KR102132267B1

KR102132267B1 - 찔레열매 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102132267B1
Application number: KR1020170110435A
Authority: KR
Inventors: 신희순; 이소영; 박소림; 남영도; 서동호; 엄지은; 최대운; 신동욱; 정선영; 손동화; 연성흠; 손락호; 필감방
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2020-07-10
Also published as: WO2019045287A2; KR20190023962A; WO2019045287A3

Abstract

본 발명은 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 찔레열매 추출물의 분획물은 인터루킨 4(IL-4)를 억제하는 것에 확인된 바, Th2 매개 면역 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

찔레열매 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 {Composition for Preventing, Improving or Treating Immune Disease Comprising Fraction of Rosa multiflora extract as an Active Ingredients}

본 발명은 찔레열매 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역시스템은 내부 및 외부의 병원성 물질로부터 인체를 보호하기 위해 다양한 세포로 구성된 방어 체계를 구축하고 있으며 이는 각각의 세포가 가진 특이적 기능 및 각 세포간의 신호 전달을 통해 이루어진다. 인체의 면역계는 면역을 억제하고 조절하는 면역 관용(tolerance)와 면역을 촉진하는 면역반응(immunity)로 크게 나눠 볼 수 있는데 이 두 가지 면역 작용이 서로 균형을 이뤄 면역학적 항상성(immunological homeostasis)이 이루어지게 된다. 그러나 어떤 이유에서 이의 균형이 깨져 면역반응이 면역 관용보다 항진되어 있을 경우 면역 질환 및 염증 질환이 초래되게 된다.

면역 질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료를 위한 면역억제에는 그 반응만을 억제하는 특이적 억제제와 비특이적 억제제가 있으며, 이론적으로 특이적 억제제의 작용이 뛰어나야 하나, 비특이적 억제제가 주로 사용된다. 임상적으로 가장 흔히 사용되는 면역억제제로는 싸이클로스포린(cyclosporine, Neoral, Cipol A), 아자치오프린(imuran), 프레드니솔론(일종의 스테로이드) 등이 있다. 최근에는 FK 506, RATG, OKT3, Cellcept 등 여러 가지 면역억제제가 개발되어 사용되고 있으며, 면역억제제는 항원자극에서 항체생성에 이르는 과정 중 대식세포에 의한 항원의 탐식, 림프구 등에 의한 항원 인식, 세포 분열, T세포와 B세포의 분열, 항체 생성 등 몇 가지 과정을 저해시킴으로써 면역 억제를 야기할 수 있다.

그러나, 현재 피부 면역질환에 대하여서는 확실한 효과를 보이는 치료제가 거의 없으며, 피부 면역질환의 하나인 아토피피부염이 증가하고 있으나 여전히 치료에 어려움을 겪고 있다. 특히 스테로이드 계통의 약물은 부작용이 심하여 세계적으로 그 대안을 마련하기 위한 시도가 활발하게 이뤄지고 있다. 이러한 피부 면역질환에 대응하는 방안으로써 독성과 부작용이 없으면서 확실한 효능이 기대되는 소재를 천연물과 식품으로부터 발굴하여 적극적으로 활용할 필요가 있다. 또한, 활성소재 및 성분의 항알레르기 작용기전도 함께 규명되어야 할 것이다.

Gell 및 Coombes(1963)는 알레르기반응을 발현시간과 타입에 기초하여 전통적으로 4 개의 부류로 나누었다. I - III 형은 항체가 관여하는 체액성 면역 반응(즉시형)이고, IV 형은 세포가 직접 관여하는 세포성 면역 반응(지연형)이다. 그리고 면역반응에 관여하는 세포와 매체의 종류에 따라 수분내에 증상이 나타나는 즉시 또는 조기 반응과 몇 시간 후에 나타나는 후기단계 반응으로 나뉘는데 제 I 형은 즉시형 과민반응, 제 IV 형은 지연형 과민반응의 형태로 나타난다. 대부분의 알레르기 반응은 제 I 형으로 천식, 비염, 결막염, 식품 및 약물 알레르기, 아토피성 피부염 등이 대표적인 질환으로 나타나고 심한 경우 아나필락시스(anaphylaxis)가 일어나 생명을 위협하기도 한다.

제 I 형 즉시형 과민반응은 2 단계로 나뉘는데 제 1 단계는 알레르겐의 체내 침입에 의하여 IgE 및 IgG1의 분비를 억제하고, IgG2a의 분비를 증가시키는 IL-12 및 IFN-r을 생산하는 Th1 세포반응과 IL-4, IL-5 및 IL-13등을 생산하는 Th2 세포반응의 균형이 Th2 쪽으로 기울어지게 되면 Th2의 과도한 면역반응으로 IL-4, IL-13 등이 분비되고 그 영향으로 B 세포가 생산한 IgE 특이항체들이 비만세포(mast cell)나 호염기구(basophil)의 표면에 부착됨으로써 알레르기 발증이 준비된 단계이다. 이를 알레르겐에 감작되었다고 한다.

알레르기 발증의 제 2 단계는 초기반응과 후기반응으로 나뉘며, 초기반응은 알레르겐이 체내에 재침입하여 비만세포를 자극하고 탈과립 반응을 유발하여 이 때 방출된 히스타민, 지질대사물, 사이토카인 등에 의한 혈관확장 등이 일어나는 것이고, 후기반응은 해당조직에 호중구, 호산구, 대식세포, Th2 세포, 호염기구 등이 침윤하여 활성화됨으로써 염증이 유발되어 아토피피부염, 비염, 천식 등을 일으키는 것이다. 이 같은 탈과립 분비 물질 중 히스타민은 가장 잘 알려진 인자이며, 즉각형 과민반응과도 관련되어 알레르기 증상의 중요한 지표로 사용되고 있다.

한편 우리나라에서는 알레르기의 치료 및 예방에 식품과 천연물이 한방과 민간요법으로 사용되어 왔다. 이러한 연구들은 주로 한약재 및 약초들의 탈과립 억제 활성을 평가한 것으로, 동충하초 등에서의 면역반응 조절에 관한 효과가 확인되기도 했다(공개특허 제2010-0005736호).

본 발명자들은 염증성 질환 및 알레르기와 같은 면역 반응에 의해 유발되는 질병, 질환 또는 상태를 예방 또는 치료할 수 있는 천연물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 찔레열매(Rosa multiflora) 분획물이 인터루킨 4(interleukin 4, IL-4)를 억제함으로써, 면역 질환 치료 및 개선 효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환의 예방, 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 분획물은 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 및 물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매로 분획된 분획물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 분획물은 인터루킨 4(IL-4)를 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 분획물은 미??리아닌(miquelianin), 엘라그산(ellagic acid), 하이페로사이드(hyperoside), 및 이소퀘르시트린(isoquercitrin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 면역 질환은 알레르기, 이식 거부, 자가면역질환 또는 염증 질환인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 식품조성물은 건강기능성 식품조성물을 포함한다.

아울러, 본 발명은 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부염 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 피부염은 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 비접촉성 피부염, 알레르기 피부염, 건선, 습진, 포진성 피부염, 및 두드러기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

삭제

본 발명은 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물을 분획하여 OVA로 유도된 면역 반응에 의해 증가된 인터루킨 4(IL-4)의 억제 효과를 확인한 결과, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 및 물 분획물에서 인터루킨 4(IL-4)의 억제가 유도된다는 것을 확인하였으며, 분획물의 추출 수율은 물> 부탄올> 디클로로메탄 > 에틸아세테이트 층 순으로 높음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 찔레열매 분획물은 면역 관련 질환에 있어 우수한 치료 및 개선 효과를 보일 것으로 예상된다.

삭제

도 1은 본 발명의 분획물을 분획하는 방법을 도식화하여 나타낸 분획도이다.
도 2는 찔레열매 부탄올 분획물에 대하여 Sephadex 컬럼 정제를 통한 TLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 찔레열매 부탄올 분획물을 Sephadex 컬럼에 정제한 정제물을 대상으로 수행한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 찔레열매 물추출물의 IL-4 생산 억제 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 찔레열매 물추출물의 용매별 분획물의 IL-4생산 억제 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 찔레열매 BuOH 층 및 BuOH 층의 2차 분획물에 대한 IL-4생산 억제 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 찔레열매 부탄올 분획물의 활성성분에 대한 IL-4생산 억제 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명자들은, 염증성 질환 및 알레르기와 같은 면역 반응에 의해 유발되는 질병, 질환 또는 상태를 예방 또는 치료 효과가 증진된 천연물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물에 면역반응을 유도하는 사이토카인인 IL-4를 억제하는 효과가 있다는 것을 확인하였다. 이에 상기 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물의 분획 중에, 우수한 면역 질환 개선 효과가 있는지 확인한 결과, 추출물에 비해 분획물에 우수한 효과가 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환의 예방, 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 면역 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 찔레열매(Rosa multiflora) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부염 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 찔레열매 추출물의 분획물을 포함하는 조성물의 제조방법으로, 하기 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다:

찔레열매에 극성 용매 또는 비극성 용매를 넣고 추출하여 추출물을 제조하는 단계(S1); 및

상기 추출물을 증류수로 용해한 후, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 및 물을 순차적으로 첨가하여 분획물을 얻어내는 단계(S2).

본 발명의 조성물에서 이용되는 찔레열매 추출물의 분획물은, 찔레열매 추출물에 유기용매를 첨가하여 분리해낸 분획물로, 상기 분획물은 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 및 물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 용매로 분획된 분획물일 수 있고, 특히 에틸아세테이트와 부탄올에서 우수한 IL-4 억제 효과를 보이는 바 바람직하게는 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물일 수 있으며, 수율면을 고려하였을 때 부탄올 분획물일 수 있다. 본 발명의 실시예에서 찔레열매 추출물과 비교하여 찔레열매 분획물들에 더 우수한 면역 질환 치료 효과를 가진다는 점을 확인하였다.

상기 추출물은 찔레열매에 추출용매를 처리하여 수득하는 것으로, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 부탄올, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로부탄올, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 실시예와 같이 물을 이용할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 찔레열매 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조된 것을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 하기의 찔레열매 추출물의 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 찔레열매(Rosa multiflora)로부터 추출한 분획물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 찔레열매 추출물의 분획물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 조성물은 조절 Th2 면역반응과 관련된 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료하는 데 유효한 것으로, Th2 면역반응과 연관된 사이토카인인 IL-4의 억제를 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용되는 면역 질환은 Th1 세포반응, Th2 세포반응, 및/또는 Th17 세포반응, 특히 Th2에 의해서 매개되는 면역 질환인 것으로, 상기 면역 질환의 구체예로는, 알레르기, 이식 거부, 자가면역질환 또는 염증 질환을 의미하는 것으로, 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 류마티스 관절염, 반응성 관절염(Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 공다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임 질환(Lyme), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 천식, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크로씨병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병, 다발경화증, 자폐스펙트럼 장애, 주의력결핍 장애 또는 주의력 결핍 과잉행동장애일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물이 적용되는 피부염은, 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 비접촉성 피부염, 알레르기 피부염, 건선, 습진, 포진성 피부염, 또는 두드러기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 찔레열매 추출물의 분획물의 약학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 "약학적 유효량"은 상술한 찔레열매 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 찔레열매 추출물의 분획물을 유효성분 포함하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 찔레열매 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 찔레열매 추출물의 분획물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 찔레열매 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 건강기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 건강기능성 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 찔레열매 추출물의 분획물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 화장료 조성물로 제조될 수 있으며, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 또는 바디 세정제 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 사용시, 화장료의 제형에 맞게 물질을 더 첨가할 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으며, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 또한 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 바람직하게는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으며, 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

실시예 1. 찔레열매로부터 유효분획 및 유효성분 분리

1.1. 추출물의 제조

찔레열매(Rosa multiflora)를 경동시장에서 구입하여, 물을 첨가하여 찔레열매 물 추출물을 제조하였다. 상기 물 추출물을 대상으로, 도 1에 제시된 분획도와 같이 4가지의 극성이 다른 용매(디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물)를 사용하여 분획물을 제조하였다. 분획 방법으로는 찔레열매 물 추출물 약 10 g을 정제수 300 mL에 용해시킨 후, 디클로로메탄(Dichloro methane, CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(Ethyl acetate, EtOAc), n-부탄올(n-Butanol, BuOH) 용매를 각각 차례로 300 mL씩 추가하고 30분 동안 교반 후 1시간 정치 과정을 반복하여 분획하였다.

1.2. 활성 실험

각 분획물에 대한 IL-4 생산 억제 활성활성실험 결과(실시예 2.1 실험방법 참고)를 통해 EtOAc와 BuOH 층에서 높은 활성이 관찰되었으며, BuOH 분획물의 수율이 약 17.3%로 더 높은 것으로 확인되었다. 즉, EtOAc와 BuOH 층에서 활성성분이 존재할 것으로 예상되나 실질적인 분획물의 생산을 위해서는 수율이 높은 BuOH 층을 활용하는 것이 효율적이라고 판단되는 바, 이하 실시예에서는 부탄올 분획물을 사용하였다.

1.3. 기능성분의 분리 및 정제

BuOH 층에서 기능성분을 분리하기 위해, sephadex 컬럼을 통해 분리 및 정제 실험을 진행하였다. 반지름 3 cm, 높이 60 cm 컬럼에 LH-20 silicagel resin을 높이 48.5 cm까지 충진하고, BuOH 분획물 2.85 g을 loading 하였다. 이동상은 80% 메탄올을 사용하여 전개하였으며, 분자량에 따라 분리된 샘플을 25 mL Tube 에 10 mL씩 총 140개를 취하였다. 취득한 샘플 내 기능성분을 분석하기 위해 TLC를 40% 메탄올을 사용하여 샘플과 표준품을 동일한 조건 하에 전개시켰다. Fraction 1부터 85까지 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 것과 같이, fr. 1-22까지 물질이 확인 되지 않았으며, fr. 23-32까지 유사한 물질이 확인되었다. fraction 33부터 40 까지 Hyperoside, Isoquercitrin, Miquelianin이 관찰되었고, fraction 41부터 84 까지 Ellagic acid의 존재가 관찰되었으며, 그 외 fraction에서는 물질이 확인되지 않았다.

동일한 물질이 확인되는 구간별로 모아 HPLC 분석한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 것과 같이, fr. 33-40에서 Miquelianin이 전체 78.59 mg 중 78.12 mg으로 가장 많이 함유하고 있는 것으로 확인되었으며, 그 외 Hyperoside, Isoquercitrin도 관찰되었다. fr. 41-84에는 Ellagic acid가 존재하는 것이 확인되었다. 결과적으로, BuOH 분획물에서 Miquelianin, Ellagic acid, Hypeorside, Isoquercitrin 외 기능성분은 관찰되지 않았다.

실시예 2. 찔레열매의 분획 및 성분의 IL-4 생산 억제 활성

2.1. 실험방법

2.1.1. OVA로 면역한 마우스 비장세포의 배양

5주령된 암컷 BALB/c 마우스에 알레르기를 유발시키기 위하여, 10 ㎍의 오브알부민(ovalbumin; OVA)과 1 ㎎의 알럼(alum)을 30분간 섞어준 혼합액을 마우스 한 마리 당 100 ㎕씩 1주일 간격으로 2차례 복강투여 하였다(n=5). 면역 1주일 후 마우스를 경추탈골로 희생시키고 무균상태에서 비장을 적출한 후 1 ㎖의 기본배지 즉, 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)과 항생제가 첨가된 RPMI1640 배지가 담긴 작은 페트리디쉬에 옮겨 아이스 위에 보관하였다. 이후 상기 비장을 메쉬를 이용하여 단세포화 시키고 5 ㎖의 기본배지로 2회 세척한 후 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 후 1 ㎖의 RBC(red blood cell) lysing buffer(SIGMA R7757)를 첨가하여 현탁하고 3분 동안 아이스 위에서 반응시킨 후 10 ㎖의 기본배지를 더 첨가하고 재현탁한 다음 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리를 2회 실시하였다. 상기 방법으로 배양한 마우스의 비장세포를 96웰 플레이트에 5 × 10⁶ cells/well로 seeding 한 후, OVA를 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 상기 찔레열매 분획물을 1, 10, 50, 100 ug/mL 의 농도로 첨가하였다. 이 후, 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 72시간 동안 배양한 후 세포 배양액을 회수하였다.

2.1.2. ELISA를 이용한 비장세포 배양액의 사이토카인 분석

상기 (1)의 방법에 따라 회수한 마우스 비장세포의 배양액으로부터 IL-4 사이토카인의 양을 측정하기 위해, IL-4 BD OptEIATM MOUSE ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) kit를 이용하여 실험을 수행하였다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 캡쳐 항체(capture antibody)를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 플레이트를 항체로 코팅시키고, washing buffer(Tween20 포함 인산염완충생리식염수, phosphate buffered saline with Tween20; PBST)로 세척한 후 assay diluent(PBS 하의 10% FBS)를 각 웰에 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 블로킹(blocking) 과정을 수행하였다. 다음으로 표준용액(standard solution)과 상기 실시예 2.1.1의 방법을 통해 회수한 마우스 비장세포의 배양액을 100 ㎕씩 상기 각 웰에 분주한 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 IL-4를 검출할 수 있는 IL-4 특이적 1차 항체와 스트렙타비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다제(streptoavidin-HRP)가 접합된 2차 항체를 각 웰에 100 ㎕씩 분주한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 100 ㎕의 기질용액(0.01% TMB in phosphate-citrate buffer)을 첨가하고 상온에서 30분 동안 발색시킨 다음, 2 M의 H₂SO₄를 각 웰에 50 ㎕씩 넣어 발색반응을 중지시킨 후 450 nm에서 micro plate reader로 흡광도를 측정하였다.

2.2. 실험 결과

2.2.1. 찔레열매 물 추출물 및 물 추출물 유해 분획물의 IL-4 억제 활성

찔레열매 물 추출물에 대한 IL-4 측정 결과를 도 4에 나타내었고, 물 추출물 유래 분획물(CH₂Cl₂ 층, EtOAc층, BuOH 층, H₂O 층)에 대한 IL-4 측정 결과를 도 5에 나타내었다. 상기 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 찔레열매 물 추출물과 비교할 때 4종 분획물에서 높은 IL-4 억제 활성을 보여 물 추출물보다는 각 분획물에서 Th2 면역억제활성이 더 높다는 것을 확인할 수 있었다.

도 5에서 세포성장에 영향을 보이지 않은 처리농도인 50 ug/mL를 기준으로 볼 때 각 분획물의 IL-4 억제활성은 EtOAc 층 > BuOH 층 > CH₂Cl₂ 층 > H₂O 층 순서로 높게 나타났는데, 도 1에 제시한 바와 같이 각 분획물 중 BuOH 층이 EtOAc 층에 비해 월등히 높은 수율을 보였기 때문에 IL-4 억제활성과 수율을 모두 고려하여 유효분획으로 BuOH 층을 선정하고 BuOH 층에 대한 2차 분획을 실시하였다.

2.2.2. BuOH 2차 분획물의 IL-4 억제 활성

2차 분획 후 획득 한 7개의 구간 분획물들의 항알레르기 활성을 평가하기 위해서 IL-4 생산 억제 활성을 측정한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 것과 같이, BuOH 층에 비해 fr.33-40, fr.35, fr.41-51, fr.52-84에서 IL-4 억제활성 높음을 확인할 수 있었다. 활성이 관찰된 이 4개의 fraction에는 도 3에 제시한 바와 같이 Miquelianin, Ellagic acid, Hypeorside, Isoquercitrin가 포함되어 있다는 것이 관찰되어 찔레열매 추출물에는 위의 4가지 성분이 유효성분인 것을 확인할 수 있었다. 추가적인 확인을 위해서 각각의 4가지의 단일성분(표준품)으로 IL-4 억제 활성을 평가한 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 도 7에서 확인할 수 있는 것과 같이, 각각의 성분 모두 IL-4를 억제할 수 있는 항알레르기 활성이 있다는 것을 확인하였다.

이상의 결과를 종합해 볼 때, IL-4 억제활성이 있는 찔레열매 물 추출물의 활성성분은 주로 BuOH 층에 다량 함유되어 있으며, BuOH 층 중에서 fr.33-40, fr.35, fr.41-51, fr.52-84에 다량함유되어 있고, 주요 활성 물질은 miquelianin, ellagic acid, hyperoside, isoquercitrin 임이 확인 되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

찔레열매(Rosa multiflora) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는,
알레르기 질환의 예방, 또는 치료용 약학적 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 분획물은 인터루킨 4(IL-4)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 알레르기 질환의 예방, 또는 치료용 약학적 조성물.
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찔레열매(Rosa multiflora) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는,
알레르기 질환 예방, 또는 개선용 식품 조성물.
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제6항에 있어서,
상기 식품조성물은 건강기능성 식품조성물인 것을 특징으로 하는, 알레르기 질환 예방, 또는 개선용 식품 조성물.
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제6항에 있어서,
상기 분획물은 인터루킨 4(IL-4)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 알레르기 질환 예방, 또는 개선용 식품 조성물.
삭제
찔레열매(Rosa multiflora) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는,
알레르기 피부염 개선용 화장료 조성물.
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제12항에 있어서,
상기 분획물은 인터루킨 4(IL-4)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 알레르기 피부염 개선용 화장료 조성물.
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