KR102145290B1 - DAPK1 또는 Pin1을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
DAPK1 또는 Pin1을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 DAPK1(Death-associated protein kinase 1) 또는 Pin1(peptidylprolyl cis/trans isomerase 1)의 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 DAPK1 또는 Pin1의 단독 또는 병용 처리 시, 신경세포 보호 및 신경 가소성 유발을 유도하고 아폽토시스(Apoptosis) 유도 활성인자의 발현을 감소시키며, DAPK1 또는 Pin1 매개성 세포사멸 기작 활성을 감소시킴에 따라 허혈성 뇌질환을 효과적으로 치료 및 예방함을 확인하여, 관련된 약학 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 DAPK1 또는 Pin1 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
2001년 우리나라 사망원인 통계조사에 따르면, 뇌혈관 질환에 의한 사망률(인구 십만 명당 사망자수)이 암 다음으로 2위인 73.8명에 이르며, 이에 따른 사회, 경제적 비용은 2조 3,138억 원으로 추정되었다. 뇌혈관 질환 치료제에 대한 수요가 매우 높으므로, 뇌혈관 질환 치료를 통한 사회적 경제적 손실을 줄이기 위한 치료제 개발연구가 중요하다. 뇌혈관 질환은 특히 노령 연령층에 발병률이 높으며, 일단 발생하면 사망률이 매우 높다. 통계청에서 2003년 10월에 발표한 우리나라 노령 인구의 비율을 살펴보면, 우리나라는 지난 2000년 65세 이상 인구가 총인구에서 차지하는 비중이 7.2%에 이르러 고령화 사회에 들어섰으며, 오는 2019년에는 이 비율이 14%를 넘어 고령사회에 진입할 것으로 전망되고 있다.
뇌혈관 질환은 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 뇌출혈 등에서 볼 수있는 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환이다. 출혈성 뇌질환은 교통사고 등에 의해서 주로 나타나며, 허혈성 뇌질환은 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환이다. 허혈성 뇌질환은 혈전증(thrombosis), 색전증(em-bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack) 및 소경색(lacune)등으로 세분할 수 있는데, 허혈성 뇌혈관질환은 주로 혈전과 색전 등에 의하여 뇌에 혈류를 공급하는 혈관에 병리학적 이상이 생긴 것이다.
대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 뇌조직에 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP감소, 부종(edema)이 발생하며, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62, 201-208, 1984; Kirino T. Brain Res., 239, 57-69, 1982).
뇌허혈에 의한 신경세포사 기전에는 크게 2가지가 있다. 하나는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발되는 흥분성 신경세포사 기전(Kang TC et al., J. Neurocytol., 30, 945-955, 2001)이고, 다른 하나는 허혈-재관류 시에 갑작스러운 산소 공급으로 인해 생체내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발되는 산화성 신경세포사 기전이다(Won MH et al., Brain Res., 836, 70-78, 1999; Sun AY, Chen YM, J. Biomed. Sci., 5, 401-414, 1998; Flowers F, Zimmerman JJ. New Horiz., 6, 169-180, 1998).
허혈성 뇌질환에서 임상적으로 사용 가능한 약물은 희소하고, 현재 유일하게 허가된 약물은 항혈전제(항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제를 포함)이다. 티크로피딘(ticlopidine), 시로스타졸(cilostazole) 및 프로스타시크린(prostacycline)의 항혈소판제나 항응고제는 종종 두통, 심계항진 및 간에 부담을 주는 부작용이 있어 사용에 제한이 따른다. 더불어, FDA 공인 시판 중인 조직플라즈미겐활성자(tissue plasminogen activator)는 혈전용해제로 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도하는 물질로서, 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니기 때문에 빠른 사용이 필요하다. 또한, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량 사용 또는 자주 사용 시에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관 질환을 유발하게 되므로 사용에 주의가 요구된다. 따라서, 신규한 허혈성 질환 치료제의 개발 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 목적은 허혈성 뇌손상 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 DAPK1(Death-associated protein kinase 1) 또는 Pin1(peptidylprolyl cis/trans isomerase 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 허혈성 뇌손상 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 DAPK1(Death-associated protein kinase 1) 또는 Pin1(peptidylprolyl cis/trans isomerase 1) 억제제의 단독 또는 병용 처리 시, 신경세포 보호 및 신경 가소성 유발을 유도하고 아폽토시스(Apoptosis) 유도 활성인자의 발현을 감소시키며, DAPK1 또는 Pin1 매개성 세포사멸 기작 활성을 감소시킴에 따라 허혈성 뇌질환을 효과적으로 치료 및 예방함을 확인하여, 관련된 약학 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 DAPK1 억제제에 처리에 의한 신경학적 기능 소실 감소를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 DAPK1 억제제 처리에 의한 뇌경색 범위 감소 및 신경학적 기능장애의 변화를 확인한 도이다.
도 3은 DAPK1 억제제 처리에 의한 허혈성 뇌손상 조직의 구조적 변화를 확인한 도이다.
도 4는 허혈성 뇌손상에 의한 세포사멸 기전에서 DAPK1의 작용을 확인한 도이다.
도 5는 DAPK1 억제성 조절이 허혈성 뇌손상 후 신경세포의 형태학적 변화 및 시냅스 형성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 6은 DAPK1 유전자 결손 동물모델 구축 및 표현형 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 DAPK1 유전자 결손 동물모델을 통한 허혈성 뇌졸중 보호효과를 확인한 도이다.
도 8은 허혈성 뇌손상에 의한 소포체 스트레스 반응기작과 DAPK1과의 상관성 규명한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 DAPK1 유전자 결손에 의한 신경세포사멸 반응기작 관련 유전자 발현변화를 확인한 도이다.
도 10은 Pin1 억제에 의한 뇌경색 범위 감소 효과 및 뇌의 구조적 붕괴 억제 효과를 확인한 도이다.
도 11은 Pin1과 Ischemic-induced neurofibrillary tangles (NFTs) 형성과의 상관성 규명한 도이다.
도 12는 허혈성 뇌손상에 의한 세포사멸기작과 Pin1과의 작용 기전을 확인한 도이다.
도 13은 허혈성 뇌손상에서의 Pin1 발현 증가 및 Pin1 억제에 의한 DAPK1의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 14는 허혈성 뇌손상에서 Pin1 억제에 의한 NeuN과 Olig2의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 15는 Pin1 작용 기작 규명을 위한 유전자 결손 동물모델 (Pin1 KO mouse) 기반 구축한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 Pin1 KO 마우스의 표현형 (Phenotype) 및 성장패턴 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 DAPK1 억제제 처리에 의한 뇌경색 범위 감소 및 신경학적 기능장애의 변화를 확인한 도이다.
도 3은 DAPK1 억제제 처리에 의한 허혈성 뇌손상 조직의 구조적 변화를 확인한 도이다.
도 4는 허혈성 뇌손상에 의한 세포사멸 기전에서 DAPK1의 작용을 확인한 도이다.
도 5는 DAPK1 억제성 조절이 허혈성 뇌손상 후 신경세포의 형태학적 변화 및 시냅스 형성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 6은 DAPK1 유전자 결손 동물모델 구축 및 표현형 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 DAPK1 유전자 결손 동물모델을 통한 허혈성 뇌졸중 보호효과를 확인한 도이다.
도 8은 허혈성 뇌손상에 의한 소포체 스트레스 반응기작과 DAPK1과의 상관성 규명한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 DAPK1 유전자 결손에 의한 신경세포사멸 반응기작 관련 유전자 발현변화를 확인한 도이다.
도 10은 Pin1 억제에 의한 뇌경색 범위 감소 효과 및 뇌의 구조적 붕괴 억제 효과를 확인한 도이다.
도 11은 Pin1과 Ischemic-induced neurofibrillary tangles (NFTs) 형성과의 상관성 규명한 도이다.
도 12는 허혈성 뇌손상에 의한 세포사멸기작과 Pin1과의 작용 기전을 확인한 도이다.
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도 14는 허혈성 뇌손상에서 Pin1 억제에 의한 NeuN과 Olig2의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 15는 Pin1 작용 기작 규명을 위한 유전자 결손 동물모델 (Pin1 KO mouse) 기반 구축한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 Pin1 KO 마우스의 표현형 (Phenotype) 및 성장패턴 분석한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 DAPK1(Death-associated protein kinase 1) 또는 Pin1(peptidylprolyl cis/trans isomerase 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 허혈성 뇌손상 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "DAPK1(Death-associated protein kinase 1)"는 칼슘/칼모듈린 의존성 인산화 효소이고, "Pin1(peptidylprolyl cis/trans isomerase 1)"는 이성질화 효소로서, 상기 DAPK1 및 Pin1는 산화적 스트레스에 반응하여 세포사멸 신호를 활성화시키는 중요한 조절인자로 작용한다. DAPK1 및 Pin1의 신호기작은 세포내 신호전달 체계를 구성하는 특정 단백질과 상호작용하여 기질단백질의 구조적 변화를 유도하거나 특정 모티프(motif)의 인산화를 통하여 기능적 변화를 야기한다.
상기 허혈성 뇌질환은 중풍, 뇌졸중, 뇌일혈, 뇌경색, 두부손상, 알츠하이머, 혈관성 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 혼수 및 쇼크 뇌손상으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물에는 DAPK1 또는 Pin1 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 DAPK1 또는 Pin1 의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
본 발명은 DAPK1 또는 Pin1을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 허혈성 뇌손상의 예방 또는 치료 목적으로, 정제,캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 DAPK1 또는 Pin1을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 DAPK1 또는 Pin1을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 DAPK1 또는 Pin1을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 DAPK1 또는 Pin1과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 DAPK1 또는 Pin1의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> DAPK1(Death-associated protein kinase 1) 억제제 처리에 의한 허혈성 뇌손상 치료 효과 확인
<1-1> 허혈성 뇌손상 동물모델에서 DAPK1 억제제를 이용한 뇌손상 보호기작 규명
1-1-1. DAPK1 억제제에 처리에 의한 신경학적 기능 소실 감소 확인
허혈성 뇌질환 동물모델 마우스 제작을 위한 국소적 허혈성 중대뇌동맥 폐색술 (MCAo)을 수행하는 과정에서 DAPK1 억제제인 (4Z)-4-(3-pyridylmethylene)-2-styryl-oxazol-5-one (Merck, Darmstadt, Germany)을 5 mg/kg 의 농도로 투여하였다. 중대뇌동맥 폐색술 시행 5분 전, 그리고 3시간 30분 후에 복강으로 각 1회, 총 2회 주입하였다. 그 후, 체중 변화 및 신경학적 기능장애 척도를 MCAo 수술 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 평가하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, DAPK1 억제제를 처리한 실험군에서 뇌손상에 대한 신경보호 효과를 확인하였고, 신경학적 기능 회복이 나타남을 확인하였다.
1-1-2. DAPK1 억제제 처리에 의한 뇌경색 범위 감소 및 신경학적 기능장애의 변화
허혈성 뇌손상 후 DAPK1 억제제 처리에 따른 신경학적 보호 효과를 규명하기 위하여, MCAo 수술 후 3일(급성기), 28일(만성기)의 뇌경색 범위와 신경학적 기능장애 척도를 평가하였다. 구체적으로, MCAo 수술 전 및 후에 5 mg/kg 농도의 DAPK1 억제제를 복강으로 주입하였고, 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) 염색방법을 이용하여 Bregma level(+4.0 ~ -6.0 mm)에서 뇌손상 영역을 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, MCAo 수술 3일, 28일에서 DAPK1 억제제 실험군의 Bregma 영역별 경색 면적과 전체 뇌경색 부피가 대조군(Vehicle 투여군)에 비하여 유의하게 감소하였고, 신경학적 척도 평가(modified neurological severity score, mNSS)에서 점진적 기능이 회복됨을 확인하였다. 따라서, DAPK1 억제제 투여에 의한 뇌경색 부피의 감소 및 신경 보호 효과가 우수함을 확인하였다.
1-1-3. DAPK1 억제제 처리에 의한 허혈성 뇌손상 조직의 구조적 변화
허혈성 뇌질환 동물모델에서 DAPK1 억제제를 처리 후, hematoxylin & eosin (H-E), cresyl violet acetate (Nissl) 등의 염색방법을 이용하여 신경세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 신경세포의 수축, 세포막의 파괴, 염색체의 응축, 세포막 거품 돌기화 등의 세포사멸의 형태학적 특징들이 DAPK1 억제제 실험군에서 대조군보다 유의적으로 억제됨을 확인하였다. 따라서, DAPK1 억제제 처리에 의하여 DAPK1가 억제 시, 신경세포의 퇴행 및 세포 사멸의 손상이 방어되는 효과가 나타남을 확인하였다.
1-1-4. 허혈성 뇌손상에 의한 세포사멸 기전에서 DAPK1의 작용 확인
허혈성 뇌질환 동물모델에서 DAPK1 억제성 조절에 의한 신경 보호 효과를 확인하기 위하여, 동측성(ipsilateral) 또는 대측성(contralateral) 조건에서, 5 mg/kg 농도의 DAPK1 억제제를 복강 주입하고 3일 후, 신경세포 및 신경교세포 확인인자(NeuN, GFAP)의 발현변화를 관찰하였다. 또한, 세포사멸 조절인자 (BAX, BCL2, Caspase3)와 자가포식 확인인자 (LC3)의 발현 변화를 면역 블랏(Immunoblots)을 수행하여 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여, DAPK1 억제제 실험군에서 신경세포 분화 확인 인자인 NeuN의 발현이 증가하고, 신경교세포 분화 확인 인자인GFAP의 발현이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 또한, DAPK1 억제제 실험군에서 세포예정사 신호기작이 활성화되어 세포사멸이 유도됨을 확인하였다.
1-1-5. DAPK1 억제성 조절이 허혈성 뇌손상 후 신경세포의 형태학적 변화 및 시냅스 형성에 미치는 영향
허혈성 뇌손상 유발 동물 모델 및 대조군에 5 mg/kg 농도의 DAPK1 억제제를 복강 주입하고, Golgi-cox 염색을 이용하여, 신경세포의 수상돌기 소극체(dendritic spine)의 형태학적 특징을 관찰하고, Sholl analysis method를 통해 neurite outgrowth를 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, DAPK1 억제제 처리군은 DAPK1 억제에 의한 신경섬유의 연접수가 증가하고 수상돌기 밀도 (density)가 대조군에 비하여 높음을 확인하여, 신경 가소성 유발 효과가 나타남을 확인하였다.
<1-2> 허혈성 뇌졸중 동물모델에서 DAPK1 유전자 결손에 의한 소포체 스트레스 관련 유전자 발현 변화 및 뇌손상 보호기작 규명
1-2-1. DAPK1 유전자 결손 동물모델 구축 및 표현형 분석
DAPK1 KO 마우스를 획득하기 위하여 DAPK1 heterozygous (+/-) mice 간의 교배를 진행하여, DAPK1 (-/-) KO 동물모델 기반을 구축하고 DAPK1 WT, DAPK1 KO 프라이머에 대한 RT-PCR를 시행하여 Wild type (+/+), DAPK1 (+/-), DAPK1 (-/-) 마우스의 유전형과 표현형을 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 6주부터 14주까지 Wild type (+/+), DAPK1 (+/-), DAPK1 (-/-) 수컷 마우스의 체중을 측정하여 각 그룹의 평균을 비교 및 분석한 결과, 그룹간 유의한 차이가 없는 것으로 확인하였다.
1-2-2. DAPK1 유전자 결손 동물모델을 통한 허혈성 뇌졸중 보호효과 검증
뇌졸중 동물모델에서 DAPK1 억제제를 이용한 실험결과를 바탕으로, DAPK1 유전자를 제거한 동물모델에서 허혈성 뇌졸중에 대한 신경보호 효과를 검증하고자, TTC 염색으로 뇌경색 크기를 비교하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, DAPK1 (+/-)와 Wild type 그룹 간에는 차이가 없었으나, DAPK1 (-/-) 실험군에서는 뇌경색 면적의 유의한 감소를 확인하였다. 또한, DAPK1 유전자 결손에 의한 신경학적 기능회복이 나타나고 있음을 확인하여, DAPK1 유전자 결손에 의한 신경 보호 효과를 확인하였다.
1-2-3. 허혈성 뇌손상에 의한 소포체 스트레스 반응기작과 DAPK1과의 상관성 규명
허혈성 뇌손상 후 DAPK1의 발현변화가 소포체 스트레스 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여, DAPK1 유전자 결손 동물모델을 제작하고 허혈성 뇌손상을 유발하여 미접힘 단백질 반응 (Unfolded protein responses, UPR))과 관련된 유전자 발현 변화를 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, DAPK1 (-/-) 실험군에서 소포체 스트레스 반응 관련 유전자 (PERK, ATF4, CHOP, XBP1)의 발현변화를 관찰한 결과, MCAo 수술을 시행하기 전에는 대조군 및 DAPK1 (+/-) 그룹과 유의한 차이가 없었으나, 허혈성 뇌손상 유발 후에는 소포체 스트레스 센서인 PERK와 UPR 유전자 발현의 주요 전사조절인자인 ATF4, XBP1의 발현감소가 확인하였다. 따라서, DAPK1 발현 조절에 의한 소포체 스트레스 관련 유전자 발현에 변화가 나타남을 확인하였다.
1-2-4. DAPK1 유전자 결손에 의한 신경세포사멸 반응기작 관련 유전자 발현변화
허혈성 뇌손상 후 DAPK1의 발현변화가 소포체 스트레스 매개성 세포사멸기작에 미치는 영향을 확인하기 위하여 DAPK1 유전자 결손모델에서 세포사멸 조절인자의 유전자 발현변화를 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, DAPK1 (-/-) 실험군에서 Apoptosis 활성증가를 의미하는 BAX/BCL2 ratio는 감소한 반면, 자가포식 (Autophagy) 관련 유전자 (LC3)의 발현은 증가됨을 확인하였다. 따라서, DAPK1 억제에 의한 Apoptosis 활성 감소 및 자가 포식 기전의 발현이 촉진됨을 확인하였다.
상기 일련의 결과에 나타낸 바와 같이, DAPK1 억제제를 이용하여 DAPK1를 억제 시, 뇌경색 부피 감소 및 신경학적 기능 회복되고, 신경세포의 퇴행 및 세포사멸의 손상 방어 효과가 나타남을 확인하였다. 또한, DAPK1 매개성 세포사멸기작 활성 감소시키며, 신경보호 및 신경가소성 유발하고, 소포체 스트레스 매개성 Apoptosis 활성 억제하는 효과가 나타나, 허혈성 신경 손상과 관련된 질환의 예방 및 치료에 효과적임을 확인하였다.
<실시예 2> Pin1 억제제 처리에 의한 허혈성 뇌손상 치료 효과 확인
<2-1> 허혈성 뇌손상에 의한 세포사멸 기전 추적 및 Pin1 억제제의 신경보호 효과 검증
2-1-1. Pin1 억제에 의한 뇌경색 범위 감소 효과 및 뇌의 구조적 붕괴 억제 효과 확인
국소적 허혈성 중대뇌동맥 폐색술 (MCAo)을 이용한 뇌질환 동물모델에서 Pin1 억제제인 juglone을 1 mg/kg의 농도로 7일 동안 복강주입 한 후, 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC), hematoxylin & eosin (H-E), cresyl violet acetate (Nissl)등의 염색방법을 이용하여 뇌손상 영역을 확인하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, TTC 염색으로 뇌경색 크기를 측정한 결과, Pin1 억제제 실험군에서 뇌경색 면적이 유의하게 감소하였고, H-E, Nissl 염색결과에서 신경세포의 형태학적 변화가 나타남으로써 Pin1 억제에 의한 신경보호 및 신경재생이 나타나고 있음을 확인하였다. 따라서, Pin1 억제제에 의한 뇌경색 범위 감소 효과 및 신경 보호 효과를 확인하였다.
2-1-2. Pin1과 Ischemic-induced neurofibrillary tangles (NFTs) 형성과의 상관성 규명
허혈성 뇌질환 동물모델에서 Pin1의 발현 변화가 신경퇴행과 관련된 DAPK1의 활성과 Tau의 기능변화에 관여하고 있음을 확인하기 위하여 뇌손상 영역에서 Pin1, DAPK1, Tau5 및 pTauThr231의 항체를 이용하여 발현변화를 확인하였다. 또한, Pin1에 의한 Tau 단백질의 인산화 억제여부를 규명하기 위하여 Pin1 억제제 처리 후, Tau5, pTauThr231의 발현변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, MCAo 그룹에서 Pin1, DAPK1의 유의한 발현 증가를 확인하였고, Tau 단백질의 Thr231 motif에서 인산화의 증가를 확인하였다. 또한, Tau5와 pTauThr231의 유의한 감소를 확인하였다. 따라서, Pin1 억제에 의한 뇌신경세포의 골격구조 안정화 효과를 확인하였다.
2-1-3. 허혈성 뇌손상에 의한 세포사멸기작과 Pin1과의 작용 기전 확인
Pin1 조절에 의한 신경세포 사멸기전의 억제여부를 규명하기 위해 Bax, Bcl2, Caspase 3 등의 세포사멸 조절인자들의 유전자 및 단백질 발현 변화를 확인하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, Pin1 억제제 실험군에서 Pro-apoptosis 확인인자인 Bax, Caspase 3의 발현은 증가하였고, Anti-apoptosis 확인인자인 Bcl2의 발현은 감소하였음을 확인하였다. 따라서, Pin1 억제에 의한 Apoptosis 유도 활성 인자의 발현 감소를 확인하였다.
2-1-4. 허혈성 뇌손상에서의 Pin1 발현 증가 및 Pin1 억제에 의한 DAPK1의 발현 변화 확인
허혈성 뇌질환 동물모델의 면역형광염색 결과에서 신경세포와 Pin1의 colocalization을 통하여, Pin1의 발현변화를 관찰하였다. 또한, Pin1 억제제 처리 후, 세포사멸을 유도하는 DAPK1의 발현변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 허혈성 뇌손상 경계지점 (penumbra)에서 Pin1의 발현증가를 확인하였고, Cerebral cortex와 Striatum에서 유의한 증가를 확인하였다. 또한, Pin1 억제제 처리 후, 세포사멸을 유도하는 DAPK1의 발현변화를 관찰한 결과, 유의한 감소가 나타남을 확인하였다. 따라서, Pin1 억제에 의한 DAPK1 매개성 세포사멸 활성 감소 효과가 나타남을 확인하였다.
2-1-5. 허혈성 뇌손상에서 Pin1 억제에 의한 NeuN과 Olig2의 발현 변화 확인
허혈성 뇌질환 동물모델의 면역형광염색 결과에서 Pin1 억제제 처리 후, 신경세포 축삭 (axon)의 재수초화 (remyelination)에 관여하는 희돌기교세포 계통전사인자 (Olig2)와 신경세포 확인인자인 NeuN의 colocalization을 통하여 형광발현을 관찰하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, Cerebral cortex와 Striatum의 허혈성 뇌손상 경계지점 (penumbra)에서 NeuN과 Olig2의 발현변화를 분석한 결과, Pin1 억제제 실험군에서 유의한 증가를 확인함으로써 Pin1 억제제의 신경재생 및 신경보호작용이 나타남을 확인하였다. 따라서, Pin1 억제에 의한 신경축삭의 재생 유도 및 재수초화 활성 효과가 나타남을 확인하였다.
<2-2> 허혈성 뇌손상에서 Pin1 유전자 결손에 의한 신경보호효과 검증
2-2-1. Pin1 작용 기작 규명을 위한 유전자 결손 동물모델 (Pin1 KO mouse) 기반 구축
도 15에 나타낸 바와 같이, Pin1 KO 마우스를 획득하기 위하여 Pin1 heterozygous (+/-) mice 간의 교배를 진행하여, Pin1 (-/-) KO 동물모델 기반을 구축하고 Pin1 WT, Pin1 KO primer에 대한 RT-PCR를 시행하여 Wild type (+/+), Pin1 (+/-), Pin1 (-/-) 마우스의 유전형을 분석하였다.
2-2-2. Pin1 KO 마우스의 표현형 (Phenotype) 및 성장패턴 분석
Wild type (+/+), Pin1 (+/-), Pin1 (-/-)의 5주령 수컷 마우스의 Body size를 측정하여 비교하였다. 실험동물의 코끝에서 항문까지의 장축 길이 (nasal-anal length)를 측정한 결과, Pin1 (-/-) 마우스의 Body size가 Wild type과 Pin1 (+/-) 마우스에 비하여 상대적으로 감소되어 있음을 확인하였다. 4주부터 17주까지 Wild type (+/+), Pin1 (+/-), Pin1 (-/-) 수컷 마우스의 체중을 측정하여 각 그룹의 평균을 비교 및 분석하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, Wild type과 Pin1 (+/-) 마우스의 체중 간에는 차이가 없었으나, Pin1 (-/-) 마우스에서는 유의한 감소를 확인하였다. Pin1 (-/-) 마우스는 출생 후부터 15주까지 특이적 성장 제한의 특징을 나타내지만, 16주 전, 후부터 체중이 회복되면서 Wild type과 Pin1 (+/-) 마우스와 유사한 성장패턴을 나타냄을 확인하였다.
상기의 일련의 결과를 통하여, Pin1 억제제 처리 시, 뇌경색 범위 감소 효과 및 신경조직의 구조적 붕괴 억제하고, Ischemic-induced neurofibrillary tangles(NFTs) 형성 저해하며, 뇌신경세포의 골격구조 안정화시킴을 확인하였다. 또한, Apoptosis 유도 활성 인자의 발현을 감소시키고, DAPK1 매개성 세포사멸 활성을 감소시키며, 신경축삭의 재생 및 재수초화 활성을 유도함으로써, 허혈성 뇌졸중의 치료 및 예방에 효과적임을 확인하였다.
<실시예 3> DAPK1 및 Pin1 억제제 병용 처리에 의한 허혈성 뇌손상 치료 효과 확인
DAPK1 및 Pin1을 병용 처리한 결과, 허혈성 뇌손상 치료 효과가 나타남을 확인하였다.
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- DAPK1 억제제인 (4Z)-4-(3-pyridylmethylene)-2-styryl-oxazol-5-one 및 Pin1 억제제인 juglone을 인간을 제외한 개체에 처리하는 단계를 포함하는 세포사멸인자인 Bax 및 Caspase 3의 발현을 증가시키고, 항(anti)-세포사멸인자인 Bcl2의 발현을 감소시키는 방법.
- DAPK1 억제제인 (4Z)-4-(3-pyridylmethylene)-2-styryl-oxazol-5-one 및 Pin1 억제제인 juglone을 인간을 제외한 개체에 처리하는 단계를 포함하는 희돌기교세포 계통 전사인자인 Olig2 및 신경세포 분화 인자인 NeuN의 발현을 증가시키는 방법.
- DAPK1 억제제인 (4Z)-4-(3-pyridylmethylene)-2-styryl-oxazol-5-one 및 Pin1 억제제인 juglone을 인간을 제외한 개체에 처리하는 단계를 포함하는 신경축삭의 재생 및 재수초화의 활성을 유도하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020170158180A KR102145290B1 (ko) | 2017-11-24 | 2017-11-24 | DAPK1 또는 Pin1을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
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| KR1020170158180A KR102145290B1 (ko) | 2017-11-24 | 2017-11-24 | DAPK1 또는 Pin1을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
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| KR20160086775A (ko) * | 2016-02-11 | 2016-07-20 | 성균관대학교산학협력단 | Pin1 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
-
2017
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| Journal of Biological Chemistry. Vol. 280, No. 51, pp. 42290-42299 (2005) |
| Molecular Neurobiology. Vol. 54, No. 6, pp. 4716-4722 (2016.07.22. 온라인 공개)* |
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