KR102173569B1 - 아크릴산 생성능을 가지는 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 아크릴산의 제조방법 - Google Patents

아크릴산 생성능을 가지는 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 아크릴산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 및 베타 알라닐 조효소 에이 : 암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase) 유전자가 도입된 아크릴산 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용하여 아크릴산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

아크릴산 생성능을 가지는 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 아크릴산의 제조방법 {Recombinant Variant Microorganism Having Acrylic Acid Producing Ability and Method for Preparing Acrylic Acid Using the Same}
본 발명은 아크릴산 생성능을 가지는 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 아크릴산의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 베타 알라닌 (beta-alanine)을 베타 알라닐 조효소 에이 (beta-alanyl-CoA)로 전환하는 효소 및 베타 알라닐 조효소 에이 (beta-alanyl-CoA)를 아크릴 조효소 에이 (acrylyl-CoA)로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 아크릴산 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 아크릴산의 제조방법에 관한 것이다.
아크릴산 (acrylic acid)은 불포화지방산 (unsaturated carboxylic acid) 중 하나로써 플라스틱, 접착제 및 코팅제 등 다양한 산업용 제품 생산에 널리 사용되는 화학물질이다. 현재 대부분 석유화학기반의 프로필렌의 산화반응을 통해 생산되고 있다. 하지만 프로필렌을 통한 아크릴산 생산은 공정 과정 중 다량의 이산화탄소를 발생시키며, 프로필렌의 지속적인 가격상승, 가격변동성 때문에 재생 가능한 자원으로부터 바이오 기반 아크릴산 생산의 필요성이 증가하고 있다.
변이 미생물을 이용한 직접적인 아크릴산 생산은 대장균 내 글루코오스로부터 3-하이드록시프로피온산 (3-hydroxypropionic acid)을 전구체로 활용하여 이를 3-에이치피-조효소 에이 디하이라타아제 (3-HP-CoA dehyratase) 및 조효소 에이 하이드로라제 (CoA hydrolase)를 통해 아크릴산을 생산한 논문을 통해 보고된 바 있다 (Chu HS et al., Metab Eng., 32: 23-29, 2015).
그러나 베타 알라닌 (beta-alanine)을 이용한 아크릴산 생산은 아직 보고된 바 없다. 베타 알라닌 (beta-alanine)을 이용한 아크릴산 생산경로를 청구한 특허가 있지만 (US 2012/0149077 A1) 베타 알라닌 (beta-alanine)을 베타 알라닐 조효소 에이 (beta-alanyl-CoA)로 전환시키는 효소를 정확히 명시하지 않았으며, 미생물을 이용하여 아크릴산을 생산하는 대사회로 그림이 포함된 특허 (US 7846707 B2) (US 8043841 B2)가 있지만, 이 특허에서는 베타 알라닌 (beta-alanine)을 베타 알라닐 조효소 에이 (beta-alanyl-CoA)로 전환시키는 효소와 아크릴 조효소 에이 (acrylyl-CoA)를 아크릴산으로 전환시키는 효소를 명시하지 않았으며, 청구항 내 대사회로에 관한 내용이 명시되지 않았으며, 실제 아크릴산이 생산된 실시예를 보고하지 않았다.
이에, 본 발명자들은 생물학적인 경로를 통해 탄소원으로부터 아크릴산을 생산하는 미생물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 베타 알라닌 (beta-alanine)을 기질 (substrate)로 받아들여 시험관 내 (in vitro) 조건에서 아크릴산을 생산하는 효소들을 개발하였고, 베타 알라닌 (beta-alanine) 생산능을 가진 변이 미생물에 베타 알라닌 (beta-alanine)을 베타 알라닐 조효소 에이 (beta-alanyl-CoA)로 전환하는 효소, 및 베타 알라닐 조효소 에이 (beta-alanyl-CoA)를 아크릴 조효소 에이 (acrylyl-CoA)로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입한 변이 미생물을 이용할 경우 베타 알라닌 (beta-alanine)으로부터 아크릴산을 생산할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 아크릴산 생산능을 가지는 변이 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용한 아크릴산의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 베타 알라닌 (beta-alanine)으로부터 아크릴산을 시험관 내 (in vitro) 조건에서 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 베타 알라닌 (beta-alanine) 생성능을 가지는 미생물에 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 유전자 및 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)가 도입된, 아크릴산 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 변이 미생물을 배양하여 아크릴산을 생성하는 단계 및; (b) 상기 생성된 아크릴산을 회수하는 단계를 포함하는 아크릴산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 베타 알라닌 (beta-alanine)을 포함하는 반응용액에 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)와 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)를 혼합한 다음, 반응시켜 아크릴산을 제조하는 단계를 포함하는 시험관 내 (in vitro) 조건에서 베타 알라닌 (beta-alanine)으로부터 아크릴산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 변이 미생물을 이용하여 생물학적 방법으로 베타 알라닌 (beta-alanine)으로부터 아크릴산을 제조할 수 있다. 또한, 상기 변이 미생물의 추가적인 효소 개량을 통해 아크릴산 생산량을 증가시킬 수 있어, 아크릴산의 산업적 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 베타 알라닌 (beta-alanine)으로부터 아크릴산을 생성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
도 2는 글루코오스로부터 아크릴산 생산능을 가지는 변이 미생물의 대사회로를 제작하는 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)를 정제를 위해 6-히스티딘 태그(6-histidine tag)가 포함된 pET-30(a)+ 플라스미드에 구축한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)를 정제를 위해 6-히스티딘 태그 (6 histidine tag)가 포함된 pET-30(a)+ 플라스미드에 구축한 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)를 정제를 위해 6-히스티딘 태그 (6-histidine tag)가 포함된 pET-30(a)+ 플라스미드에 구축한 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 정제를 위한 SDS-PAGE 사진이다.
도 7은 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase) 정제를 위한 SDS-PAGE 사진이다.
도 8은 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase) 정제를 위한 SDS-PAGE 사진이다.
도 9는 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 효소를 이용하여 시험관 내 (in vitro) 조건에서 제조한 베타 알라닐 조효소 에이 (beta-alanyl-CoA) 분석 결과이다.
도 10은 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 및 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)를 이용하여 시험관 내 (in vitro) 조건에서 제조한 아크릴산의 분석 결과이다.
도 11은 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)를 미생물 내에서 발현하기 위해 제작한 act 유전자가 삽입된 pTrc99A act 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 12는 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 및 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)를 미생물 내에서 발현하기 위해 제작한 act 및 acl2 유전자가 삽입된 pTrc99A act acl2 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 13은 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase), 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase) 및 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)를 미생물 내에서 발현하기 위해 제작한 act, acl2 및 pct 유전자가 삽입된 pKYS1 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 14는 상기 플라스미드 벡터가 도입된 변이 미생물을 이용하여 제조한 아크릴산의 분석 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 및 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)를 이용해 베타 알라닌 (beta-alanine)으로부터 아크릴산을 생산할 수 있음을 확인하여, 이를 통해 생물학적인 방법으로 베타 알라닌 (beta-alanine)으로부터 아크릴산을 생산할 수 있는 시스템을 확립하였다 (도 1).
구체적으로, 본 발명에서는 베타 알라닌 (beta-alanine) 생산균주 (Song et al., Metab Eng., 30: 121-129, 2015)에 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)와 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)를 도입한 미생물을 이용하여 아크릴산 제조 가능성을 알아보는 실험을 수행하였다. 그 결과, 상기 효소가 도입된 미생물을 이용할 경우, 아크릴산이 생산됨을 확인하였다 (표 2).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 미생물 내에서 베타 알라닌 (beta-alanine)이 아크릴산으로 전환되는지 확인해보기 위해, 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)와 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase), 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)를 코딩하는 유전자 act, acl2 , pct가 클로닝된 pKYS1를 제작한 후 (도 13), 이를 베타 알라닌 (beta-alanine) 생산 균주에 도입하였다. 상기 변이 미생물을 탄소원이 포함된 배지에서 배양한 결과, 미생물 배양액에서 아크릴산이 생성되는 것을 확인할 수 있었다 (표 2).
따라서, 본 발명은 일 관점에서 베타 알라닌 (beta-alanine) 생성능을 가지는 미생물에 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 및 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase) 유전자가 도입된, 아크릴산 생성능을 가지는 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "아크릴산 (acrylic acid)"은 CH2=CHOCO2H의 조성을 가지는 유기 화합물을 의미하며, 프로프-2-에노익산 (prop-2-enoic acid) 등으로도 지칭된다. 본 발명의 변이 미생물은 탄소원으로부터 베타 알라닌 (beta-alanine) 생성능을 가지는 미생물에, 1) 베타 알라닌을 기질로하여 베타 알라닐 조효소 에이 (beta-alanyl coenzyme A)로 전환시키는 효소인 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 유전자, 및 2) 베타 알라닐 조효소 에이를 기질로 하여 아크릴 조효소 에이 (acrylyl coenzyme A)로 전환시키는 효소인 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase) 유전자를 도입한 것으로, 아크릴산 생성능을 가지는 것이다.
본 발명에서 상기 도입은 형질 전환에 의해 이루어질 수 있으며, "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입 후 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 상기 세포 내로 본 발명의 유전자를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법, 열 충격법 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 발명에서 용어, "변이 미생물"은 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명에 있어서, 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 유전자 및 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 유전자를 도입하여 아크릴산 생성능을 가지는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 상기 미생물은 예를 들면, 박테리아, 효모 또는 곰팡이일 수 있고, 구체적으로 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하는 미생물, 더욱 구체적으로 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미생물은 베타 알라닌 생성능을 가지는 미생물을 숙주세포로 하여, 상기 유전자들의 도입에 의해 아크릴산 생산을 생산할 수 있다. 상기 베타 알라닌 생성능을 가지는 미생물은 예를 들어, 본 발명의 실시예에서 사용한 CWF4NA pSynPPC7 균주 (Song et al., Metab Eng., 30: 121-129, 2015)일 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)는 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 유래의 act 유전자에 의해 코딩되는 효소일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 유래의 act 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 act 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제에 상응하는 효능을 나타내는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수 (score), 동일성 (identity) 및 유사도 (similarity) 등의 매개 변수 (parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다 (예: BLAST 2.0). 또한 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 확인함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)는 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 유래의 acl2 유전자에 의해 코딩되는 효소인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 유래의 acl2 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 acl2 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제에 상응하는 효능을 나타내는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 알라닌 (beta-alanine) 생성능을 가지는 미생물은 추가로 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase) 유전자가 도입된 것일 수 있다. 상기 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제는 아크릴 조효소 에이 (acrylyl coenzyme A)를 기질로 하여 아크릴산으로 전환시키는 효소를 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia Eutropha) 유래의 pct 유전자에 의해 코딩되는 효소인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia Eutropha) 유래의 pct 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 pct 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제에 상응하는 효능을 나타내는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있고, 더욱 구체적으로는 Trc 프로모터를 통해 강한 유전자 발현이 가능한 pTrc99A 플라스미드를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 알라닌 (beta-alanine) 생성능을 가지는 미생물은 추가로 아크릴일 조효소 에이 리덕테아제 (acrylyl-coA reductase) 유전자가 결실된 것일 수 있다. 상기 아크릴일 조효소 에이 리덕테아제는 아크릴 조효소 에이 (acrylyl coenzyme A)를 기질로 하여 프로피오닐 조효소 에이 (propionyl-CoA)로 전환하는 효소를 말하며, 이를 막아 아크릴산 생산을 증대시키기 위한 목적으로, 상기 유전자를 결실시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 유전자의 결실은, 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 것을 모두 포함할 수 있다. 이는 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이의 일례로 상동재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기에서 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300 개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100 개, 더욱 더 구체적으로는 1 내지 50 개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 대장균 (Escherichia coli) 유래의 acuI 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 acuI 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 아크릴일 조효소 에이 리덕테아제 (acrylyl-CoA reductase)에 상응하는 효능을 나타내는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 1 이상의 탄소원을 포함하는 배지에서 베타 알라닌 생성능을 가지는 것일 수 있다. 상기 배지에 포함되는 탄소원으로는 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스, 글리세롤, 프럭토오스, 몰라세, 전분, 셀룰로오스 및 슈가 케인 (sugar cane)을 개별적으로 사용하거나 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 변이 미생물을 배지에서 배양하여 아크릴산을 생성하는 단계 및; (b) 상기 생성된 아크릴산을 회수하는 단계를 포함하는 아크릴산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27 ℃ 내지 37 ℃, 구체적으로는 30 ℃ 내지 35 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생성된 아크릴산을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아크릴산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 아크릴산을 회수할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 베타 알라닌을 포함하는 반응용액에 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)와 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)를 혼합한 다음, 반응시켜 아크릴산이 시험관 내 (in vitro) 조건에서 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 아크릴산의 제조방법은 베타 알라닌을 포함하는 반응용액에 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase) 및 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)를 혼합한 다음, 반응시켜 아크릴산을 제조하는 단계를 포함하는 아크릴산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 반응용액은 추가로 아세틸 조효소 에이를 포함할 수 있으나, 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 효소가 베타 알라닌을 베타 알라닐 조효소 A로 전환시키는데 CoA를 제공할 수 있는 것이라면, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 아크릴산의 제조방법은 추가로 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)를 혼합 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)는 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 유래의 act 유전자에 의해 코딩되는 효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)는 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 유래의 acl2 유전자에 의해 코딩되는 효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia Eutropha) 유래의 pct 유전자에 의해 코딩되는 효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase), 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase) 및 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)는 전세포 효소 또는 부분정제된 효소로 분리되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta- alanine coenzyme A transferase) 클로닝 및 활성 확인
1-1: pET30a _his_act 벡터의 제작
클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) (ATCC 25522) 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5와 6의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, N-말단에 6-히스티딘 태그 (6-histidine tag)가 표지된 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)를 코딩하는 his-act 절편을 제작하였다.
[서열번호 5] pET30a-his tagged act (n-term) Fwd: tttaagaaggagatatacatatgAAAAGACCCTTGGAAGGTATTC
[서열번호 6] pET30a-his tagged act (n-term) Rev: gcggccgcaagcttgtcgacttaatgatgatgatgatggtgGATGACATTTTTCTCTTCCAG
다음으로, 상기 제조된 his-act 절편과 T7 프로모터를 통해 강한 유전자 발현이 가능한 pET30a 플라스미드 (Novagen, USA)를 제한효소 (NdeI 및 SalI)를 처리한 후, gibson assembly 반응을 통해 his-act 절편과 pET30a 플라스미드를 접합시켜, pET30a_his_act 발현 벡터를 제작하였다 (도 3).
1-2: 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta- alanine coenzyme A transferase)의 정제
베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)의 정제를 위해서 상기 실시예 1-1에서 수득한 플라스미드 pET30a_his_act를 대장균 BL21(DE3) (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 도입하였다. 상기 형질전환 균주들을 25 mg/L 카나마이신 (kanamycin)이 포함된 10 mL LB 액체 배지 (트립톤 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L)에 접종하여 37 ℃에서 200 rpm으로 지속적으로 흔들어주며 12 시간 동안 초기 배양하였다. 그 후, 상기와 같은 배지 400 mL에 상기 배양액의 1 %를 접종하여 37 ℃에서 200 rpm으로 지속적으로 흔들어주며 배양하였다. 그 후, 스펙트로포토미터로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.55~0.66에 다다랐을 때, 1 mM IPTG를 첨가하여 his_act 발현을 유도하였다. 발현 유도 3 시간 후에 배양액을 원심분리기 (Hanil Science Industrial, 한국)에서 3000 rpm, 4 ℃에서 10 분간 원심분리하여 미생물을 분리하였고, 상등액은 제거하였다. 그 후, 분리된 미생물을 평형 버퍼 (equilibrium buffer, 50 mM Na3PO4, 300 mM NaCl, pH 7.0) 35 mL에 혼합한 다음, 세포 소니케이터 (cell sonicator, Sonics & Materials, Inc., 미국)를 이용하여 30 %의 강도로 5 초간 펄스를 주고 5 초간 쉬는 방식으로 1 시간 반 동안 미생물을 파쇄하였다. 그 후 13200 rpm, 4 ℃에서 10 분간 원심분리를 하여 세포 잔해를 제거한 후 세포 파쇄액을 얻었다. 이러한 세포 파쇄액을 0.45 ㎛ 필터에 흘려주었다. 그 후 Talon resin (Clontech Laboratories, Inc., 미국)을 이용하여 his-tag이 달린 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)를 분리하였다. Talon resin에 붙은 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)의 분리는 각각 3.75, 7.5, 15, 22.5, 37.5, 75, 150 mM의 이미다졸 (imidazole)이 섞인 평형 버퍼를 이용하여 수행하였다. 그 후, 전체 세포 파쇄액, talon resins를 통과한 단백질 용액, 각 농도의 이미다졸 (imidazole)로 얻은 단백질 용액 각각을 모두 5x Laemmli 샘플 버퍼 (LPS Solution, 한국)와 섞은 샘플들을 12 % SDS-PAGE를 이용하여 분리하였고, Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad, 미국) 용액으로 염색하였다 (도 6).
그 결과, 15 mM의 이미다졸로 정제한 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)가 가장 순도가 높은 것을 확인하고 Amicon Ultra Centrifugal Filter (Merck Millipore, 독일)를 이용하여 50 mM 인산칼륨버퍼 (potassium phosphate buffer) (pH 7.5)를 흘려주어 버퍼를 교환하였다. 정제된 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)는 글리세롤 (glycerol)과 부피비 1 : 1로 섞어 -80 ℃에 보관하였다.
실시예 1-3. 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta- alanine coenzyme A transferase )의 효소 활성 분석
효소 활성 분석을 위해 10 mM의 베타 알라닌 (beta-alanine)과 1 mM의 아세틸 조효소 에이 (acetyl-CoA)를 1 mL의 50 mM 인산칼륨버퍼 (pH 7.5)에 녹인 후 정제한 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)를 15 ㎍만큼 첨가하였다. 반응은 37 ℃에서 5 시간 동안 진행하였다. 반응 혼합물에서 coenzyme A 유도체들만 분리하기 위하여 OASIS HLB SPE 카트리지 (Waters, 미국)를 이용하였고, 아래와 같은 프로토콜을 사용하였다.
처음 카트리지에 1 mL의 메탄올을 흘린 뒤, 2 mL의 0.15 % TCA 용액을 흘려준 뒤 반응혼합물을 흘려준 다음 다시 1 mL의 0.15 % TCA 용액을 흘려주었다.
마지막으로 메탄올과 암모니아수가 99 : 1 부피비로 섞인 용액을 1 mL 흘려서 정제된 조효소 에이 유도체들을 수득하였다. 그 뒤, 진공 원심분리기를 이용하여 용매를 제거하였고 -24 ℃에 샘플을 보관하였다. 이 샘플을 증류수에 녹여 HPLC-MS (Mass spectrometers: LC/MSD VL, Agilent, 미국, HPLC: Agilent, 미국) 또는 HPLC-MS/MS 분석 (Mass spectrometers: API3200QTRAP, SCIEX, 미국, HPLC: Shimadzu, 일본)으로 조효소 에이 유도체 분석을 하였다.
그 결과, 베타 알라닌 (beta-alanine)을 기질로 이용하여 진행한 반응 혼합물의 1 차 MS 분석 결과 GABA coenzyme A의 예상되는 m/z 값인 838.613와 비슷한 값인 837.7에서 피크를 확인하였고, 이 피크를 2 차 MS로 단편화 (fragmentation) 하여 분석한 결과 예상되는 피크인 m/z = 230, 332, 428과 비슷한 값인 230.2, 332.2, 427.8에서 피크가 확인되었다 (도 9).
이 결과로부터, 본 발명에 따라 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)가 성공적으로 베타 알라닌 (beta-alanine)을 베타 알라닐 조효소 에이 (beta-alanyl-CoA)로 전환시키는 것을 확인하였다.
실시예 2: 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA :ammonia lyase)의 클로닝 및 활성 확인
2-1. pET30a _his_ acl2 벡터의 제작
클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) (ATCC 25522)염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, N-말단에 6-히스티딘 태그 (6-histidine tag)가 표지된 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA :ammonia lyase)를 코딩하는 his-act 절편을 제작하였다.
[서열번호 7] pET30a-his tagged acl2 (n-term) Fwd: tttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcatGTAGGTAAAAAGGTTGTACATC
[서열번호 8] pET30a-his tagged acl2 (n-term) Rev: cggagctcgaattcggatccTTATTGAGGGTGCTTTGC
다음으로, 상기 제조된 his-act 절편과 T7 프로모터를 통해 강한 유전자 발현이 가능한 pET30a 플라스미드 (Novagen, USA)를 제한효소 (NdeI 및 SalI)를 처리한 후, gibson assembly 반응을 통해 his-acl2 절편과 pET30a 플라스미드를 접합시켜, pET30a_his_act를 제작하였다 (도 4).
2-2. 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta- alanyl - CoA :ammonia lyase)의 정제
베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)의 정제를 위해서 상기 실시예 2-1에서 수득한 플라스미드 pETa_his_acl2를 대장균 BL21(DE3) (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 도입하였다. 실시예 1-2에 기술된 방법으로 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA :ammonia lyase)를 정제하였다. 그 결과, 75 mM의 이미다졸로 정제한 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA :ammonia lyase)가 가장 순도가 높은 것을 확인하고 (도 7), Amicon Ultra Centrifugal Filter (Merck Millipore, 독일)를 이용하여 50 mM 인산칼륨버퍼 (potassium phosphate buffer) (pH 7.5)를 흘려주어 버퍼를 교환하였다. 정제한 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA :ammonia lyase)는 글리세롤 (glycerol)과 부피비 1 : 1로 섞어 -80 ℃에 보관하였다.
실시예 3. 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 ( Propioinate coenzyme A transferase ) 클로닝 및 활성 확인
3-1: pET30a _his_pct 벡터의 제작
랄스토니아 유트로파 (Ralstonia Eutropha) 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9와 10의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, N-말단에 6-히스티딘 태그 (6-histidine tag)가 달린 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)를 코딩하는 his-pct 절편을 제작하였다.
[서열번호 9] pet30a his pct (reh) Fwd: tttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcatAGAAAGGTTCCCATTA TTACC
[서열번호 10] pet30a his pct (reh) Rev: gcggccgcaagcttgtcgacTCAGGACTTCATTTCCTTC
다음으로, 상기 제조된 his-pct 절편과 T7 프로모터를 통해 강한 유전자 발현이 가능한 pET30a 플라스미드를 제한효소 (NdeI 및 SalI)를 처리한 후, gibson assembly 반응을 통해 his-pct 절편과 pET30a 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pET30a_his_pct를 제작하였다 (도 5).
3-2: 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)의 정제
프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)의 정제를 위해서 실시예 3-1에서 수득한 플라스미드 pETa_his_pct를 대장균 BL21(DE3) (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 도입하였다. 실시예 1-2에 기술된 방법으로 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)를 정제하였다. 그 결과, 3.75 mM의 이미다졸로 정제한 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)가 가장 순도가 높은 것을 확인하고 (도 8), Amicon Ultra Centrifugal Filter (Merck Millipore, 독일)를 이용하여 50 mM 인산칼륨버퍼 (potassium phosphate buffer) (pH 7.5)를 흘려주어 버퍼를 교환하였다. 정제한 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)는 글리세롤 (glycerol)과 부피비 1 : 1로 섞어 -80 ℃에 보관하였다.
실시예 4. 시험관 내 ( in vitro )에서 아크릴산 생산
실시예 1-2 및 2-2에서 정제한 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)(ACT), 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)(ACL2) 및 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)(PCT)를 이용하여 실시예 1-3의 방법을 이용하여, 하기 표 1에 개시된 조건으로 반응을 진행하였다. 이 때, 혼합하는 효소들은 몰수비 1 : 1 : 1 (각각 15 ㎍, 5.5 ㎍, 19.5 ㎍)로 혼합하였으며 5 시간 동안 37 ℃에서 반응을 진행한 후 HPLC를 통해 분석을 하였다.
그 결과, 표 1에 개시된 바와 같이 반응용액 그 자체와 반응용액에 ACT만 혼합하였을 경우 아크릴산이 전혀 생산되지 않는 것을 확인할 수 있었으며, ACL2를 추가로 넣었을 경우 37 mg/L의 아크릴산이 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 나아가, ACT 및 ACL2와 함께 PCT를 넣어줬을 경우 아크릴산 생산량이 53 mg/L로 증가하는 것을 확인하였다. 반응용액에 아세틸 조효소 에이(acetyl-CoA)가 첨가되지 않은 경우 아크릴산이 전혀 생산되지 않은 것을 확인하였다.
HPLC를 통해 측정한 아크릴산이 실제 아크릴산인지 확인하기 위해 LC MS를 통해 확인하였다 (도 10).
조건 변화에 따른 아크릴산 생산 (mg/L)
10mM 베타 알라닌(beta-alanine)
+1mM 아세틸 조효소 에이(acetyl-CoA)		 0
10mM 베타 알라닌(beta-alanine)
+1mM 아세틸 조효소 에이(acetyl-CoA) + ACT		 0
10mM 베타 알라닌(beta-alanine)
+1mM 아세틸 조효소 에이(acetyl-CoA) + ACT + ACL2		 37
10mM 베타 알라닌(beta-alanine)
+1mM 아세틸 조효소 에이(acetyl-CoA) + ACT + ACL2 + PCT		 53
10mM 베타 알라닌(beta-alanine) + ACT + ACL2 + PCT 0
실시예 5. 변이 미생물을 이용한 아크릴산 생산
5-1: pTrc99A act, pTrc99A act acl2 , 및 pKYS1 발현벡터의 제작
클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 균주와 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia Eutropha) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제 (beta-alanine coenzyme A transferase)를 코딩하는 act 절편을 제작하였고, 서열번호 13과 14의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제 (beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)를 코딩하는 acl2 절편을 제작하였다. 또한 서열번호 15와 16의 프라이머를 이용하여 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제 (propionate coenzyme A transferase)를 코딩하는 pct 절편을 제작하였다.
[서열번호 11] pKYS1aFwd : ctagcgaattcgagctcacaggaaacagaccATGAAAAGACCCTTGGAAG
[서열번호 12] pKYS1aRev : gcctgcaggtcgactctagaTTAGATGACATTTTTCTCTTCC
[서열번호 13] pKYS1a2Fwd : gagaaaaatgtcatctaatctagaacaggaaacagaccATGGTAGGTAAAAAGGTTGTAC
[서열번호 14] pKYS1a2Rev : gcttgcatgcctgcagTTATTGAGGGTGCTTTGC
[서열번호 15] pKYS1a2pFwd : caccctcaataactgcagacaggaaacagaccATGAAGGTGATCACCGCACG
[서열번호 16] pKYS1a2pRev : ccgccaaaacagccaagcttTTACAGGTGCAGGGGCCC
다음으로, 상기 제조한 act, acl2, pct 절편을 Trc 프로모터를 통해 강한 유전자 발현이 가능한 pTrc99A 플라스미드 (Pharmacia Biotech, Sweden)에 도입하여, act 발현 벡터, act 및 acl2 발현 벡터 및 act, acl2 및 pct 발현 벡터를 각각 제조하였다.
먼저 act 발현 벡터인 pTrc99A act는, pTrc99A 플라스미드를 제한효소 (SacI 및 kpnI)로 처리한 후, gibson assembly 반응을 통해 act 절편과 pTrc99A 플라스미드를 접합시켜 제조하였다 (도 11).
다음으로, act 및 acl2 발현 벡터인 pTrc99A act acl2는, 상기 pTrc99A act 플라스미드를 제한효소 (SacI 및 xbaI)로 처리한 후, gibson assembly 반응을 통해 acl2 절편과 pTrc99A act 플라스미드를 접합시켜 제조하였다 (도 12).
다음으로, act, acl2 및 pct 발현 벡터인 pKYS1은, 상기 pTrc99A 플라스미드를 제한효소 (SacI 및 HindIII)로 처리한 후, gibson assembly 반응을 통해 act, acl2, pct 절편과 pTrc99A 플라스미드를 접합시켜 제조하였다 (도 13).
5-2: 변이 미생물을 이용한 아크릴산 생산
아크릴 조효소 에이 (acrylyl-CoA)의 프로피오닐 조효소 에이 (propionyl-CoA)로 전환을 막기 위해 베타 알라닌 (beta-alanine) 생성능을 가지는 CWF4NA pSynPPC7 균주 (Song et al., Metab Eng., 30:121-129, 2015) 내 아크릴일 조효소 에이 리덕테아제 (acrylyl-coA reductase) 유전자를 결실시켜 KYS2 균주를 만들었다.
실시예 5-1에서 제작된 pTrc99A act 플라스미드, pTrc99A act acl2 플라스미드 및 pKYS1 플라스미드를 KYS2 균주에 각각 도입하였으며, KYS2 균주에 pTrc99A 플라스미드를 도입한 균주를 대조군 균주로 사용하였다.
실시예 5-1에서 제작된 각각의 플라스미드가 도입되어 있는 변이 미생물들을 엠피실린 (Ampicillin)이 50 mg/L 포함된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 50 mg/L엠피실린이 포함된 10 mL LB 액체 배지에 접종하여 37 ℃에서 200 rpm으로 지속적으로 흔들어주며 12 시간 동안 초기 배양하였다. 변형 MR배지 (pH 6.5)의 조성은 3 차 증류수 1 리터당 15 g 글루코오스, 9 g (NH4)2SO4, 6.67 g KH2PO4, 4.0 g (NH4)2HPO4, 2 g NaHCO3, 0.8 g 시트르산, 0.8 g MgSO4·7H2O, 0.01 g CaCl2·2H20, 5 mL trace metal solution (증류수 1 리터 당 10 g FeSO4·7H2O, 2.2 g ZnSO4·4H2O, 0.58 g MnSO4·4H2O, 1 g CuSO4·5H2O, 0.1 g (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0.02 g Na2B4O7·10H2O)의 성분으로 구성되어있다. 배양은 36 시간 동안 37 ℃와 220 rpm으로 작동하는 shaking incubator에서 진행하였다. 배양이 끝난 배양액은 10,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여, 상등액만을 채취하여 액체크로마토그래피 (liquid chromatography) 분석을 수행함으로써, 아크릴산의 생산을 측정하였다.
그 결과 하기 표 2에 나타난 바와 같이, pTrc99A만 도입된 균주와 act만 발현된 균주의 경우 아크릴산이 전혀 생산되지 않은 반면, act와 acl2를 도입한 경우 10 mg/L의 아크릴산이 생산되었다. 아울러, act, acl2와 함께 pct를 도입한 경우 아크릴산 생산량이 15 mg/L로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
HPLC를 통해 측정한 아크릴산이 실제 아크릴산인지 확인하기 위해 LC MS를 통해 확인하였다 (도 14).
조건 변화에 따른 아크릴산 생산 (mg/L)
KYS2 + pTrc99A 0
KYS2 + pTrc99A act 0
KYS2 + pTrc99A act acl2 10
KYS2 + pTrc99A act acl2 pct (pKYS1) 15
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Variant Microorganism Having Acrylic Acid Producing Ability and Method for Preparing Acrylic Acid Using the Same <130> KPA160001-KR <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> act gene <400> 1 atgaaaagac ccttggaagg tattcgtgta cttgatttaa cacaggctta cagtggcccc 60 ttttgtacaa tgaatcttgc tgatcatggt gctgaggtta ttaaaattga gcgccccggc 120 agtggagatc aaacaagagg ttgggggcct atggaaaatg actacagtgg ctactatgct 180 tacattaacc gtaataaaaa aggaatcacc ttaaatcttg cttccgaaga aggaaagaaa 240 gtttttgccg aattggttaa atctgccgat gtgatttgcg aaaactataa ggttggtgtt 300 ttagaaaaat taggcttttc ctatgaggtc ttaaaagaac tcaacccccg catcatttat 360 ggctccatca gcggttttgg attaacaggt gaattgtcct cccgcccctg ctatgatatc 420 gtcgctcaag caatgagcgg aatgatgagt gtaaccggct ttgcagacgg tcctccctgc 480 aaaatcggcc cttctgtagg agatagctat actggtgcat atttgtgcat gggtgttttg 540 atggcattat acgaaagaga aaaaacaggc gttggccgcc gtatcgatgt gggaatggta 600 gataccctgt tctctacaat ggaaaacttt gttgttgaat acaccattgc tggtaagcat 660 ccccaccgtg caggcaatca agatccaagt attgcccctt ttgactcctt tagggcaaaa 720 gattcggatt ttgtaatggg gtgtggcaca aacaaaatgt ttgcaggact atgtaaagca 780 atgggcagag aggatttgat tgatgatcct cgtttcaata caaacctgaa tcgttgtgat 840 aactatttaa atgacttaaa gccaatcatc gaagaatgga cccaaacaaa gaccgttgca 900 gagttagagg aaatcatctg cggactttcc attcccttcg gcccaatcct cacgattccc 960 gagatttctg agcattcctt aacaaaagaa agaaatatgc tttgggaagt ttatcagcct 1020 ggcatggata gaacaattcg cattcccggc tcccctatta aaatccacgg tgaagaagat 1080 aaggctcaga aaggtgcccc tattctggga gaagacaatt ttgctgtcta cgcagaaatt 1140 ttaggtctct cagtagaaga aattaaatca ctggaagaga aaaatgtcat ctaa 1194 <210> 2 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acl2 gene <400> 2 atggtaggta aaaaggttgt acatcattta atgatgagcg caaaagacgc tcactatact 60 ggtaacttag taaacggcgc tagaatcgtg aatcagtggg gcgacgtagg tacagaatta 120 atggtttatg ttgatggtga catcagctta ttcttgggct acaaagatat cgaattcaca 180 gctcctgtat atgttggtga ttttatggaa taccacggct ggattgaaaa agttggcaac 240 cagtcctata catgtaaatt tgaagcatgg aaagtagcaa agatggttga tatcacaaat 300 ccacaggata cacgtgcaac agcttgtgaa cctccggtac tttgtggtac tgcaacaggc 360 agccttttca tcgcaaagga taatcagaga ggtcctcagg aatcttcctt caaggatgca 420 aagcaccctc aataa 435 <210> 3 <211> 1629 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pct gene <400> 3 atgaaggtga tcaccgcacg cgaagcggcg gcactggtgc aggacggctg gaccgtggcc 60 agcgcgggct ttgtcggcgc cggccatgcc gaggccgtga ccgaggcgct ggagcagcgc 120 ttcctgcaga gcgggctgcc gcgcgacctg acgctggtgt actcggccgg gcagggcgac 180 cgcggcgcgc gcggcgtgaa ccacttcggc aatgccggca tgaccgccag catcgtcggc 240 ggccactggc gctcggccac gcggctggcc acgctggcca tggccgagca gtgcgagggc 300 tacaacctgc cgcagggcgt gctgacgcac ctataccgcg ccatcgccgg cggcaagccc 360 ggcgtgatga ccaagatcgg cctgcacacc ttcgtcgacc cgcgcaccgc gcaggatgcg 420 cgctaccacg gcggcgccgt caacgagcgc gcgcgccagg ccattgccga gggcaaggca 480 tgctgggtcg atgcggtcga cttccgcggc gacgaatacc tgttctaccc gagcttcccg 540 atccactgcg cgctgatccg ctgcaccgcg gccgacgccc gcggcaacct cagcacccat 600 cgcgaagcct tccaccatga gctgctggcg atggcgcagg cggcccacaa ctcgggcggc 660 atcgtgatcg cgcaggtgga aagcctggtc gaccaccacg agatcctgca ggccatccac 720 gtgcccggca tcctggtcga ctacgtggtg gtctgcgaca accccgccaa ccaccagatg 780 acgtttgccg agtcctacaa cccggcctac gtgacgccat ggcaaggcga ggcagcggtg 840 gccgaagcgg aagcggcgcc ggtggctgcc ggcccgctcg acgcgcgcac catcgtgcag 900 cgccgtgcgg tgatggaact ggcgcgccgt gcgccgcgcg tggtcaacct gggcgtgggc 960 atgccggcag cggtcggcat gctggcgcac caggccgggc tggacggctt cacgctgacc 1020 gtcgaggccg gccccatcgg cggcacgccc gcggatggcc tcagcttcgg tgcctcggcc 1080 tacccggagg cggtggtgga tcagcccgcg cagttcgatt tctacgaggg cggcggcatc 1140 gacctggcca tcctcggcct ggccgagctg gatggccacg gcaacgtcaa tgtcagcaag 1200 ttcggcgaag gcgagggcgc atcgattgcc ggcgtcggcg gctttatcaa catcacgcag 1260 agcgcgcgcg cggtggtgtt catgggcacg ctgacggcgg gcgggctgga agtccgcgcc 1320 ggcgacggcg gcctgcagat cgtgcgcgaa ggccgcgtga agaagatcgt gcctgaggtg 1380 tcgcacctga gcttcaacgg gccctatgtg gcgtcgctcg gcatcccggt gctgtacatc 1440 accgagcgcg cggtgttcga gatgcgcgct ggcgcagacg gcgaagcccg cctcacgctg 1500 gtcgagatcg cccccggcgt ggacctgcag cgcgacgtgc tcgaccagtg ctcgacgccc 1560 atcgccgttg cgcaggacct gcgcgaaatg gatgcgcggc tgttccaggc cgggcccctg 1620 cacctgtaa 1629 <210> 4 <211> 975 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acuI gene <400> 4 atgcaggcgt tacttttaga acagcaggac ggcaaaactc tcgcatcagt acagactctg 60 gacgaaagtc gcctgccgga gggcgatgtc acggtcgatg ttcactggtc gagcctgaac 120 tataaagatg cgctggcgat taccggtaag ggaaaaatca tccgtaattt tccgatgatt 180 cctgggatcg attttgccgg aactgtacgc accagcgaag atccgcgttt tcatgccggt 240 caggaggtgt tactcactgg ctggggcgtt ggtgaaaacc actggggtgg gctggcggag 300 caggcgcgag tgaaaggtga ctggctggtt gccatgccgc aagggctgga cgcgcgtaaa 360 gcaatgatta tcggtactgc cggttttacc gccatgctgt gtgtgatggc gctggaagat 420 gccggtgttc gcccgcagga cggggagatt gtcgtgacgg gtgccagtgg tggcgtcggc 480 agtaccgccg tggcgctgct gcataagttg ggttatcagg tcgttgccgt ttccggtcgc 540 gaaagtaccc atgaatatct gaaaagttta ggtgctagcc gtgttctccc tcgtgatgag 600 tttgccgaat cccgtcctct ggaaaaacaa gtctgggctg gggcaattga caccgttggc 660 gacaaagtgc tggcaaaagt gctggcgcaa atgaattacg gcggctgcgt ggcggcctgt 720 ggtctggcgg gtggttttac tctgccaacc acggtcatgc catttattct gcgtaatgtc 780 cgtttgcaag gggtggattc agtaatgacg ccaccagaac gccgcgcaca agcctggcag 840 cgactggtcg ccgatttacc ggaatcattc tatacccagg cggcaaaaga gatatctctg 900 tcagaggcac cgaactttgc cgaggccatc attaataacc agatccaggg tcgcacgctg 960 gtgaaggtta actaa 975 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET30a-his tagged act(n-term) Fwd <400> 5 tttaagaagg agatatacat atgaaaagac ccttggaagg tattc 45 <210> 6 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET30a-his tagged act(n-term) Rev <400> 6 gcggccgcaa gcttgtcgac ttaatgatga tgatgatggt ggatgacatt tttctcttcc 60 ag 62 <210> 7 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET30a-his tagged acl2(n-term) Fwd <400> 7 tttaagaagg agatatacat atgcaccatc atcatcatca tgtaggtaaa aaggttgtac 60 atc 63 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET30a-his tagged acl2(n-term) Rev <400> 8 cggagctcga attcggatcc ttattgaggg tgctttgc 38 <210> 9 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET30a-his tagged pct(reh) Fwd <400> 9 tttaagaagg agatatacat atgcaccatc atcatcatca tagaaaggtt cccattatta 60 cc 62 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET30a-his tagged pct(reh) Rev <400> 10 gcggccgcaa gcttgtcgac tcaggacttc atttccttc 39 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKYS1a Fwd <400> 11 ctagcgaatt cgagctcaca ggaaacagac catgaaaaga cccttggaag 50 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKYS1a Rev <400> 12 gcctgcaggt cgactctaga ttagatgaca tttttctctt cc 42 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKYS1a2 Fwd <400> 13 gagaaaaatg tcatctaatc tagaacagga aacagaccat ggtaggtaaa aaggttgtac 60 60 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKYS1a2 Rev <400> 14 gcttgcatgc ctgcagttat tgagggtgct ttgc 34 <210> 15 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKYS1a2p Fwd <400> 15 caccctcaat aactgcagac aggaaacaga ccatgaaggt gatcaccgca cg 52 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKYS1a2p Rev <400> 16 ccgccaaaac agccaagctt ttacaggtgc aggggccc 38

Claims (17)

  1. 베타 알라닌 생성능을 가지는 미생물에 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제(beta-alanine coenzyme A transferase) act 유전자, 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제(beta-alanyl-CoA:ammonia lyase) acl2 유전자 및 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제(propionate coenzyme A transferase) pct 유전자가 도입된, 아크릴산 생성능을 가지는 변이 미생물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 추가로 아크릴일 조효소 에이 리덕테아제(acrylyl-coA reductase) 유전자가 결실된, 변이 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제(beta-alanine coenzyme A transferase) act 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 유래인 것인, 변이 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제(beta-alanyl-CoA:ammonia lyase) acl2 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 유래인 것인, 변이 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제(propionate coenzyme A transferase) pct 유전자는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia Eutropha) 유래인 것인, 변이 미생물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 아크릴일 조효소 에이 리덕테아제(acrylyl-coA reductase) 유전자는 대장균 (Escherichia coli) 유래 acuI 유전자인 것인, 변이 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것인, 변이 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스, 글리세롤, 프럭토오스, 몰라세, 전분, 셀룰로오스 및 슈가 케인(sugar cane)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 탄소원을 포함하는 배지에서 베타 알라닌 생성능을 가지는 것인, 변이 미생물.
  10. 다음 단계를 포함하는 아크릴산의 제조방법:
    (a) 제1항 및 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이 미생물을 배지에서 배양하여 아크릴산을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 아크릴산을 회수하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배지는 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스, 글리세롤, 프럭토오스, 몰라세, 전분, 셀룰로오스 및 슈가 케인(sugar cane)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 탄소원을 포함하는 것인, 아크릴산의 제조방법.
  12. 베타 알라닌을 포함하는 반응용액에 act 유전자에 의해 코딩되는 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제(beta-alanine coenzyme A transferase), acl2 유전자에 의해 코딩되는 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제(beta-alanyl-CoA:ammonia lyase) 및 pct 유전자에 의해 코딩되는 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제(propionate coenzyme A transferase)를 혼합한 다음, 반응시켜 아크릴산을 제조하는 단계를 포함하는 아크릴산의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 반응용액은 추가로 아세틸 조효소 에이를 포함하는 것인, 제조방법.
  14. 삭제
  15. 제12항에 있어서, 상기 베타 알라닌 조효소 에이 트랜스퍼라제(beta-alanine coenzyme A transferase) act 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래인 것인, 아크릴산의 제조방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 베타 알라닐 조효소 에이:암모니아리아제(beta-alanyl-CoA:ammonia lyase)acl2 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum) 유래인 것인, 아크릴산의 제조방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 프로피오네이트 조효소 에이 트랜스퍼라제(propionate coenzyme A transferase) pct 유전자는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia Eutropha) 유래인 것인, 아크릴산의 제조방법.
KR1020160005941A 2016-01-18 2016-01-18 아크릴산 생성능을 가지는 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 아크릴산의 제조방법 KR102173569B1 (ko)

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