 상대적으로 높아져(예를 들어, 섭씨 37도에서 점도 300 Pas) 약물을 서서히 방출하도록 구성해야 한다.

이를 확인하기 위해, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 하이드로겔을 시험관내(In-vitro) 실험으로 확인할 결과, 1일째 40~50중량% 가량의 약물이 방출되고, 3~5일이면 하이드로겔이 와해되면서 약물 뿐만 아니라 하이드로겔 역시 체내에 흡수되어 사라지는 것을 확인하였다.

이러한 방식은 첨부한 도 3의 예시와 같은 형태로 설명될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법은 겔 형성용 중합체 배합단계와, 배합물에 약물전달물질을 첨가하는 혼합단계와, 혼합물을 여과한 후 바이알(Vial)에 충전하는 단계와, 충전된 바이알을 동결건조하는 단계를 포함한다.

이때, 본 발명에 따른 제조방법은 무균처리된 상태에서 무균실에서 진행되므로 별도의 멸균처리 공정을 거칠 필요가 없다.

그리고, 상기 겔 형성용 중합체 배합단계는 배합탱크에 플록사머 407(Poloxamer 407) 3200g과 주사용수 12L를 투입한 후 교반하면서 배합하는 단계이다.

이 경우, 칠링온도(Chilling Temp):2℃, 교반속도:80-250rpm, 교반시간:60-140분의 조건을 갖는다.

또한, 상기 겔 형성용 중합체는 N-이소프로필 아크릴아미드 중합체, 에틸히드록시에틸셀룰로오스, 폴리(에틸렌옥사이드-프로필렌 옥사이드-에틸렌 옥사이드), 폴록사머, 플루로닉스(PLURONICS(R)) 중합체, 폴리(에틸렌 글리콜)/폴리(D,L-락트산-코-글리콜산)블록 공중합체, 다당류, 알기네이트, 폴리포스파진, 폴리아크릴레이트, 테트로닉스(TETRONICS(TM))중합체, 및 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체 중에서 폴리(에틸렌 옥사이드-프로필렌 옥사이드-에틸렌 옥사이드)는 블록공중합체로 폴리(에틸렌 옥사이드-b-프로필렌 옥사이드-b-에틸렌 옥사이드)인 Poloxamer 407을 사용할 수 있다.

다만, 본 발명에서는 플록사머 407(Poloxamer 407)을 예시적으로 실시하였다.

아울러, 상기 배합물에 약물전달물질을 첨가하는 혼합단계는 소듐히알루로네이트(Sodium hyaluronate) 84.8g을 첨가한 후 주사용수를 첨가하여 배합탱크내 용량표시인 16L 표시선에 레벨을 맞춘 다음 혼합 교반하는 단계이다.

이 경우, 교반속도:150-250rpm, 교반시간:120-600분의 조건을 가지며, 약물전달물질은 온도 민감성 하이드로겔 형성을 위한 보조제이다.

이때, 상기 약물전달물질은 고체 상태의 약물전달물질로, 분말 상태의 고체인 폴리(에틸렌 옥사이드-프로필렌 옥사이드-에틸렌 옥사이드)와 소듐히알루로네이트의 혼합물일 수 있으며, 겔은 온도민감성 하이드로겔로 사용함이 바람직하다.

온도민감성 하이드로겔은 상온에서 액체 상태이고, 체온에서 고체 또는 겔 상태인 온도 감응형 하이드로겔을 의미하며, 예를 들어 고체 상태의 온도민감성 하이드로겔 형성용 중합체와 고체 상태의 온도민감성 하이드로겔 형성 보조제가 용매에 용해 또는 현탁되어 상온에서 액체 상태이고, 체온에서 고체 또는 겔 상태로 전환되는 메카니즘을 가진다.

그리고, 상기 바이알 충전단계는 필터 크기(Filter size) 10.0um, 여과시간 300분 동안 여과시킨 후 10g/총 1368 vial의 바이알당 충전량으로 충전하는 단계이다.

아울러, 상기 동결 건조단계는 양호한 보존상태를 유지한 채 장기간 보존될 수 있도록 하면서 안전성을 확보할 수 있도록 하기 위한 단계이다.

이때, 동결 건조 조건이 중요한데, 이는 사용하기 위해 수용액 상태로 만들 때 용해되는 속도가 일정 범위내를 유지해야 하기 때문이다.

본 발명에서는 동결 건조된 약물의 37℃ 상태에서 시간에 따른 용해속도를 HPLC를 이용하여 다수회 측정한 후 평균을 내어 동결 건조 조건을 설정하였다.

본 발명에 따른 동결 건조 조건은 -15 ~ -50℃에 이르는 냉동은 60~120분에 걸쳐 이루어지도록 하고, -45 ~ 30℃ 까지의 건조는 -45℃에서는 1분, -30℃에서는 180-240분, -20℃에서는 840분, 0℃에서는 600분, 30℃에서 10분간 히팅하여 건조하도록 구성된다.

이렇게 하면, 본 발명이 목적하는 물리화학적 특성을 가지면서 안전한 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체를 제조할 수 있게 된다.

본 발명에 따른 약물전달체의 특성을 확인하기 위해 다음과 같이 검액을 제조하였다.

먼저, 일회용 멸균주사기를 이용하여 5mL 생리식염수를 취한 후, 동결건조분말이 담겨 있는 바이알에 주입한 수 가볍게 흔들었다. 그런 다음, 냉장상태(2-8 ℃)에서 8시간가량 보관하여 용해시켰으며, 샘플은 도 4와 같이 유지하였다.

그런 다음, 본 발명에 따른 약물전달체의 생물학적 안전성을 평가하였다.

안전성 평가는 Invitro 세포독성시험 방식으로 수행하였으며, Invitro 세포독성시험은 시험물질이 세포의 배양환경 상에서 마우스의 섬유아세포(NCTC Clone 929)에 세포독성을 야기하는지 평가하기 위한 것이며, ISO 10993-5:2009 (Biological Evaluation of Medical Devices, Part 5: Tests for invitro의 항목에 따라 균일한 단층을 형성한 마우스의 섬유아세포 Cytotoxicity) Agar diffusion test 방식으로서 한천을 중층하고 시험물질을 중층 상에 직접 접촉시킨 후 시험물질로부터 한천을 통하여 확산되는 물질이 세포에 어떤 영향을 미치는지가 현미경상으로 관찰하고, Neutral의 생세포 염색의 반응성을 관찰하며, 또한 탈색된 영역 상에서 실제 세포의 용해가 얼마나 일어났는지도 현미경 상으로 관찰하는 방식이다.

이때, 검체는 샘플의 온도를 37℃까지 올려 겔화시킨 후 이를 평판위에 올려 놓고 수행하였다.

아울러, 사용할 세포주의 명칭은 NCTC Clone 929(L-929), 공급원:ATCC(American Type Culture Collection, USA)이었다.

또한, 배양조건 배양액 및 항생제는 10% Horse serum[Penicillin (100 Units/mL)/Streptomycin] Minimum Essential Medium(pH 7.4)이었고, 조건은 (5±1)% CO2, (37±1)℃에서 배양하여 3~4일마다 계대하였다.

시험방법은 단층 배양된 세포에 트립신을 처리하여 세포농도가 당(Trypsin/EDTA) 1 mL 105개가 되도록 조정하고 약 10㎠에 접종하였다.

그리고, 세포독성시험의 최종적 결과 판독은 다음의 ISO 10993-5, 8.5 Determination of cytotoxicity 에 따라 실시하였다.

시험에 있어 탈색의 상태와 용해의 정도는 표 2에서 나타내었다.

확인 결과, 시험물질이 투여된 세포에서 일부 세포의 용해는 관찰되었으나 중층상의 탈색은 관찰되지 않았고, 각 대조군에서도 세포 독성이 확인되지 않았다.

이를 통해, 본 발명에 따른 약물전달체는 생물학적 안전성을 확보하고 있음을 확인하였다.

덧붙여, 약물전달 성능을 평가하기 위해 Lidocaine의 피하투여(20 mg/kg) 후 Tissure distribution의 결과를 확인하였다.

투여 후 조직에서의 약물노출량(AUC)을 비교한 결과, 하기 표 3에서와 같이, 간에서의 유의적인 차이는 보였으나, 그 외 다른 조직과 유의적인 차이를 보이지 않았다.

이때, 각 Group별 투여용매 조성은 아래와 같으며, Group1의 투여양은 0.607 mL/kg, Group2의 투여량은 각각 0.506 mL/kg으로 실험이 진행되었으며, 실험기간 동안 동물(흰쥐) 상태는 양호하였고 특이사항은 없었다.

- Group 1 : HDC-3D (1 vial) 에 2% 리도카인염산염수화물 주사액 20 mL 을 섞은 혼합액

- Group 2 : 2% 리도카인염산염수화물 주사액

또한, 본 발명에 따른 약물전달체의 물성변화를 확인하기 위해 UTM(Universal Testing Machine)를 이용하여 온도감응성 하이드로겔의 온도변화에 따른 물성을 확인하였다.

상기 표 4에서와 같이, 상온에서는 압축에 따라 응력의 변화를 보이지 않거나 그 변화가 미비하였기에 액체 혹은 미비한 점성을 갖고 있음을 확인하였다. 그에 비해 체온과 유사한 온도에서의 압축에 따른 응력을 확인함에 따라 고체상 겔의 형성 및 이를 통한 물성강화를 확인하였다.

이를 통해, 온도감응성 하이드로겔의 체내 주입시 체내에서의 졸-젤 상전이 현상을 통한 고체상 겔로의 상변화 및 이를 통한 물성강화를 예측할 수 있었다.

마지막으로, 소동물 수준에서의 체내 주사에 따른 온도감응성 하이드로겔 형성 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다.

온도감응성 하이드로겔의 체내 주사에 따른 고체상 겔의 형성 및 이의 지속시간을 확인하기 위하여 온도감응성 하이드로 겔과 형광제인 로다민 B (Rhodamine B)의 혼합액의 소동물의 피하에 주입하였다.

이때, 단독 로다민 B 과 온도감응성 하이드로겔과 로다민 B 혼합액 모두 투약직 후에 투약에 따른 변화를 시각적으로 확인이 가능하였으나 단독 로다민 B는 온도감응성 하이드로겔과 로다민 B 혼합액에 비해 그 차이가 미비하였다.

아울러, 단독 로다민 B의 경우, 투약 1시간까지 투약에 따른 형태의 확인이 가능하였으나 이후 시간경과에 따른 약물의 체내흡수로 인해 그 형태의 확인이 어려웠다.

그에 비해, 온도감응성 하이드로겔과 로다민 B 혼합액의 경우, 투약 초기부터 투약에 따른 형태의 확인이 단독 로다민 B에 비해 확연하였으며 9시간까지 형태의 확인이 가능하였다.

이를 통해, 온도감응성 하이드로겔을 체내 주사에 따른 고체상의 겔의 형성 및 지속시간의 예측함과 동시에 단독 로다민 B에 비해서 오랜 지속시간을 통해서 약물과 혼합을 통해서 서방형의 약물방출형태를 보일 것으로 예측이 가능하였으며, 또한, 피하주사에 따른 주사부위에서의 염증반응으로 인한 변화를 보이지 않음에 따라 체내 주사에 따른 안정성 또한 예측할 수 있었다.

Claims

겔 형성용 중합체 배합단계와; 배합물에 약물전달물질을 첨가하는 혼합단계와; 혼합물을 여과한 후 바이알(Vial)에 충전하는 단계와; 충전된 바이알을 동결건조하는 단계;를 포함하는 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법에 있어서;
상기 겔 형성용 중합체 배합단계는 배합탱크에 플록사머 407(Poloxamer 407) 3200g과 주사용수 12L를 투입한 후 교반하면서 배합하는 단계로서, 배합조건은 칠링온도(Chilling Temp):2℃, 교반속도:80-250rpm, 교반시간:60-140분이고;
상기 배합물에 약물전달물질을 첨가하는 혼합단계는 소듐히알루로네이트(Sodium hyaluronate) 84.8g을 첨가한 후 주사용수를 첨가하여 배합탱크내 용량표시인 16L 표시선에 레벨을 맞춘 다음 혼합 교반하는 단계로서, 교반조건은 교반속도:150-250rpm, 교반시간:120-600분이며;
상기 바이알 충전단계는 필터 크기(Filter size) 10.0um, 여과시간 300분 동안 여과시킨 후 10g/총1368 vial의 바이알당 충전량으로 충전하는 단계이고;
상기 동결 건조조건은 -15 ~ -50℃에 이르는 냉동의 경우 60~120분에 걸쳐 이루어지도록 하고, -45 ~ 30℃까지의 건조는 -45℃에서 1분, -30℃에서 180-240분, -20℃에서 840분, 0℃에서 600분, 30℃에서 10분간 건조하도록 구성된 것을 특징으로 하는 온도감응형 하이드로겔을 이용한 서방성 약물전달체 제조방법.
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