KR102148425B1

KR102148425B1 - 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR102148425B1
Application number: KR1020200003309A
Authority: KR
Inventors: 박경수; 이승아; 이용덕; 이학모; 정성수
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 서울대학교병원
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2020-08-26
Also published as: WO2021141452A1; US20230088644A1

Abstract

본 발명은 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물 및 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로, 일 예에 따른 분화 유도용 조성물을 이용하거나, 일 예에 따른 분화 유도방법을 통해 다양한 종류의 줄기세포로부터 효율적으로 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하여 인슐린 생산세포를 단기간 내에 제조할 수 있고, 비교적 간편하게 인슐린 생산세포를 대량생산할 수 있어, 인슐린 생산세포 및/또는 이로부터 생산되는 인슐린을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

Description

인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물 및 이의 이용{Composition for inducing differentiation into insulin producing cells and uses thereof}

인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물 및 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.

당뇨병(diabetes mellitus)은 인슐린 작용의 결핍으로 인한 고혈당증을 특징으로 하는 만성대사 질환으로서 대사이상을 수반하는 질환으로 선진국 및 개발 도상국에서 모두 빠르게 증가하고 있다. 당뇨병은 원인에 따라 크게 두 가지 형태 (제1형, 제2형)로 구분된다. 제1형 당뇨병의 경우 자신의 면역세포가 인슐린 생산세포를 파괴하여 발생하는 당뇨병이며, 제2형 당뇨병의 경우 다양한 원인에 의하여 신체 내 장기/조직/세포 등이 인슐린에 대한 저항성에 기인하는 것으로 고혈당에 기인한 인슐린 생산세포의 기능저하 및 소실로 혈당의 조절이 원활하지 않게 되고 결과적으로 고혈당을 보이는 당뇨병 증상과 함께 그에 따른 합병증이 유발된다.

현재 당뇨병 환자들에게 이용될 수 있는 치료방법으로 경구 혈당 강하제 및 재조합 인슐린 제제 형태의 평생 약제(life long-medication)등이 있다. 이러한 약제 치료와 함께 엄격한 식이요법 및 생활 습관을 조절을 함에도 불구하고, 당뇨병 환자의 30%가 신경병증, 망막병증, 족부 궤양 등과 같은 경미한 질환(minor disorder)과 함께 신부전 및/또는 심장 문제를 나타낸다. 많이 활용되고 있는 인슐린 치료법은 식사 전, 후에 주사를 통하여 인슐린을 투여하는 방법으로서 인슐린은 피하주사로 투여하는 것을 원칙으로 하고 있고, 작용 시간에 따라 투여방법이 다르다. 인슐린 주사 투여는 먹는 약에 비해서 혈당 강하 효과가 더 빠르게 나타나고, 먹는 약을 사용할 수 없는 환경에서도 안전하게 사용할 수 있으며, 용량의 제한도 없지만, 하루에 3번씩 지속적으로 사용되어야 하기 때문에 주사침에 대한 거부감, 투여방법의 어려움, 저혈당 증상, 장기적인 인슐린투여에 의해 발생하는 체중증가 현상 등의 단점이 존재한다. 최근 당뇨 치료를 위하여 췌장 소도세포 이식(Pancreatic islet transplantation)을 시행하고 있으나, 췌장 이식은 공여자의 절대부족과 지속적인 면역억제제(immunosuppressor)의 투여 등 이용 가능성의 보편화와 부작용에 대한 문제점이 발생한다.

한편, 부족한 췌도 공여자에 대한 또 다른 대안으로 줄기세포로부터 인슐린을 생산하는 세포를 분화 및 증식시켜 환자에 이식함으로써 당뇨병을 치료하고자 하는 연구가 진행되고 있으나 그 성과가 미미하다. 실제 부족한 췌도를 대체할 목적으로 생체 외에서 배아줄기세포, 역분화 줄기세포 등 다양한 세포를 이용하여 인슐린을 생산하는 세포로 분화시킨 후 이식함으로써 당뇨병을 치료하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있으나 분화 효율 면에서 그 이용이 매우 제한적이고 천문학적인 비용 소모가 예상되며 안전성에 대한 우려가 있다.

이에, 인슐린 생산세포로의 우수한 분화 효율을 갖는 분화 유도 방법 및 분화 유도용 조성물에 대한 연구 개발이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1491108호

이에, 본 출원의 발명자들은 퓨트레신, 글루코사민, 및/또는 니코틴아미드를 포함하는 조성물이 단기간 내에 줄기세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화를 효율적으로 유도하는 것을 확인하고, 분화가 유도된 세포에서의 인슐린 분비 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 퓨트레신(putrescine) 단독; 또는 퓨트레신, 글루코사민(glucosamine), 및 니코틴아미드(nicotinamide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 및 배지를 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 배지 조성물에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인슐린 생산세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 따른 분화 유도용 조성물 및 환자 유래 혈액의 혼합물을 포함하는, 상기 환자에서의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도 방법으로 분화된 인슐린 생산세포를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 명세서에서, "인슐린 생산세포(insulin producing cell)"는 인슐린을 생산하여 분비할 수 있는 세포로서, 췌장 베타 세포와 동일한 기능을 수행할 수 있는 세포를 의미하며, 예를 들면 췌장 베타 세포일 수 있다.

본 명세서에서, “분화(differentiation)”란 세포가 특정 세포로 발달하는 것을 의미하며, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 구조나 기능이 특화되는 현상으로, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다.

본 명세서에서, "줄기세포(stem cell)"는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 재생할 수 있는 미분화 세포들을 의미한다. 상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간, 비-인간인 영장류, 및/또는 마우스(mouse), 랫트(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류 유래인 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 발달 가능한 다능성(multipotency), 만능성(pluripotency), 또는 전능성(totipotency) 세포일 수 있다.

본 명세서에서, 인슐린 생산세포로의 분화 유도 효과가 우수하다(또는 증가되었다)는 것은 하기 특징 중 1 이상의 결과를 나타내는 것일 수 있다:

(1) 세포에서 베타세포 발달 및 성숙에 관련된 유전자 및 단백질(예를 들면, INS(insulin), PDX1(Pancreas/duodenum homeobox protein 1), MAFA(V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A), NEUROG3(Neurogenin 3), NEUROD1(neurogenic differentiation 1), 및/또는 NKX6.1(Homeobox Protein Nkx6.1) 등)의 발현양이 증가;

(2) 글루코스 자극에 의해, 세포 내 및/또는 세포 밖으로 분비되는 인슐린 분비양(insulin secretion(μIU/㎖))이 증가;

(3) 작은 섬 모양의 클러스터(cluster) 형성; 및

(4) 인슐린 생산 세포로의 분화 시간 단축.

상기 PDX1은 베타세포를 포함한 췌장 외분비 및 내분비 세포의 발달에 필수적이고 인슐린 유전자의 전사를 증가시키고, 상기 MAFA는 인슐린 유전자의 인핸서/프로모터 영역에 결합하여 포도당에 결합하여 인슐린 발현을 유도한다고 알려져 있다.

기존에 알려진 분화 유도용 조성물을 사용하거나 기존에 알려진 분화방법(예를 들면, Pagliuca FW et al., 2014 Cell; Rezania A et al., 2014 Nat Biotechnol)에 의하면, 줄기세포를 인슐린 생산 세포로의 분화하는데 소요되는 시간은 약 40일 정도이다.

본 명세서에서, "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 상하 20% 이내, 10% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내, 또는 0.5% 이내의 값 또는 범위를 포함하는 의미로 해석될 수 있다.

일 예에서, 인슐린 생산 세포로의 분화 시간을 단축시킨다는 것은 일 예에 따른 분화 유도용 조성물을 적용하거나 일 예에 따른 분화방법으로 5 내지 25μIU/㎖, 5 내지 20μIU/㎖, 5 내지 15μIU/㎖, 10 내지 25μIU/㎖, 10 내지 20μIU/㎖, 또는 10 내지 15μIU/㎖ 범위로 인슐린을 분비하는 세포로까지 분화 유도 기간이 4일 내지 10일, 4일 내지 8일, 3일 내지 6일, 4일 내지 6일, 6일 내지 8일, 또는 6일 소요되는 것을 의미할 수 있다.

일 예에 따른 분화 유도용 조성물(분화 유도용 배지 조성물)을 적용하거나 일 예에 따른 분화방법으로 5x10⁵ 내지 5x10⁷ cells/㎖, 5x10⁵ 내지 5x10⁶ cells/㎖, 또는 5x10⁶ 내지 5x10⁷ cells/㎖의 세포를 4 일 내지 10일, 4일 내지 8일, 3일 내지 6일, 4일 내지 6일, 6일 내지 8일, 또는 6일 동안 분화 유도한 세포를 포도당(glucose)으로 자극(예를 들면 1 내지 30mM의 glucose가 포함된 배지에서 1일 내지 5일 또는 3일 동안 배양)하면, 세포는 5 내지 25μIU/㎖, 5 내지 20μIU/㎖, 5 내지 15μIU/㎖, 10 내지 25μIU/,㎖10 내지 20μIU/㎖, 또는 10 내지 15μIU/㎖의 인슐린을 분비할 수 있다.

일 양상은 퓨트레신(putrescine), 또는

퓨트레신, 글루코사민(glucosamine), 및 니코틴아미드(nicotinamide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

일 예에서 상기 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물은 퓨트레신을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물은 퓨트레신 및 글루코사민을 포함하거나 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 퓨트레신 및 글루코사민의 조합 또는 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드의 조합에 의하여 조성물의 인슐린 생산 세포로의 분화 유도 효과가 상승적으로 증가될 수 있다.

상기 퓨트레신(putrescine)은 "1,4-부탄다이아민(1,4-diaminobutane 또는 1,4-butanediamine)"으로서, 박테리아에서 동식물과 같은 전범위의 유기체에서 발견되는 폴리아민의 한 종류이고, 퓨트레신은 세포 증식과 정상 세포성장에서 중요한 역할을 하며, 산화적 스트레스에 방어 기작에도 중요한 물질로 알려져 있다.

일 예에 따르면, 다양한 종류의 폴리아민 중에서 퓨트레신은 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도할 수 있는 유효물질로 작용할 수 있다. 상기 퓨트레신은 퓨트레신 외의 폴리아민(예를 들면, 스퍼미딘(spermidine), 또는 스퍼민(spermine))과 달리 세포배양에 사용될 수 있는 물질(예를 들면, FBS(fetal bovine serum)) 등에 존재하는 폴리아민 옥시다제(polyamine oxidase)에 의해 독성물질(toxic metabolites) (예를 들면, 알데하이드(aldehydes))을 생성하지 않는다.

상기 글루코사민(glucosamine)은 아미노당의 일종으로 당단백질과 당지질의 생화학적 결합의 주요 전구체이며, 갑각류를 비롯한 여러 절지동물의 외골격이나 진균류 등의 세포벽을 구성하는 주성분인 키토산이나 키틴 같은 다당류 구조의 일부분을 이룬다.

일 예에 따르면, 퓨트레신 및 글루코사민을 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)은 퓨트레신 또는 글루코사민을 각각 포함하는 조성물 보다 인슐린 생산세포로의 분화 효과가 현저히 우수할 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 퓨트레신 및 글루코사민을 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)에서 퓨트레신의 농도는 1 내지 20mM, 1mM 이상 내지 20mM 미만, 5 내지 20mM, 5mM 이상 내지 20mM 미만, 1 내지 15mM, 5 내지 15mM, 1 내지 10mM, 또는 5 내지 10mM일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 퓨트레신 및 글루코사민을 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)에서 글루코사민의 농도는 1 내지 20mM, 1mM 이상 내지 20mM 미만, 5 내지 20mM, 5mM 이상 내지 20mM 미만, 1 내지 15mM, 5 내지 15mM, 1 내지 10mM, 또는 5 내지 10mM일 수 있다.

일 예에서, 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물) 내 퓨트레신 농도 또는 글루코사민 농도가 20mM을 초과하거나 20mM 이상일 경우, 상기 조성물을 인슐린 생산 세포로의 분화 용도로 사용시 세포 생존율(cell viability)이 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 37% 이하, 5 내지 70%, 5 내지 60%, 5 내지 50%, 5 내지 40%, 5 내지 37%, 35 내지 50%, 35 내지 40%, 또는 36 내지 40%일 수 있어 세포 분화에 적절하지 않을 수 있다.

일 예에 따르면, 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드을 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)은 퓨트레신, 글루코사민, 및/또는 니코틴아미드를 포함하는 조성물 보다 인슐린 생산세포로의 분화 효과가 현저히 우수할 수 있다.

일 예에 따르면, 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드를 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)에서 퓨트레신의 농도는 1 내지 20 mM, 1mM 이상 내지 20mM 미만, 5 내지 20mM, 5mM 이상 내지 20mM 미만, 1 내지 15mM, 5 내지 15mM, 1 내지 10mM, 또는 5 내지 10mM일 수 있다.

일 예에 따르면, 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드를 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)에서 글루코사민의 농도는 1 내지 20 mM, 1mM 이상 내지 20 mM미만, 5 내지 20 mM, 5mM 이상 내지 20mM 미만, 1 내지 15mM, 5 내지 15mM, 1 내지 10mM, 또는 5 내지 10mM일 수 있다.

일 예에 따르면, 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드를 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)에서 니코틴아미드의 농도는 1 내지 20 mM, 1mM 이상 내지 20 mM미만, 5 내지 20 mM, 5mM 이상 내지 20mM 미만, 1 내지 15mM, 5 내지 15mM, 1 내지 10mM, 또는 5 내지 10mM일 수 있다.

일 예에 따른 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물은 유전자 조작을 배제하기 때문에 안전하며, 기전이 명확하지 않은 고가의 화합물 또는 성장인자 없이도 인슐린 생산세포로의 분화를 유도할 수 있으며, 단기간 내(예를 들면, 1일 내지 10일, 1일 내지 9일, 1일 내지 8일, 1일 내지 7일, 1일 내지 6일, 2일 내지 10일, 3일 내지 9일, 4일 내지 8일, 4일 내지 6일, 또는 6일 내)에 인슐린 생산세포로의 분화를 간편하게 유도할 수 있고, 세포의 오염 변성 등을 최소화할 수 있는 장점을 가지고 있다.

일 예에서, 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물) 내 퓨트레신 농도, 글루코사민 농도, 또는 니코틴아미드 농도가 20mM을 초과하거나 20mM 이상일 경우, 상기 조성물을 인슐린 생산 세포로의 분화 용도로 사용시 세포 생존율이 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 37% 이하, 5 내지 70%, 5 내지 60%, 5 내지 50%, 5 내지 40%, 5 내지 37%, 35 내지 50%, 35 내지 40%, 또는 36 내지 40%일 수 있어 세포 분화에 적절하지 않을 수 있다.

일 예에 따른 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물은

일 예에서, 상기 분화 유도용 조성물은 STAT3 억제제(STAT3 inhibitor)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)은 배양이 시작된 후 0 내지 8일차, 2 내지 6일차, 3일 내지 5일차, 2일 내지 4일차, 3일 내지 4일차, 4일 내지 5일차, 또는 4일차에 STAT3 억제제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 일 예에 따르면, 상기 범위의 시기에 분화 유도용 조성물이 STAT3 억제제를 추가적으로 포함하면, 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)의 인슐린 생산세포로의 분화 유도 효과가 현저히 증가될 수 있다.

일 예에 따르면, 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드, 및 STAT3 억제제를 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)은 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드, 및/또는 STAT3 억제제를 포함하는 조성물 보다 인슐린 생산세포로의 분화 효과가 현저히 우수할 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드, 및 STAT3 억제제를 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)에서 퓨트레신의 농도는 1 내지 20mM, 1mM 이상 내지 20 mM 미만, 5 내지 20mM, 5mM 이상 내지 20 mM 미만, 1 내지 15mM, 5 내지 15mM, 1 내지 10mM, 또는 5 내지 10mM일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드, 및 STAT3 억제제를 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)에서 글루코사민의 농도는 1 내지 20mM, 1mM 이상 내지 20mM 미만, 5 내지 20mM, 5mM 이상 내지 20mM 미만, 1 내지 15mM, 5 내지 15mM, 1 내지 10mM, 또는 5 내지 10mM일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드, 및 STAT3 억제제를 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)에서 니코틴아미드의 농도는 1 내지 20mM, 1mM 이상 내지 20mM 미만, 5 내지 20mM, 5mM 이상 내지 20mM 미만, 1 내지 15mM, 5 내지 15mM, 1 내지 10mM, 또는 5 내지 10mM일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드, 및 STAT3 억제제를 포함하는 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)에서 STAT3 억제제의 농도는 0.01 내지 100μM, 0.1 내지 100μM, 0.1 내지 50uM, 0.5 내지 50uM, 0.1 내지 20uM, 0.1 내지 15uM, 0.5 내지 15uM, 0.5 내지 10uM, 0.1 내지 10uM, 1 내지 20uM, 1 내지 15uM, 또는 1 내지 10uM일 수 있다.

STAT(Signal Transducer and Transcriptions)은 STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6의 일곱개의 subunit 형태를 가지는 전사인자로서, 특히 STAT3는 다양한 경로를 통해 지속적으로 활성화되어 종양형성을 촉진하는 역할을 하고, 세포에서 여러 유전자의 전사에 관여하는 전사조절인자이며, 정상적인 경우, 외부로부터 사이토카인이나 성장 요소들에 의한 신호전달에 반응하여, 세포질에 존재하던 STAT3는 핵 안으로 이동하여 세포의 발달, 분화, 생장, 생존, 신생혈관합성 그리고 면역기능 등을 위한 유전자들을 조절한다,

일 예에서, 상기 STAT3 억제제는 JSI-124, BP-1-102, CPT, STA-21(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), AG-490((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드(Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀(Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트(Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825(Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4 pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE(3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱(Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트(Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione), 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 STAT3 억제제는 유기용매에 용해된 형태로 추가될 수 있고, 상기 유기용매는 통상적으로 사용될 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, DMSO, DMF, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알콜, 물, 다이클로로메테인, THF, 및/또는 에틸아세테이트일 수 있다.

상기 BP-1-102(Cas No. 1334493-07-0)는 하기 화학식 1의 화학식을 갖는 것일 수 있고, 일 예에 따르면, STAT3 억제제 중에서도 BP-1-102를 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물에 추가로 포함하면, 다른 STAT3 억제제(예를 들면, JSI-124 및/또는 CPT)를 추가한 것 보다 인슐린 생산 세포로의 분화 유도 효과가 우수한 것일 수 있다. 일 예에 따르면, 상기 BP-1-102는 유기용매에 용해되어 첨가될 수 있으며, 상기 분화 유도용 조성물 내에서 BP-1-102의 농도는 0.1 내지 100μM, 0.1 내지 50μM, 1 내지 50μM, 5 내지 50μM, 5 내지 20μM, 1 내지 10μM, 5 내지 10μM, 5 내지 15μM, 10 내지 20μM, 10 내지 15μM, 또는 10μM일 수 있다.

[화학식 1]

상기 JSI-124(Cas No. 2222-07-3)는 하기 화학식 2의 화학식을 갖는 것일 수 있고, 일 예에 따르면, STAT3 억제제 중에서도 JSI-124를 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물에 추가로 포함하면, 다른 STAT3 억제제(예를 들면, CPT)를 추가한 것 보다 인슐린 생산 세포로의 분화 유도 효과가 우수한 것일 수 있다. 일 예에 따르면, 상기 JSI-124는 유기용매에 용해되어 첨가될 수 있으며, 상기 분화 유도용 조성물 내에서 JSI-124의 농도는 0.01 내지 100μM, 0.1 내지 100μM, 0.1 내지 50μM, 0.1 내지 30μM, 0.1 내지 20μM, 0.1 내지 15μM, 0.1 내지 10μM, 0.1 내지 5μM, 0.1 내지 1μM, 또는 0.1μM일 수 있다.

[화학식 2]

일 예에서, 상기 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물은 성체 줄기세포(adult stem cells), 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells), 및 전발생세포(progenitor cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세포를 인슐린 생산세포로 분화 유도할 수 있는 것일 수 있다.

상기 세포, 예를 들면, 성체 줄기세포(adult stem cells), 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)는 인간, 비-인간인 영장류, 및/또는 마우스(mouse), 랫트(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류 유래인 것일 수 있다.

일 예에 따른 분화 유도용 조성물, 분화 유도용 배지 조성물 및/또는 분화 방법은 다양한 종류의 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화를 유도할 수 있어, 세포의 종류에 제한되지 않고, 수득이 용이한 세포(예를 들면, 제대혈 줄기세포 또는 골수세포)로부터 인슐린 생산세포로의 분화를 효율적으로 유도할 수 있어, 간편하게 인슐린 생산세포의 대량 생산이 가능하다.

배아줄기세포(embryonic stem cells)는 수정란에서 유래하는 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 갖는 줄기세포이다.

유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells)는 역분화 줄기세포라고도 불리며, 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌림으로써, 배아줄기세포처럼 만능성을 유도해 낸 세포를 의미한다.

전발생세포(progenitor cells)는 줄기세포와 유사하게 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖지만, 줄기세포보다 특이적이고 표적화되어 있으며, 줄기세포와 달리 분열 횟수가 유한하다. 상기 전발생 세포는 중간엽 유래의 전발생세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 전발생세포는 줄기세포 범주에 포함되며, 특별한 언급이 없는 한 '줄기세포'는 전발생세포도 포함하는 개념으로 해석된다.

성체 줄기세포(adult stem cell)는 제대(탯줄), 제대혈(탯줄혈액) 또는 성인의 골수, 혈액, 신경, 피부, 지방 등에서 추출한 줄기세포로, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 상기 성체 줄기세포는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 성 체줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 다양한 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있어서, 난치병/불치병 치료에 유리하게 적용될 수 있다.

일 예에서, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)일 수 있다. 중간엽 줄기세포는 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cell; MSC)라고도 불리며, 골모세포(osteoblasts), 연골모세포(chondrocytes), 근육세포 (myocytes), 지방세포(adipocytes) 등과 같은 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포(multipotent stromal cell)를 의미한다. 중간엽줄기세포는 태반 (placenta), 제대(umbilical cord), 제대혈(umbilical cord blood), 지방 조직 (adipose tissue), 성체 근육(adult muscle), 각막 기질(corneal stroma), 젖니의 치아 속질(dental pulp) 등과 같은 비골수 조직(non-marrow tissues) 등으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 배아 중간엽 줄기세포(Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Stem Cell(ES-MSC))일 수 있다.

본 명세서에서, 배지(culture media)는 생체 외에서 인슐린 생산세포로의 분화 유도 및 세포의 생존을 지지할 수 있게 하는 것을 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 일 예에서 배양에 사용되는 배지는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

일 예에서, 상기 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물은 CMRL1066, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), McCoy's 5A, 199 배지, 및 내피세포 성장 배지 MV2(Endothelial Growth Medium MV2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 배지를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 배지는 세포의 종류 및/또는 목적하는 바에 따라 무혈청 배지이거나, 성장인자의 공급원으로서 혈청(예를 들면, FBS(fetal bovine serum), BVS(bovine calf serum), 말 혈청(horse serum), 인간 혈청(human serum) 등) 및/또는 항생제(예를 들면, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등)를 추가로 포함할 수 있다.

상기 CMRL1066 배지는 글라이코실아민(glycosylamines)인 뉴클레오사이드(nucleosides)와 비타민, 성장요소인자가 풍부한 배지로 세포 배양에 널리 쓰이는 배지이고, 종래에 인슐린 생산세포로의 분화용 배지로 사용된 바는 없다.

일 예에서, 상기 CMRL1066 배지는 10% FBS를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 CMRL1066 배지는 글루코스(glucose), FBS, 및 항생제를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 CMRL1066 배지는 D-Glucose 약 1000mg/L, Phenol Red 약20mg/L, 및 Sodium Bicarbonate 약 2200mg/L를 포함하고, pH는 7.3 ±0.3인 것일 수 있다. 상기 CMRL1066 배지는 시판되는 것을 이용할 수 있다.

일 예에서, 상기 DMEM 배지는 글루코스, FBS, 및 항생제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 DMEM 배지는 시판되는 것을 이용할 수 있으며 예를 들면, Hyclone에서 제조된 것일 수 있고, 카탈로그 번호가 SH30021, SH30022, 또는 SH30307인 것일 수 있다. 상기 DMEM 배지는 D-Glucose 약 1000mg/L, Phenol Red 약 15 내지 16mg/L, 및 Sodium Bicarbonate 약 3700mg/L를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물은 기존에 알려진 인슐린 생산세포로의 분화 유도 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 상기 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물, 및 배지를 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.

일 예에서, 상기 배지는 CMRL1066, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), McCoy's 5A, 199 배지, 및 내피세포 성장 배지 MV2(Endothelial Growth Medium MV2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있다. 상기 배지에 대한 것은 전술한 바와 같다.

일 예에 따르면, 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드를 포함하는 조성물 및 CMRL1066 배지를 포함하는 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 배지 조성물은 다른 종류의 배지를 포함하는 배지 조성물 보다 인슐린 생산세포로의 분화 유도 효과가 현저히 우수할 수 있다.

일 예에서 상기 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 배지 조성물은 기존에 알려진 인슐린 생산세포로의 분화 유도 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있다.

일 예에서, 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드, STAT3 저해제(예를 들면, JSI-124, BP-1-102, 또는 CPT), 및 CMRL1066로 이루어진 분화 유도용 조성물(또는 분화 유도용 배지 조성물)은 이외의 다른 유효성분을 포함하지 않아도, 줄기세포로부터 인슐린 생산 세포로의 분화 유도 효과가 우수한 것일 수 있다.

다른 양상은 분리된 세포를 상기 분화 유도용 배지 조성물(또는 상기 분화 유도용 조성물)에서 배양하는 단계를 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

상기 배양하는 단계에서, 세포는 부착 배양 및/또는 부유 배양될 수 있다.

일 예에서, 상기 배양하는 단계는 인슐린 생산 세포로의 분화에 최적 조건을 유지시켜주는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 배양하는 단계는 분리된 세포를 상기 배지 조성물에서 35 내지 38℃의 온도 및 5% CO₂의 조건에서 3일 내지 6일 동안 배양하는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 배양하는 단계는 세포를 0.5x10⁶cells/㎖ 내지 10⁷cells/㎖, 0.5x10⁶cells/㎖ 내지 5x10⁶cells/㎖, 5x10⁶cells/㎖ 내지 10⁷cells/㎖ 또는 5x10⁶cells/㎖ 농도로 배지 조성물을 포함하는 플레이트에 분주하고, 25 내지 40℃, 28 내지 38℃, 25내지 35℃, 35 내지 38℃, 35 내지 37℃ 또는 37℃의 온도 및 7.0 내지 7.5, 7.1 내지 7.4, 또는 7.3의 pH 조건에서 1일 내지 14일, 1일 내지 12일, 1일 내지 10일, 1일 내지 8일, 1일 내지 7일, 1일 내지 6일, 2일 내지 14일, 4일 내지 14일, 6일 내지 14일, 2일 내지 10일, 3일 내지 9일, 3일 내지 8일, 3일 내지 6일, 4일 내지 6일, 또는 6일 동안 배양하는 것일 수 있다.

일 예에 따르면 상기 배양하는 단계에서 분리된 세포를 포함하는 배지 조성물은 10 내지 100 rpm, 10 내지 80rpm, 30 내지 80rpm, 80rpm, 또는 30 내지 60rpm의 속도로 교반될 수 있다.

상기 pH 범위를 유지하기 위해서 5% CO₂가 보강된 공기를 사용하거나 탄산염 완충용액이 사용될 수 있다.

상기 배지 조성물에서 배지는 CMRL1066, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), McCoy's 5A, 199 배지, 및 내피세포 성장 배지 MV2(Endothelial Growth Medium MV2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있다. 상기 배지에 대해서는 전술한 바와 같다.

일 예에 따르면, 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아마이드를 포함하는 조성물 및 CMRL1066 배지를 포함하는 배지 조성물에서 세포를 배양하면 CMRL1066 배지 외의 다른 종류의 배지를 포함하는 배지 조성물에서 배양한 것 보다 인슐린 생산세포로의 분화 유도 효과가 현저히 우수할 수 있다.

일 예에서, 상기 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법은 배양하는 단계에서 세포를 1일 내지 14일, 1일 내지 12일, 1일 내지 10일, 1일 내지 8일, 1일 내지 7일, 1일 내지 6일, 2일 내지 14일, 4일 내지 14일, 6일 내지 14일, 2일 내지 10일, 3일 내지 9일, 4일 내지 8일, 4일 내지 6일, 또는 6일 동안 배양시에 일 예에 따른 분화 유도용 조성물이 포함되지 않은 배지 조성물에서 배양한 대조군 대비 베타세포 분화 관련 인자의 mRNA 또는 단백질 발현을 약 1 내지 500배, 1 내지 100배, 10 내지 50 배, 또는 1 내지 10배 증가시킬 수 있다.

일 예에서, 상기 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법은 세포 배양 후 2일 내지 6일차, 3일 내지 5일차, 2일 내지 4일차, 3일 내지 4일차, 4일 내지 5일차, 또는 4일차에 배지 조성물에 STAT3 억제제를 첨가하여 세포를 배양하는 것일 수 있다. 상기 범위의 시기에 STAT3 억제제를 첨가한 경우, 상기 범위 이외의 시기에 STAT3억제를 첨가한 경우보다 인슐린 생산세포로의 분화 유도 효과가 우수할 수 있다.

일 예에서, 퓨트레신, 글루코사민, 및/또는 니코틴아미드를 포함하는 배지 조성물에서 세포(분리된 세포)를 배양하고, 배양 후 2일 내지 6일차, 3일 내지 5일차, 2일 내지 4일차, 3일 내지 4일차, 4일 내지 5일차 또는 4일차에 배지 조성물에 STAT3 억제제(예를 들면, BP-1-102 및/또는 JSI-124)를 첨가하여 세포를 배양하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 STAT3 억제제는 JSI-124, BP-1-102, 및 CPT로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. STAT3 억제제에 대해서는 전술한 바와 같다.

일 예에서, 상기 세포는 성체 줄기세포, 배아 줄기세포, 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 성체 줄기세포, 배아 줄기세포, 유도 만능줄기세포(역분화 만능줄기세포), 및 전발생세포에 대해서는 전술한 바와 같다.

다른 양상은 상기 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 분화된 인슐린 생산세포를 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 명세서에서, '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류될 수 있다.

본 명세서에서, "당뇨(Diabetes)병"은 인슐린의 분비량이 부족하거나 인슐린의 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환 (metabolic disease)를 의미한다.

또 다른 양상은 분화 유도용 조성물 및 환자 유래 혈액의 혼합물을 포함하는, 상기 환자에서의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 환자 유래 혈액은 환자로부터 채취되어 분리된 것일 수 있다.

상기 환자 유래 혈액은 환자 유래 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 환자 유래 성체 줄기세포(adult stem cells), 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세포를 포함할 수 있다. 상기 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 혈액 내에 포함된 환자 유래 세포가 상기 분화 유도용 조성물에 의해 분화된 인슐린 생산세포를 포함하는 것일 수 있다.

상기 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 혈액이 분리된 환자에 적용되어 면역 거부 반응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있어 효율적으로 당뇨병 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.

상기 환자는 당뇨병에 걸릴 위험이 있거나 당뇨병을 진단 받은 개체일 수 있고, 상기 개체는 당뇨병이 발생할 수 있는 임의의 포유동물, 예를 들면 인간 및 영장류 뿐만 아니라 소, 돼지, 양, 말, 개, 및 고양이 등 가축일 수 있다.

다른 양상은 상기 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 분화된 인슐린 생산세포를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 당뇨병은 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병일 수 있다.

본 명세서에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학적 조성물들의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속성 제제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있고 상기 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's PharmaceuticalSciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제, 주입제 등이 바람직하다. 또한, 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 투여량은 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹⁰ 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

일 예에 따른 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 기존 당뇨병 치료제의 부작용 및 안정성 문제 등을 해결한 새로운 당뇨병 세포 치료제로 사용할 수 있다.

일 예에 따른 분화 유도용 조성물을 이용하거나, 일 예에 따른 분화 유도방법을 통해 다양한 종류의 줄기세포로부터 효율적으로 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하여 인슐린 생산세포를 단기간 내에 제조할 수 있고, 비교적 간편하게 인슐린 생산세포를 대량생산할 수 있어, 인슐린 생산세포 및/또는 이로부터 생산되는 인슐린을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

도 1a는 STZ 투여에 의해 제조된 당뇨병 모델 마우스에 퓨트레신으로 감작된세포를 이식하여 혈당을 측정하는 실험 과정에 대한 모식도를 나타내고, 도 1b는 세포를 이식받은 당뇨병 모델 마우스의 혈당(좌측 그래프) 및 체중(우측 그래프)을 측정한 결과를 나타낸다. 도 1b에서 대조군(control)은 당뇨병이 유발되지 않은 정상 마우스를 나타내고, (STZ)는 당뇨병 모델 마우스를 나타내며, (STZ+ control cells)는 분화가 유도되지 않은 골수세포가 이식된 당뇨병 모델 마우스를 나타내고, (STZ + Put-primed cells)는 퓨트레신으로 감작된 골수세포를 이식받은 당뇨병 모델 마우스를 나타낸다.
도 2a는 퓨트레신을 첨가하여 분화를 유도시킨 인간 골수 줄기세포에서, 인슐린(INS), 및 인슐린을 생산하는 베타세포 분화를 촉진하는 인자(MAFA, PDX-1, NEUROG3)의 유전자 발현양을 나타내고, 도 2b는 퓨트레신을 첨가하여 분화를 유도시킨 제대혈 줄기세포에서, 인슐린(INS), 및 인슐린을 생산하는 베타세포 분화를 촉진하는 인자(MAFA, NEUROG3)의 유전자 발현양을 나타낸다. 도 2a에서 *는 p<0.05; **는 p<0.01을 의미하고, 이하 도면에서도 동일하다.
도 3은 마우스 골수세포에 글루코사민 및/또는 퓨트레신을 처리하여 분화를 유도한 세포에서의 인슐린(INS) 및 베타세포 분화 관련 유전자(MAFA, PDX1, 또는 NEUROG3)의 발현양을 나타낸다. 도 3에서 'GlcN' 은 글루코사민을 의미하고, 'Put'은 퓨트레신을 의미하며 '-'는 해당 성분이 포함되지 않은 것을 의미하고, '+'는 해당 성분이 포함된 것을 의미한다. 다른 도면에서도 마찬가지이다.
도 4는 제대혈 줄기세포에 글루코사민, 퓨트레신, 및/또는 니코틴아미드를 처리하여 분화를 유도한 세포에서의 인슐린(INS) 및 베타세포 분화 관련 유전자(MAFA, PDX1, 또는 NEUROG3)의 발현양을 나타낸다. 도 4에서 'GlcN' 은 글루코사민을 의미하며, 'Put'은 퓨트레신을 의미하고, NAD는 니코틴아미드를 의미하며, 다른 도면에서도 마찬가지이다.
도 5는 골수세포에 글루코사민, 퓨트레신, 및/또는 니코틴아미드를 처리하여 분화를 유도한 세포에서의 인슐린(INS) 및 베타세포 분화 관련 유전자(PDX1)의 발현양을 나타낸다.
도 6은 DMEM 또는 CMRL1066 배지에서 제대혈 단핵구 세포에 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 처리하여 분화를 유도한 세포에서의 인슐린(INS) 및 베타세포 분화 관련 유전자(MAFA, PDX1, NEUROG3, NEUROD1, 또는 NKX6.1)의 발현양을 나타낸다. 구체적으로 도 6의 좌측 이미지는 RT-PCR의 결과를 나타내고 도 4의 우측 그래프는 각 유전자에 대한 실시간 PCR의 결과를 나타낸다. 도 6에서 NIT-1은 마우스 유래 분화가 완료된 인슐린 생산세포주(베타세포주; insulinoma)를 의미하고, 이하 도면에서도 동일하다. 도 6에서 '-'는 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 포함하지 않은 배지에서 배양한 세포에 대한 결과를 의미하고, 'P+G+N' 또는 'P/G/N'은 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 포함하는 배지에서 분화를 유도한 세포에서의 결과를 의미한다.
도 7a는 인간 배아 중간엽 줄기세포에 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 처리하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도시키는 방법에 대한 모식도를 나타낸다. 도 7b는 배아 중간엽 줄기세포에 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 함께 처리하여 분화를 유도시킨 세포에 대해 인슐린 및 베타세포 분화 관련 유전자(PDX1, NEUROG3, NEUROD1, 또는 NKX6.1)의 발현양을 비교한 결과(RT-PCR)를 나타낸다. 도 7b에서 CTL은 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드가 포함되지 않은 CMRL 1066배지에서 배양된 대조군(control)을 의미하고, 숫자 1, 2, 및 3은 동일 조건에서의 반복된 실험결과를 각각 나타낸다.
도 8a는 마우스 골수세포에, 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 함께 처리하여 세포를 배양하고, 배양 후 0(배양 시작시), 2, 또는 4일차에 각각 STAT3 억제제인 JSI-124를 처리하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도하는 방법에 대한 모식도를 나타낸다. 도 8b는 골수세포에 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 함께 처리하여 세포를 배양하고, 배양 후 0, 2, 또는 4일차에 각각 STAT3 억제제인 JSI-124를 처리하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도시킨 세포에 대해 인슐린 및 베타세포 분화 관련 유전자(PDX1, NEUROG3, 또는 NEUROD1)의 발현양을 비교한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 8b에서 좌측 이미지는 RT-PCR 결과를 나타내고, 우측 그래프는 실시간 PCR결과를 나타내며, 도 8b의 우측 그래프에서 '-'는 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드만을 처리하고, STAT3 억제제를 처리하지 않은 그룹을 의미한다.
도 9a는 제대혈 단핵구 세포에, 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 함께 처리하여 세포를 배양하고, 배양 후 4일차에 다양한 종류의 STAT3 억제제(JSI-124, CPT, 또는 BP-1-102)를 처리하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도하는 방법에 대한 모식도를 나타낸다. 도 9b는 제대혈 단핵구 세포에 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 함께 처리하여 세포를 배양하고, 배양 후 4일차에 다양한 종류의 STAT3 억제제(JSI-124, CPT, 또는 BP-1-102)를 처리하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도시킨 세포에 대해 인슐린 및 베타세포 분화 관련 유전자(MAFA, PDX1, NEUROG3, NEUROD1, 또는 NKX6.1)의 발현양을 비교한 결과를 나타낸다.(도 9b에 CPT에 대한 결과는 나타나지 않음)
도 10a는 제대혈 단핵구 세포에 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 함께 처리하여 세포를 배양하고, 배양 후 4일차에 BP-1-102를 처리한 후 6일 동안 세포를 부유 배양하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도하고 세포를 세척 후 CMRL 1066 배지로 재부유한 뒤 3일간 추가 배양하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도하는 방법에 대한 모식도를 나타낸다. 도 10b는 도 10a에 기재된 방법으로 분화 유도된 세포에서 인슐린 분비양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 11a은 분화 유도용 조성물 내 퓨트레신 농도에 따른 인슐린 생산 세포로의 분화 유도 효과를 나타낸다.
도 11b는 분화 유도용 조성물 내 퓨트레신 농도에 따른 세포 생존율(cell viability, %)를 나타낸다.

본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1. 퓨트레신에 의한 인슐린 생산 세포로의 분화 유도

실시예 1.1 당뇨병 모델 마우스에서의 혈당 감소 효과

본 실시예에서 퓨트레신을 이용하여 감작된 골수세포 당뇨병 모델 마우스에서 혈당을 조절하는 능력이 있는지 여부를 살펴보고자 하였다.

8주령의 C57B/6 마우스(서울대학교 실험동물자원 관리원)의 대퇴골과 경골을 분리하고, 장골에서 골수를 적출한 뒤, 용혈용액(BD Pharmingen)을 이용하여 적혈구를 제거하고, 표준배지로 골수세포(골수 줄기세포) 재부유시켜 실험에 사용하였다. 5.5mM 글루코스, 10% FBS, 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco´s Modified Eagle Medium)(표준배지)에 골수세포를 5x10⁶cells/㎖로 부유시켜, 세포의 부착이 저해된 12-웰 플레이트에 분주하고, 웰에 최종 농도가 10mM가 되도록 퓨트레신을 처리하여 부유배양용 세포배양 인큐베이터(37℃, 5% CO₂, 90-95% humidity)에서 30 내지 60rpm으로 6일간 부유배양하였다.

퓨트레신을 10mM의 농도로 함유하는 표준배지(DMEM)에서 6일간 배양하여 감작된-골수세포(2X10⁶개)를 matrigel(BD)과 1:1의 부피비로 혼합하여 준비하였다.

8주령의 C57BL/6 마우스; 오리엔트 바이오)에 140mg/kg의 streptozotocin(STZ, Sigma)을 복강 내로 투여하였고, STZ 투여 후 3일차에 혈당을 측정하여 400mg/dl 이상의 혈당을 보이는 개체를 당뇨가 유발된 마우스로 선별하여 당뇨병 모델 마우스를 제작하였다. 당뇨병 모델 마우스에 상기에서 퓨트레신으로 감작된 세포를 각각 STZ 투여 후 3일차 및 14일차에 걸쳐 두 차례 피하지방에 이식(2x10⁶cells)하였다. STZ 투여 후 28일 동안 세포를 이식받은 당뇨병 모델 마우스의 혈당 및 체중을 측정하여 도 1b에 나타내었다.

도 1b에 나타난 바와 같이, STZ 투여 그룹 및 STZ 및 퓨트레신으로 감작되지 않은 세포를 이식받은 그룹(STZ+ control cells)에서 정상 마우스(control) 대비 혈당이 증가되었고 체중이 감소되었으나, 퓨트레신으로 감작된 세포(Put-primed cells)를 이식받은 그룹에서 혈당(blood glucose)의 증가가 저해되었고, 당뇨에 의한 체중(body weight) 감소가 억제되었다.

실시예 1.2 인간 골수세포의 분화

본 실시예에서 퓨트레신에 의해 인간 유래 줄기세포가 인슐린 생산세포로 분화 유도되는지 검증하였다. 백인 남성 donor의 골수세포(whole bone marrow cells; 고마바이오텍)에서 인간 유래 골수세포(골수 줄기세포)를 준비하였다.

부착이 저해된 12-웰 플레이트에 5.5mM 글루코스, 10% FBS, 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지 및 5mM의 농도가 되도록 퓨트레신을 첨가하고 인간 유래 골수세포를 5x10⁶cells/㎖로 분주하여 부유배양용 세포배양 인큐베이터(37℃, 5% CO₂)를 이용하여 30 내지 60rpm으로 부유배양하였다.

인슐린 생산세포의 출현여부는 배양 후 6일차의 세포를 수집하여 실시간 PCR(real-time PCR) 방법으로 인슐린(INS), 및 인슐린을 생산하는 베타세포 분화를 촉진하는 인자(MAFA, PDX-1, NEUROG3)의 유전자 발현양을 측정하여 이를 도 2a에 나타내었다.

구체적으로, 배양 후 6일차의 세포를 수집하여, 총 RNA를 추출하였다. 나노드랍 분광 나노드랍 분광 광도계(NanoDrop Technology, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 RNA 농도/품질을 평가하였다. 동량의 RNA를 역전사 키트(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰고, SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 실시간 PCR(ABI PRISM 7900, Applied Biosystems)을 수행하였다. 95℃에서 10분 후에, 95℃에서 10초 및 60℃에서 30초로 이루어진 사이클을 40회 수행하여 인슐린(INS), MAFA, PDX-1, NEUROG3 등의 유전자 발현을 측정하였다. 각 샘플의 상대적인 mRNA 발현은 GAPDH(control gene)에 의해 표준화되었고 Student 's unpaired t-test를 사용하여 통계를 분석하였다. 증폭에 사용된 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 기재하였다.

프라이머		염기서열(5'->3')	서열번호
INS	Forward	CTG CAT CAG AAG AGG CCA TCA AG	서열번호 1
INS	Reverse	GGG TGT GTA GAA GAA GCC TCG	서열번호 2
MAFA	Forward	CGC ACG CTC AAG AAC CG	서열번호 3
MAFA	Reverse	GCC AGC TTC TCG TAT TTC TCC TTGT	서열번호 4
PDX-1	Forward	TTC ACG AGC CAG TAT GAC CTT CAC	서열번호 5
PDX-1	Reverse	GAA GAC AGA CCT GGG ATG CAC A	서열번호 6
NEUROG3	Forward	CTA AGA GCG AGT TGG CAC TG	서열번호 7
NEUROG3	Reverse	CCG AGT TGA GGT TGT GCA TT	서열번호 8
GAPDH	Forward	CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG	서열번호 9
GAPDH	Reverse	AGG CAG GGA TGA TGT TCT GG	서열번호 10

도 2a에 나타난 바와 같이, 퓨트레신을 포함하지 않은 배지 조성물에서 배양된 대조군(control; 도 2a에서 '-'로 표시됨) 대비, 퓨트레신이 첨가되어 분화가 유도된 인간 유래 골수세포에서 인슐린(INS), MAFA, PDX1, NEUROG3의 발현이 현저히 증가한 것을 확인하였다.

실시예 1.3 인간 제대혈 줄기세포의 분화

또 다른 인간 유래 줄기세포로서, 검체 수급이 비교적 용이한 제대혈 (umbilical cord blood)에서 분리된 단핵구 세포에 퓨트레신을 처리하여 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하였다.

피콜 밀도 구배 프로토콜(Ficoll-gradient protocol)을 사용하여 신선한 제대혈에서 단핵구 세포를 분리한 후, 용혈용액(BD Pharmingen)을 이용하여 적혈구를 제거하고, 인간 유래 제대혈 단핵구 세포(제대혈 줄기세포)를 준비하였다.

1mM 또는 5Mm 농도가 되도록 퓨트레신을 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법과 동일하게 인간 유래 제대혈 단핵구 세포를 배양하여 퓨트레신으로 분화 유도(감작)시키고, 상기 실시예 1.2의 방법과 같이 실시간 PCR을 수행하여 인슐린(INS), 및 인슐린을 생산하는 베타세포 분화를 촉진하는 인자(MAFA, NEUROG3)의 유전자 발현양을 측정하여 이를 도 2b에 나타내었다. 도 2b에 나타난 바와 같이 퓨트레신을 포함하지 않은 배지 조성물에서 배양된 대조군(control; 도 2b에서 '0'으로 표시됨) 대비, 5mM의 퓨트레신이 첨가되어 분화가 유도된 인간 유래 제대혈 줄기세포에서 베타세포 특이적 유전자(INS, MAFA, NEUROG3)의 발현이 현저히 증가되었다.

실시예 1.4 퓨트레신 농도에 따른 분화 유도 효과

실시예 1.4.1 퓨트레신 농도에 따른 인슐린 생산 세포로의 분화 유도 효과

배지에 포함되는 퓨트레신 농도를 제외하고, 상기 실시예 1.3과 동일한 방법으로 퓨트레신을 포함하지 않는 배지(퓨트레신 0mM) 또는 퓨트레신을 0.1 내지 20mM의 다양한 농도로 포함하는 배지에서 인간 제대혈 줄기 세포를 6일간 배양하였다. 6일간 배양 후 세포를 수집하여 실시간 PCR을 수행하여 인슐린(INS), 및 인슐린을 생산하는 베타세포 분화를 촉진하는 인자(MAFA, PDX-1, NEUROG3, 또는 NKX6.1)의 유전자 발현양을 측정하여 이를 도 11a에 나타내었다(유전자 발현양 측정에 사용된 프라이머는 표 1 및 표 2에 기재됨).

도 11a에 나타난 바와 같이, 퓨트레신을 5mM 이상의 농도로 포함하는 배지 조성물에서 분화 유도된 세포에서 인슐린 및 베타세포 분화를 촉진하는 인자의 유전자 발현양이 현저히 증가하였다.

실시예 1.4.2 퓨트레신 농도에 따른 세포 생존율(cell viability) 분석

배지에 포함되는 퓨트레신 농도를 제외하고, 상기 실시예 1.3과 동일한 방법으로 퓨트레신을 포함하지 않는 배지(퓨트레신 0mM) 또는 퓨트레신을 5 내지 20mM의 농도로 포함하는 배지에서 인간 제대혈 줄기세포를 6일간 배양하였다. 6일간 배양 후 세포를 수집하여 살아있는 세포와 죽은 세포에 대하여 각각 acridine orange(AO, 살아있는 세포 염색)와 propidium iodide(PI, 죽은 세포 염색)로 염색한 후, Cellometer Fluorescent Viability Cell Counter K2 기계를 이용하여 획득한 세포수 및 세포 생존율(cell viability, %)를 도 11b에 나타내었다.

도 11b에 나타난 바와 같이, 퓨트레신을 20mM 농도로 포함하는 배지 조성물에서 분화 유도된 세포수가 급격히 감소하였다. 이로부터, 20mM 농도 이상으로 퓨트레신이 포함되면 세포 생존율에 영향을 미침을 알 수 있다.

실시예 2. 퓨트레신 및 글루코사민에 의한 인슐린 생산세포로의 분화 유도

8주령 C57BL/6마우스(오리엔트 바이오)로부터 상기 실시예 1.1의 방법과 같이 골수세포를 분리하였다. 세포의 부착이 저해된 12-웰 플레이트에 5.5 mM 글루코스, 10% FBS, 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco´s Modified Eagle Medium)(표준배지) 및 골수세포를 5x10⁶cells/㎖로 분주하고, 각각의 웰에 10mM의 농도가 되도록 글루코사민(GlcN)과 10mM의 농도가 되도록 퓨트레신(Put)을 각각 또는 함께 처리한 후 부유배양용 세포배양 인큐베이터(37℃, 5% CO₂, 90-95% humidity)에서 30 내지 60rpm으로 6일간 부유배양하였다.

인슐린 생산세포의 출현여부는 상기 실시예 1.2의 방법과 같이, 배양 후 6일차의 세포에 대하여 인슐린을 생산하는 베타세포 분화를 촉진하는 인자들에 대한 실시간 PCR(real-time PCR) 방법으로 인슐린(INS), MAFA, PDX-1, NEUROG3의 유전자 발현양을 측정하여 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 글루코사민 또는 퓨트레신을 각각 처리하였을 때 인슐린 및 인슐린 생산세포로의 분화를 촉진하는 인자의 발현이 변하였고, 퓨트레신 또는 글루코사민을 개별적으로 처리한 군 보다 퓨트레신 및 글루코사민을 함께 처리한 군에서 인슐린(INS), MAFA, PDX-1, NEUROG3 의 발현이 모두 상승적으로 증가하였다. 특히 인슐린의 발현에 있어서, 글루코사민(대조군 대비 2배)과 퓨트레신(대조군 대비 4.3배)을 각각 처리하였을 때보다 글루코사민 및 퓨트레신을 함께 처리하여 분화를 유도하였을 때(대조군 대비 26배) 상승적으로 인슐린 발현이 증가하였다.

실시예 3. 인슐린 생산세포로의 분화 유도 공정 최적화

본 실시예에서 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드를 포함하는 조성물의 인슐린 생산세포로의 분화 유도 효과를 살펴보고자 하였다.

(1) 퓨트레신 처리군(5mM), (2) 퓨트레신(5mM), 및 글루코사민(5mM) 처리군, 또는 (3) 퓨트레신(5mM), 글루코사민(5mM), 및 니코틴아미드(10mM) 처리군, (4) 대조군(무처리군)으로 나누어, 상기 실시예 1.1 방법과 유사하게 제대혈 줄기세포(상기 실시예 1.3과 동일한 방법으로 준비) 또는 마우스 골수세포(상기 실시예 1.1와 동일한 방법으로 준비)를 부유 배양하여 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하였다.

배양 후 6일차에 분화가 유도된 제대혈 줄기 세포 또는 마우스 골수 세포를 수득하고 총 RNA를 추출하여 상기 실시예 1.2의 방법과 유사하게 실시간 PCR을 수행하여, 인슐린 및 베타세포 분화 관련 유전자(MAFA, PDX1, 또는 NEUROG3)의 발현을 측정하여 이를 각각 도 4(분화가 유도된 제대혈 줄기 세포에서의 유전자 발현양) 및 도 5(분화가 유도된 마우스 골수 세포에서의 유전자 발현양)에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 퓨트레신 및 글루코사민 처리군 보다 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드 처리군에서 인슐린과 베타세포 분화 관련 유전자의 발현이 상승적으로 증가하였다. 인슐린의 발현에 있어서 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드 처리군에서 대조군 대비 인슐린의 발현이 약 142.5배 증가하였고, 글루코사민 및 퓨트레신 처리군(대조군 대비 10배의 인슐린 발현양이 증가함) 대비 14배 이상 인슐린 발현이 증가하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 마우스 골수세포에 퓨트레신, 글루코사민, 또는 니코틴아미드를 개별적으로 처리하여 분화를 유도한 군 보다 퓨트레신, 글루코사민, 및 니코틴아미드를 함께 처리한 군에서 상승적으로 베타세포 분화 관련 유전자(PDX1)의 발현이 현저히 증가하였다.

실시예 4. 세포 배양배지에 따른 인슐린 생산세포로의 분화 유도 효과

상기 실시예 1.3에서와 동일한 방법으로 제대혈 단핵구 세포를 분리하고, 배양배지에 따른 분화 유도 조성물의 효과를 살펴보기 위하여 글루코사민 5mM, 퓨트레신 5mM, 및 니코틴아미드 10mM이 되도록 글루코사민, 퓨트레신, 니코틴아미드를 첨가한 표준배지(DMEM) 또는 CMRL1066 배지에서 제대혈 단핵구 세포를 상기 실시예 1.1에서와 유사한 조건으로 6일간 부유 배양하였다. 배양 후 6일차에 DMEM 또는 CMRL1066 배지에서 분화가 유도된 세포를 각각 수집하여 총 RNA를 추출하여 RT-PCR과 실시간 PCR을 수행하여 유전자들의 발현 정도를 비교하였다. RT-PCR 및 실시간 PCR에 사용된 프라이머의 서열은 표 1 및 2에 기재하였다. 실시간 PCR 수행 조건은 상기 실시예 1.2와 동일하고, RT-PCR은 Bio-Rad C1000 Thermal Cycler를 이용하여 94℃ 5분 후에, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1 분으로 이루어진 사이클을 30회 수행하고, 72℃에서 10분 조건으로 수행하였다. 증폭에 사용된 프라이머의 염기서열은 표 1 및 2에 기재하였다.

프라이머		염기서열(5'->3')	서열번호
NEUROD1	Forward	TAA GAC GCA GAA GCT GTC CA	서열번호 11
NEUROD1	Reverse	GTC CGA GGA TTG AGT TGC AG	서열번호 12
NKX6.1	Forward	GAA CCG CCG GAC CAA GT	서열번호 13
NKX6.1	Reverse	GTC GTC CGA GTT GGG ATC CAG	서열번호 14
GAPDH	Forward	CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG	서열번호 9
GAPDH	Reverse	AGG CAG GGA TGA TGT TCT GG	서열번호 10

도 6의 좌측 이미지는 RT-PCR의 결과를 나타내고 도 6의 우측 그래프는 각 유전자에 대한 실시간 PCR의 결과를 나타낸다. 도 6에 나타난 바와 같이 인슐린 및 베타세포 분화 관련 유전자들의 발현이 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드가 첨가된 CMRL 1066 배지에서 세포를 배양하였을 때 현저히 증가하였다.

실시예 5. 인간 배아 중간엽 줄기세포(ES-MSC)를 이용한 인슐린 생산세포로의 분화 능력 검증

10% FBS를 포함하는 CMRL 1066 배지에 글루코사민(5mM), 퓨트레신(5mM), 및 니코틴아미드(10mM)를 함께 첨가하고, 인간 배아 중간엽 줄기세포(Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Stem Cell(ES-MSC); 서울대병원 제공)를 37℃, CO₂조건 하에 Surface treated culture dish에서 부착 배양하고, 배양 후 3일차에 세포를 수집하고 총 RNA를 수득하여 상기 실시예 4의 방법과 유사하게 인슐린 및 베타세포 분화 관련 유전자(PDX1, NEUROG3, NEUROD1, 또는 NKX6.1)에 대해 RT-PCR을 수행하여 이 결과를 도 7b에 나타내었다. 도 7b에서 NIT-1은 마우스 유래 분화가 완료된 인슐린 생산세포주(베타세포주; insulinoma)를 의미하고, CTL은 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드가 포함되지 않은 CMRL 1066 배지에서 배양된 대조군(control)을 의미한다.

도 7b에 나타난 바와 같이, 인간 배아 중간엽 줄기세포에 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 함께 처리하여 분화를 유도하였을 때 배양 3일만에 인슐린 및 베타세포 분화 관련 유전자들의 발현이 현저히 증가된 것이 관찰되었다. 따라서 상기 인슐린 생산세포로의 분화 방법(분화 유도용 조성물)이 성체 줄기세포뿐만 아니라, 배아 중간엽 줄기세포(배아 줄기세포)까지 인슐린 생산세포로 분화시킬 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 6. STAT3 저해제의 처리 시기에 따른 인슐린 생산세포로의 분화 유도 효과

CMRL 1066 배지에 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 함께 처리하여 마우스 골수 세포를 상기 실시예 1.1과 유사한 조건에서 배양하고, 배양 후 0, 2, 또는 4일차에 각각 STAT3 억제제인 JSI-124(Calbiochem, 동남케미칼)의 농도가 배지 내에서 100nM(0.1uM)가 되도록 처리하고 배양 후 6일차에 세포를 수집하였다. 인슐린 생산세포의 출현을 확인하기 위하여, 수집된 세포로부터 상기 실시예 1.2의 방법과 유사하게 총 RNA를 추출하여 RT-PCR과 real-time PCR을 통해 인슐린(INS) 및 베타세포 분화 관련 유전자(PDX1, NEUROG3, 또는 NEUROD1)의 발현양을 확인하여 이를 도 8b에 나타내었다. 도 8b에서 좌측 이미지는 RT-PCR 결과를 나타내고, 우측 그래프는 실시간 PCR결과를 나타내고, 도 8b의 우측 그래프에서 '-'는 퓨트레신, 글루코사민, 니코틴아미드만을 처리하고, STAT3 억제제를 처리하지 않은 그룹을 의미한다.

도 8b에 나타낸 바와 같이, STAT3 억제제를 첨가한 실험군에서 인슐린 생산세포로의 분화를 촉진하는 유전자들의 발현 정도가 증가하는 것을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라, 특히 배양 후 4일차에 JSI-124를 첨가하였을 때 인슐린(INS) 및 베타세포 분화 관련 유전자(PDX1, NEUROG3, 또는 NEUROD1)의 발현양이 다른 시기에 JSI-124를 처리하였을 때보다 유의미하게 증가하였다.

실시예 7. STAT3 저해제 종류에 따른 인슐린 생산 세포로의 분화 효과

STAT3 저해제 종류에 따른 분화효과를 살펴보기 위해서, 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드(퓨트레신 5mM, 글루코사민 5mM, 니코틴아미드 10mM)를 함께 첨가한 CMRL1066 배지에서 상기 실시예 1.3의 방법으로 분리한 인간 제대혈 단핵구 세포를 배양하고 배양 후 4일차에 다양한 종류의 STAT3 억제제(JSI-124(0.1uM; Calbiochem, 동남케미칼), CPT(1uM; Sigma, 동남케미칼), 또는 BP-1-102(10uM; Calbiochem, 동남케미칼)를 참고문헌을 참고하여 각 STAT3 억제제가 활성을 갖는 적정한 농도로 처리하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도하였다. 배양 후 6일차에 세포를 수집하고, 인슐린 생산세포의 출현을 확인하기 위하여, 수집된 세포로부터 상기 실시예 1.2의 방법과 유사하게 총 RNA를 추출하여 RT-PCR과 real-time PCR을 통해 인슐린(INS) 및 베타세포 분화 관련 유전자(MAFA, NEUROG3, NEUROD1, 또는 NKX6.1)의 발현양을 확인하여 이를 도 9b에 나타내었다.

STAT3 저해제 중에서 CPT < JSI-124 < BP-1-102의 순서로 인슐린 및 베타세포 분화 관련 유전자들의 발현양이 현저히 상승하였고, CPT < JSI-124 < BP-1-102의 순서로 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 포함하는 조성물에 추가로 첨가하였을 때 인슐린 생산 세포로의 분화 효율이 우수한 것을 알 수 있었다. (CPT 에 대한 결과는 도 9b에 나타나지 않음) 특히 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드만을 처리하였을 때보다 4일차에 BP-1-102를 추가하여 처리하였을 때 인슐린의 발현이 약 3배 이상 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 8. STAT3 저해제 처리에 의한 인슐린 분비 능력 검증

상기 실시예 7과 같이, 제대혈 단핵구 세포에 CMRL1066 배지에 글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드를 함께 처리하여 세포를 배양하고, 배양 후 4일차에 BP-1-102를 처리하여 총 6일 동안 세포를 부유배양하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도하였다. 이 후, 세포를 회수하여 PBS로 세척하여 남아있는 분화 유도 인자(글루코사민, 퓨트레신, 니코틴아미드, BP-1-102)들을 제거한 후, glucose challenge로 인한 인슐린의 분비량을 확인하기 위하여, 상기에서 분화가 유도된 세포를 11mM 글루코스(glucose), 10% FBS, 1% 항생제가 함유되어 있는 CMRL1066 배지로 재부유한 뒤 부착 배양용 6 웰-플레이트에 옮겨 3일간 추가로 부착 배양(37℃, CO₂배양)하였다.

부착 배양된 세포가 인슐린을 분비하는지를 확인하고자 부착 배양 후 확보된 배양 상층액 중에 존재하는 인슐린을 ELISA 방법(Ultrasensitive Insulin ELISA, Catalog# 80-INSHUU-E01.1; ALPCO, 지노믹스원)을 통해 인슐린 분비양을 정량하여 이를 도 10b에 나타내었다.

도 10b에 나타난 바와 같이, 제대혈 단핵구 세포가 인슐린을 생산하는 세포로 분화하여 인슐린을 세포밖으로 분비하는 것을 확인하였다. 세가지 분화유도인자(글루코사민, 퓨트레신, 및 니코틴아미드)만을 첨가하였을 때보다 STAT3 억제제인 BP-1-102를 배양 4일차에 함께 처리하여 분화를 유도하였을 때 인슐린의 분비가 10배 이상 증가되는 것을 확인하였다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Composition for inducing differentiation into insulin producing cells and uses thereof <130> DPP20193294KR <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INS_Forward <400> 1 ctgcatcaga agaggccatc aag 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INS_Reverse <400> 2 gggtgtgtag aagaagcctc g 21 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAFA_Forward <400> 3 cgcacgctca agaaccg 17 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAFA_Reverse <400> 4 gccagcttct cgtatttctc cttgt 25 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDX-1_Forward <400> 5 ttcacgagcc agtatgacct tcac 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDX-1_Reverse <400> 6 gaagacagac ctgggatgca ca 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEUROG3_Forward <400> 7 ctaagagcga gttggcactg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEUROG3_Reverse <400> 8 ccgagttgag gttgtgcatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_Forward <400> 9 ctgcaccacc aactgcttag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_Reverse <400> 10 aggcagggat gatgttctgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEUROD1_Forward <400> 11 taagacgcag aagctgtcca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEUROD1_Reverse <400> 12 gtccgaggat tgagttgcag 20 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX6.1_Forward <400> 13 gaaccgccgg accaagt 17 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX6.1_Reverse <400> 14 gtcgtccgag ttgggatcca g 21

Claims

퓨트레신(putrescine), 글루코사민(glucosamine), 및 니코틴아미드(nicotinamide)를 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 STAT3 억제제(STAT3 inhibitor)를 추가로 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 STAT3 억제제는 JSI-124, BP-1-102, 및 CPT로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 퓨트레신은 1 내지 20mM의 농도로 포함되는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 글루코사민은 1 내지 20mM의 농도로 포함되는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 니코틴아미드는 5 내지 20mM의 농도로 포함되는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 STAT3 억제제는 0.1 내지 50uM의 농도로 포함되는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 성체 줄기세포, 배아 줄기세포, 또는 이들의 조합을 인슐린 생산세포로 분화 유도할 수 있는 것인, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 CMRL1066, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), McCoy's 5A, 199 배지, 및 내피세포 성장 배지 MV2(Endothelial Growth Medium MV2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 배지를 추가로 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물, 및 배지를 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 배지 조성물.
제10항에 있어서, 상기 배지는 CMRL1066, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), McCoy's 5A, 199 배지, 및 내피세포 성장 배지 MV2(Endothelial Growth Medium MV2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인, 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 배지 조성물.
분리된 세포를 제10항에 따른 배지 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 분리된 세포를 상기 분화 유도용 배지 조성물에서 35 내지 38℃의 온도 및 5% CO₂의 조건에서 3일 내지 6일 동안 배양하는 것인, 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 배지는 CMRL1066, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), McCoy's 5A, 199 배지, 및 내피세포 성장 배지 MV2(Endothelial Growth Medium MV2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 배지를 추가로 포함하는, 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 방법은 세포 배양 후 3일 내지 5일차에 상기 배지 조성물에 STAT3 억제제를 첨가하여 세포를 배양하는 것인, 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 STAT3 억제제는 JSI-124, BP-1-102, 및 CPT로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 분리된 세포는 성체 줄기세포, 배아 줄기세포, 또는 이들의 조합인, 인슐린 생산 세포로의 분화를 유도하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 분화 유도용 조성물 및 환자 유래 혈액의 혼합물을 포함하는, 상기 환자에서의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제12항에 따른 방법으로 분화된 인슐린 생산세포를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.