KR102164058B1 - 텔로머라제로부터 유래된 보편적 암 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 텔로머라제 역전사효소로부터 유래되고 (i) HLA 클래스 II와 결합할 수 있고 (ii) CD4 Th 반응을 자극할 수 있는 아미노산 15개 내지 20개의 펩티드에 관한 것이다. 이들 보편적 암 펩티드는 특히 항종양 면역요법 및 면역모니터링에 유용하다.

Description

텔로머라제로부터 유래된 보편적 암 펩티드{UNIVERSAL CANCER PEPTIDES DERIVED FROM TELOMERASE}
본 발명은 텔로머라제로부터 유래하는 에피토프 펩티드에 관한 것이다. 이들 펩티드는 가장 일반적으로 발견되는 MHC(주요 조직적합성 복합체) 클래스 II 대립분자(allele)와 결합하는 보편적 암 펩티드(UCP)이다. 본 발명의 펩티드는 CD4 Th 반응을 자극할 수 있다. 이들 보편적 암 펩티드는 특히 항종양 면역요법 및 면역 모니터링에 유용하다.
최근에 임상실습에 도입되는 면역요법(Kantoff et al, Robert et al)은 암 예후 및 화학요법 효과에 미치는 면역반응의 영향이 강조되었다. CD8 T 세포(CTL)는 종양 관련 항원(TAA)을 발현하는 종양 세포에 대해 세포독성 활성을 나타내기 때문에 이들 CTL이 항종양 반응에 관여하는 후천성 면역세포중에서도 주동세포로 간주되어 왔다. 그러나, 현재로서는 CD4 T 헬퍼 1(Th1) 림프구도 항종양 반응을 일으키는데 중요한 역할을 담당하고 있음은 분명하다. 주된 특징이 INF-γ의 생성으로 나타나는 CD4 Th1 림프구는 많은 상호작용을 통해 종양에 대항하도록 조력하는 CD8 T 세포의 유도 및 유지에 중요한 역할을 한다(Shedlock et al). 또한, CD4 Th1 세포는 자연살해세포 및 대식세포와 같은 선천성 면역세포를 모집하고 활성화함으로써 CD8 T 세포와는 독립적으로 항종양 활성을 발현할 수 있다(Kennedy et al, Perez-Diez et al). 또한, CD4 Th1 세포에 의해 분비되는 IFN-γ는 직접적인 항종양 또는 항혈관신생 효과를 중재한다(Street et al). 또한, 암이 진행되는 과정에서 CD4 Th1 세포가 새로운 차원의 역할을 한다는 보고가 있다. 즉, CD4 T 세포가 종양 부위(Bos et al) 또는 감염된 점막(Nakanishi et al)에 살해 T-세포가 유입되도록 길을 열어주어야 하는 것으로 제시되어 왔다. 게다가, 마우스 종양 모델에 따르면 CD4 Th1 세포는 세포노화와 신생혈관생성 억제를 유도하는데 반드시 필요하며 그 결과로 MYC 또는 BCR-ABL 발암유전자를 불활성화하여 지속적인 종양 퇴행을 일으킨다(Rakhra et al). 인간에 있어서, 고밀도의 종양-침윤 CD4 Th1 세포는 양호한 직장암 진단 마커로 제시되어 왔다(Tosolini et al). 따라서, CD4 Th1 세포를 자극하는 것은 항종양 반응을 촉진시키는데 중요하다. 최근에 통상적인 화학요법의 효과에 치료전 면역지표들이 영향을 미친다는 점이 속속 드러나고 있음에도 불구하고(Fridman et al, Zitvogel et al), 종양-특이적 CD4 Th1 면역성과 화학요법 효과사이의 상관관계에 대해서는 밝혀진 것이 거의 없다.
CD4 Th 세포는 MHC 클래스 II 분자에 의해 제시되는 15 내지 20개 아미노산의 펩티드를 인식한다. 인간의 MHC 분자는 보통 HLA(인간 백혈구 연관 항원) 분자로 언급된다. HLA 분자는 2가지 주요 클래스가 있는데 HLA 클래스 I과 HLA 클랜스 II이다. HLA 클래스 I 분자는 주로 CD8+ 세포독성 T 세포를 활성화시키는 반면, HLA 클래스 II 분자는 주로 CD4 T 세포를 활성화시킨다. HLA 클래스 II 분자는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP인 3개의 다른 아유전자좌(subloci)에 의해 인코딩된다. 그러나, 흔히 암 연구에서 서술되는 CD4 T 세포 반응은 HLA-DR 아유전자좌에 의해 인코딩된 HLA 클래스 II 분자에 한정된다. 다수의 HLA 클래스 II 분자와 결합할 수 있는 관련 TAA의 축퇴성 펩티드의 동정은 암백신을 개선하고 CD4 T 세포 면역성의 모니터링을 이끌 수 있다. 과거 수년간 여러 연구진들은 항암 면역요법을 개선하는데 사용할 목적으로 TAA로부터 CD4 T 세포 에피토프를 개발하는데 역점을 두어 왔다(Kobayashi et al, 2008, Campi et al,2003, Kobayashi et al, 2000). 그러나, TAA로부터 HLA 클래스 II 에피토프를 동정하는 것은 그들의 중대한 이질성때문에 한계가 있다. 실제로, HLA 클래스 II 유전자좌는 상당한 다형성을 보이고 많은 변이체를 가짐에 따라, HLA-DR의 많은 대립 변이체와 결합할 수 있는 펩티드를 찾는 일은 매우 힘든 작업이다.
최근에 텔로머라제 단백질이 세포 노화 방지에 역할을 한다는 추정에 따라 관심이 집중되었다. 텔로머라제는 분열 세포에서 텔로미어의 길이를 유지해 주며 이 효소의 과발현은 악성 세포가 텔로미어-의존 세포 사멸을 회피하기 위해 발생시킨 주된 기전이다(Martinez et al). 따라서, 텔로머라제 활성은 줄기세포-유사 종양 세포를 포함한 모든 피연구 암형태에서 관찰되었고, 이에 텔로머라제 활성은 암세포의 전형적인 특징이다(Hanahan et al). 그러므로, 텔로머라제는 보편적 TAA를 위한 좋은 전형이 될 것으로 보인다. 이러한 측면에서, 텔로머라제-유래된 CD4 펩티드는 암 면역요법을 개발하는데 아주 유용한 도구가 될 수 있을 것이다.
국제특허출원 WO98/14593에는 인간 텔로머라제 단백질의 아미노산 서열이 개시되어 있고, 또한 이 단백질 및 이의 특정 단편들의 능동면역요법을 위한 용도가 제시되고 있다.
Schroers 등은 이전에 TERT-유래된 불규칙한 HLA-DR 제한된 펩티드를 공개한 바 있다(Schroers et al, 2002 및 2003). 그러나, 세포중재성 종양 면역에 대한 그들의 역할은 전임상 모델 또는 임상 단계 어디에서도 전혀 다루어지지 않았다. 근래에, TERT-유래된 CD4 헬퍼 펩티드를 사용한 암백신이 화학요법과 병용되었을 때 암환자의 생존기간 증가와 관련이 있을 수 있는 CD4 T 특이면역을 자극할 수 있었다(Kyte et al, 2011; Schlapbach et al, 2011). 그럼에도 불구하고, GV1001 백신 또한 다른 암에서 특이면역반응과 임상효과를 유도하지는 못했다(Scardino et al, 2002). 비록 이 펩티드가 CTL 에피토프 근처에 모여드는 것으로 생각되지만, GV-1001-특이 CD4 T 세포 조력이 항종양 CTL 반응에 미치는 영향은 지금까지 연구된 바가 없다.
본 발명은 광범위한 HLA 클래스 II 분자와 결합할 수 있는 새로운 인간 TERT(텔로머라제 역전사효소) 단편의 개발 및 종양과 같이 CD4 또는 CD8 T 세포 반응을 자극할 필요가 있는 질병의 치료를 위한 상기 hTERT 단편의 용도를 기초로 한다.
본 발명은 hTERT로부터 유래된 새로운 보편적 HLA 클래스 II 펩티드를 제공하며, 이들은 보편적 암 펩티드(UCP)로 지칭된다. 이들 UCP는 가장 일반적으로 발견되는 HLA-DR 대립분자뿐만 아니라 HLA-DQ 및 HLA-DP 대립분자와도 결합할 수 있고 CD4 Th("헬퍼") 반응을 자극할 수 있다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 관점은 인간 텔로머라제 역전사효소로부터 유래되는 15 내지 20개 아미노산의 펩티드이며, 이 펩티드는 (i) HLA 클래스 II와 결합할 수 있고 (ii) CD4 Th 반응을 자극할 수 있다.
가장 바람직한 양태로서, 본 발명의 펩티드는 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 아미노산 서열로 구성된다:
- KSVWSKLQSIGIRQH(서열번호 1);
- GTAFVQMPAHGLFPW(서열번호 2);
- SLCYSILKAKNAGMS(서열번호 3);
- PAAFRALVAQCLVCV(서열번호 4);
- 단백질분해에 대해 내성을 증가시키는 임의의 화학적 개질에 의해 서열번호 1, 2, 3 또는 4로부터 유래된 펩티드; 및
- 아미노산 1개 이상의 치환, 바람직하게는 보존치환 또는 펩티드의 면역원성을 증가시키는 치환에 의해 서열번호 1, 2, 3 또는 4로부터 유래된 실질적 상동성 펩티드.
또한, 본 발명은 상기 정의된 펩티드 서열 중에서 2개 이상, 바람직하게는 3개, 더 바람직하게는 4개 이상의 상이한 펩티드 서열을 포함하고 이들 펩티드 서열은 임의로 아미노산 스페이서(spacer)에 의해 분리되어 있는, 아미노산 160개 미만, 바람직하게는 120개 미만의 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3 및 4를 임의의 순서로 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 i) 상기된 펩티드 1개 이상 또는 상기된 아미노산 160개 또는 120개 미만의 폴리펩티드 서열을 포함하고, ii) CD8 에피토프 펩티드를 포함하는 아미노산 300개 미만, 바람직하게는 200개 미만의 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산을 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 펩티드들의 조합물, 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3 및 4의 펩티드 4종의 조합물 또는 상기 펩티드를 인코딩하는 핵산의 조합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
특정 양태로서, 본 발명의 조성물은 면역원성 항종양 항원 또는 면역원성 바이러스, 박테리아 또는 기생충 항원을 추가로 포함하는 백신 조성물이다.
본 발명은 또한 환자에게 CD4 또는 CD8 T 세포 반응을 자극하는데 사용하거나 환자, 바람직하게는 인간 환자의 종양 또는 감염증을 치료하는데 사용하는 상기 정의된 약학 조성물에 관한 것이다.
특정 양태로서, 종양은 암이며, 예를 들면 만성 림프성백혈병, 만성 골수성백혈병, 다발성골수종, 악성골수종, 호지킨병, 흑색종, 뇌종양(예, 교모세포종, 신경모세포종 및 성상세포종), 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 두경부암 및 위암으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 암이다. 바람직한 양태로서, 종양은 바이러스에 의해 유발된 암, 예를 들면 자궁경부암이다.
본 발명의 다른 관점은 1개 이상의 HLA 클래스 II 분자, 바람직하게는 비오티닐화된 HLA 클래스 II 분자에 결합된 상기 정의된 펩티드 1개 이상을 포함하는 컨쥬게이트(conjugate)이다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 정의된 펩티드 4개 이상이 결합되어 있는 비오티닐화된 HLA 클래스 II 분자 4개 이상을 포함하고, 상기 4개 이상의 비오티닐화된 HLA 클래스 II 분자들은 임의로 검출가능하게 표지된 아비딘 분자를 통해 서로 연결되어 있는 상기 정의된 컨쥬게이트이다.
이러한 펩티드 또는 컨쥬게이트들은 또한 종양 보유 환자로부터 종양-특이적 T 세포 반응을 생체내, 생체외 및 시험관내 평가하는데 유용하다.
또한, 본 발명은 환자의 생물학적 시료를 상기 정의된 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계를 포함하여, 상기 환자로부터 항-텔로머라제 CD4 T 세포 반응을 검출 또는 모니터링하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
바람직한 양태로서, 상기 환자는 CD4 또는 CD8 T 세포 상승 치료법을 필요로 하며, 바람직하게는 상기 환자는 종양을 갖고 있거나 텔로머라제-발현 세포를 감염시키는 바이러스로 감염되어 있다.
다른 바람직한 양태로서, 상기된 방법은 환자가 한 가지 치료법을 필요로 하는지 아니면 조정된 치료법을 필요로 하는지를 결정 또는 모니터링하거나, 환자의 결과를 예측하거나, 치료에 대한 반응을 모니터링하는데 유용하다.
도 1: 건강한 기증자로부터 수득된 UCP-특이적 T 세포주.
4종 UCP의 조합물로 건강한 기증자를 3회 자극한 후 그들 기증자의 PBMC로부터 CD4 T 세포주를 수득하고 ELISPOT에 의해 IFN-γ-생성 CD4 T 세포를 평가하였다. (A) 건강한 기증자 6명의 각 UCP에 대한 반응을 보여준다. (B) UCP-특이적 T 세포주가 항-HLA 클래스 I(W6.32), HLA-DR(L243) 또는 HLA-DP(B7/21) 차단 항체의 존재하에 관련 펩티드로 자극되었다. (C) 다양한 HLA-DR 유전자형을 갖는 건강한 기증자 3명의 각 UCP에 대한 반응을 보여준다.
도 2: UCP-특이적 CD4 T 세포 클론들의 기능상 특성화.
T 세포 클론은 UCP의 풀로 1회 자극된 암환자 T 세포주의 한계희석에 의해 수득되었다. (A 및 C) TNF-생성 T 세포의 비율 및 관련 UCP 10 μM에 반응한 환자 GE001로부터 분리된 T 세포 클론의 비율; 105 T 세포를 브레펠딘 A의 존재하에 5시간 배양하고, CD4 항체로 염색한 다음, 고정하고, 투과화 완충액중에서 항-TNF 항체로 염색하였다; 이어서, 104 T 세포를 유세포분석기로 분석하였0다. (B 및 D) 관련 UCP에 반응한 CD4 T 세포 클론의 반응성을 보여준다. CD4 T 세포 클론이 표시된 범위의 펩티드 농도와 함께 배양되었다. TNF 분비는 유세포분석기에 의해 브레펠딘 A의 존재하에서 5시간 평가되었다. (E) UCP4 10 μM에 반응한 GE001.36 T 세포 클론에 의해 생성된 사이토카인을 인간 10-플렉스 사이토카인 검정법으로 검정한 결과를 보여준다.
도 3: 전이성 NSCLC 환자에서의 천연 UCP 특이적 반응.
(A) NSCLC 환자 84명 및 대조군으로 건강한 기증자 22명에 대하여 자연발생 UCP 특이적-T 세포반응을 평가한 결과이다. 4종 UCP의 혼합물로 단시간(1주) 자극 후 IFN-γ ELISPOT 검정법으로 특이적-T 세포의 존재를 검출하였다. 배경을 공제한 특이적 IFN-γ 스팟이 그 결과이다. IFN-γ 스팟이 >10이고 배경에 2배이상인 경우가 양성 반응이다.
(B) NSCLC 환자 12명에서의 각 UCP-특이적 T 세포반응의 빈도를 보여준다.
(C)NSCLC 환자 8명에 대한 1주일간의 시험관내 자극 후 UCP 대 바이러스-특이적 면역반응의 그래프이다.
(D) UCP-특이적 면역 상태에 따른 환자에서의 호중구 대 림프구 비율(NLR)의 기준값 및 CD4+ Foxp3+ T 세포 빈도를 보여준다.
도 4: 전이성 NSCLC 환자에서의 자연발생 UCP CD4 T 세포반응의 영향.
(A) 진행성 질병(PD) 환자 또는 통제성 질병(CD) 환자에서의 UCP 반응자 및 무반응자 빈도
(B) CD 환자의 전체생존율(OS)의 카플란마이어 추정치
(C) CD 환자의 무진행 생존율(PFS)의 카플란마이어 추정치
(D) 백금계 일차 화학요법으로 치료받은 CD 환자의 OS의 카플란마이어 추정치
(E) 백금계 일차 화학요법으로 치료받은 CD 환자의 PFS의 카플란마이어 추정치.
도 5: UCP 백신화가 고 결합활성 Th1 분극된 CD4 T 세포 반응을 자극한다.
(A-B), A2/DR1 마우스(n=8)가 TERT를 인코딩하는 DNA로 2회 면역화되었다.
(A), UCP의 존재하에서 비장 림프구의 증식
(B), DNA-면역화 마우스로부터의 CD8 결핍형 비장 림프구가 생체외 IFN-γ ELISPOT에 의해 검정되었다. 컬럼=매회 마우스 4마리를 이용한 3회의 평균; 막대=SD.
(C-D), 마우스(3-4/군)가 IFA 중의 각 UCP로 1회 면역화되었다.
(C), 10일 경과하여, 비장-분리된 CD4 T 세포가 UCP 처리된 DC의 존재하에서 밤새 배양되었다. 상층액에서 사이토카인 생성이 루미넥스 검정법에 의해 측정되었다. 컬럼=사이토카인의 평균량; 막대=SD.
(D), 분리된 CD4 T 세포가 표기된 바와 같이 펩티드 농도를 높이면서 생체외 배양되었다. IFN-γ 생성량은 ELISPOT에 의해 측정되었다. 곡선=3마리 마우스로부터의 평균 반응; 막대=SD.
(E), 마우스가 표기된 저용량의 UCP로 1회 백신화되었다. UCP-특이적 T 세포반응은 생체외 IFN-γ ELISPOT에 의해 비장에서 평가되었다.
도 6: 자가/TERT-특이적 CTL 반응에 대한 UCP 백신화의 CD4 헬퍼 역할
마우스(3/군)가 IFA중의 pY988 + 각 UCP로 면역화되거나 pY988/IFA 단독으로 면역화되었고, 10일 경과하여 비장에서의 면역반응이 모니터링되었다.
A, 새로 분리된 CD8 T 세포는 TERT pY988/A2+ 5량체로 염색되었다. 대표적인 유세포분석 도트 플롯(위쪽 패널)과 pY988/A2+ CD8 T 세포(아래쪽 패널)를 보여준다.
B. IFN-γ ELISPOT에 의한 항-pY988 CD8 T 세포의 생체외 검출
C-D, 동시적인 UCP-특이적 CD4 T 세포반응이 CD8-결실 분획에서 IFN-γ(C) 및 인터루킨-2(D) ELISPOT 검정에 의해 평가되었다. 컬럼=마우스 3마리로부터의 평균 스팟; 막대=SD.
데이터는 독립적인 3회 실험을 대표한다.
도 7: UCP2의 존재하에 면역화는 자가 pY988-특이적 CTL 반응의 질을 높여준다.
A-C, 마우스(3-4/군)가 pY988 + UCP2(UCP2 + pY988/IFA) 또는 단독의 pY988/IFA로 1회 면역화되었다.
A, 10일 경과하여, 새로 분리된 비장 CD8 T 세포는 증가하는 pY988 펩티드 농도와 함께 배양되었고 IFN-γ-분비 CD8 T 세포는 생체외 ELISPOT에 의해 검출되었다.
B, 생체내 세포독성 검정. 비펄스된 세포(UP) 대비 CFSE-표지된 pY988-처리된 표적 세포의 용해 및 생체내 평균 용해율을 나타내는 대표적인 유세포분석 막대도표를 보여준다.
C-D, 면역화 이후 30일 경과하여 장기간 T 세포반응이 평가되었다.
C. CD44hiCD62lo 세포상에 통과된 pY988/A2 5량체+ CD8 T 세포의 빈도(좌측) 및 IFN-γ 분비 검정에 의한 빈도(우측).
D, 생체외 IFN-γ ELISPOT에 의해 CD8-결실 분획에서 측정된 UCP2-특이적 CD4 T 세포반응.
E. 마우스(4/군)가 DNA/TERT로 면역화하기 3일전에 항-CD4 mAb(GK1.5)(CD4 결실됨, 흰 막대) 또는 염수(결실되지 않음, 검정 막대)로 처리되었다. 자가/TERT-특이적 CTL(좌측) 및 UCP-특이적 CD4 T 세포반응(우측)이 생체외 IFN-γ ELISPOT에 의해 비장에서 측정되었다.
도 8: UCP2-특이적 CD4 Th1 세포는 수지상 세포를 활성화한다.
A, 마우스(3/군)가 UCP2 + pY988/IFA 또는 단독의 pY988/IFA로 1회 면역화되었다. 10일 경과하여, 유세포분석기에 의해 림프절 CD11c+ DC에서 활성화 마커 CD80, CD86 및 HLA-DR의 발현이 분석되었다. 대표적인 유세포분석 막대도표(위쪽 패널) 및 MFI 평균값(아래쪽 패널)을 보여준다. 컬럼=MFI 평균값; 막대=SD. B-E: DC와 CD4 T 세포의 상호작용 분석.
B, 시험관내 DC-CD4 T 세포 공동배양의 도식
C, 상청액을 ELISA하여 측정한 IFN-γ 및 GM-CSF 생성량
D, CD22c+ DC상에 CD86과 HLA-DR의 발현
E, 상청액을 ELISA하여 측정한 인터루킨 12 생성량.
데이터는 독립적인 2회 실험을 대표한다.
도 9: UCP계 백신화의 항종양 치료효과
A, B16-A2 흑색종에서 웨스턴블롯에 의한 TERT 발현(좌측) 및 TRAP-ELISA 검정에 의한 활성(우측).
B-E, 종양-함유 마우스(6-8 마우스/군)가 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 펩티드로 치료상 백신화되었다.
B, 종양 크기의 추가조사. 괄호안의 숫자는 군당 종양 퇴행성 마우스를 가리킨다.
C, 50일까지 기록된 생존율 곡선
D, UCP2-백신화 군에서 무종양 마우스의 비장에서의 IFN-γ ELISPOT에 의한 항-TERT 면역반응의 검출.
E, 본 실험에서, 종양-함유 마우스(n=4/군)가 상기와 같이 백신화되었고 25일째에 유세포분석기에 의해 종양-침윤성 면역세포가 분석되었다. 컬럼=평균 세포비율; 막대=SD.
데이터는 독립적인 2회 실험을 대표한다.
도 10: 인간에서의 UCP-특이적 T 세포반응의 분석
A, 암환자로부터의 혈액 림프구가 UCP 풀과 5일간 직접 배양되었고 3H 티미딘 삽입에 의해 특별한 증식이 측정되었다.
반응 환자 9명으로부터의 대표적인 데이터를 보여준다.
B-D, 림프구가 UCP 풀과 1주간 시험관내 배양되었다.
B, IFN-γ ELISPOT에 의한 UCP-특이적 T 세포의 검출. 반응 환자 9명으로부터의 대표적인 데이터를 보여준다. 컬럼=3회 반복실험의 평균; 막대=SD.
C, UCP의 존재하에 15시간 배양 후 DIA플렉스 검정에 의한 상청액에서의 사이토카인 생성의 검출. 컬럼=환자 3명으로부터의 사이토카인 평균량; 막대=SD.
D, 반응 환자 6명에서 각 UCP에 대한 T 세포반응.
도 11: 암환자로부터 UCP4-특이적 CD4 Th1 세포 클론의 분리.
A, IFN-γ 생성 UCP4-특이적 T CD4 세포 클론이 대장암환자로부터 분리되었다.
B, 실시간 RT-PCR에 의한 UCP4-특이적 T CD4 클론의 mRNA 발현 평가. 양수 및 음수 변화 배수 값은 건강한 지원자로부터의 CD4 T 세포에 비하여 mRNA 발현의 상승 조절 또는 감소 조절을 가리킨다.
C, 세포내 염색에 의한 사이토카인 생성 분석.
본 발명자들은 UCP-특이적 CD4 T 세포반응이 화학요법에 반응하는 암환자들의 전체생존율에 긍정적으로 영향을 미친다는 것을 밝혀냈다. 실제로, 본 발명자들은 화학요법에 반응하는 환자들이 UCP를 표적으로 하는 선천적 항종양 면역반응의 혜택을 본다는 사실을 밝혀냈다. 이와 대조적으로, 화학요법이 효과가 없을 경우에는 종양 용해가 낮고 궁극적으로 생체내 UCP-특이적 CD4 T 반응의 활성화를 위해 TERT 항원 방출이 덜 발생한다.
본 발명자들은 이제 hTERT로부터 유래된 HLA 클래스 II 펩티드를 동정하였고 이 펩티드는 또한 보편적 암 펩티드(UCP)로도 지칭된다. 이들 UCP는 놀랍게도 대부분의 인간 HLA-DR 대립분자뿐만 아니라 HLA-DQ 및 HLA-DP 대립분자와도 결합할 수 있다. 이들 UCP는 내생적으로 프로세싱되고 CD4 T 세포에 제시된다. 궁극적으로, 이들 UCP는 텔로머라제에 대해 CD4 Th 세포반응, 바람직하게는 CD4 Th1 세포반응을 자극하고 CD8 T 세포의 세포독성 활성에 대해 헬퍼 효과를 나타낸다.
이들 펩티드는 이를 필요로 하는 모든 환자, 특히 암 치료를 필요로 하는 환자에 대해서도 특히 보조제로서 CD4 또는 CD8 T 세포반응을 상승시키고 항-텔로머라제 CD4 T 세포 반응을 모티터링하는데 유용하다.
펩티드 특징:
본 발명의 펩티드는 텔로머라제 단백질로부터 유래된다.
텔로머라제 단백질은 "종양 관련 항원" 또는 "TAA"이다. TAA는 종양 세포를 정상 세포로부터 면역학적으로 구별해 주며 인간 암에 대한 진단 및 치료 표적을 제공한다. TAA는 상당한 이종성을 나타낸다. 본 발명의 펩티드는 HLA 클래스 II 분자와 결합하고 CD4 T 세포에 제시될 수 있다. 본 발명에서 동정된 펩티드는 "UCP" 또는 "보편적 암 펩티드"로 지칭되며, 이것은 이들 펩티드가 대다수의 종양에서 발현된다는 것을 의미한다. 본 발명의 UCP는 광범위한 HLA 클래스 II 대립분자, 보다 특정적으로는, HLA-DR 대립분자와 결합할 수 있을뿐만 아니라 HLA-DQ 및 HLA-DP 대립분자와도 결합할 수 있다. 본 발명에서, UCP 펩티드는 또한 "HLA 클래스 II 펩티드"로도 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "텔로머라제"는 텔로미어 말단을 유지해 주는 효소인 리보뉴클레오프로테인 폴리머라제를 가리킨다. 텔로머라제는 체내의 대부분의 정상세포에서는 발현되지 않는다. 그러나, 텔로머라제 활성은 분열이 활발히 진행중에 있는 세포에서 검출될 수 있다. 특히, 텔로머라제는 악성 세포에서 과발현되고, 텔로머라제 활성은 모든 피연구 암 형태에서 관찰되었다. 본 발명에서, 텔로머라제는 특히 텔로머라제 복합체의 아단위 hTERT(인간 텔로머라제 역전사효소)를 가리킨다. 아단위 hTERT는 인간 텔로머라제의 촉매 단백질 아단위이다. 아단위 hTERT는 아미노산 1132개로 이루어진 127 kDa의 단백질이며 이의 활성을 위해 필요한 상이한 도메인들로 형성되어 있다. hTERT는 다음과 같은 몇 가지 장점을 제공한다: i) 대부분의 인간 암에서의 발현, ii) 항원성 상실 종양 도피 기전을 방지하는 세포 불멸과 종양 성장에 필수적인 발암 역할, iii) 암세포 및 암줄기세포에서의 구성적 고발현 및 iv) 면역원성(Martinez et al, Hanahan et al).
본 발명의 펩티드는 hTERT로부터 유래된 아미노산 15 내지 20개의 펩티드이다. 바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 hTERT로부터 유래된 아미노산 15 내지 17개, 바람직하게는 15개의 펩티드이다.
본원에 정의된 펩티드는 종양 세포 또는 항원 제시 세포의 표면상의 다수의 HLA 클래스 II 분자와의 복합체로서 제시될 수 있으며, 이에 따라 대다수의 환자에게 유용하다.
본 발명의 펩티드는 텔로머라제 단백질에 대해 CD4 Th 세포 반응, 바람직하게는 Th1 세포 반응을 발생할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 CD8 T 세포의 세포독성 활성에 대해 헬퍼 효과를 나타낼 수 있다.
보다 자세하게는, 4종의 펩티드가 본 발명자들에 의해 동정되었다: UCP1(p44), UCP2(p578), UCP3(p916) 및 UCP4(p1041). 아미노산 서열은 아래 표 1과 같다.
UCP 서열
펩티드 서열
UCP2 KSVWSKLQSIGIRQH(서열번호 1)
UCP3 GTAFVQMPAHGLFPW(서열번호 2)
UCP4 SLCYSILKAKNAGMS(서열번호 3)
UCP1 PAAFRALVAQCLVCV(서열번호 4)
본 발명의 다른 펩티드는 서열번호 1, 2, 3 또는 4로부터 1개 또는 그 이상의 치환에 의해 유래된 실질적 상동성 펩티드이다. 바람직하게는 치환은 보존적이고/이거나 펩티드 면역원성을 개선시킨다.
펩티드의 면역원성은 CD4 T 세포상에 존재하는 T 세포 수용체(TCR)에 대해 펩티드의 결합 친화성을 증가시키고/시키거나 펩티드-TCR 복합체의 수명을 연장시킴으로써 개선될 수 있다.
2종의 아미노산 서열은 1개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 치환된 경우 또는 아미노산 가운데 80% 이상이 동일하거나 아미노산 가운데 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상이 유사(기능상으로 동일)한 경우 "상동성", "실질적 상동성" 또는 "실질적 유사"한 것이다. 바람직하게는, 유사 또는 상동성 서열은 예를 들어 GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램 또는 본 분야에 알려진 프로그램중 임의의 것(BLAST, FASTA 등)을 사용한 서열 배열에 의해 동정한다. 바람직하게는, 이 상동성 펩티드는 고리화 방지를 위해 2개의 시스테인 잔기를 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "보존 치환"은 펩티드의 전체적인 형태와 기능에 변화를 주지 않으면서 한 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미하며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 한 아미노산의 유사한 특성(예, 극성, 수소결합 포텐셜, 산성, 염기성, 형상, 소수성, 방향족성 등)을 갖는 아미노산으로의 치환을 포함한다. 유사한 특성이 갖는 아미노산들은 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신은 친수성-염기성 아미노산이고 상호치환가능하다. 유사하게, 소수성 아미노산인 이소류신은 류신, 메티오닌 또는 발린으로 치환될 수 있다. 서로 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산으로는 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌이 포함된다.
용어 "치환" 또는 "개질"과 관련하여, 본 발명은 천연 아미노산으로부터 변이 또는 개질된 아미노산을 포함한다.
이런 관점에서 본 발명의 맥락에 비추어 본 분야에서 보존 치환은 한 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환된 것으로 인정되고 있음이 이해되어야 한다. 아래 표 2는 보존 치환의 한 예를 보여준다.
보존 치환 I
측쇄 특징 아미노산
무극성 G A P I L V
극성-무전하 C S T M N Q
극성-전하 D E K R
방향족 H F W Y
기타 N Q D E
다른 방법으로서, 문헌[Lehninger, 1975]에 기술된 바와 같이 보존 아미노산들이 분류될 수 있다. 아래 표 3은 그러한 분류를 보여준다.
보존 치환 II
측쇄 특징 아미노산
무극성(소수성)
A. 지방족 A L I V P
B, 방향족 F W
C. 황함유 M
D. 중성 G
무전하-극성
A. 하이드록실 STY
B. 아미드 NQ
C. 설프하이드릴 C
D. 중성 G
양전하(염기성) K R H
음전하(산성) D E
또 다른 방법으로서의 예시적인 보존 치환이 아래 표 4에 제시된다.
보존 치환 III
고유 잔기 치환 예
Ala(A) Val(V), Leu(L), Ile(I)
Arg(R) Lys(K), Gln(Q), Asn(N)
Asn(N) Gln(Q), His(H), Lys(K), Arg(R)
Asp(D) Glu(E)
Cys(C) Ser(S)
Gln(Q) Asn(N)
Glu(E) Asp(D)
His(H) Asn(N), Gln(Q), Lys(K), Arg(R)
Ile(I) Leu(L), Val(V), Met(M), Ala(A), Phe(F)
Leu(L) Ile(I), Val(V), Met(M), Ala(A), Phe(F)
Lys(K) Arg(R), Gln(Q), Asn(N)
Met(M) Leu(L), Phe(F), Ile(I)
Phe(F) Leu(L), Val(V), Ile(I), Ala(A)
Pro(P) Gly(G)
Ser(S) Thr(T)
Thr(T) Ser(S)
Trp(W) Tyr(T)
Tyr(Y) Trp(W), Phe(F), Thr(T), Ser(S)
Val(V) Ile(I), Leu(L), Met(M), Phe(F), Ala(A)
펩티드 제조:
본원에 기술된 펩티드는 본 분야의 전문가에게 알려져 있는 표준 합성 방법, 예를 들면 화학합성 또는 유전자조합을 사용하여 합성할 수 있다. 바람직한 양태로서, 펩티드는 축합시 펩티드 결합에 참여하는 것을 제외한 아미노산 작용기를 보호하면서, 아미노산 서열을 적절한 순서로 이미 함유하고 있는 예형 단편을 축합하거나 사전에 제조된 서너개 단편을 축합하는, 아미노산 잔기의 단계별 축합에 의해 수득한다. 특히, 펩티드는 Merrifield가 처음으로 공개한 방법에 따라 합성할 수 있다.
화학합성 기술의 예는 고상합성 및 액상합성이다. 고상합성의 경우, 예를 들면, 합성 대상 펩티드의 C-말단에 상응하는 아미노산을 유기용매중에서 불용성인 지지체에 결합시키고, 아미노기와 적당한 보호기에 의해 보호된 측쇄 작용기를 함유한 아미노산들을 하나씩 C-말단에서 N-말단으로 축합하는 반응과 수지에 결합된 아미노산과 펩티드의 아미노기의 보호기를 분리하는 반응을 교대로 반복함으로써 펩티드 쇄를 연장한다. 고상합성 방법은 사용된 보호기의 종류에 따라 크게 tBoc 방법과 Fmoc 방법으로 분류한다. 전형적으로 사용되는 보호기로는 아미노기위한 tBoc(t-부톡시카르보닐), Cl-Z(2-클로로벤질옥시카르보닐), Br-Z(2-브로모벤질옥시카르보닐), Bzl(벤질), Fmoc(9-플루오레닐메톡시카르보닐), Mbh(4,4'-디메톡시디벤즈하이드릴), Mtr(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐), Trt(트리틸), Tos(토실), Z(벤질옥시카르보닐) 및 Clz-Bzl(2,6-디클로로벤질); 구아니디노기를 위한 NO2(니트로) 및 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸클로만-6-설포닐); 및 하이드록실기를 위한 tBu(t-부틸)이 포함된다. 목적하는 펩티드의 합성 후, 펩티드를 탈보호반응시키고 고체 지지체로부터 분리한다. 이러한 펩티드 분리반응은 Boc 방법의 경우 플루오르화수소 또는 트리-플루오로메탄 설폰산으로 수행할 수 있고, Fmoc 방법의 경우엔 TFA로 수행할 수 있다.
다른 방법으로서, 펩티드는 재조합 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 이 경우, 핵산 및/또는 유전자 작제물은 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이들 서열중 하나와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 이들 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 폴리뉴클레오티드 서열 및 숙주 세포안에서 본 발명에 따른 펩티드의 발현(예, 전사 및 해독)을 유도하는 조절서열(예, 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등)으로 구성된 또는 포함하는 유전자 작제물에 관한 것이다.
따라서, 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하고(또는 적합한 환경하에서 발현할 수 있고)/하거나 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 유전자 작제물을 함유하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
펩티드의 제조 방법은 임의로 그 펩티드를 정제하고/하거나 그 펩티드를 화학적으로 개질시키는 단계를 포함할 수 있다.
단백질분해(proteolysis)에 대한 추가적인 보호:
본 발명의 펩티드는 단백질 분해에 대한 내성을 개선하는 임의의 화학적 개질에 의해 서열번호 1, 2, 3 또는 4로부터 유래되는 펩티드를 포함한다.
특히, 본원에 기술된 펩티드의 N- 및/또는 C-말단은 임의로 단백질분해에 대해 보호될 수 있다. 예를 들어, N-말단은 아세틸기의 형태일 수 있고/있거나 C-말단은 아미드기의 형태일 수 있다. 또한, 단백질분해에 대한 내성을 위해 펩티드의 내부 개질이 고려된다. 예를 들면, 적어도 -CONH- 펩티드 결합이 (CH2NH) 환원 결합, (NHCO) 레트로-인버소 결합, (CH2-O) 메틸렌-옥시 결합, (CH2-S) 티오메틸렌 결합, (CH2CH2) 카바 결합, (CO-CH2) 세토메틸렌 결합, (CHOH-CH2) 하이드록시에틸렌 결합, (N-N) 결합, E-알센 결합 또는 -CH=CH- 결합에 의해 개질 및 대체된다.
예를 들어, 펩티드는 아세틸화, 아실화, 아미드화, 가교결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 공유가교결합 형성, 시스테인 형성, 파이로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글라이코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 인산화 등에 의해 개질될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 D 배치의 아미노산들로 구성될 수 있으며, 이로인해 펩티드는 단백질분해에 대해 내성을 갖는다. 또한, 본 발명의 펩티드는 분자내 가교결합에 의해, 예를 들어, 소위 "스테이플" 기술에 따라, 적어도 2개의 아미노산 잔기를 올레핀 측쇄, 바람직하게는 C3-C8 알케닐 쇄, 바람직하게는 펜텐-2-일 쇄에 의해 개질시킨 후 이어서 쇄를 화학적으로 가교결합시킴으로써 안정화할 수 있다. 예를 들면, 위치 i 및 i+4 내지 i+7의 아미노산들이 반응성 올레핀 잔기를 나타내는 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 이러한 모든 단백질분해-내성 화학적으로 개질된 펩티드는 본 발명에 속한다.
본 발명의 다른 관점에서, 뇨배출율과 약물사용량을 줄이고 혈중반감기를 높이기 위해 펩티드는 이의 C-말단 또는 라이신 잔기에 의해 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자, 특히 1500 또는 4000 MW의 PEG에 공유결합된다. 또 다른 양태로서, 펩티드를 마이크로스피어를 형성하는 약물전달시스템용 생체분해성과 생체융합성 중합체 재료에 삽입시켜 펩티드 반감기를 증가시킨다. 중합체 및 공중합체의 예는 폴리(D,L-락티드-코-글라이콜리드)(PLGA)(US2007/0184015에 기술되어 있다)이다.
폴리펩티드
또한, 본 발명은 상기 정의된 펩티드 서열중 상이한 펩티드 서열 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 더 바람직하게는 4개 이상을 포함하는 아미노산 160개 미만, 바람직하게는 120개 미만의 폴리펩티드에 관한 것이다.
이들 펩티드는 폴리펩티드 서열의 N-말단으로부터 C-말단으로 어떠한 순서로도 가능할 수 있다.
임의로, 펩티드는 아미노산 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 본 발명에 따르면, 스페이서는 일반적으로 1개 내지 10개의 아미노산, 바람직하게는 3개 내지 6개의 아미노산을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 인접한 펩티드와 함께 새로운 항원 부위를 형성하지 않는 것으로 선택한다.
또한, 본 발명은 i) 상기 정의된 펩티드 1개 이상과 ii) CD8 에피토프 펩티드를 포함하는 아미노산 300개 미만, 바람직하게는 200개 미만의 폴리펩티드에 관한 것이다.
임의로, 폴리펩티드는 1 내지 10개의 아미노산, 바람직하게는 3 내지 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 스페이서 1개 이상을 포함할 수 있다.
CD8 에피토프 펩티드는 항원에 대해 CD8 T 세포반응을 활성화시킬 수 있는 펩티드이다. 바람직하게는, CD8 에피토프는 CD8 항종양반응 또는 바이러스, 박테리아 또는 기생충 항원에 대한 CD8 반응을 활성화시킬 수 있다. CD8 에피토프 펩티드를 포함하는 종양 항원의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 티로시나제, 알파페토프로테인, 암태아성항원(CEA), CA-125, MUC-1, 상피성 종양항원, 흑색종 관련 항원, P1A, MART1/MELAN-1 및 gp100/pMell7뿐만 아니라 티로시나제 관련 단백질 pg75 및 MUM-1, HER2/neu, 인간 유두종바이러스 단백질 E6 및 E7, GnT-V, 베타-카테닌, CDK4, p15, MAGE1, MAGE3, BAGE, GAGE, PSMA, TARP, STEAP, HTLV-1 Tax 및 WT1이 포함된다. CD8 에피토프 펩티드의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니나 gp100.154, NA17-A.nt38 및 MelanA/MART-1.27, CEA.571, 티로시나제.368-N, p53.65, Her2/neu.369-377, gp100.209, gp100.280, gp100.476, 티로시나제.368-D, MAGE-3.271 및 Her2/neu.654, gp100.457, Melan-A/MART-1.32, 티로시나제.I, p53.149, p53.264 및 HPV E7.86이 포함된다. 텔로머라제로부터의 CD8 에피토프 펩티드는 pY988, pY572, p1, p4, p68, p277, p342, p351, p444, p464, p540, p865, p966, p1107 및 p1123이다(참조: 미국특허원 US2009/175892A).
핵산
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 구성되는 분리된 핵산에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 폴리뉴클레오티드 서열 및 숙주 세포안에서 본 발명에 따른 펩티드의 발현(예, 전사 및 해독)을 유도하는 조절서열(예, 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등)으로 구성된 또는 포함하는 유전자 작제물에 관한 것이다.
본 발명의 유전자 작제물은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 이중가닥 DNA이다. 본 발명의 유전자 작제물은 또한 대상 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 형질전환에 적합한 형태이거나, 대상 숙주 세포의 게놈 DNA내로 통합되기에 적합한 형태이거나, 대상 숙주 유기체안에서의 독립적인 복제, 유지 및/또는 유전을 위해 적합한 형태일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자 작제물은 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스 또는 트랜스포손과 같은 벡터의 형태일 수 있다. 특히, 벡터는 발현 벡터, 즉 시험관내 및/또는 생체내에서(예, 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현시스템안에서) 발현을 제공할 수 있는 벡터일 수 있다.
바람직하지만 비제한적인 관점에서, 본 발명의 유전자 작제물은 i) 본 발명의 핵산 1개 이상; ii) 상기 핵산이 작동적으로 연결되는 1개 이상의 조절요소(예, 프로모터 및 임의의 적합한 터미네이터); 및 임의로 iii) 3'- 또는 5'-UTR 서열, 리더 서열, 선별 마커, 발현 마커/리포터 유전자 및/또는 형질전환 또는 통합(의 효율)을 촉진 또는 증가시킬 수 있는 요소와 같은 유전자 작제물의 추가 요소 1개 이상을 포함한다.
특정 양태로서, 본 발명은 상기 정의된 아미노산 160개 또는 120개 미만의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점은 i) 상기 정의된 펩티드 1개 이상 및 ii) 상기 정의된 CD8 에피토프 펩티드를 포함하는 아미노산 300개 또는 200개 미만의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
컨쥬게이트(conjugates)
본 발명의 펩티드(들)는 HLA 클래스 II 분자에 결합되어 컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
컨쥬게이트는 1개 이상의 HLA 클래스 II 분자에 결합된 1개 이상의 본 발명의 펩티드를 포함한다.
바람직한 양태로서, HLAㅍ 클래스 II 분자는 비오티닐화된다.
바람직하게는, 4개의 비오티닐화 HLA 클래스 II 분자에 결합된 4개 이상의 펩티드가 아비딘 분자와 결합하고 다량체(예, 4량체 또는 5량체)를 형성한다. 이들 컨쥬게이트는 CD4 T 세포상에 존재하는 다량의 T 세포 수용체(TCR)과 효율적으로 결합한다.
CD4 T 세포는 만일 아비딘 분자가 표지와 컨쥬게이션되어 있는 경우 예를 들어 유세포분석에 의해 쉽게 검출할 수 있다. 표지의 예로서 플루오로크롬을 들 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 컨쥬게이트는 HLA 클래스 II 분자(들)에 결합된 펩티드(들)에 대해 특이성을 보이는 CD4 T 세포의 양을 결정하는데 아주 강력한 도구이다. 다시 말해서, 본 발명의 컨쥬게이트는 환자로부터 TERT-특이적 CD4 T 세포 면역반응을 정량하는 것을 가능하게 해 준다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 4개 이상이 결합된 비오티닐화 HLA 클래스 II 분자 4개 이상을 포함하고 이들 4개 이상의 비오티닐화 HLA 클래스 II 분자들은 임의로 검출가능하게 표지된 아비딘 분자를 통해 서로 연결되는 컨쥬게이트를 제공한다. 특정 양태로서, 컨쥬게이트는 본 발명에 따른 펩티드 4개가 결합된 비오티닐화 HLA 클래스 II 분자 4개를 갖고 이들 4개의 비오티닐화 HLA 클래스 II 분자들은 임의로 검출가능하게 표지된 아비딘 분자를 통해 서로 연결된다.
CD4 및/또는 CD8 T 세포 반응의 자극
본 발명자들은 항-텔로머라제 CD4 Th1 면역성이 종양 환자, 특히 치료법(특히, 화학요법)에 반응을 보인 환자의 전체생존율 및 무진행 생존율을 높여준다는 것을 제시하였다.
또한, 본 발명자들은 TERT 특이적 CD4 T 세포반응을 유인할 수 있는 HLA 클래스 II 펩티드를 동정하였고 이들 펩티드가 항종양 백신화의 효과를 유의적으로 증강시킴을 보였다.
본 발명의 펩티드(UCP)는 CD4 및/또는 CD8 T 세포반응을 자극하는데(또는 상승시키는데) 유용하다. 본 발명자들은 UCP 백신화가 대부분 IFN-γ뿐만 아니라 인터루킨-2를 생성하는 고 결합활성(avidity) CD4 T 세포를 유도하였음을 제시하였다. UCP-특이적 CD4 T 세포는 또한 수지상 세포에 의한 활성화 및 인터루킨-2 생성을 유도하였다. 또한, 본 발명자들은 백신 제제중에 본 발명에 따른 UCP의 존재가 원발 및 기억 반자기 종양 CD8 반응을 상당히 증강시켰음을 발견하였다. 이것은 활성화 CD4 Th 세포의 "헬퍼 효과"에 의해 설명된다. 특히, 종양-반응성 CD4+ T 헬퍼 1 T 세포(Th1)은 종양에 대한 세포성 면역의 유도에 필수적인 서너 종류의 사이토카인(예, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2)을 생성한다(Kennedy et al, 2008). 널리 인정되고 있는 한 가지 모델에 따르면, CD4+ T 세포가 보조자극 수용체의 상호작용에 의한 효율적인 CD8+ T 세포 초회감작을 위해 수지상 세포(DC)를 모집 및/또는 활성화하는 능력이 증명된다(Bennett et al, 1998; Smith et al, 2004).
본 발명의 HLA 클래스 II 펩티드는 특히 종양 환자의 면역요법 또는 감염증 치료에 유용한 치료제이다.
바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3과 서열번호 4의 펩티드 4종을 동시에 또는 순차적으로 투여함으로써 병용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "환자"는 포유동물, 바람직하게는 남성, 여성, 성인 및 아동을 포함한 사람을 가리킨다. 환자는 일반적으로 CD4 또는 CD8 T 세포의 자극이 요구되는 대상자이다. 특정 양태로서, 환자는 종양, 특히 암을 앓고 있는 환자이다. 종양은 바람직하게는 암이고, 예를 들면 만성 림프성백혈병, 만성 골수성백혈병, 다발성골수종, 악성골수종, 호지킨병, 흑색종, 뇌종양(예, 교모세포종, 신경모세포종 및 성상세포종), 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 두경부암 및 위암으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 암이다. 폐암, 특히 비소세포 폐암(NSCLC)가 바람직하다.
다른 바람직한 양태로서, 종양은 바이러스 또는 온코바이러스에 의해 유발된 암이다. 온코바이러스는 인간 유두종 바이러스(HPV), 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스(KSHV 또는 HHV-8), 엡스타인-바르 바이러스(EBV 또는 HHV-4), 메르켈 세포 폴리오마바이러스 또는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV 또는 HHV-5)뿐만 아니라 C형 간염 바이러스 또는 인간 T세포림프친화바이러스(HTLV-1)을 포함한다.
암은 전이 단계를 포함하여 어떠한 발생 단계의 암도 해당될 수 있다.
다른 양태로서, 환자는 바이러스, 기생충 또는 박테리아에 감염된 환자일 수 있다. 바이러스의 예로는 유두종 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 간염 바이러스, 아데노바이러스, 믹소바이러스(예, 인플루엔자), 파라믹소바이러스, 폭스바이러스(예, 백시니아) 및 렌티바이러스(예, HIV)가 포함된다.
치료 대상 환자는 바람직하게는 통상적 치료법을 받아 온 환자이거나 받고자 하는 환자이며, 가장 바람직하게는 통상적 일차 치료법을 받아 온 환자이거나 받고자 하는 환자이다.
본 발명의 UCP계 면역요법은 통상적 치료법과 병용될 수 있다.
용어 "통상적 치료법"은 그 치료법이 관례적으로 적용되거나, 비록 관례대로 적용되지 않더라도 그 치료법이 적절하고 적어도 보건 당국에 의해 권장된다는 것을 의미한다. 암의 경우에, "통상적" 치료는 치료하고자 하는 암의 유형에 따라 의사에 의해 선택된다. 보다 특정적으로, 통상적 치료법은 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법, 면역요법, 특정 키나제 억제제계 요법 및 항체계 요법을 포함한다. 화학요법은 세포독성물질 또는 세포사멸유도제, 특히 유전자독성물질과 같은 모든 화합물가운데 단독 화합물 또는 둘 이상의 조합물을 포함한다. 방사선요법은 예를 들어 X-선, 감마 방사선 및/또는 UVC 방사선중에서 선택된 모든 방사선 치료를 포함한다. 호르몬요법, 즉 아폽토시스 또는 Fas 리간드 또는 가용성/막결합 TRAIL 또는 가용성/막결합 TNF 알파(TNFα)를 유도하는 치료법은 안티아로마타제와 같은 화합물을 포함한다. 면역요법은 사이토카인 또는 인터페론 또는 백신을 포함한다. 특정 키나제 억제제계 요법은 예를 들어 티로신 키나제 억제제, 세린 키나제 억제제 및 트레오닌 키나제 억제제중에서 선택된 화합물을 포함한다.
바람직한 양태로서, 본 발명의 펩티드 또는 이를 인코딩하는 핵산은 보조요법이다. 예를 들면, 이들은 화학요법 또는 항종양 백신화와 병용된다.
본 발명의 펩티드 또는 이를 인코딩하는 핵산은 텔로머라제에 대한 CD4 Th 세포반응, 바람직하게는 CD4 Th1 세포반응을 유발하고 CD8 T 세포 항종양 활성에 대해 헬퍼 효과를 나타냄으로써 환자의 종양 또는 감염증을 치료하는데 사용할 수 있다. 이와 같은 치료법의 부작용은 감소된다. 실제로, 유기체의 체내에 건강한 세포 대부분은 텔로머라제 단백질을 발현하지 않는 반면, 암세포는 텔로머라제 단백질을 과발현한다. 따라서, 건강한 세포는 본 발명의 펩티드에 의해 치료될 때 영향을 받지 않는다.
본 발명의 펩티드의 효능은 CD8 T 세포에 대한 헬퍼 효과에 의해 증가된다. 본 발명의 펩티드는 CD4 T 세포를 자극함으로써 CD8 T 세포 항종양 활성에 대해 헬퍼 효과를 나타낸다. 실제로, CD4 T 세포는 종양 세포에 대한 CD8 T 세포의 유도 및 유지를 위해 중요하다. 본원에 기술된 펩티드는 CD8 에피토프 근처에 모여서 CD8 T 세포의 세포독성 활성을 촉진할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료" 또는 "요법"은 치유적 치료 및/또는 예방적 치료를 포함한다. 보다 자세하게는, 치유적 치료는 증상의 완화, 호전 및/또는 완치, 경감 및/또는 안정화(예, 더 이상 악화되지 않음)뿐만 아니라 특정 질병의 증상 진행 지연중 어떠한 것도 해당된다. 예방적 치료는 발병 차단, 발전 위험 감소, 발병 감소, 발병 지연, 진행 감소뿐만 아니라 특정 질병의 증상이 발생하는 시간의 연장중 어떠한 것도 해당된다. 특히 관심을 두고 있는 예방은 특히 종양발현전 병변의 예방이다.
따라서, 본 발명은 또한 종양을 예방하는데 유용한 백신에 관한 것이다.
이에, 본 발명은 종양 또는 감염증의 치료를 필요로 하는 환자에게 1종 이상의 펩티드 또는 이를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자의 종양 또는 감염증을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 일부 암환자들이 텔로머라제에 대해 감소된 CD4 Th1 세포반응을 나타내거나 갖고 있지 않음을 제시하여 왔다. 텔로머라제-특이적 CD4 Th1 세포 반응이 자연적으로 발생되지 않는 환자들의 생존율은 그러한 자연발생 텔로머라제-특이적 CD4 Th1 세포반응이 발생되는 환자의 생존율보다 낮다.
따라서, 보다 특정적으로 본 발명은 환자가 항-텔로머라제 면역반응을 자연적으로 생성할 수 없을 때 특히 유용한 본원에 기술된 펩티드(또는 이들 펩티드를 인코딩하는 핵산)에 관한 것이다. 이들 환자군에서, 본 발명의 치료법은 환자들의 전체생존율을 향상시키는 텔로머라제-특이적 CD4, 특히 CD4 Th1, T 세포반응을 유인한다. 이들 환자에 있어서, 본 발명의 펩티드(또는 이들 펩티드를 인코딩하는 핵산)은 바람직하게는 보조요법으로서, 즉 바람직하게는 화학적치료 백신 또는 항종양 백신과 병용된다.
또한, 본 발명의 치료법은 텔로머라제-특이적 CD4, 특히 CD4 Th1, T 세포반응을 상승시키고 추가로 환자들의 전체생존율을 향상시킴으로써 그러한 반응이 자연적으로 발생되는 환자에게 유용하다. 이들 환자에 있어서, 본 발명의 펩티드(또는 이들 펩티드를 인코딩하는 핵산)는 단독으로 사용되거나 보조요법으로서, 즉 바람직하게는 화학적치료 백신 또는 항종양 백신과 병용된다.
약학 조성물
본 발명은 본원에 정의된 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 상기 펩티드의 조합물, 더 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3 및 4의 펩티드 4종의 조합물을 포함할 수 있다.
상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산과 같은 치료제는 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합되어 제형된다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 특히 항암제와 같은 임의의 다른 활성 약물을 포함할 수 있으며, 예를 들면 DNA 결합제, 특히 알킬화 또는 끼어들기(intercalating) 약물과 같은 DNA 복제 억제제, DNA 폴리머라제 억제제와 같은 대사길항제 또는 토포이소머라제 I 또는 II 억제제를 이용하거나, 알칼로이드와 같은 항유사분열촉진제를 이용하거나, 티로시나제 억제제 또는 모노클로날 항체와 같은 암증식차단제를 이용하는 통상적 세포독성 화학요법제를 포함할 수 있다.
특정 양태로서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산은 백신 조성물에 사용된다. 바람직하게는, 백신 조성물은 암세포에 대한 면역반응을 구분하여 유도하는 면역원성 종양 항원(바람직하게는, 펩티드 종양 항원)을 추가로 포함한다.
이와 같은 종양 항원의 예는 상기한 바 있다.
바람직하게는, 본 발명의 백신 조성물은 감염증에 대한 면역반응을 구분하여 유도하는 면역원성 바이러스, 박테리아 또는 기생충 항원(바람직하게는, 펩티드 바이러스, 박테리아 또는 기생충 항원)을 추가로 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드는 텔로머라제로부터 유래된 CD8 에피토프 펩티드와 조합된다.
본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드(또는 이들 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산)는 정맥내, 경구, 경피, 피하, 점막, 근육내, 폐내, 비내, 비경구, 직장내, 질내 및 국소 투여를 포함하여 임의의 용이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 비내가 특히 관심을 끄는 투여 경로이다.
유리하게는, 종양내 투여도 고려된다.
바람직한 양태로서, 본 발명의 치료제, 바람직하게는 핵산은 전기천공법에 의해 근육내로 또는 피부를 통해 투여될 수 있다.
활성성분들이 용해 또는 분산되어 있는 약물학적 조성물의 제조는 본 분야에서 널리 이해되고 있는 것이며, 제형을 기준으로 한정될 필요는 없다. 전형적으로 그러한 조성물은 액제 또는 현탁제와 같은 주사제로 제조된다. 그러나, 사용전에 액체와 혼합하여 액제 또는 현탁제로 재구성하기에 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있다. 또한, 제제는 에멀젼화될 수도 있다. 특히, 본 발명의 약학 조성물은 고체용량형으로 제형될 수 있으며, 이의 예로는 캡슐, 정제, 환제, 산제, 당의정 또는 과립제를 들 수 있다.
비히클의 선택 및 비히클내 활성물질의 함량은 일반적으로 활성 화합물의 용해성 및 화학성질, 특정 투여방식 및 약무에 정해진 관찰 규정에 따라 결정된다. 예를 들어, 락토즈, 나트륨 시트레이트, 탄산칼슘 및 제2인산칼슘과 같은 부형제, 전분 및 알긴산과 같은 붕해제, 특정 규산염 복합체 및 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 활택제를 혼합하여 정제를 제조하는데 사용할 수 있다. 캡슐을 제조하는 있어서 락토즈와 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이 유리하다. 수성 현탁제가 사용되는 경우, 이들은 에멀젼화제 또는 현탁촉진제를 함유할 수 있다. 또한, 수크로즈, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 클로로포름과 같은 희석제 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.
조성물의 효능을 증강시키기 위하여 보조제를 첨가할 수 있으며, 이의 예로는 알루미늄염(예, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄), 계면활성제(예, 라이소루시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드), 오일 에멀젼, 완전프로인트보조제, 불완전프로인트보조제, MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로즈 디코리노마이코이에이트), 티로신, 알루미나, 사포닌 보조제(예, StimulonTM), 사이토카인을 들 수 있다.
제조는 활성 분자의 조절된 또는 지속된 방출을 제공하기 위하여 활성 분자를 주사용 마이크로스피어, 생체흡수성 입자, 고분자 화합물(예, 폴리악틱산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 같은 물질로의 제형 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드(또는 이들 펩티드를 인코딩하는 핵산)은 펩티드들(또는 이들 펩티드를 인코딩하는 핵산들)의 조합물로서 투여될 수 있다.
투여량은 CD4 T 세포반응의 자극을 유도할 수 있는 양으로 전문가에 의해 선택되며, 투여 경로 및 사용된 용량형에 의해 좌우된다. 단일용량 또는 분할용량으로 대상자에게 투여되는 펩티드의 총 일일용량은 예를 들어 일일 약 1 ㎍ 내지 10 mg, 바람직하게는 일일 100 ㎍ 내지 5 mg의 양일 수 있다. 단위용량 조성물은 일일 용량과 동일한 양으로 수회 분할량으로 함유할 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자를 위한 특정 용량 수준은 체중, 종합적인 건강 상태, 성별, 식습관, 투여시간, 투여경로, 흡수율, 배설율, 다른 약물과의 병용 여부 및 치료중에 있는 특정 질병의 중증도를 포함한 다양한 요인에 의해 좌우된다는 점은 누구나 이해할 수 있을 것이다.
진단, 예후 및 면역모니터링(Diagnostic, prognostic and immunomoniteoring)
본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 특히 종양 또는 감염증 환자, 생물학적 시료에서 텔로머라제-특이적 CD4 T 세포반응을 평가하는데 사용할 수 있다.
용어 "생물학적 시료"는 환자로부터 채취된 모든 생물학적 시료를 가리킨다. 시료의 예는 생물학적 유액 및 조직 생검을 포함한다. 바람직하게는, 시료는 혈액, 혈청, 타액, 뇨 또는 정액일 수 있다. 보다 바람직한 생물학적 시료는 혈액 시료이다.
본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 특히 통상적 치료 이전에, 통상적 치료 과정에 또는 통상적 치료 이후에 종양 환자의 종양-특이적 CD4 T 세포반응을 평가하는데 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 UCP는 환자의 항-텔로머라제 CD4 T 세포반응을 검출 또는 모니터링하는데 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 펩티드에 의해 백신접종 후 항-텔로머라제 CD4 T 세포반응을 모니터링하는 것이 가능하다.
본 발명의 한 가지 관점에서, 환자는 CD4 또는 CD8 T 세포 상승 요법을 필요로 한다.
본 발명의 특정 관점에서, 환자가 본 발명에 기술된 펩티드와 같은 보조제 치료법을 필요 여부를 결정하고 그러한 보조제 치료법을 응용 또는 조정하기 위하여 UCP-특이적 면역반응을 통상적 요법 이전에, 과정중에 및 이후에 정량한다.
이것은 특히 환자가 통상적 치료, 특히 화학요법에 대한 "반응자"이거나 반응가능자인지를 결정하는데 유용하다.
본 발명의 맥락에 비추어, 환자는 이의 증상중 적어도 한 가지가 완화될 것으로 기대할 수 있거나 그 질병의 진행이 중단 또는 경감되는 경우 "반응자"로 간주된다. 완전 반응자, 부분 반응자 또는 안정한 암환자가 RECIST 기준에 따라 정의될 수 있다(Eisenhauer et al, European Journal of Cancer, 2009, 45:228-247). 고형 종양에서, RECIST 기준은 하나 이상의 측정가능한 병변의 존재를 기초로 하는 국제 표준이다. "완전 반응"은 모든 표적 병변의 소멸을 의미하고, "부분 반응"은 표적 병변들의 최장 직경 합계에서 30% 감소를 의미하며, "진행성 질병"은 표적 병변들의 촤장 직경 합계에서 20% 증가를 의미하고, "안정성 질병"은 상기 기준을 충족하지 않는 변화를 의미한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 컨쥬게이트는 종양을 가진 환자가 바람직하게는 본 발명의 펩티드 또는 이를 인코딩하는 핵산을 포함하는 약학 조성물일 수 있는 보조제 치료를 필요로 하는지의 여부 또는 이러한 치료법 또는 조성물의 용량 섭생을 조절(즉, 증가, 지속, 감소 또는 중단)해야 하는지의 여부를 결정하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 치료 또는 백신화 후에, 특히 종양 세포의 용해를 포함한 항종양 치료 또는 감염된 텔로머라제-발현 세포의 용해를 포함한 항감염증 치료 후에 항-텔로머라제 CD4 Th 세포반응을 결정할 수 있도록 해 준다. 이와 같은 치료는 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 필요로 할 수 있으나 이들 펩티드 또는 폴리펩티드로 한정되는 것은 아니다.
아래 양태들은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드에 바탕을 두고 예시된 것이나 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트가 항-텔로머라제 T 세포반응을 검출하는데 사용되는 한 다른 치료법에도 마찬가지로 적용될 수 있다.
첫번째 특정 양태로서, 본 발명은 종양 또는 감염증을 가진 환자의 생물학적 시료로부터 수득된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 본원에 기술된 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트로 자극하는 단계 및 상기 펩티드 또는 컨쥬게이트에 대해 특이적인 CD4 Th 세포의 양을 결정하여 이 CD4 Th 세포의 양이 대조값보다 낮으면 보조제 치료 또는 조정된 보조제 치료를 필요로 하는 것으로 정하는 단계를 포함하여, 상기 환자의 보조제 치료 또는 조정된 보조제 치료에 대한 필요 유무를 결정 또는 모니터링하는 방법을 제공한다.
보다 특정적으로, 본 발명은 종양 또는 감염증을 가진 환자의 생물학적 시료로부터 수득된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 본원에 정의된 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트로 자극하는 단계 및 상기 펩티드 또는 컨쥬게이트에 대해 특이적인 CD4 Th 세포의 양을 결정하여 이 CD4 Th 세포의 양이 대조값보다 낮으면 보조제 치료를 필요로 하는 것으로 정하는 단계를 포함하여, 상기 환자의 보조제 치료, 바람직하게는 본 발명의 펩티드 또는 이들 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 약학 조성물에 대한 필요 유무를 결정하는 시험관내 방법을 제공한다.
이러한 본 발명의 관점에서, "대조값"은 자연발생 항-TERT CD4 Th 면역반응을 생성할 수 있는 여러 개체의 생물학적 시료중의 항-TERT CD4 Th 세포의 양으로부터 설정할 수 있다. 이는 통계상 참조값일 수 있다.
특정 양태로서, 상기 방법은 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트에 의한 자극 이전 또는 이후에 CD4+ T 세포를 분리하고 임의로 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 그런 다음, 본 발명의 펩티드에 대해 특이적인 세포를 예를 들어 IFN-γ ELISPOT로 정량한다. 프로토콜 예가 아래 실험 섹션에 상세히 기술되어 있다. 또한, 유세포분석기가 예를 들어 세포질내 사이토카인 염색의 표준 프로토콜을 이행함으로써 사용될 수 있다(참조예: Prussin and Metcalfe, Journal of Immunological Methods, 1995, 188:117-128).
추가로, 본 발명의 UCP계 면역모니터링은 항암 면역반응을 회복 및/또는 개선하는 보상척도를 제공하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 CD4 Th 면역반응, 특히 CD4 Th1 면역반응을 모니터링하는데 효과적인 도구일 수 있다. 보다 자세하게는, 본 발명의 펩티드(들) 또는 컨쥬게이트(들)은 항-텔로머라제 CD4 Th 세포의 양을 결정하고 궁극적으로 보조제 치료, 바람직하게는 본원에 기술된 항종양 치료(즉, 본 발명의 펩티드(들) 또는 이들 펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 이들 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트)를 적용하는데 사용할 수 있다. 보다 정확하게는, 본 발명의 약학 조성물은 환자에 존재하지 않는 항-텔로머라제 CD4 Th 반응을 설정하거나 환자에 이미 존재하는 항-텔로머라제 CD4 Th 반응을 상승시키는데 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 환자의 생물학적 시료로부터 수득된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트로 자극하는 단계 및 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트에 대해 특이적인 CD4 Th 세포의 양을 결정하여 이 CD4 Th 세포의 양이 대조값보다 낮으면 상기 환자를 치료 조정을 필요로 하는 환자로 정하는 단계를 포함하여, 상기 환자의 보조제 치료 또는 조정된 보조제 치료에 대한 필요 유무를 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명의 관점에서, "대조값"은 환자의 생물학적 시료의 항-TERT CD4 Th1 세포의 양으로부터 설정된다. 보다 정확하게는, 종양을 가진 환자에서 항-TERT CD4 Th1 세포의 양은 그 환자의 여러 치료 시점(예, 화학요법 이전, 진행중 및/또는 이후)에서 결정되고, 이전 값은 치료를 적용하기 위한 "대조값"으로 고려된다.
본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 종양을 가진 환자의 예후를 설정하고 생존을 예측하기 위한 마커로서 사용될 수 있다.
특정 양태로서, 본 발명은 또한 종양을 가진 환자의 생물학적 시료로부터 수득된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트로 자극하는 단계 및 상기 펩티드 또는 컨쥬게이트에 대해 특이적인 CD4 Th 세포의 양을 결정하여 이 CD4 Th 세포의 양이 대조값보다 낮으면 상기 환자를 재발가능성 환자로 정하는 단계를 포함하여, 상기 환자의 결과를 예측하는 시험관내 방법을 제공한다.
본 발명의 관점에서, 환자는 상기된 바와 같은 통상적 치료를 받을 수 있거나 본 발명의 펩티드 또는 이들 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 약학 조성물 또는 상기 통상적 치료와 상기 약학 조성물의 병합으로 치료받을 수 있다.
이러한 본 발명의 관점에서, "대조값"은 본 분야에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 긍정적인 예후를 받아 온 종양을 가진 한명 또는 그 이상의 환자의 생물학적 시료에서 항-TERT CD4 Th 세포의 양으로부터 설정될 수 있다. 이 대조값은 통계상 참조값일 수 있다.
본 발명의 펩티드는 또한 통상적 치료에 대한 환자, 특히 종양을 가진 환자의 반응성을 결정하는 마커로서 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 관점에서, UCP-특이적 면역반응은 환자가 상기 통상적 치료에 대한 반응자 또는 무반응자인지를 결정하기 위해 통상적 치료 이전, 진행중 및 이후에 정량된다.
따라서, 본 발명은 환자의 생물학적 시료로부터 수득된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트로 자극하는 단계 및 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트에 대해 특이적인 CD4 Th 세포의 양을 결정하여 CD4 Th 세포의 양이 대조값보다 낮으면 상기 통상적 치료에 대해 불량한 반응으로 정하는 단계를 포함하여, 통상적 치료에 대한 상기 환자의 반응을 모니터링하는 시험관내 방법을 제공한다.
이러한 본 발명의 관점에서, "대조값"은 상기 통상적 치료에 반응하지 않는 종양 환자군과 상기 통상적 치료에 반응하는 환자군의 생물학적 시료의 항-TERT CD4 Th1 세포의 평균량으로부터 설정된다.
본 발명의 추가적인 관점 및 이점들이 아래 실험 섹션에서 기술될 것이며, 이것은 본 발명을 예시하는 것으로서 본원의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예:
실시예 1: 불규칙한 HLA-DR 텔로머라제-유래된 에피토프의 동정 및 폐암환자에서의 자연발생 종양-특이적 CD4 T 세포면역의 분석
1.1 재료 및 방법
환자
Georges Pompidou 대학병원(Paris, France) 및 Jean Minjoz 대학병원(Besancon, France)은 2009년 1월부터 2011년 2월까지 환자를 모집하였다. 국제암연합(International Union against Cancer, UICC) 분류법에 따라 종양 단계와 등급을 정했다. 조직학적으로 NSCLC로 판정된 환자들은 사전동의 후 임상에 지망하는 것으로 등록되었다. 본 연구는 프랑스법과 지역윤리위원회의 승인하에 진행되었다. 혈액 세포는 Etablissement Francais du Sang(EFS, Besancon, France)에서 익명의 건강한 기증자로부터 사전동의 하에 EFS 가이드라인에 따라 페레시스 키트 제제로서 채취되었다. Olerup SSP DRB1 타이핑 키트(Olerup, Sweden)를 사용하여 HLA-DR 유전형질분석을 실시하였다.
탤로머라제-유래된 CD4 T 에피토프 선별 및 결합 검정
TERT로부터 유래된 펩티드 4종 (보편적 암 펩티드(UCP1(PAAFRALVAQCLVCV, 서열번호 4), UCP2(KSVWSKLQSIGIRQH, 서열번호 1), UCP3(GTAFVQMPAHGLFPW, 서열번호 2) 및 UCP4(SLCYSILKAKNAGMS, 서열번호 3)로 지칭)은 여러 HLA-DR 분자와의 결합에 대해 SIFPETHI(www.syfpeithi.de), NetMHCpan 2.1(http://www.cbs.dtu.dk/-services/NetMHCIIpan/) 및 NetMHCII 2.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII) 소프트웨어를 사용하여 추정되었다(Kobayashi et al, 2008). 합성 펩티드(>80% 순도)는 Activotec(Cambridge, United Kingdom)으로부터 구입한 것이다. HLA-DR 분자와의 결합력은 Wang, et al에서 공개된 바와 같이 경쟁적 ELISA에 의해 평가되었다.
건강한 기증자로부터 UCP-특이적 T 세포의 발생
피콜-하이파크 구배(Sigma-Aldrich, France)에서 밀도원심분리하여 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하고 4종 UCP 풀 10 μM을 포함한 RPMI 5% 인간 혈청에서 24웰 평판에 웰당 4.106 세포로 플레이팅하였다. 1일째에 재조합 인터루킨 7(5 ng/mL)(Peprotech, Franch)을 첨가하고 3일째에 인터루킨 2(20 UI/mL)(Novartis, Switzerland)를 첨가하였다. 7일째 및 14일째에, UCP 10 μM로 펄스된 γ-조사된 자가 PBMC로 세포를 자극하고, 8일째 및 15일째에 공지된 바와 같이(Wang et al, Adotevi et al, 2006) 20 UI/mL IL-2를 첨가하였다. 21일째에, CD4 T 세포를 정제하고(Miltenyi, France), IFN-γ ELISPOT로 T 세포주의 특이성을 조사하였다. 간단히 설명하면, AIM V 배지(Invitrogen, United Kingdom)중의 각 UCP(5 μM)를 포함한 항-인간 IFN-γ mAb 전코팅된 ELISPOT 평판에서 CD4 T 세포(105/웰)를 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배지 단독으로 배양된 세포를 음성 대조군으로 사용하고, PMA(100 ng/ml)(Sigma-Aldrich) 및 이오노마이신(10 μM)(Sigma-Aldrich)의 존재하에 배양된 세포는 양성 대조군으로 사용하였다. 제조사(Gene Probe, France)의 지시에 따라 이행한 후 IFN-γ 스팟이 나타났다. 음성 대조값(배경)을 공제하고 특이적 T-세포의 수를 계산하였다. 이 값은 스팟-형성 세포/105 세포로 표시된다. 스팟-형성 세포의 계수는 C.T.L. Immunospot 시스템(Cellular Technology Ltd., USA)로 수행하였다. HLA-DR-제한을 위해, ELISPOT 동안에 세포 배양물에 차단 항체 항-HLA-클래스 I(클론 W6.32), HLA-DR(클론 L243) 및 HLA-DP(클론 B7/21)(10 ㎍/ml)을 첨가하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.
CD4 T 세포 클론 분리 및 증폭
한계희석법으로 T 세포 클론을 분리하고, 공지방법에 따라(Godet et al) 조사된 상동성 PBMC, B-EBV 세포주 및 인터루킨 2 150 UI의 존재하에 PHA로 자극후 증폭시켰다. 세포질내 TNF-α 염색 및 인간 10-플렉스 사이토카인 검정법(인간 Th1/Th2/Inflammation Diaplex, Diaclone, France)을 이용하여 UCP-특이적 CD4 T 세포 클론의 기능 분석을 수행하였다.
자연발생 UCP-특이적 CD4 T 세포반응의 평가
암환자 또는 건강한 지원자로부터 피콜-분리된 PBMC를 RPMI 5% 인간 혈청중의 24웰 평판(4.106 세포/웰)에서 UCP 풀 10 μM과 배양하고 1일째에 인터루킨 7(5 ng/mL)을 첨가하고 3일째에 인터루킨 2(20 UI/mL)를 첨가하였다. 바이러스에 대한 회상 반응을 위해, 세포를 사이토메갈로바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 엡스타인 바르 바이러스로부터의 펩티드 32종의 혼합물(CTL, Germany)과 유사하게 배양하였다. 1주간의 세포 배양 후, 위에 상세히 설명된 바와 같이 IFN-γ ELISPOT로 UCP-특이적 T 세포의 존재를 측정하였다.
유세포분석
세포질내 사이토카인 염색을 위해, 10 μM 펩티드의 존재 또는 부재하에 5시간의 자극 후, Cytofix/Cytoperm 키트(BD Bioscience, USA)를 이용하여 항-CD4(BD Bioscience, USA) 및 항-TNF-α(eBioscience, USA)로 T 세포를 표지하였다. 유세포분석 Treg 분석을 위해, PBMC를 표면 항체(항-CD4, 항-CD25)로 일차 염색하고, 고정한 후, 투과화한 다음 항-hFoxp3(PCH101; eBioscience)로 이차 염색하였다. FACS Canto II(BD Bioscience)로 시료를 수득하고 DIVA 소프트웨어로 분석하였다. NLR은 절대호중구수를 절대림프구수로 나눈값으로 정의된다(Suzuki et al).
통계
NCSS 2007 소프트웨어(Number Cruncher Statistical Systems, Kaysville, USA)로 통계분석을 수행하였다. 모든 시험에서 유의 수준은 p<0.05로 정했다. 변수는 평균±SD 또는 중앙값으로 나타냈고, 적합화된 경우 Wilcoxon Rank-Sun 검정으로 검사하였다. 생존율 곡선은 Klapan-Meier 방법으로 계산하고 로그 순위(Log-rank) 검정과 비교하였다.
1.2. 결과
TERT로부터 보편적 HLA-DR-제한된 CD4 T 세포 에피토프의 동정
여러 HLA-DR 분자와 결합할 수 있는 TERT의 아미노산 서열내에 CD4 에피토의 존재를 추정하기 위하여, 본 발명자들은 세 가지 알고리즘 Syfpeithi, NetMHCpan-2.1 및 NetMHC2.2로부터의 결과를 병합하였다. 본 발명자들은 일반적으로 발견되는 인간 HLA-DR 대립분자와의 결합력에 대한 확률 규모에서 점수가 높게 나타난 4종의 15량체 펩티드 서열(UCP1, UCP2, UCP3, UCP4로 지칭함)을 선별하였다(표 1). 이 결과를 검증하기 위하여, 본 발명자들은 공지된 바와 같이 경쟁적 ELISA를 기초로 시험관내 결합 검정을 실시하였다. 그들의 결합 특성을 본 발명자들이 참고로 사용해 왔고 강한 결합제의 상대친화성이 <100인 고결합제 펩티드와 쉽게 비교될 수 있도록 데이터는 상대친화성(RA)으로 표시하였다. 결과들은 모든 펩티드가 HLA-DR에 의해 인코딩된 가장 흔한 대립분자와 효과적으로 결합하는 능력을 입증해 준다(표 5). 데이터는 상대활성 RA(UCP의 IC50 대 참조 펩티드의 IC50의 비율)로 표시되었고 3회 실험의 평균값이다. 양호한 결합제는 RA<100이고 약한 결합제는 RA>50이다.
HLA-DR 유전자좌에 의해 인코딩된 가장 흔한 대립분자들에 대한 펩티드의 상대친화성
HLA-DR 대립분자
펩티드 서열번호 DR1 DR3 DR4 DR7 DR11 DR13 DR15 DRB3 DRB4 DRB5
UCP44
(UCP1)		 4 3 0.4 50 3 25 1 4 30 4 1
UCP578
(UCP2)		 1 0.2 144 112 1 4 231 8 154 229 1
UCP916
(UCP3)		 2 0.1 173 2 2 0.2 134 0.2 53 >500 0.2
UCP1041
(UCP4)		 3 0.3 >500 34 8 0.3 >500 3 154 >500 0.5
4종의 펩티드는 DR1, DR4, DR7, DR11, DR15, DRB3 및 DRB5를 포함한 7종의 상이한 HLA-DR 분자와 강력한 결합력을 나타냈다. 특히, UCP1 및 UCP2는 중간 RA(100-500) 내지 낮은 RA(<100)로 검정된 모든 HLA-DR 분자와 결합할 수 있었다. 따라서, 이들 펩티드는 우점적 HLA-DR 항원 10종의 표현형 빈도에 비추어 전종의 90% 이상을 차지할 수 있다(Wang et al). 게다가, UCP에 대한 CD4 T 세포반응이 전장 TERT 단백질을 인코딩하는 DNA 플라스미드(Adotevi et al, 2006, Pajot et al)에 의한 면역화로 인간화 HLA-DR1*010/HLA-A2 트랜스제닉 마우스에서 유도되었고 이는 그들 펩티드가 내인적 프로세싱을 거쳐 CD4 T 세포에 생체내 제시된다는 것을 가리킨다.
이어서, UCP가 인간 CD4 T 세포를 자극하는 능력을 검정하였다. 이 목적으로 위하여, 건강한 지원자의 말초혈액으로부터 분리된 림프구를 시험관내에서 UCP 풀로 자극하고 UCP-특이적 CD4 T 세포주의 발생을 ELISPOT 검정법으로 스크리닝하였다. 도 1A에서 보는 바와 같이, CD4 T 세포는 적어도 1종의 UCP를 인식할 수 있었다. UCP 특이적 CD4 T 세포반응의 HLA-DR 제한이 HLA-DR 차단 항체의 존재하에 IFN-γ 분비의 억제로 검증되었다(도 1B). HLA-DR 스펙트럼-형별검사는 정상인의 HLA-DR 대립분자들이 UCP의 불규칙한 성질을 나타내지 않음을 보여준다(도 1C). 따라서, 이들 결과는 UCP에 대한 전구 CD4 T 세포가 인간 말초 T 레퍼토리에 존재하고 이들 다수의 HLA-DR 맥락에서 그들 펩티드를 인식함을 내포한다. 추가로 이들 반응을 특성화하기 위해 본 발명자들은 암환자로부터 UCP2 및 UCP4에 대해 특이적인 CD4 T 세포 클론을 분리하였다. 모든 UCP4-특이적 CD4 T 세포 클론들은 동족 펩티드의 존재하에 강력한 반응성을 나타냈고 아주 낮은 펩티드 농도(<0.1 μM)에서 관찰된 최대 절반 TNF 분비를 보였다(도 2A, B). UCP2 특이적 클론에서 유사한 결과를 얻었으며 최대 절반 TNF 분지가 약 4 μM에서 관찰되었다(도 2C, D). 추가로, 본 발명자들은 펩티드 자극 후에 클론들이 주로 IFN-γ 및 TNF-α를 생성했으나 IL-4나 IL-17A는 생성하지 않았음을 제시하였으며 이는 Th1 분극과 일치한다(도 2E). 이들 CD4 T 세포주의 반응성은 HLA-DR 차단 항체에 의해 억제되며 이는 그들의 HLA-DR 제한을 가리킨다.
따라서, 이들 결과는 고 결합활성 UCP-특이적 CD4 T 세포 클론들이 암환자로부터 생성될 수 있고 Th1 분극된 것임을 나타낸다. 또한, 이들 결과는 상기 UCP들이 악성의 맥락에서 자연히 프로세싱되고 CD4 T 세포에 제시된다는 것을 증명한다.
NSCLC 환자에 UCP에 대한 천연 CD4 T 세포의 존재
텔로머라제 유전자 다형성은 폐암 감염성과 연관이 있어 왔고 TERT 발현은 모든 유형의 NSCLC(비소폐암종)에서 발견된다(Lantuejoul, Rafnar et al). 따라서, 본 발명자들은 NSCLC에서의 자연발생 UCP-특이적 CD4 T 세포반응을 포괄적으로 분석하였다. 84명의 NSCLC 진행 환자로부터 피콜-분리된 혈액 림프구를 일차 화학요법전에 채취하고 UCP 풀과 함께 단기간(1주) 배양한 후 IFN-γ ELISPOT에 의해 특이적 T 세포를 측정하였다. 건강한 지원자 22명에서 채취한 혈액 림프구를 대조군으로서 사용하였다. IFN-γ 분비 세포의 수가 음성 대조군에 비해 적어도 2배인 경우 양성으로 고려되었다. 이 실험 디자인으로 본 발명자들은 특이적 CD4 T 세포 기억 반응을 측정할 수 있다. 도 3A에서 보는 바와 같이, UCP-특이적 기억 면역반응이 84명의 환자가운데 32명(38%)에서 발견된 반면 건강한 사람에서는 UCP에 대한 특이적 IFN-γ 반응이 전혀 검출되지 않았다. 이들 반응의 사이토카인 분비 프로필 분석에서 IL-4, IL-17 및 IL-10의 부재하에서 TNF-γ 및 IFN-γ의 높은 생성이 나타나는데, 이는 Th1 분극을 가리킨다(데이터 미공개). 각각이 분석한 결과로서, 4종의 UCP 각각은 환자에서 CD4 T 세포반응을 발생할 수 있다. 그러나, UCP-2 및 UCP-4에 대한 T 세포반응의 빈도는 이들 펩티드가 보다 더 면역원성임을 제시한다(도 3B). UCP 특이적 반응을 보이지 않는 환자에서 효과적인 항바이러스 회상 반응의 존재에 의해 증명되는 바와 같이, 환자에서 UCP 특이적 면역반응의 부재는 총체적 T 세포 아네르기와 연관성이 없을 수 있다(도 3C). NSCLC에서 항종양 반응을 감소키는 것으로 보고된 많은 면역 지표의 영향을 배제하기 위해(Suzuki et al), 본 발명자들은 UCP-특이적 면역반응을 갖는 또는 갖지 않는 환자에서 순환하는 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포(Tregs) 및 혈장 IL-10을 측정하였다. 본 발명자들은 두 그룹에서 비슷한 수준의 순환 Tregs를 제시하였다(도 3D) ELISA에 의한 혈장 IL-10의 부재가 UCP-면역 상태와 무관하게 관찰되었다(데이터 미공개). 추가로, 이들 두 그룹에서 림프구의 총수와 호중구-림프구 비율(NLR)은 매우 비슷하다(도 3D).
이 결과는 NSCLC 환자가 TAA-특이적 CD4 T 세포반응을 자연히 증가시킬 수 있고 UCP는 NSCLC에서의 항종양 면역반응을 모니터링할 수 있는 원형 펩티드임을 가리킨다.
자연발생 UCP-특이적 T 세포 면역반응은 화학요법에 반응하는 환자의 전체생존율을 증가시킨다.
임상 결과에 미치는 UCP-특이적 CD4 면역반응의 영향을 일차 화학요법(CT) 후에 반응한 또는 발전한 환자를 대상으로 분석하였다. 이 목적으로 위하여, 본 발명자들은 84명의 NSCLC 진행 환자 가운데 55명을 10개월간 집중 추적관찰하였다.
포함된 모든 환자들은 전이 4기로 분류되었다. TERT에 대한 T-세포 반응은 연령, 흡연, ECOG PS 상태 또는 조직학적 하위유형과 같은 임상 또는 예후 변수와 상관성이 없었다. 엘로티닙 치료를 받은 6명의 환자를 제외하고, 모든 환자들은 백금 이중선 치료를 받았다. 일차 후 55명 중 36명(65%)에서 RECIST 기준에 기초한 통제성 질병(CD)에 이르렀고, 이들 가운데 25%(55명 중 14명)는 부분반응(PR)에, 40%(55명 중 22명)는 안정성 질병(SD)에 이르렀다. 55명 가운데 19명(35%)에서는 진행성 질병(PD)이 관찰되었다. 자연발생 TERT-특이적 CD4 면역반응의 빈도는 CT 후에 CD 환자 또는 PD 환자에서 비슷하였다. 대조적으로, CT 이전에 TERT-특이적 면역성을 보인 환자는 TERT-특이적 면역성이 없는 환자에 비하여 CD 그룹에서 증가된 전체생존율(OS)을 나타냈다(중앙값 OS: 53주 대 40주, p=0.034, HR=0.54, 95% Cl [0.3-1]). 기존 UCP-특이적 면역반응은 CD 환자의 무진행 생존율(PFS)을 비유의적으로 증가시켰다(중앙값 PFS: 33주 대 24주, p=0.391, HR=0.76, 95% Cl [0.4-0.7])(도 4B). 본 발명자들이 엘로티닙 치료 환자를 배제하고 백금계 CT를 받은 환자에 집중하였을 때 비슷한 결과가 관찰되었다(중앙값 OS: 53주 대 40주, p=0.049, HR=0.52, 95% Cl [0.3-0.9])(도 4C, D). 대조적으로, 일차 CT 후 PD 환자들에서 본 발명자들은 UCP-특이적 면역 상태와 상관없이 생존율 차이가 없음을 발견하였다(데이터 미공개). 따라서, 화학요법에 민감한 종양을 가진 환자에서 자연적인 TERT-특이적 CD4 Th1 반응의 존재는 보다 긴 OS와 상관관계가 있다.
실시예 2: 텔로머라제로부터 유래된 신규 UCP의 자가 항종양 CD8 T 세포 반응에 대한 강력한 CD4 헬퍼 활성
2.1 재료 및 방법
합성 펩티드.
TERT로부터 유래된 4종 펩티드(보편적 암 펩티드(UCP)로 지칭함) UCP1(TERT44-58: PAAFRALVAQCLVCV, 서열번호 4), UCP2(TERT578-592: KSVWSKLQSIGIRQH, 서열번호 1), UCP3(TERT916-930: GTAFVQMPAHGLFPW, 서열번호 2) 및 UCP4(TERT1041-1055: SLCYSILKAKNAGMS, 서열번호 3) 및 TERT로부터 유래된 펩티드 HLA-A2-제한된 pY988(YLQVNSLQTV, 서열번호 5)와 pY572(YLFFYRKSV, 서열번호 6)가 본 발명자들에 의해 사용되었다. 인간 및 마우스 TERT에는 천연형의 2종 잠재 HLA-A2 TERT 펩티드가 완전히 보존되어 있다(Hernandez et al, 2002). 합성 펩티드(>80% 순도)는 Activotec(UK)로부터 구입하였다.
마우스
HLA-DRB1*0101/HLA-A*0201-트랜스제닉 마우스(A2/DR1 마우스)는 공지된 것이다(Pajot et al, 2004). 이들 마우스는 H-2 클래스 I 및 IA 클래스 II 녹아웃이고 이들의 CD8 T 및 CD4 T 세포는 각각 HLA-A*0201 및 HLA-DR1*0101 분자에 의해 제한된다.
면역화
UCP의 프로세싱을 연구하기 위하여, 공지된 바와 같이 AD/DR1 마우스를 0일째 및 14일째에 pTrip-TERT DNA(100 ㎍)으로 면역화하였다. 일부 실험에서, DNA 면역화 이전에 항-CD4 mAb 처리(클론 GK1.5)로 CD4 T 세포를 결실시켰다. UCP 면역화를 위해 불완전 프로인트 보조제(IFA, Sigma-Aldrich, France)중에 에멀젼화된 100 ㎍의 각 UCP를 마우스에 주사하였다. 일부 실험에서, 50 ㎍의 pY988 펩티드를 IFA중의 각 UCP 100 ㎍과 함께 동시에 주사하였다. 모든 펩티드 백신화는 우측 옆구리에 피하(s.c) 주사하여 진행되었다. 8주령 내지 10주령 마우스가 자체 동물 사육실에서 사육 관리되었다. 모든 실험은 프랑스의 동물실험규칙에 규정된 우수실험실운영기준에 따라 이행되었다.
마우스 증식 검정
공지된 바와 같이(Pajot et al, 2004) 최종 DNA 면역화 후 10일 경과하여 증식 검정을 실시하였다. 결과는 자극 지수=(특이적 펩티드에 의한 cpm)/(비관련 펩티드에 의한 cpm)으로 나타낸다.
5량체 염색 및 ELISPOT 검정
공지된 바와 같이 생체외 5량체 염색을 실시하였다(Adotevi et al, 2010; Adotevi et al, 2006). PE-컨쥬게이션된 pY988 및 pY572 HLA-A2.1 5량체(Prolmmune, UK)로 세포를 염색하였다. 세포 염색 후, 시료를 FACS Canto II(BD Biosciences, France)와 Diva 소프트웨어로 유세포분석하였다. 생체외 ELISPOT는 공지 내용 및 제조사 지침에 맞춰 수행하였다(GenProbe, France)(Adotevi et al, 2010; Adotevi et al, 2006)
수지상세포 활성화
펩티드-면역화된 마우스로부터의 비장 또는 림프절 CD11c+ DC를 공동자극 수용체 발현에 대해 직접 분석하였다. 일부 실험에서, A2/DR1 마우스로부터의 미성숙 골수 유래 DC(iDC)를 UCP 또는 IFA 단독으로 면역화된 마우스로부터의 CD4 T 세포와 15시간 배양한 다음, 공동자극 수용체의 세포 표면 발현 및 사이토카인 생성을 위해 염색하였다.
종양 도전
HLA-A2.1-양성 B16F10 쥐 종양 세포주(B16-A2로 지칭함)는 다량의 TERT를 발현하는 것으로 알려져 있었다(Adotevi et al, 2010). A2/DR1 마우스의 옆구리에 식염수 100 ㎕중의 2.105 B16-A1 세포를 피하 주사하였다. 5일째에, 마우스 군을 UCP2(100 ㎍)와 함께 또는 없이 pY988과 pY572 펩티드의 혼합물(100 ㎍)로 면역화하였다. 17일째에 추가 주사를 실시하였다. 대조 마우스는 식염수 중의 보조제 IFA로 처리되었다. 캘리퍼스로 2-3일마다 종양 성장을 모니터링하였고, 종양 덩어리의 표면이 >200 mm2에 이르렀을 때 마우스를 안락사시켰다. 카플란-마이어 모델을 이용하여 마우스 생존율을 평가하였다.
암환자에서 UCP-특이적 T 세포 반응의 검출
Besancon(프랑스) 대학병원의 암환자로부터 사전동의하에 채혈하였다. 연구는 프랑스법 및 지역윤리위원회의 승인하에 수행하였다. 공지된 바와 같이(Pajot et al, 2004) 3H 티미딘 삽입에 의해 피콜-분리된 림프구를 분석하였다. 림프구를 UCP로 단기간 시험관내 자극한 후 인간 ELISPOT 검정(GenProbe)에 의해 UCP-특이적 면역반응을 분석하였다. 부수적으로, UCP와 함께 또는 없이 15시간 배양한 후 DIAplex Human Th1/Th2 키트(GenProbe)로 제조사 지침에 따라 사이토카인 생성을 측정하였다.
통계
데이터는 평균±SD로 기록된다. 군간의 통계치 비교는 Prism 4 GraphPad 소프트웨어를 사용함으로써 스튜던트 t 검정을 기초로 이루어졌다. 마우스 생존율은 카플란-마이어 방법으로 산정하였고, 로그 순위 검정을 사용하였다. 0.05(*) 미만의 P값은 유의적인 것으로 고려되었다.
2.2. 결과
UCP에 의한 면역화는 생체내에서 고 결합활성 Th1 분극된 CD4 T 세포반응을 유도한다.
본 발명자들 및 외 다른 연구진들은 인간 종양 항원을 스크리닝하는데 인간화 HLA 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하는 것이 에피토프 동정을 위한 "역면역학" 방법을 최적화할 수 있는 강력한 대안을 대표한다는 것을 공개한 바 있다(Adotevi et al, 2006; Osen et al, 2010). 본원에서 본 발명자들은 UCP의 HLA-DRB1*0101 분자와의 결합력을 근거로 UCP의 생체내 면역원성을 연구하기 위하여 A2/DR1 마우스를 사용하였다. UCP가 TERT 단백질로부터 내인적으로 프로세싱될 수 있는지를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 전장 TERT 서열을 인코딩하는 플라스미드 DNA로의 면역화를 수행하였고, 5일 3H-티미딘 삽입 검정에 의해 UCP-특이적 CD4 비장세포를 모니터링하였다. 도 5A에서 보는 바와 같이, 모든 UCP는 DNA-면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 증식을 다르게 자극한다. 특히, UCP1 또는 UCP4에 비하여 UCP2 및 3에 대한 반응에서 높은 T 세포 증식이 측정되었다. 본 발명자들은 이들 결과를 생체외 IFN-γ ELISPOT 검정을 이용하여 검증하였고 강력한 UCP-특이적 CD4 T 세포 반응을 발견하였다(도 5B). UCP1과 대조적으로, UCP2, 3 및 4에 대한 특이적 CD4 T 세포 반응이 모든 면역화 마우스에서 검출되었다(도 5B). 이들 데이터는 DRB1*0101 제한의 맥락에서 UCP가 생체내에서 효율적으로 프로세싱되고 CD4 T 세포에 제시된다는 것을 명확히 보여준다. CD4 헬퍼 T 세포의 다른 집단들은 항종양 면역반응을 조절함에 따라(Pardoll et al, 1998), 본 발명자들은 생체내 UCP-특이적 CD4 T 세포 반응의 분극을 연구하였다. 이를 위하여, UCP-백신화 마우스로부터 새로 분리된 CD4 T 세포를 UCP로 펄스된 또는 펄스되지 않은 동계(syngenic) iDC의 존재하에 배양하고 사이토카인 생성을 측정하였다. 모든 사례에서, 본 발명자들은 UCP-특이적 CD4 T 세포가 고수준의 IFN-γ와 IL-2를 생성하지만 IL-4, Il-5, IL-10 또는 Il-17은 생성하지 않음을 제시하였다. 이 결과는 UCP 면역화가 우선적으로 생체내에서 Th1 분극된 면역반응을 유도한다는 것을 가리킨다(도 5C).
이어서, UCP-특이적 CD4 T 세포의 결합활성을 평가하기 위하여, UCP-면역화된 마우스로부터 새로 정제된 CD4 T 세포를 증가하는 펩티드 농도의 존재하에서 배양하였고, 특이적 IFN-γ 생성 CD4 T 세포의 수를 ELISPOT로 측정하였다. 도 5D의 결과는 UCP2, UCP3 및 UCP4로 면역화된 마우스가 높은 결합활성 특이적 CD4 T 세포를 유도하였음을 보여준다(<10-7 μM). 이에 비해, UCP1 또는 UCP4로 백신화된 마우스로부터의 CD4 T 세포는 각각 10-1 및 10-3 μM의 펩티드 농도에 반응하였다. 이를 근거로 하여, 본 발명자들은 낮은 용량의 UCP2 또는 UCP3 펩티드(약 1 ㎍)이 생체내에서 강력한 IFN-γ+ CD4 T 세포를 자극한 것으로 결론내렸다(도 5E). 종합하면 UCP는 생체내에서 효율적으로 프로세싱되며 A2/DR1 마우스에서 높은 결합활성 Th1 분극된 CD4 T 세포를 자극한다.
UCP-특이적 CD4 T 세포는 생체내에서 최적의 항-자가/TERT CD8 T 세포 반응을 조력한다.
CD4 T 세포 헬퍼 기능은 강력하고 지속적인 CTL 반응의 발생에 중요한 것으로 고려된다(Shedlock et al, 2003). UCP-특이적 CD4 T 세포에서 이 문제를 다루기 위하여, 본 발명자들은 마우스를 UCP의 존재하에 자가/TERT 펩티드 pY988로 공동면역화하였다. 이 펩티드는 인간 및 마우스 TERT 서열에 완전히 보존되어 있다. 5량체 염색 및 ELISPOT 검정에 의해 pY988-특이적 CTL 반응을 생체외에서 측정하였다. 도 6A에서 보는 바와 같이, pY988 단독으로 백신화된 마우스에 비하여 pY988 + UCP로 면역화된 마우스에서 보다 높은 빈도의 기능성 pY988-특이적 CD8 T 세포가 검출되었다. 비록 UCP1 백신화가 pY988/A2 5량체 + CD8 T 세포-특이적 반응의 빈도에 거의 영향을 미치지 않았으나, UCP 4종은 자가/TERT 펩티드에 대해 IFN-γ-분비 CD8 T 세포의 수를 유의적으로 증가시킬 수 있었다(도 6B). pY988-특이적 CD8 T 세포 반응의 크기는 마우스에서 부수적으로 유도된 UCP-특이적 면역반응의 세기와 강한 상관성이 있었다(도 6C, D). 게다가, 이들 UCP는 생체내에서 자가/TERT pY572-특이적 CTL 반응에 유사한 헬퍼 효과를 나타냈다. 따라서, 헬퍼 펩티드로 UCP의 첨가는 생체내에서 자가/TERT CD8 에피토프에 대한 면역관용을 효율적으로 파괴한다.
이어서, 본 발명자들은 종양 박멸을 위한 두 가지 중요한 기능인 CTL 결합활성 및 기억에 미치는 UCP 헬퍼 펩티드의 영향을 밝히고자 연구하였다. 이를 위해 본 발명자들은 생체내에서 강력한 Th1 면역반응을 유도하는 UCP2에 초점을 두었다. 도 7A에서 보는 바와 같이, pY988 + UCP2로 면역화된 마우스로부터 새로 분리된 CD8 T 세포들은 펩티드 pY988의 극히 낮은 농도(<10-3 μM)에 대해 여전히 반응적이었다. 이들 세포는 또한 잠재적인 천연 대응물 p988을 인식하였고 이는 그들의 높은 결합활성을 반영한다(데이터 미공개). 따라서, pY988 + UCP2로 백신화된 마우스는 pY988 군보다 CFSE-표지된 표적 세포에 대해 보다 강력한 생체내 세포독성을 나타냈다(도 7B). 따라서, UCP2 헬퍼 면역반응은 생체내에서 CTL 반응의 질을 증강시킨다. 이 결과는 고 결합활성 CD4+ T 세포의 자극이 항종양 CTL 결합활성과 세포용해활성을 증가시킴을 보여주는 이전 보고서(Bandmaier et al, 2009)를 지지한다. 게다가, UCP2가 공동주사된 마우스에서 지속적인 항-자가/TERT CTL 반응이 검출되었다(도 7C). 이 반응은 생체내에서 장기간 지속되는 UCP2-특이적 CD4 T 세포반응과 상관성이 있었다(도 7D). UCP-특이적 CD4 T 세포 조력의 역할을 검증하기 위하여, 본 발명자들은 항-자가/TERT CD8 T 세포 반응이 TERT-DNA 면역화 이전에 CD4 T 세포가 결실된 마우스에서 결실되지 않은 마우스에 비하여 심하게 감소되었음을 보여주었다(도 7E). 유사한 결과들이 HPV-16 E7 및 NA-17로부터의 펩티드를 이용한 다른 항원 모델에서 수득되었다(데이터 미공개). 따라서, 생체내에서 종양 특이적 CTL의 최적의 초회항원자극을 위해 UCP-특이적 CD4 T 세포의 동시 자극이 요구된다.
UCP-특이적 CD4 T 세포는 생체내에서 수지상세포 활성화를 촉진한다.
수지상세포 활성화의 유도는 항원제시를 지속시키고 공동자극 신호를 CTL에 제공하기 위해 CD4+ Th1 세포에 의해 사용된 한 가지 주요 헬퍼 기전을 대표한다. 이것은 "메나제 뜨와(삼각관계)" 모델로 언급된다(Ridge et al, 1998). 이 기전을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 pY988 +/- UCP2의 혼합물로 면역화된 마우스로부터 수득된 DC에서의 공동자극 수용체 발현을 분석하였다. 도 8A에서 보는 바와 같이, UCP2/pY988 면역화된 마우스로부터의 림프절 CD11c+ DC는 pY988-면역화된 마우스에 비하여 보다 고수준의 CD86, CD80뿐만 아니라 HLA-클래스 II 분자를 발현하였다. 두 번째 세트의 실험에서, UCP2/IFA 또는 IFA 주사된 마우스로부터 분리된 CD4 T 세포를 도 8B에서 보는 바와 같이 동계 iDC와 공동배양하였다. 예상대로, UCP2-특이적 CD4 T 세포는 유의적인 양의 Th1 사이토카인(예, IFN-γ 및 GM-CSF)을 생성하였다(도 8C). 본 발명자들은 UCP2-특이적인 CD4 T 세포의 존재가 강력한 DC 활성화를 유도하였고 DC가 다량의 인터루킨-12를 생성할 수 있는 능력을 증강시켰음을 보여주었다(도 8D, E). 이들 결과는 종합해 보면 UCP2-특이적 T 세포의 자극이 생체내에서 DC의 표현형 및 기능을 결정한다는 것을 보여준다.
UCP2 헬퍼 펩티드는 주화 B16-A2 흑색종에 대한 자가/TERT CD8 펩티드의 백신 효능을 증강시킨다.
치료적 백신화 프로토콜에서 UCP의 헬퍼 역할을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 생체내에서 강력한 CTL 헬퍼 기능을 나타내는 UCP2 헬퍼 펩티드에 초점을 두었다. 공격적이고 빈약한 면역원성 B16F10-HLA-A*0201 흑색종을 A2/DR1 마우스에 사용하였다. 공지된 바와 같이 이 세포주는 기능성 쥐 TERT를 다량 발현하며(도 9A) 자가/TERT-특이적 CTL에 의해 인식된다(Adotevi et al, 2010). 2종 자가/TERT CTL 펩티드(pY572 + pY988/IFA) 단독으로 또는 그 펩티드를 UCP2 헬퍼 펩티드의 존재하에서 종양 보유 마우스를 2회 백신화하였다. 도 9B에서 보는 바와 같이, 보조제 IFA만 주사된 대조군은 25일째에 종양 성장 면적이 >200 mm2에 이르렀다. 이 전형적인 실험에서, pY572 + pY988/IFA로 백신화된 마우스 8마리중 1마리에서 종양 퇴행이 관찰된 한편 2마리에서는 종양 성장이 지연되었다. UCP2와 병용하여 pY988 + pY572/IFA로 면역화된 군에서는 완전한 종양 퇴행이 8마리 마우스중 5마리에서 일어났다. 따라서, 종양 세포 주사 후 50일까지의 생존율 분석에서 UCP2의 존재하에 백신화된 마우스의 63%가 살아있었고 이에 비해 pY988 + pY572/IFA가 주사된 마우스군은 13%가 살아있는 것으로 나타났다(p<0.05)(도 9C). 2개월 후, 무종양 마우스에서 항-pY988 효과기(effector) CTL 반응이 검출되었고, 이것은 생체내의 장기간 UCP2-특이적 CD4 T 세포 반응과 상관성이 있었다. 이러한 지속적인 T 세포 면역성은 B16/A2 종양의 이차 치사량에 대해 방어능을 제공한다.
종양 침윤 CD8 T 세포의 밀도는 종양 억제에 중요한 것으로 제시되었다(Galon et al, 2006). 이에, 본 발명자들은 동일한 백신화 프로토콜로 처치된 마우스에서 종양내 면역세포 침윤을 분석하였다. pY988 + pY572/IFA가 주입된 마우스군에 비하여 백신 + UCP2 헬퍼 펩티드가 주입된 마우스군에서 보다 높은 전체 CD3+CD8+ T 세포 침윤이 관찰되었다(67% 대 40%, p<0.05)(도 9E). 대조적으로, UCP 백신화는 NK 세포 또는 조절 T 세포 종양 침윤에 영향을 미치지 않았다(도 9E). 이 결과는 UCP2-특이적 면역반응이 종양 미세환경에서 주로 효과기 CTL을 작동시킨다는 것을 제시한다.
본 발명자들의 결과를 종합해 보면 UCP2 특이적 CD4 T 세포들이 생체내에서 종양-특이적 CTL 반응에 강력한 헬퍼 활성을 나타낸다는 것이 명백하다. 게다가, UCP2의 첨가는 종양 부위로 CD8 T 세포의 귀소에 영향을 미친다. 이러한 모든 데이터들은 항종 치료 백신화를 위한 UCP의 용도를 지지한다.
인간 암에서의 천연 UCP-특이적 CD4 T 세포 반응
암에서 TERT의 광범위한 발현에 근거하여 본 발명자들은 다른 조직학 근원의 암을 가진 환자에서의 UCP-특이적 CD4 T 세포 반응을 위해 연구하였다. 이를 위하여, 본 발명자들은 6일간 UCP로 직접 자극된 암환자로부터 채취된 혈액 림프구의 3H-티미딘 혼입을 측정하였다. 도 10A에서 보는 바와 같이, UCP 자극으로 특이적 T 세포 증식이 유도되었다. 이어서, PBMC의 단기간 시험관내 자극 후 IFN-γ ELISPOT에 의해 UCP-특이적 T 세포를 측정하였다. 본 발명자들은 결장암, 신장암, 폐암, 위암 및 백혈병과 같은 여러 암에서 UCP에 대한 다수의 IFN-γ 생성 T 세포를 발견하였다. 이 결과는 T 세포 증식 반응을 지지한다(도 10B). UCP-특이적 T 세포는 Th1 사이토카인을 주로 생성하지만 IL-4, IL-10 또는 IL-17은 전혀 생성하지 않는다. 이 결과는 본 발명자들의 생체내 연구와 일치한다(도 10C). 앞에서 제시된 바와 같이, 각 UCP에 대한 T 세포 반응이 또한 다양한 암을 나타내는 환자들의 PBMC에서 발견되었다. 이 결과는 UCP 에피토프가 불규칙적이라는 아이디어를 지지한다(도 10D). UCP-특이적 CD4 T 세포의 분극을 보다 정확하게 연구하기 위하여 본 발명자들은 직장암 반응 환자 1명으로부터 유도된 UCP4에 대해 특이적인 CD4 T 세포 클론을 생성하였다(도 11A). 건강한 기증자로부터의 CD4 T 세포에 비하여, 이들 클론은 T-bet mRNA를 2배 많은 수준으로 발현하였고, GATA-3, RORγc 및 Foxp3 mRNA는 더 적게 발현하였다(도 11B). 추가로, 이들 클론은 다량의 IFN-γ, TNF-α와 소량의 IL-10을 생성하였으나 IL-13이나 IL-17은 전혀 생성하지 않았는데 이는 Th1과 관련된 사이토카인 패턴이다(도 11C). 따라서, 위 결과들은 UCP-특이적 T 세포 레퍼토리가 암환자에서 자연발생적으로 자극받으며 이들 UCP-특이적 면역반응이 Th1 분극된 반응임을 가리킨다.
참고문헌
Figure 112014098862507-pct00001
Figure 112014098862507-pct00002
Figure 112014098862507-pct00003
Figure 112014098862507-pct00004
SEQUENCE LISTING <110> INVECTYS UNIVERSITE DE FRANCHE-COMTE CENTRE HOSPITALIER REGIONAL UNIVERSITAIRE DE BESANCON <120> UNIVERSAL CANCER PEPTIDES DERIVED FROM TELOMERASE <130> IP20142561FR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val 1 5 10 15 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Tyr Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Tyr Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val 1 5

Claims (16)

  1. 하기 펩티드의 조합을 포함하는 조성물:
    - KSVWSKLQSIGIRQH(서열번호 1); 및
    - SLCYSILKAKNAGMS(서열번호 3),
    상기에서, 조성물은 환자 내 종양을 치료하는데 사용하기 위한 백신 조성물이거나 약학 조성물임.
  2. 제1항에 있어서,
    - KSVWSKLQSIGIRQH(서열번호 1);
    - SLCYSILKAKNAGMS(서열번호 3);
    - GTAFVQMPAHGLFPW(서열번호 2); 및
    - PAAFRALVAQCLVCV(서열번호 4);
    의 4개의 펩티드의 조합을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    면역원성 종양 항원을 추가로 포함하는 백신 조성물인, 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에서 정의된 펩티드의 조합을 포함하는 약학 조성물로, 환자 내 종양을 치료하는데 사용하기 위한, 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    인간 환자 내 종양을 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 종양은 암인, 종양을 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 암은 만성 림프성백혈병, 만성 골수성백혈병, 다발성골수종, 악성골수종, 호지킨병, 흑색종, 뇌종양, 교모세포종, 신경모세포종, 성상세포종, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 두경부암, 위암 및 바이러스에 의해 유발된 암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 종양을 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
  8. 1개 이상의 HLA 클래스 II 분자에 결합된, 적어도 제1항에서 정의된 2개의 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트.
  9. 제8항에 있어서,
    적어도 제2항에서 정의된 4개의 펩티드가 결합되어 있는 비오티닐화된 HLA 클래스 II 분자 4개 이상을 포함하고, 상기 4개 이상의 비오티닐화된 HLA 클래스 II 분자는 아비딘 분자를 통해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  10. 제9항에 있어서
    상기 아비딘 분자는 검출가능하게 표지되는 것을 특징으로 하는, 컨쥬게이트.
  11. 환자로부터 텔로머라제에 대해 특이적인 CD4 T 세포 반응을 검출 또는 모니터링하는 시험관내 방법으로서,
    환자의 생물학적 시료를 제8항의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관내 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 환자는 종양 보유 환자인 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    환자가 항-종양 치료(anti-tumor therapy)를 필요로 하는지 아니면 조정된 항-종양 치료를 필요로 하는지를 결정 또는 모니터링하거나, 환자의 결과를 예측하거나, 또는 항-종양 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위한, 시험관내 방법.
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