KR20160086775A - Pin1 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 Pin1(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1)의 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 Pin1 저해제는 허혈성 뇌졸중에서 활성화되는 노치1(Notch1) 신호전달의 활성화 산물인 NICD1의 생성을 조절하여 신경세포의 사멸 및 허혈성 뇌졸중에 의해 유발되는 뇌경색과 신경세포 결손을 감소시키는 신경세포 보호효과를 지님으로써 뇌졸중의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, 뇌혈관질환 및 뇌졸중과 연관된 치매의 치료에도 유용하게 이용될 수 있다.

Description

Pin1 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물{composition for the prevention or treatment of the symptoms in the stroke comprising the inhibitor of Pin1}

본 발명은 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 Pin1(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1)의 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

뇌졸중(stroke)은 뇌혈류 이상으로 인해 갑작스레 유발된 국소적인 신경학적 결손 증상을 통칭하는 것으로, 의학적으로는 뇌혈관 질환(cerebrovascular accident)으로 칭한다. 뇌졸중은 뇌에 혈액을 공급하는 혈관이 막힘으로써 유발되는 허혈성 뇌졸중(Ischemic Stroke)과 뇌혈관이 터져서 유발되는 뇌출혈(Cerebral hemorrhage)로 분류된다.

허혈성 뇌졸중은 혈관 벽에 콜레스테롤 등이 침착되면서 그 내경이 좁아지며 이에 의해 뇌혈관이 막히는 뇌혈류동맥경화증과 혈전이 목이나 심장의 큰 혈관에서 생긴 후 떨어져 나와 뇌혈류를 차단하는 뇌색전증으로 분류할 수 있다. 또한 허혈성 뇌졸중은 혈액순환 장애에 따라 완전 허혈과 부분 허혈로 분류되는데 완전 허혈시에는 뇌 국소 부위의 혈액순환이 완전히 차단되어 뇌세포가 죽는 현상인 뇌경색이 발생하게 된다. 뇌는 몸 전체 산소 소모량의 20%를 차지하고 에너지원으로서 포도당만을 사용하므로 혈액의 흐름이 끊겨 에너지 공급이 잠시만 중단되어도 쉽게 뇌세포의 괴사가 일어나게 되며 이러한 뇌경색 유발 결과인 뇌세포 파괴에 의한 장애는 영구적으로 남는다. 허혈성 뇌졸중의 가장 흔한 원인은 고혈압, 당뇨, 고지혈증 등으로 인해 뇌에 혈액을 공급하는 혈관에 동맥경화증이 발생하여 뇌혈류가 차단되는 경우이다. 이외에 심장부정맥, 심부전 및 심근경색의 후유증으로 인하여 심장에서 혈전이 생성되어 뇌혈류를 차단하는 경우가 있고, 드물게는 모야모야병, 호모시스테인혈증 등의 질병에 의해 혈전이 생성되는 경우와 기타 노폐물들이 원인이 되기도 한다.

뇌졸중은 전 세계적인 주요 사망 원인 중 하나로, 세계보건기구의 2008년 통계에 따르면 뇌혈관질환은 사망원인 세 번째로 매년 1600만 명 이상의 신규 환자가 발행하며 뇌졸중으로 사망하는 환자는 5~6백만 명에 이르는 것으로 집계되었다. 우리나라의 경우에는 2010년 기준 뇌졸중에 의한 사망률이 인구 10만 명 당 53.2명으로 암에 이어 사망원인 2위를 차지하였다. 2000년에 비하면 뇌졸중에 의한 사망률은 낮아졌지만 뇌졸중 발병에 연령 또한 영향을 미치므로 전 세계적으로 인구 고령화 추세로 인해 뇌졸중의 위험은 계속될 것으로 전망되고 있다. 뇌졸중은 발병 이후 사망하지 않아도 심각한 신경학적 장애를 남기는 경우가 많기 때문에 재활과 치료에 많은 비용이 소요되며 가족이나 타인의 도움이 많이 필요하므로 가계와 사회 전체에 상당한 경제적 부담을 유발하는 질병이다. 또한 뇌졸중은 치매의 주요한 발병 원인으로 알려져 있다.

뇌졸중의 치료는 CT나 MRI를 통한 발병의 위험을 조기에 발견하여 혈류를 원활하게 해주는 외과적인 수술, 발생 직후인 급성기 치료, 재활치료, 그리고 재발방지 치료로 나누어진다. 허혈성 뇌졸중은 급성기 치료로 혈전을 녹이는 혈전 용해제와 혈전 생성을 막는 항혈소판제 등의 항 혈전 치료요법이 대부분이다. 항혈전 요법에 사용되는 약물로는 아스피린 등의 항혈소판제, 헤파린과 와파린 등의 항응고제, 그리고 혈전 용해제인 rT-PA(recombinant tissue plasminogen activator)가 사용되고 있다. 하지만 뇌졸중의 가장 큰 위험은 이러한 급성기 치료에도 불구하고 유발되는 뇌신경세포 사멸에 의한 사망 또는 뇌기능 손상에 따른 후유증이다. 전 세계적으로 신경세포 사멸을 막기 위해 NMDA 수용체 봉쇄제, 칼슘통로차단제, 유리기 제거제 등의 다양한 치료제 개발이 진행되었지만 대부분 환각, 저혈압, 부종, 심장기능 장애 등의 부작용 때문에 제한적으로 사용되거나 임상을 통과하지 못하였다. 따라서 신경세포 사멸을 막을 수 있는 신경세포 보호제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, Pin1(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1)은 기질의 펩티딜기를 시스(cis), 트란스(trans)로 이성질화시킴으로써 특정 단백질들의 활성화 또는 불활성화를 조절하는 분자적 스위치(molecular switch)로 작용한다. Pin1은 기질의 인산화 된 세린(Serine), 트레오닌(Threonine), 프롤린(Proline)의 아미노산 모티브를 인식하는 WW domain과, 기질의 구조를 cis나 trans 형태로 변화시키는 PPIase domain으로 구성된다. Pin1은 특정 단백질들의 핵 또는 미토콘드리아로의 이동, 타겟 단백질과의 상호작용 조절, 전사인자 단백질들의 전사활성도 증가, 효소의 활성 증가 등에 관여한다.

최근에는 Pin1이 JNK(c-Jun N-terminal kinase)에 의해 유도되는 신경세포의 사멸에서 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 즉, Pin1을 저해하였을 때 산화적 스트레스(oxidative stress) 또는 글루타메이트에 의한 흥분 독성(glutamate excitotoxicity) 조건에서 신경세포 사멸이 감소하였다. 또한, Pin1은 신경세포 사멸과 관련된 p53 및 Notch1 신호전달 경로에 관여되는 단백질 또는 관련 세포막 단백질들과 상호작용한다고 알려져 있다.

노치(Notch)는 세포막 수용체로서 세포의 분열, 분화 및 다양한 조직으로의 발생단계를 조절하며, 포유류 세포의 Notch는 1~4의 네 가지 종류가 있다. Notch1은 신경 전구세포의 분화 및 유지에 관여하며 세포주기와 시냅스 가소성을 조절하는데 중요한 역할을 한다. Notch1은 리간드와 결합 후 활성화되어 메탈로프로테아제(metalloprotease)인 ADAM과 감마-세크레타제(γ-secretase)에 의해 두 단계의 단백질 분해가 일어나게 되고 NICD1(Notch intracellular domain 1)이 생성되어 NICD1이 핵 안으로 들어간 후 전사 조절 인자로 작용한다. 최근에는 Notch1의 활성화는 세포사멸(apoptosis)과 관련되어 있으며, 뇌 허혈증에서 허혈성 조건은 Notch1을 활성화시켜 신경세포의 사멸 유도에 기여한다는 연구결과가 보고된바 있다.

이러한 결과들은, Pin1이 Notch1과 상호작용하여 허혈성 뇌졸중과 같은 다른 스트레스에 의한 신경세포 사멸에도 중요한 역할을 할 수 있음을 시사하지만, 구체적인 연구결과는 아직 보고된 바가 없다.

본 발명자들은, 상기와 같은 종래의 문제점 해결을 위하여 Pin1에 의해 조절되는 신경세포의 사멸 조건에서 주글론(juglone)을 포함하는 Pin1 저해제가 세포사멸을 유도하는 노치1(Notch1)의 신호 활성을 낮추어 세포사멸을 감소시키고 허혈성 신경계 뇌질환의 동물모델에서 중뇌동맥 폐쇄로 인한 뇌경색의 발생을 억제시키는 등 신경세포 보호 효과를 지님을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 Pin1 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Pin1의 저해제를 유효성분으로 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 저해제는 5-히드록시-1,4-나프토퀴논(5-hydroxy-1,4-naphthoquinone; juglone), 디에틸-1,3,6,8-테트라하이드로-1,3,6,8-테트라옥소벤조(Diethyl-1,3,6,8-tetrahydro-1,3,6,8-tetraoxobenzo; PiB), 및 디펜타메틸렌 티우람 모노설파이드(dipentamethylene thiuram monosulfide; DTM)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 Pin1의 발현 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 노치1(Notch1)의 활성을 억제함으로써 신경세포 보호효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 약리학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 보조제(additive)를 더 함유할 수 있다.

본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 조성물의 뇌졸중 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 Pin1 저해제는 허혈성 뇌졸중에서 활성화되는 노치1(Notch1) 신호전달의 활성화 산물인 NICD1의 생성을 억제하여 신경세포의 사멸 및 허혈성 뇌졸중에 의해 유발되는 뇌경색과 신경세포 결손을 감소시키는 신경세포 보호효과를 지님으로써 뇌졸중의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, 뇌혈관질환 및 뇌졸중과 연관된 치매의 치료에도 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은, Pin1이 Notch1 신호 활성을 조절하는지 검증하기 위하여 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y에 Pin1을 발현시키거나 발현을 억제시킨 후, 또는 감마세크레타제의 억제제를 처리하여 Notch1의 활성화를 억제한 후 Notch1의 활성화 산물인 NICD1 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 2는, 쥐 배아 섬유아세포인 MEF세포에서 Pin1의 발현 유무에 따른 NICD1의 단백질 발현 변화와 핵으로의 이동 여부를 검증한 결과이다.
도 3은, Pin1의 NICD1 유비퀴틴화 조절 여부를 검증하기 위하여 Pin1을 돌연변이 시키거나 Pin1 저해제인 juglone을 처리한 후 NICD1의 유비퀴틴화 정도를 관찰한 결과이다.
도 4는, 허혈성 뇌졸중 유사환경에서 juglone이 Pin1에 의한 신경세포 사멸을 억제하는지 검증한 결과이다.
도 5는, 허혈성 뇌졸중 유사환경에서 Pin1 저해제인 juglone, PiB, DTM 처리에 의한 신경세포 사멸 억제 검증을 위하여 trypan blue(0.4%) 염색을 수행한 후 세포 사멸 정도를 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 6은, 정상 대조군 마우스, Pin1의 heterozygous 마우스, Pin1 knock out 마우스를 이용하여 허혈성 뇌졸중 발병에 있어서 Pin1이 중요한 인자임을 검증한 결과이다.
도 7은, 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAO) 동물모델에서 Pin1 저해제인 juglone 투여에 의한 뇌졸중 발생 억제 효과를 검증한 결과이다.
도 8은, 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAO) 동물모델을 통해 허혈성 뇌졸중 유발 이후 Pin1 저해제인 juglone 투여에 의한 신경세포 보호효과를 검증한 결과이다.

본 발명은 Pin1의 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 뇌졸중은 바람직하게는 허혈성 뇌졸중일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌졸중을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌졸중에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 상기 저해제는 Pin1의 발현 또는 활성을 억제하는 기능을 가지는 것으로, 5-히드록시-1,4-나프토퀴논(5-hydroxy-1,4-naphthoquinone; juglone), 디에틸-1,3,6,8-테트라하이드로-1,3,6,8-테트라옥소벤조(Diethyl-1,3,6,8-tetrahydro-1,3,6,8-tetraoxobenzo; PiB), 및 디펜타메틸렌 티우람 모노설파이드(dipentamethylene thiuram monosulfide; DTM)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 화합물들은 공지된 화학적인 합성 방법으로 제조하거나, 시판되는 시약을 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명에서는 뇌졸중에 의한 세포사멸 유발 시 활성화되는 신호전달 경로인 Notch1의 활성 조절 인자로서 Pin1을 동정하였으며, Pin1이 Notch1을 활성화시키고 안정성을 증가시켜 신경세포사멸 유발에 관여한다는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, Pin1이 Notch1의 신호 활성을 조절하는지 그 연관성을 검증하기 위하여 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y에 Pin1 cDNA를 이용하여 Pin1 단백질을 발현시킨 후 Notch1의 활성화 형태인 NICD1 단백질의 발현변화를 확인한 결과 Pin1 과발현 시 NICD1 단백질 양이 증가함을 확인하였다. 이후 Pin1의 과발현과 함께 NICD1을 절단하는 감마-세크레타제의 억제제인 DAPT를 함께 처리한 결과 NICD1이 증가하지 않았다. 이를 통해 Pin1 과발현이 감마-세크레타제 매개 Notch1 신호 활성과 NICD1의 안정성에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한 Pin1 siRNA를 세포에 처리하여 Pin1의 발현을 저해하였을 때 siRNA의 농도에 의존적으로 NICD1 단백질의 발현 양이 감소하는 것을 관찰함으로써 Pin1이 Notch1 신호를 활성화시킴을 다시 한 번 확인하였다(실시예 2-1 참조). 또한 Pin1은 NICD1 핵으로의 이동능 역시 조절하는 것으로 관찰되어 Pin1이 Notch1을 활성화 및 안정화시키는 것을 확인하였다(실시예 2-2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, Pin1이 NICD1 단백질의 유비퀴틴화를 통한 분해에도 영향을 미치는지 검증하기 위하여 NICD1의 분해 시 일어나는 유비퀴틴화의 변화를 관찰하였다. 그 결과 Pin1을 과발현시킨 경우에는 NICD1의 유비퀴틴화가 감소하였고, Pin1 저해제인 juglone을 처리하거나 Pin1 단백질을 돌연변이화 시킨 경우에는 NICD1의 유비퀴틴화가 감소되지 않았다. 따라서 Pin1이 NICD1의 유비퀴틴화를 통한 분해를 억제하여 안정성을 증가시키는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 허혈성 뇌졸중 유사환경에서 Pin1 저해제에 의하여 신경세포 사멸이 억제되는지 검증하였다. 포도당과 혈청이 제거된 배지와 5% 산소가 공급되는 환경인 GD(glucose deprivation)와 포도당 및 혈청 제거와 더불어 1%의 산소가 공급되는 OGD(oxygen and glucose deprivation)에서 일차 신경세포를 배양한 결과, 두 가지 환경 모두의 경우 세포 내 Pin1 단백질의 발현 양이 증가하였으며 신경세포의 사멸이 유도되었다. 반면에 동일한 환경 하에서 세포에 juglone을 처리한 경우에는 Pin1 단백질의 발현과 신경세포 사멸이 감소하였다. 또한 juglone 처리에 의해 증가되었던 NICD1 단백질의 생성이 감소하였고, 세포사멸 신호 단백질인 cleaved caspase-3의 양도 감소하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조). 이후 동일한 허혈성 뇌졸중 유사환경에서 SH-SY5Y 세포주에 juglone을 포함한 다른 Pin1 저해제인 PiB과 DTM을 처리한 경우에도 세포사멸이 감소하는 효과를 나타내었다(실시예 5 참조).

또한, 본 발명에서는 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAO) 동물모델에서 Pin1 저해제인 juglone의 뇌졸중 발생 억제효과와 허혈성 뇌졸중 유발에 의한 신경세포 사멸을 억제하는 신경세포 보호효과를 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, Pin1 저해제의 효과를 확인하기 이전에 허혈성 뇌졸중 발병에 있어서 Pin1의 중요성을 검증하기 위해 정상 대조군 마우스, Pin1의 이형접합체(heterozygous) 마우스, 및 Pin1을 전혀 발현하지 않는 Pin1 knock out 마우스에 중뇌동맥협착 수술을 통해 허혈성 뇌졸중을 유발시켰다. 그 결과, 대조군과 비교하여 heterozygous와 knock out 마우스에서 허혈성 뇌졸중의 결과 나타나는 허혈의 생성과 신경결손이 감소하였으며, Pin1 단백질의 발현감소에 따른 뇌 세포 내 NICD1 단백질이 감소하였고 유비퀴틴화 효소인 FBW7 단백질은 증가하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 마우스에 juglone을 복강투여 함과 동시에 중뇌동맥협착 수술을 수행하여 허혈성 뇌졸중을 유발시킨 후 juglone을 투여하지 않은 대조군과 비교하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 허혈의 생성과 신경결손이 감소하였으며, 뇌 세포 내 NICD1과 Pin1 단백질은 감소하였고 FBW7 단백질은 증가하였다. 그리고 인간 허혈성 뇌졸중 환자의 조직에서 Pin1 단백질의 발현이 증가되어있는 것을 면역조직화학염색법을 통한 Pin1 염색을 통해 확인하였다(실시예 7 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 마우스에 중뇌동맥협착 수술을 수행하여 허혈성 뇌졸중을 유발시켜 신경세포 사멸을 유도한 후 Pin1 저해제인 juglone을 투여하여 신경세포사멸이 억제되는지 검증하였다. 그 결과, juglone을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 허혈의 생성과 신경 결손이 감소하였고, 뇌 세포 내 NICD1과 Pin1 단백질은 감소하였으며 FBW7 단백질은 증가하였다. 따라서 Pin1저해제인 juglone은 허혈성 뇌졸중이 유발된 이후에도 신경세포 보호효과를 가짐을 확인하였다(실시예 8 참조).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험재료 준비

1-1. 세포주 배양 및 시약 준비

본 발명의 실시예에서는 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y와 쥐 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)인 MEF 세포를 사용하였다. 두 세포 모두 10% fetal bovine serum (Gibco, Welgene, Hyclone)과 1% penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM(Sigma) 배지에서 배양되었다.

하기 실시예들에서 사용된 Pin1 억제제인 juglone(5-hydroxy-1,4-naphthoquinone)은 최종 농도가 1-5μM이 되도록 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹여 준비하였다.

1-2. Western blot 분석

세포에서 단백질을 분리하여 샘플을 준비한 후 Tris-glycine running buffer를 이용하여 10%의 SDS(Sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 겔을 떼어낸 후 0.025 mol/L Tris base, 0.15mol/L glycine, and 10% (v/v) methanol을 포함하는 transfer buffer를 이용하여 nitrocellulose membrane상으로 단백질들이 전기적인 흐름에 따라 이동되도록 15V에서 1시간 30분 동안 transfer 과정을 수행하였다. 단백질들이 결합된 membrane을 blocking buffer(5% non-fat milk in 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 137 mM NaCl, 0.2% Tween-20)에 담군 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 membrane을 발현 정도를 확인하고 싶은 각각의 단백질에 특이적인 1차 항체 즉, Pin1(R&D, Epitomics), NICD1(Upstate), MYC(Roche), FBW7(Bioss), 또는 Actin(Sigma)과 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 membrane을 Tris-buffered saline-T(20 mM Tris-HCL, pH 7.5, 137 mM NaCl, 0.2% Tween-20)로 10분간 3회 반복 세척하였다. 그리고 상온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시키고 다시 3회 세척한 후 Odyssey® Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences) 또는 ECL-plus system으로 감광하여 각 단백질의 발현 정도를 확인하고 분석하였다.

1-3. 면역세포화학염색법(Immunocytochemistry)

Pin1이 제거된 쥐 배아 섬유아세포(Mouse Embryonic Fibroblast; MEF) 즉, MEF Pin1(-/-)세포를 커버 글라스에 배양한 후 Pin1 cDNA 1.5μg을 과발현시키고 동량의 control cDNA를 MEF Pin1(-/-)과 MEF Pin1(+/+) 세포에 발현시킨 후 24시간 후에 4% paraformaldehyde를 PBS(phospho buffer saline, pH 7.4) buffer에 녹여 5분간 반응시켜 세포들을 고정시켰다. 이후 0.2% Triton-X-100을 녹인 PBS buffer에 10분간 반응시키고 PBS buffer로 10분씩 3회 세척 후 5% BSA(bovine serum albumin)을 녹인 PBS buffer에 1시간동안 반응시켰다. 관찰하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하는 Pin1, NICD1 1차 항체를 1% BSA을 녹인 PBS buffer에 1:50 비율로 섞은 후 4℃에서 밤새 반응시키고, 다시 PBS buffer로 10분씩 3회 세척 후 1차 항체와 특이적으로 반응하는 FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 붙어있는 IgG 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 다시 PBS buffer로 3회 세척 후 핵 염색을 위한 DAPI 시약이 섞인 마운팅 용액을 10ul 도포 후 커버글라스를 슬라이드글라스와 접합시키고 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 형광이미지를 관찰하였다.

1-4. 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAO) 동물모델 구축

마우스를 마취시켜 목 주위의 표피를 절개한 후 좌뇌로 연결되는 총경동맥(left common carotid artery)을 실로 묶어 막은 뒤 외경동맥(external carotid artery)을 절개하고 절개된 외경동맥을 통해 필라멘트를 삽입하였다. 내경동맥(internal carotid artery)을 통해 중뇌동맥(middle cerebral artery)까지 필라멘트를 밀어 넣어 중뇌동맥을 국소적으로 막아 혈액의 공급을 차단해 허혈성 동물 모델을 구축하였다. 1시간 동안 뇌경색을 유발한 후 필라멘트를 혈관에서 제거하여 다시 혈액을 공급해준 후 봉합하였다.

실시예 2. Pin1에 의한 Notch1 신호 활성 조절 검증

2-1. Pin1 단백질에 의한 Notch1 신호 활성 조절 확인

우선적으로 Notch1 신호 활성과 Pin1의 연관성을 검증하기 위해 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y에 Pin1 cDNA를 이용하여 Pin1 단백질을 과발현시킨 후 Notch1 신호의 활성화 물질인 NICD1 단백질의 발현변화를 Western blot(WB)으로 확인하였다.

그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, Pin1을 과발현시킨 경우 유전자를 발현시키지 않는 plasmid cDNA를 넣어준 대조군(pcDNA)에 비하여 NICD1 단백질의 양이 증가되었다. 이는 세포막에 박혀있는 막 단백질인 Notch1은 감마-세크레타제(γ-secretase)에 의해 잘려 활성화 형태인 NICD1이 되는데, Pin1 단백질의 과발현에 의해 감마-세크레타제 억제제인 DAPT(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)에 의한 NICD1 생성억제가 부분적으로 이루어지지 못한 것을 의미한다. 이를 검증하기 위해 도 1B에서처럼, Pin1을 과발현시킨 후 감마-세크레타제의 억제제인 DAPT를 5μM 농도로 함께 처리한 경우에는 NICD1이 증가하지 않는 것을 확인하였다. 즉, Pin1 단백질의 과발현이 감마-세크레타제 매개 Notch1 신호 활성과 NICD1의 안정성에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 상기 실험과 반대로, 특이적으로 Pin1의 mRNA를 분해하여 단백질의 발현을 억제할 수 있는 Pin1에 특이적인 siRNA를 사용하여 Pin1의 발현을 저해하였다. 그 결과, 도 1C에 나타낸 것처럼 control siRNA를 처리한 대조군과 비교하여 NICD1 단백질의 생성이 감소하였으며, Pin1 siRNA의 처리 농도에 비례하여 감소한 것을 확인하였다.

2-2. Pin1 단백질에 의한 NICD1의 핵으로의 이동 조절 확인

Notch1의 활성화 형태인 NICD1 단백질은 핵으로 이동하여 유전자 발현을 조절하는 전사 보조인자들(transcriptional co-factors)과 상호작용한다고 보고되어있다. 따라서 Pin1 단백질이 NICD1의 생성과 핵으로의 이동에 영향을 미치는지 검증하였다.

Pin1이 제거된 쥐 배아 섬유아세포(Mouse Embryonic Fibroblast; MEF)에 Pin1 cDNA를 이용하여 다시 발현시킨 후 NICD1 단백질의 변화를 western blot(WB)으로 확인하였다. 또한 형광 이미지로 NICD1의 핵으로의 이동 여부를 확인하기 위해 면역세포화학염색법(immunocytochemistry)을 수행한 후 공초점 현미경(confocal microscope)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 2A에 나타내 바와 같이, Pin1이 제거된 원래의 MEF 세포(MEF Pin1(-/-))는 NICD1 단백질이 거의 발현되지 않은 반면, Pin1 단백질을 재발현 시킨 MEF세포(MEF Pin1(+/+))는 사용한 Pin1 cDNA 농도에 의존적으로 NICD1 단백질이 다시 생성됨을 확인하였다. 또한 면역세포화학염색법 수행 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, DAPI를 이용하여 세포의 핵을 염색한 후 겹쳐본 이미지(MERGE)와 비교하였을 때, MEF Pin1(-/-) 세포는 핵에서의 NICD1의 양이 매우 낮고 핵을 제외한 세포질에 퍼져있는 반면, Pin1이 제거된 원래의 MEF 세포에 Pin1을 다시 넣어준 경우(MEF Pin1(-/-)+Pin1)는 MEF Pin1(+/+)세포와 유사한 수준으로 핵에서 NICD1 단백질이 관찰되었다.

실시예 3. Pin1에 의한 NICD1의 유비퀴틴화 조절 검증

NICD1 단백질은 핵에서 F-box and WD repeats domain-containing 7(FBW7)을 통한 프로테아좀 의존적 경로(proteasome-dependent pathway)에 의해 분해된다고 알려져 있다. 상기 실시예 2에서 Pin1이 NICD1의 안정성을 조절하는 것을 확인하였으므로 Pin1이 NICD1 단백질의 유비퀴틴화를 통한 분해과정에도 영향을 미치는지 검증하였다.

MYC이 연결된 NICD1, HA가 연결된 유비퀴틴(Ub), 그리고 Pin1을 SH-SY5Y 세포주에 발현시킨 후 MG132를 처리하여 26S 프로테아좀 복합체의 단백질 분해 활성을 억제하였다. 이후 HA와 FBW7에 특이적인 항체를 사용함으로써 co-immunoprecipitation(IP)과 western blot(WB) 분석을 통하여 NICD1의 유비퀴틴화 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, Pin1을 과발현시킨 경우에는 plasmid cDNA(pcDNA)를 사용한 대조군에 비하여 NICD1의 유비퀴틴화가 감소하였다. 반면에 Pin1 저해제인 juglone을 1.5μM 농도로 처리한 경우에는 NICD1의 유비퀴틴화가 다시 증가하였다.

다음으로, Pin1 단백질을 구성하는 도메인 중 기질과 결합하는 WW domain과 이성질화 활성을 가지는 PPIase domain의 구성 아미노산의 일부를 다른 아미노산으로 치환시켜 각각 돌연변이(R17A, C113A/A118T)를 만든 후 같은 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 3B에 나타낸 바와 같이, 정상 Pin1이 과발현된 경우 NICD1의 유비퀴틴화가 감소한 것과 달리 돌연변이 Pin1을 과발현시킨 경우에는 NICD1이 감소하지 않았다. 상기 결과들을 통해 Pin1이 NICD1의 유비퀴틴화를 감소시켜 단백질 분해를 저해하여 NICD1 단백질의 안정성을 증가시키는 것을 확인하였다.

실시예 4. 허혈성 뇌졸중 유사환경에서 juglone에 의한 신경세포 보호작용 검증

상기 실시예 2 및 3을 통해 Pin1이 신경세포의 사멸에 관여하는 Notch1 신호전달에 영향을 미치는 것을 확인하였으므로, 허혈성 뇌졸중과 유사한 상황에서 신경세포사멸 유발 시 Pin1의 발현 변화 및 Pin1 저해제인 juglone 처리 시 신경세포사멸이 억제되는지 검증하였다.

일차 신경세포를 포도당(glucose)과 혈청(serum)이 제거된 배지 하에 산소가 5% 또는 1%인 배양기에서 9, 12, 24시간 동안 배양하여 세포수준에서 허혈성 뇌졸중과 유사한 환경을 조성하여 신경세포 사멸을 유발하였다. 이후 Pin1 단백질의 발현 정도를 면역세포화학염색법과 western blot을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, 신경세포를 glucose와 serum이 없는 배지 하에 1% 산소의 배양기에서 배양한 OGD(oxygen and glucose deprivation) 조건에 노출시킨 경우 신경세포 마커인 MAP2와 초록색 형광 발현에 의해 Pin1 단백질이 증가되어 있음을 확인하였다. 그리고 DAPI를 이용해 핵을 염색한 경우와 겹친 이미지(Merged)를 관찰하여 Pin1이 세포질에서 강하게 발현되고 있음을 확인하였다. 또한, 도 4B에서처럼 glucose와 serum만 없는 배지에서 배양한 GD(glucose deprivation) 조건하에서 12시간 또는 24시간 동안 배양한 경우에도 모두 Pin1 단백질의 발현이 증가하였다. 그리고 OGD 조건하에서 신경세포를 12시간 동안 배양한 후 trypan blue(0.4%)로 염색한 결과 신경세포의 사멸이 유도된 것을 도 4C에서 확인하였다. 반면에 도 4A 내지 도 4C에서 나타난 Pin1 생성과 세포사멸의 증가가 juglone 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다.

다음으로 각각의 GD 또는 OGD 조건 하에서 12시간 또는 24시간 동안 일차 신경세포를 배양한 후 세포사멸 신호 단백질 중 하나인 caspase-3와 NICD1 단백질의 발현 변화를 western blot을 통해 검증하였다.

그 결과, 도 4D 및 도 4E에 나타낸 바와 같이, 두 가지 배양조건과 배양 시간에서 모두 caspase-3의 활성화 형태인 cleaved caspase-3(CLCas-3) 단백질의 생성이 증가하였지만 juglone 처리에 의해 감소하였다. 또한, 도 4F 및 도 4G에 나타낸 바와 같이, 두 가지 배양조건에서 모두 NICD1 단백질의 생성이 증가한 반면, juglone 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 허혈성 뇌졸중에서 NICD1 증가에 의한 세포사멸 신호의 증가를 Pin1의 저해를 통해 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. Juglone을 포함한 Pin1 저해제들에 의한 신경세포 보호작용 검증

상기 실시예 4와 같은 방법으로 SH-SY5Y 세포를 OGD 또는 GD 조건 하에서 노출시켜 세포사멸을 유도한 후 juglone을 포함한 Pin1 저해제들을 처리하여 신경세포 보호효과를 검증하였다.

SH-SY5Y 세포에 Pin1 저해제인 juglone(5-hydroxy-1,4-naphthoquinone), PiB(Diethyl-1,3,6,8-tetrahydro-1,3,6,8-tetraoxobenzo), DTM(dipentamethylene thiuram monosulfide)을 각각 1.5, 5, 5μM 농도로 처리함과 동시에 GD 또는 OGD 조건에 노출시켜 세포사멸을 유도한 후 6시간, 12시간 뒤에 trypan blue(0.4%)로 염색하여 세포사멸 정도를 정량적으로 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 정도의 차이는 있지만 OGD 또는 GD 조건 하에 노출시켜 6시간 또는 12시간 동안 세포사멸을 유도한 후 Pin1 저해제를 처리한 경우 모두 세포사멸이 감소하였다. 즉, Pin1 저해제인 juglone, PiB, DTM들의 신경세포 보호효과를 확인하였다.

실시예 6. 허혈성 뇌졸중 동물모델에서 Pin1이 미치는 영향 검증

실제 허혈성 뇌졸중 발병에 있어서 Pin1이 중요한 영향을 미치는지 in vivo 상에서 검증하기 위해 하기와 같은 동물실험을 수행하였다.

Pin1을 정상적으로 발현하는 정상 대조군 마우스(Pin1(+/+)), 1쌍의 상동염색체 중 하나의 염색체만 Pin1을 정상적으로 발현하는 이형접합체(heterozygous) 마우스(Pin1(+/-)), 그리고 Pin1을 전혀 발현하지 않는 knock out 마우스(Pin1(-/-))를 준비한 후 상기 실시예 1-4에서처럼 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAO) 수술을 통해 마우스들에 허혈성 뇌졸중을 유발시킨 후 각 그룹을 비교하였다.

그 결과, 도 6A 및 도 6B에 나타낸 바와 같이, 뇌를 적출한 후 육안으로 뇌경색 크기를 알 수 있는 TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)염색을 수행하여 각 그룹의 허혈생성 정도를 비교한 결과, 정상대조군에 비하여 Pin의 heterozygous와 knock out 마우스에서 허혈 생성이 감소하였다. 또한 도 6C에서처럼, 뇌졸중 유발에 의한 뇌신경세포 사멸에 따른 신경결손 역시 감소함을 확인하였다. 이후 적출한 좌뇌 조직을 이용하여 NICD1, Pin1, FBW7에 각각 특이적인 항체를 이용한 western blot(WB)을 수행하여 각 단백질의 발현정도를 비교하였다. 그 결과, 도 6D 내지 도 6E에 나타낸 바와 같이, Pin의 heterozygous와 knock out 마우스의 경우 Pin1 단백질의 발현량 감소에 따라 NICD1 단백질은 감소하였고, NICD1의 유비퀴틴화 효소인 FBW7 단백질은 증가하였다. 상기 결과들을 통해, 뇌졸중 발병에 있어서 Pin1이 매우 중요한 인자임을 확인하였다.

실시예 7. 중뇌동맥협착 동물모델에서 juglone의 뇌졸중 억제 효과 검증

상기 실시예 6에서 뇌졸중 발병에 있어서 Pin1이 매우 중요한 인자임을 확인하였으므로, 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAO) 동물모델에서 Pin1의 저해제인 juglone에 의한 뇌졸중 억제 효과를 검증하였다.

마우스에 juglone(3mg/kg)을 2회 복강 투여한 후 중뇌동맥협착 수술을 통해 마우스에 허혈성 뇌졸중을 유발시킨 후 juglone을 투여하지 않은 대조군 마우스와 비교하였다.

그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, juglone을 투여한 마우스의 경우 대조군에 비해 허혈의 생성이 감소하였고, 도 7B와 같이 신경결손 역시 대조군에 비하여 감소하였다. 또한 뇌졸중을 유발한 마우스의 좌뇌를 이용하여 western blot(WB)을 수행하여 NICD1, Pin1, FBW7 단백질들의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, 도 7C 및 도 7D에 나타낸 바와 같이, juglone을 투여한 마우스의 경우 대조군에 비하여 NICD1과 Pin1 단백질이 감소하였으며, FBW7 단백질은 증가하였다. 또한 도 7E를 통해 뇌졸중 환자의 뇌 조직에서도 면역조직화학염색법을 통한 Pin1 단백질의 염색을 통해 정상인에 비해 Pin1 단백질의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다.

실시예 8. 허혈성 뇌졸중 유발 이후 Pin 1 저해에 의한 신경세포 보호효과 검증

다음으로 허혈성 뇌졸중을 유발시켜 신경세포사멸이 유도되었을 때 Pin1 저해제인 juglone 투여 시 신경세포사멸이 억제되는지 검증하였다.

상기 실시예 1-4와 같이 중뇌동맥협착 수술을 통해 허혈성 뇌졸중을 유발한 후 juglone(3mg/kg)을 정맥주사(Intravenous Injection)로 1회 투여 후 juglone을 투여하지 않은 대조군 마우스와 비교하였다.

그 결과, 도 8A 및 도 8B에 나타낸 바와 같이, juglone을 투여한 경우 대조군에 비하여 허혈의 생성 감소와 신경 결손이 감소함을 확인하였다. 또한 상기 실시예 6 내지 7에서와 같이 western blot을 통한 NICD1, Pin1, FBW7 단백질의 발현 정도를 확인한 결과, 도 8C 및 도 8D와 같이 juglone을 투여한 마우스의 경우 대조군과 비교하여 NICD1과 Pin1 단백질이 감소하였으며, FBW7 단백질은 증가하였다. 상기 결과를 통해 Pin1 저해제인 juglone은 허혈성 뇌졸중이 유발된 이후에도 신경세포 보호효과를 가짐을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (2)

1. 5-히드록시-1,4-나프토퀴논(5-hydroxy-1,4-naphthoquinone; juglone)을 포함하는 Pin1(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1) 저해제를 신경세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 노치1(Notch1) 활성을 억제하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 Pin1 저해제는 디에틸-1,3,6,8-테트라하이드로-1,3,6,8-테트라옥소벤조 페난트롤린-2,7-디아세테이트(Diethyl-1,3,6,8-tetrahydro-1,3,6,8-tetraoxobenzo phenanthroline-2,7-diacetate; PiB), 또는 디펜타메틸렌 티우람 모노설파이드(dipentamethylene thiuram monosulfide; DTM)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 시험관 내에서 노치1(Notch1) 활성을 억제하는 방법.

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