KR102138840B1 - 데칸산을 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

데칸산을 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 데칸산(decanoic acid)을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 데칸산을 유효성분으로 포함하는 조성물은 임신 초기 모체의 자궁내막으로 침투하는 영양막 세포 내 PI3K/AKT, MAPK 신호전달메커니즘을 조절하는 하위 신호전달물질의 인산화를 억제함으로써 영양막 세포의 증식 및 침투성을 억제하고 세포 사멸 효과를 향상시키는 효과가 있는바, 영양막 세포의 비정상적 발달에 의해 발명하는 임신성 영양막 질환을 예방 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

데칸산을 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating gestational trophoblastic disease comprising decanoic acid}
본 발명은 데칸산(decanoic acid)을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
융모막암, 포상기태와 같은 임신성 영양막 질환은 영양막 세포의 비정상적인 증식, 과도한 이동성과 침투성으로 인해 발병하는 질병이다. 특히 융모막암은 임신성 영양막 질환중 가장 악성의 질병으로 주로 임신 초기에 포상기태로부터 발병하는 경우가 대다수이며(VCMak et al, Carcinogenesis, 2016; LDuffy et al, Journal of clinical medicine research, 2015), 영양막 조직에서 유래된 악성 종양인 융모막암은 임신기에 20,000~40,000 명 당 1명의 비율로 나타나는 것으로 보고된바 있다(Soper et al, Gynecol Oncol, 2004). 또한, 융모막암은 혈관침투성이 매우 높으며 폐나 질 같은 타기관으로의 전이가 빈번하게 일어나는 것으로 알려져있다 (Geramizadeh and Rad, Indian J Pathol Microbiol, 2012).
일반적인 융모막암의 치료 방법은 EMA-CO라고 불리는 화학적치료법을 실시하는 것이다. 하지만, 융모막암 환자의 15-25%는 이러한 화학적 치료법에 대해 저항성 및 나쁜 예후를 나타낸다(Powles et al, Br J Cancer, 2007). 따라서 융모막암에 나타나는 항암제 내성을 극복하기 위해 더욱 효과적인 치료제 개발을 통한 접근법이 필요한 실정이다.
데칸산은 10개의 탄소원자를 가지는 불포화지방산 계열로서 코코넛오일, 팜오일 등에서 자연적으로 추출될 수 있으며(Dasgupta and Bhattacharyya, J. Oleo. Sci, 2009), 아이스크림, 과일주스, 와인 등에 인공적인 풍미를 내기 위한 식품첨가제로 사용되고 있다(Huang et al., Arch. Oral Biol, 2001). 또한, 데칸산은 항바이러스 및 항박테리아 효과를 가지고 있고, 인간 세포에 노출될 경우 다양한 생물학적 활성을 지니는 것으로 보고되고 있으며(Huang et al., J. Dermatol. Sci, 2014), 유방암, 대장암, 피부암 등 다양한 암종에서 항암 효과를 지니는 것으로 알려져 있다(Narayanan et al., Int. J. Mol. Sci, 2015).
이처럼, 데칸산에 의한 다양한 약리적 효과들이 보고되고 있으나, 현재까지 여성 생식 또는 임신 관련 질환과 관련하여 데칸산의 효능에 대해 알려진 바는 전무하며, 특히 영양막 세포의 증식, 이동성, 침투성 등 영양막 세포의 비정상적 발달과 관련된 특성을 조절함으로써 임신성 영양막 질환을 치료하는 효과에 대해서는 알려진바 없다.
이에, 본 발명자들은 임신성 영양막 질환 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 데칸산이 영양막 세포 증식과 이주성 및 침투성 억제, 세포 사멸 유도 효과가 있음을 확인하고, 데칸산이 영양막 세포 내 PI3K/AKT 및 ERK1/2 MAPK 신호전달기전을 억제한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 영양막 세포의 증식, 이주 및 침투 능력을 억제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 영양막 세포의 사멸 효과를 향상시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 영양막 세포의 증식, 이주 및 침투 능력을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 영양막 세포의 사멸 효과를 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 데칸산을 유효성분으로 포함하는 조성물은 임신 초기 모체의 자궁내막으로 침투하는 영양막 세포 내 PI3K/AKT, MAPK 신호전달메커니즘을 조절하는 하위 신호전달물질의 인산화를 억제함으로써 영양막 세포의 증식 및 침투성을 억제하고 세포 사멸 효과를 향상시키는 효과가 있는바, 영양막 세포의 비정상적 발달에 의해 발명하는 임신성 영양막 질환을 예방 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 영양막 세포주 증식에 데칸산이 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 영양막 세포 내 데칸산 처리에 따른 산화 스트레스 유도 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 영양막 세포 내 데칸산 처리에 따른 칼슘이온 농도 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 영양막 세포 내 칼슘이온 조절에 따른 세포 증식성 조절 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 영양막 세포주에 데칸산 처리 시 세포사멸 기전을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 영양막 세포주에 데칸산 처리 시 세포 침투성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 영양막 세포 내 데칸산 처리에 의한 PI3K/AKT 및 ERK1/2 MAPK 신호전달 경로 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 영양막 세포 내 데칸산, PI3K/AKT 및 ERK1/2 억제제 병용처리에 따른 신호전달 단백질의 인산화 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 영양막 세포 내 데칸산에 의한 세포 증식 억제 및 세포 사멸 기전을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 데칸산의 영양막 세포 내 세포 증식 억제 및 세포 사멸 기전을 밝혔다(도 9).
본 발명은 일 관점에서 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 데칸산을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 있어서, 상기 영양막 세포는 포유동물 유래의 세포일 수 있으며, 상기 포유동물은 설치목(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 우제목(예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소, 사슴, 기린 및 영양), 기제목(예를 들어, 말, 당나귀, 코뿔소 및 맥), 식육목(예를 들어, 개, 고양이, 호랑이, 늑대, 여우, 사자, 치타, 표범, 너구리, 오소리, 퓨마, 재규어 및 삵쾡이), 토끼목(토끼 및 우는 토끼), 식충목(예를 들어, 고슴도치, 두더지 및 솔레노돈) 및 영장목(예를 들어, 침팬지, 오랑우탄, 고릴라, 보노보노, 일본원숭이, 붉은털원숭이)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 담체는 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염, 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국부 투여용으로 제형화하는 것을 특징으로 할 수 있고, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화 방지제, 긴장성 조정제, 방부제, 증점제 및 점도 개질제로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔 및 분말로 구성된 군에서 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 증상의 경중도, 환자의 체중, 연령, 성, 투여 방식 및 투여시간 등과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률 제6722호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 식품을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있고, 과립제, 정제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 껌, 차, 젤리, 각종 음료수, 드링크제, 알코올 음료 등으로 제조될 수 있으며, 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 인체를 비롯한 동물 신체에 투여하기 적합한 임의의 생약 형태, 더욱 구체적으로는 경구 투여에 통상적인 임의의 형태, 예를 들어 식품 또는 사료, 식품 또는 사료의 첨가제 및 보조제, 강화된 식품 또는 사료, 정제, 환제, 과립, 캡슐 및 발포 배합물 등과 같은 고체 형태 또는 용액, 현탁액, 유화액, 음료, 페이스트 등과 같은 액체형태 일 수 있고, 영양제, 비타민, 전해질, 감미제, 착색제, 유기산, 방부제 등을 함유할 수 있으며, 이러한 성분들을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 데칸산은 PI3K/AKT 및 ERK1/2 MAPK 신호전달기전을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, PI3K/AKT 또는 ERK1/2 MAPK 신호전달경로를 억제하는 타겟 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 임신성 영양막 질환은 융모막암(choriocarcinoma), 포상기태(hydatidiform mole) 및 융모선종(villous adenoma)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 에토포사이드, 시스플라틴 또는 파클리탁셀을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 융모막암, 포상기태, 융모선종 등을 포함한 임신성 영양막 질환의 치료제로 사용되는 화학치료제를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 약학적 조성물을 이용하여 영양막 세포의 증식, 이주 및 침투 능력을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 약학적 조성물을 이용하여 영양막 세포의 사멸 효과를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예
<실험 방법>
실험동물 및 세포배양
HTR8/SVneo 세포는 American Type Culture Collection에서 구매하여 사용하였으며, 세포의 단층배양을 위해서 2.05 mM L-Glutaimine이 함유된 RPMI-1640 배지에 5%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 함께 혼합하여 사용하였다.
실험 재료
후보 조성물질인 데칸산은 Sigma-Aldrich, Inc로부터 구매하여 사용하였으며, 데칸산에 의한 신호전달메커니즘을 확인하기 위하여 phospho-JNK, c-Jun, eIF2α, AKT, P70S6K, S6, ERK1/2 단백질 및 IRE1α, cleaved Caspase-9, total-JNK, c-Jun, eIF2α, AKT, P70S6K, S6, ERK1/2에 대한 항체를 Cell Signaling Techonology사로부터 구매하였다. 이 외, PCNA, GRP78, PERK, TUBA에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology 사에서 구매하였다. Ruthenium red는 Abcam 사에서 구매하였으며 BAPTA-AM은 Santa Cruz Biotechnology사에서 구매하였다.
BrdU를 이용한 세포 증식 능력 분석
영양막 세포의 증식 능력에 데칸산이 미치는 영향을 확인하기 위하여 FBS 기아 조건으로 배양한 5×103개의 세포와 배지 100 ㎕를 96 well에 분주하고 데칸산을 용량의존적으로 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 배양한 다음, BrdU 키트 (Cat No: 1167229001, Roche)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험을 수행하였다. 인큐베이션 이후, 10 μM BrdU를 각 well에 추가적으로 넣어 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 2시간 동안 배양하였다. 융모암 세포에 BrdU를 labeling 하고 세포를 고정하여 anti-BrdU-POD 용액을 상온에서 90분 인큐베이션 시킨 이후 3차례 씻어주었으며, 마지막으로 100 μl의 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine substrate으로 세포를 반응하여 ELISA 리더기를 사용하여 370 nm, 492 nm 내 흡광도를 측정하여 세포 증식 능력을 분석하였다.
면역형광법
3×104 개의 영양막 세포를 5% FBS가 포함 된 배지 300 μl와 함께 confocal dish (catalog number: 100350, SPL Life Science, Republic of Korea)에 분주하여 배양한 뒤, 24시간 FBS 기아상태로 추가로 배양하여 데칸산 400 μM을 24시간 동안 처리한 뒤 메탄올로 10분간 세포를 고정하고, 2 μg/ml로 희석된 PCNA 항체를 처리하였으며 대조군에는 mouse IgG를 처리하여 4℃에서 16시간 인큐베이션 하였다. 이후, 0.1% BSA (bovine serum albumin)이 포함된 PBS로 2번의 워싱과정을 거쳐 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG Alexa 488 (catalog number: A-11001, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 antibody dilution buffer에 1:200으로 희석하여 상온에서 1시간동안 배양하였다. HTR8/SVneo 세포를 0.1% BSA-PBS로 워싱한 다음 DAPI 염색을 추가적으로 시행하여 HTR8/SVneo 세포 내 타겟 단백질뿐만 아니라 핵을 동시에 관찰할 수 있도록 하였다. 실험 종료 후 LSM710 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 공초점 현미경을 이용하여 세포를 관찰 및 촬영하였다.
세포 주기 분석
데칸산에 의한 영양막 세포의 세포주기 변화 양상을 확인하기 위하여 5×105 세포를 6 well에 배양하고 70~80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 다음으로, 데칸산을 용량의존적으로 처리하여 48시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 0.1% BSA/PBS로 워싱을 진행하고 70% Ethanol에서 16시간 동안 세포를 고정시킨 후, 0.1% BSA/PBS로 워싱하고 RNase A (Sigma) 처리 하에서 PI 염색을 수행하였다. FACS 튜브에 염색된 용액을 옮겨 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하여 세포 주기를 분석하였다.
DCFH -DA를 이용한 세포내 ROS 측정
HTR8/SVneo 세포 내 ROS 생성에 데칸산이 미치는 영향을 확인하기 위하여 peroxide 존재하에 2’, 7’-dichlorofluorescin (DCF)로 변환되어 형광을 띠는 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA, Sigma)를 사용하였다. HTR8/SVneo 세포를 트립신을 통해 떼어내고 원심분리를 통해 세포 pellet을 얻은 이후 PBS로 한번 워싱하고 10 μM의 DCFH-DA를 37℃ 인큐베이터 내에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 다음으로, 세포를 PBS에 의해 두 번 워싱하고 데칸산을 용량 의존적으로 (0, 100, 200, 400 μM) 1시간동안 37℃ 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 처리된 세포는 PBS로 다시 워싱하고 유세포 분석기를 사용하여 DCF 형광 강도를 분석하였다.
지질과산화 분석
영양막 세포내 지질과산화 정도를 분석하기 위해 Click-iT lipid peroxidation imaging kit (Invitrogen)을 사용하였다. 3×104 개의 영양막 세포를 5% FBS가 포함 된 배지 300 μL와 함께 confocal dish 에 분주하여 배양한 뒤, 데칸산 400 μM으로 37℃ 인큐베이터 내에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 3.7% formaldehyde로 세포를 고정하고 0.5% Triton X-100을 이용하여 premeablization한 후 Alexa Fluor 488 Azide로 상온에서 30분 동안 형광염색하였다. 마지막으로 PBS로 헹구고 DAPI를 염색한 이후, LSM710 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 공초점 현미경을 이용하여 세포를 관찰 및 촬영하였다.
세포내 칼슘이온 및 미토콘드리아 칼슘이온 농도 측정
HTR8/SVneo 세포 내 칼슘이온 농도에 데칸산이 미치는 영향을 확인하기 위하여 먼저 5×105 세포를 6 well에 배양하고 70~80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, 데칸산을 처리하여 48시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 Fluo-4 AM (Invitrogen)을 37℃ 인큐베이터 내에서 20분 동안 인큐베이션 하였다. 염색된 세포는 PBS로 한 번 워싱하고 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하였다. 미토콘드리아 칼슘이온 농도 변화는 Rhod-2 AM (Cat No: R1244, Invitrogen)을 사용하여 측정하였다. 5×105 개의 영양막 세포를 6 well에 배양하고 70~80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 다음으로, 데칸산을 용량의존적으로 처리하여 48시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 원심분리 하여 세포 pellet을 얻었다. 세포는 3 μM Rhod-2 AM에 풀어준 후 4℃에서 30분간 인큐베이션 하였다. 염색된 세포는 Hank’s balanced salt solution (HBSS)에 워싱한 후 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하였다.
JC -1 염색을 통한 미토콘드리아 막전위 측정
JC-1 미토콘드리아 막 전위 (MMP) 변화는 mitochondria staining kit (Cat No: CS0390, Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하였다. 5×105개의 영양막 세포를 6 well에 배양하고 70~80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, 데칸산을 용량의존적으로 (0, 100, 200, 400 μM) 처리하여 48시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 원심분리 하여 세포 pellet을 얻었다. 세포는 JC-1 staining solution 에 풀어준 후 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 20분간 인큐베이션 하였다. 염색된 세포는 다시 원심분리하여 1x JC-1 staining buffer로 워싱한 후 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하였다.
Annexin V와 propidium iodide 염색을 통한 세포사멸 분석
데칸산에 의한 영양막 세포의 사멸 효과를 확인하기 위하여 FITC Annexin V 세포 사멸 진단 키트 I (BD Biosciences)를 사용하여 실험을 진행하였다. 먼저 5×105 세포를 6 well에 배양하고 70~80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, 데칸산을 용량의존적으로 (0, 100, 200, 400 μM) 처리하여 48시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 PBS로 워싱을 진행하고 1 mL의 1× binding buffer를 사용하여 세포를 천천히 혼합하고 원심분리하여 세포 pellet을 얻었다. 다음으로 200 μL의 1× binding buffer으로 세포현탁배양하여 브라운 1.5 mL 튜브에 100 μL 넣고 Annexin V 5 μL, PI 5 μL를 함께 혼합하여 세포를 15분 동안 실온에 두어 염색하였다. 이후 1× binding buffer를 400 μL 추가하여 5 mL FACS 튜브에 염색된 용액을 옮겨 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하여 사멸된 세포의 수를 측정하였다.
단백질 발현 분석 ( 웨스턴블롯 )
영양막 세포에 데칸산을 처리한 다음 영양막 세포로부터 전체 단백질을 추출하여 Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 단백질을 정량하였다. 이후, 추출한 단백질을 95℃에서 5분간 변성하였으며 10% SDS/PAGE 젤을 이용하여 전기영동 수행한 뒤, nitrocellulose membrane으로 옮겨주고, 1차 항체와 2차 항체를 차례로 인큐베이션 시킨 다음 chemiluminescence detection (SuperSignal West Pico, Pierce, Rockford, IL, USA) 시약을 사용하여 ChemiDoc EQ system과 Quantity One software (Bio-Rad) 기기를 사용하여 타겟 단백질의 발현을 분석하였다.
세포 침투성 분석
세포 침투성은 matrigel로 37℃에서 2시간 동안 코팅된 8-μm pore Transwell inserts (Corning)를 사용하였다. 데칸산 400 μM가 포함된 배지의 영양막 세포를 위쪽 챔버에서 12시간 동안 37℃ 배양한 다음, 아래쪽으로 침투한 세포의 수를 측정하기 위해 메탄올로 10분간 고정하였다. 이후, 헤마톡실린 (Sigma)으로 상온에서 30분간 인큐베이션 시킨 다음 위쪽 챔버에 남아있는 세포를 면봉으로 닦아 제거하였다. 침투한 세포의 수는 DM3000 (Leica) 현미경을 사용하여 측정하였다.
mRNA 발현 분석 ( qPCR )
영양막 세포에 데칸산 400 μM을 처리한 다음 Trizol reagent (Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 이후, 1 μg의 RNA를 AccuPower RT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자 발현은 SYBR Green (Sigma)과 StepOnePlus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 측정하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분동안 인큐베이션 후 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 3분 조건을 40회 증폭하였으며 GAPDH 발현량에 기반하여 정규화하였다.
통계분석
본 실험결과는 SAS (statistical analysis system) 통계프로그램을 이용하여 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였다. P < 0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
결과 및 고찰
영양막 세포의 증식성에 데칸산이 미치는 영향 분석
데칸산에 의한 임신 초기 영양막 세포주(HTR8/SVneo)의 변화양상을 분석하기 위하여 먼저 데칸산을 용량의존적으로 (0, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 600, 800 μM) 첨가한 배지에 24시간 또는 48시간 배양하였으며 이후 세포 증식 양상을 분석한 결과, 영양막 세포의 증식력이 데칸산에 의해 단계적으로 감소한다는 것을 확인하였다(도 1A). 800 μM의 데칸산을 24시간 처리 시 영양막 세포의 증식력이 50% 이상 감소하였고 48시간 처리의 경우 400 μM의 데칸산 처리부터 영양막 세포의 증식력이 50% 이상 감소하였다. 이후, DNA 증식에 필수적인 단백질인 PCNA에 대한 항체를 사용하여 면역형광기법을 수행한 결과, 컨트롤 그룹에 비해 400 μM 데칸산을 24시간 처리한 영양막 세포의 핵 내에서는 PCNA의 발현이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다(도 1B). 뿐만 아니라 데칸산을 48시간 동안 처리 시, SubG1 상태의 영양막 세포의 비율이 급격히 증가함을 확인하였다(도 1C). 반대로, G2/M 상태의 영양막 세포의 비율은 데칸산 처리에 따라 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과를 통해 데칸산이 영양막 세포의 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
영양막 세포 내 데칸산에 의한 산화 스트레스 유도 효과 분석
데칸산에 의해 HTR8/SVneo 세포 내 산화 스트레스가 유발되는지 확인하기 위해 DCF 형광 관찰을 통해 세포 내 활성산소(ROS) 생성 정도를 확인하였다. 그 결과, 데칸산을 처리한 HTR8/SVneo 세포 내 DCF 형광이 용량의존적으로 증가하였으다(도 2A). 400 μM의 데칸산 처리 시 대조군에 비해 약 22.3배의 활성산소 생성량이 증가율을 보였다. 또한 활성산소에 의해 유도되는 지질과산화 정도를 확인한 결과 대조군에 비해 400 μM 데칸산을 2시간 처리한 영양막 세포에서 지질과산화 현상이 급격히 증가하는 것을 확인하였으며 이를 수치화하였을 때 약 2.5배의 증가율을 보였다 (도 2B).
다음으로, Fluo-4 염색과 Rhod-2 염색을 통해 각각 세포내 칼슘이온 농도와 미토콘드리아 특이적 칼슘이온 농도를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과 데칸산에 의해 세포내 칼슘이온 농도는 크게 변하지 않았으나, 400 μM 데칸산을 48시간 처리함에 따라 미토콘드리아 특이적 칼슘이온 농도가 약 2.9배 증가함을 확인하였다 (도 3A, 3B). 다음으로, 데칸산에 의해 영양막 세포 내 미토콘드리아 특이적 칼슘이온의 증가가 영양막 세포의 증식성에 직접적으로 관여하는지 분석하기 위해 칼슘이온 채널 억제제인 Ruthenium Red (8 μM)와 칼슘이온 제거제로 알려진 BAPTA-AM (1 μM)을 데칸산과 병용 처리한 결과, BAPTA-AM 처리 시 데칸산에 의해 증가한 미토콘드리아 칼슘이온 농도가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 4A). 실제로 영양막 세포의 증식성을 데칸산과 Ruthenium Red 및 BAPTA-AM과 병용 처리 후 확인한 결과 Ruthenium Red에 의해서는 세포 증식성에 큰 변화가 없었으나 BAPTA-AM 처리에 따라서는 데칸산에 의해 감소했던 세포 증식성이 회복되는 것으로 나타났다(도 4B). 이러한 결과를 통해 영양막 세포 내 데칸산에 의한 산화 스트레스를 매개로 하여 영양막 세포 내 미토콘드리아 특이적 칼슘 유입이 촉진되며 이는 영양막 세포의 증식성과 밀접하게 관련된다는 것을 확인하였다.
영양막 세포 내 데칸산에 의한 세포사멸 기전 분석
영양막 세포 내 미토콘드리로의 칼슘 이온 과유입에 따라 미토콘드리아의 막 전위가 변화하는지 여부를 확인하기 위해 데칸산을 용량의존적 (0, 100, 200, 400 μM)으로 6, 24, 48시간 인큐베이션 후 JC-1 염색을 통해 미토콘드리아 막전위를 측정하였다. 그 결과 용량 및 시간 의존적으로 데칸산에 의해 영양막 세포 내 미토콘드리아 막 전위가 감소하는 것을 확인하였다(도 5A). 6시간, 24시간 48시간 처리 시 각각 대조군에 비하여 1.4배, 3.0배, 7.3배의 미토콘드리아 막 전위를 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라 데칸산의 영양막 세포에 대한 세포사멸 유도 효과를 분석하기 위해, 영양막 세포에 데칸산을 용량의존적 (0, 100, 200, 400 μM)으로 48시간 인큐베이션 후 Annexin V 및 PI 염색을 통해 세포사멸이 일어나는 영양막 세포의 수를 FACS를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 대조군에 비하여 데칸산을 처리하였을 때 용량의존적으로 세포 사멸이 증가함을 확인하였다(도 5B). 400 μM의 데칸산에 반응하여 약 33.9%의 영양막 세포가 사멸 상태로 존재하였으며 이는 대조군에 비하여 약 5.8배에 해당하는 수치였다.
JNK 단백질은 미토콘드리아 및 소포체에 영향을 미치며 ROS에 의해 활성화되는 신호전달 단백질이다. 데칸산에 의해 소포체 스트레스가 유도되는지 확인하기 위해 소포체 스트레스와 밀접한 관련이 있는 신호전달 단백질인 JNK와 그 하위 신호전달 단백질인 c-Jun의 인산화를 확인해보았다. 그 결과, JNK와 c-Jun 모두 400 μM의 데칸산에 의해 인산화가 증가하였으며 GRP78, PERK, eIF2α, IRE1α 등 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현 및 활성이 증가함을 확인하였다(도 5C). GRP78 단백질은 소포체 스트레스의 표적이 되는 샤페론 단백질이며 PERK와 IRE1α는 소포체 스트레스 감지 단백질이다. 또한 eIF2α는 PERK에 의해 인산화되는 하위 단백질로 잘 알려져있다. 뿐만 아니라, 미토콘드리아 의존적 세포사멸 경로의 대표적인 단백질인 Caspase-9의 cleaved form 역시 데칸산에 의해 증가하는 경향을 보였다.
이러한 결과를 통해 데칸산이 영양막 세포 내에 소포체 스트레스를 매개로 하여 세포 사멸을 유도한다는 것을 확인하였다.
영양막 세포의 침투성에 데칸산이 미치는 영향 분석
영양막 세포의 침투성에 데칸산이 미치는 영향에 대해 확인해보기 위해 Matrigel을 코팅한 Transwell에 HTR8/SVneo 세포를 분주한 후 데칸산(400 μM)이 함유된 배지에서 12시간 인큐베이션 하였다. 그 결과, 데칸산에 의해 영양막 세포의 침투성이 약 66% 감소하였다(도 6A). 뿐만 아니라 MMP2, MMP14, PLAU, FOXM1 등 세포외기질을 조절함으로써 세포의 침투성을 향상시키는 단백질의 mRNA 수준 발현을 분석한 결과 데칸산 처리 시 대조군에 비해 해당 유전자들의 발현이 확연히 감소하는 것으로 나타났다(도 6B-6E). 이러한 결과를 통해 데칸산이 영양막 세포의 과도한 침투성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
PI3K / AKT와 ERK1 /2 신호전달 경로에 데칸산이 미치는 영향 분석
영양막 세포 내 데칸산에 의해 유도되는 세포의 증식 억제 및 세포 사멸에 영향을 미치는 신호전달메커니즘을 확인하기 위하여 증식과 연관된 ERK1/2 MAPK 및 AKT의 인산화 양상을 데칸산 용량의존적(도 7)으로 웨스턴블롯을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 데칸산은 영양막 세포 내에서 AKT, P70S6K, S6 등 PI3K/AKT 신호전달 경로에 포함된 단백질의 인산화를 억제할 뿐만 아니라 ERK1/2 단백질의 활성 역시 억제함을 확인하였다.
뿐만 아니라, AKT에 대한 특이적 억제제인 LY294002(20 μM)와 ERK1/2에 대한 특이적 억제제인 U0126(20 μM)을 데칸산과 병용처리하여 AKT, P70S6K, S6, ERK1/2 신호전달 단백질의 활성을 웨스턴블롯을 통해 분석하였다(도 8). 그 결과 P70S6K, S6를 포함하는 PI3K/AKT 신호전달 경로는 U0126 병용 처리에 따라 활성이 증가하는 반면, ERK1/2 단백질의 활성은 LY294002에 병용 처리에 의해 더욱 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 데칸산이 조절하는 신호전달 경로는 AKT 신호전달 단백질이 ERK1/2 단백질보다 상위에서 작용하며 교차 효과를 지니는 것을 암시하는 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 데칸산(decanoic acid)을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환(Gestational trophoblastic disease) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 데칸산이 PI3K/AKT 및 ERK1/2 MAPK 신호전달기전을 억제하는 것을 특징으로 하는 임신성 영양막 질환(Gestational trophoblastic disease) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    PI3K/AKT 또는 ERK1/2 MAPK 신호전달경로를 억제하는 타겟 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 임신성 영양막 질환(Gestational trophoblastic disease) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 임신성 영양막 질환은 융모막암(choriocarcinoma), 포상기태(hydatidiform mole) 및 융모선종(villous adenoma)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 임신성 영양막 질환(Gestational trophoblastic disease) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 데칸산(decanoic acid)을 유효성분으로 포함하는 임신성 영양막 질환(Gestational trophoblastic disease) 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 데칸산(decanoic acid)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 영양막 세포의 증식, 이주 및 침투 능력을 억제하는 방법.
  7. 데칸산(decanoic acid)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 영양막 세포의 사멸 효과를 향상시키는 방법.
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Endocrinology, 157(1), 382-394, 2016.
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